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Cancer Research

इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख के माध्यम से रोगी-व्युत्पन्न डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड्स में डीएनए क्षति मरम्मत प्रोटीन की कल्पना करना

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64881
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1, 1
1Washington University in St. Louis, 2University of California San Francisco

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल रोगी-व्युत्पन्न डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड्स में डीएनए क्षति मरम्मत प्रोटीन के मूल्यांकन के तरीकों का वर्णन करता है। यहां व्यापक चढ़ाना और धुंधला करने के तरीके शामिल हैं, साथ ही विस्तृत, उद्देश्य परिमाणीकरण प्रक्रियाएं भी हैं।

Abstract

इम्यूनोफ्लोरेसेंस उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ लक्ष्य एंटीजन की कल्पना करने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीकों में से एक है, जिससे प्रोटीन, ग्लाइकेन और छोटे अणुओं की सटीक पहचान और स्थानीयकरण की अनुमति मिलती है। जबकि यह तकनीक दो-आयामी (2 डी) सेल संस्कृति में अच्छी तरह से स्थापित है, तीन आयामी (3 डी) सेल मॉडल में इसके उपयोग के बारे में कम जाना जाता है। डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड 3 डी ट्यूमर मॉडल हैं जो ट्यूमर सेल क्लोनल विषमता, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट, और सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन को पुन: उत्पन्न करते हैं। इस प्रकार, वे दवा संवेदनशीलता और कार्यात्मक बायोमाकर्स के मूल्यांकन के लिए सेल लाइनों से बेहतर हैं। इसलिए, प्राथमिक डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड्स पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करने की क्षमता इस कैंसर के जीव विज्ञान को समझने में बेहद फायदेमंद है। वर्तमान अध्ययन उच्च श्रेणी के सीरस रोगी-व्युत्पन्न डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड्स (पीडीओ) में डीएनए क्षति मरम्मत प्रोटीन का पता लगाने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस की तकनीक का वर्णन करता है। पीडीओ को आयनकारी विकिरण के लिए उजागर करने के बाद, इम्यूनोफ्लोरेसेंस को फॉसी के रूप में परमाणु प्रोटीन का मूल्यांकन करने के लिए बरकरार ऑर्गेनोइड्स पर किया जाता है। छवियों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी पर जेड-स्टैक इमेजिंग का उपयोग करके एकत्र किया जाता है और स्वचालित फॉसी काउंटिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है। वर्णित विधियां डीएनए क्षति मरम्मत प्रोटीन की अस्थायी और विशेष भर्ती के विश्लेषण और सेल-चक्र मार्करों के साथ इन प्रोटीनों के सह-स्थानीयकरण की अनुमति देती हैं।

Introduction

डिम्बग्रंथि का कैंसर स्त्री रोग संबंधी दुर्भावना के कारण मृत्यु का प्रमुख कारण है। अधिकांश रोगियों को कार्बोप्लाटिन जैसी डीएनए-हानिकारक दवाओं के साथ इलाज किया जाता है, और होमोलोगस रिकॉम्बिनेशन रिपेयर (एचआरआर) की कमी वाले ट्यूमर वाले लोगों को पॉली (एडीपी-राइबोज) पोलीमरेज़ (पीएआरपी) इनहिबिटर 1,2 दिया जा सकता है। हालांकि, अधिकांश रोगी इन उपचारों के लिए प्रतिरोध विकसित करते हैं और निदान के 5 साल के भीतर मर जाते हैं। डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) की विकृति डिम्बग्रंथि के कैंसर और कीमोथेरेपी और पीएआरपी अवरोधक प्रतिरोध 3 दोनों के विकास से जुड़ी हुईहै। इस प्रकार, डिम्बग्रंथि के कैंसर, संभावित बायोमाकर्स और नए लक्षित उपचारों के पैथोफिज़ियोलॉजी को समझने में डीडीआर का अध्ययन अनिवार्य है।

डीडीआर का मूल्यांकन करने के लिए वर्तमान तरीके इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) का उपयोग करते हैं, क्योंकि यह डीएनए क्षति प्रोटीन और न्यूक्लियोटाइड एनालॉग की सटीक पहचान और स्थानीयकरण की अनुमति देता है। एक बार डीएनए में डबल-स्ट्रैंडेड ब्रेक (डीएसबी) होने के बाद, हिस्टोन प्रोटीन एच 2 ए एक्स तेजी से फॉस्फोराइलेटेड होता है, जिससे एक फोकस बनता है जहां डीएनए क्षति मरम्मत प्रोटीन एकत्रहोते हैं। इस फॉस्फोराइलेशन को आईएफ का उपयोग करके आसानी से पहचाना जा सकता है; वास्तव में, डीएसबी 5,6,7,8,9 के प्रेरण की पुष्टि करने के लिए आमतौर पर एच-एच 2 ए एक्स परख का उपयोग किया गया है। बढ़ी हुई डीएनए क्षति को प्लैटिनम संवेदनशीलता और डीएनए हानिकारक एजेंटों की प्रभावकारिता 10,11,12 के साथ जोड़ा गया है, और अन्य कैंसर उपचारों में कीमोथेरेपी प्रतिक्रिया से जुड़े बायोमार्कर के रूप में प्रस्तावित किया गया है। डीएसबी पर, एचआरआर में कुशल एक सेल घटनाओं की एक श्रृंखला करता है जो बीआरसीए 1 और बीआरसीए 2 को प्रतिकृति प्रोटीन ए (आरपीए) को बदलने और डीएनए से बांधने के लिए आरएडी 51 की भर्ती की ओर ले जाता है। एचआरआर मरम्मत डीएसबी को ईमानदारी से मरम्मत करने के लिए डीएनए टेम्पलेट का उपयोग करती है। हालांकि, जब ट्यूमर एचआरआर में कमी होती है, तो वे वैकल्पिक मरम्मत मार्गों पर भरोसा करते हैं जैसे कि गैर-होमोलोगस एंड जॉइनिंग (एनएचईजे)। NHEJ को त्रुटि-प्रवण माना जाता है और सेल पर एक उच्च उत्परिवर्तन बोझ पैदा करता है, जो सकारात्मक नियामक14 के रूप में 53BP1 का उपयोग करता है। इन डीएनए क्षति प्रोटीन को आईएफ का उपयोग करके फॉसी के रूप में सटीक रूप से पहचाना जा सकता है। प्रोटीन के लिए धुंधला होने के अलावा, आईएफ का उपयोग कांटा संरक्षण और एकल-फंसे डीएनए अंतर गठन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। स्थिर कांटे रखने की क्षमता को प्लैटिनम प्रतिक्रिया के साथ सहसंबद्ध किया गया है, और हाल ही में, गैप परख ने पीएआरपी इनहिबिटर 6,15,16,17 की प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने की क्षमता दिखाई है। इसलिए, जीनोम में परिचय के बाद न्यूक्लियोटाइड एनालॉग्स के लिए धुंधला होना डीडीआर का अध्ययन करने का एक और तरीका है।

आज तक, डिम्बग्रंथि के कैंसर में डीडीआर का मूल्यांकन काफी हद तक समरूप 2 डी सेल लाइनों तक सीमित है जो विवो ट्यूमर18,19 में क्लोनल विषमता, माइक्रोएन्वायरमेंट या वास्तुकला को पुन: उत्पन्न नहीं करते हैं। हाल के शोध से पता चलता है कि डीडीआर तंत्र6 जैसे जटिल जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने में ऑर्गेनोइड 2 डी सेल लाइनों से बेहतर हैं। वर्तमान पद्धति पीडीओ में RAD51, O-H2AX, 53BP1, RPA और जेमिनिन का मूल्यांकन करती है। ये विधियां बरकरार ऑर्गेनोइड का आकलन करती हैं और विवो ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के समान सेटिंग में डीडीआर तंत्र के अध्ययन की अनुमति देती हैं। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और स्वचालित फॉसी गिनती के साथ, यह पद्धति डिम्बग्रंथि के कैंसर में डीडीआर मार्ग को समझने और रोगियों के लिए उपचार योजनाओं को निजीकृत करने में सहायता कर सकती है।

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Protocol

ट्यूमर ऊतक और जलोदर एक स्त्री रोग संबंधी ऑन्कोलॉजी बायोरिपॉजिटरी के हिस्से के रूप में रोगी की सहमति प्राप्त करने के बाद प्राप्त किए गए थे जिसे सेंट लुइस इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड (आईआरबी) में वाशिंगटन विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। रोगियों को शामिल किया गया था यदि उनके पास उन्नत चरण उच्च श्रेणी के सीरस डिम्बग्रंथि के कैंसर (एचजीएसओसी) थे। सभी प्रक्रियाओं को बेंच पर कमरे के तापमान पर किया गया था जब तक कि अन्यथा निर्दिष्ट न हो। सभी अभिकर्मकों को कमरे के तापमान पर तैयार किया गया था (जब तक कि अन्यथा संकेत न दिया गया हो) और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था।

1. ऑर्गेनॉइड पीढ़ी

  1. पहले प्रकाशित रिपोर्ट20 के बाद ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करें।

2. ऑर्गेनोइड्स की प्लेटिंग और विकिरण

  1. संस्कृति में ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके, पिपेट टिप के मैनुअल हेरफेर के माध्यम से कल्चर डिश से ऑर्गेनोइड्स के टैब को हटा दें। 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में ऑर्गेनोइड्स एकत्र करें।
  2. शंक्वाकार ट्यूब को 1,650 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। पिपेट का उपयोग करके, सतह पर तैरने वाले को सावधानी से हटा दें।
  3. गोली में एक पशु मूल-मुक्त, पुनः संयोजक एंजाइम के 1,000 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। घोल को मिलाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,650 x g पर घोल को सेंट्रीफ्यूज करें। पिपेट का उपयोग करके, सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दें।
  5. सेंट्रीफ्यूजेशन और आकांक्षा के बाद, फॉस्फेट-बफर्ड खारा के 1,000 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
  6. घोल के 10 μL को 1.5 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और ट्रिपैन ब्लू के 10 μL के साथ मिलाएं।
  7. ट्राइपैन ब्लू सेल समाधान के 10 μL को सेल काउंटिंग चैंबर स्लाइड में लें और इसे सेल काउंटिंग मशीन में डालें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  8. 8-वेल ग्लास चैंबर स्लाइड में बेसमेंट मेम्ब्रेन एक्सट्रैक्ट (बीएमई) के प्रति 20 μL प्लेट 40,000 कोशिकाएं ( सामग्री की तालिका देखें)। यह 3-5 दिनों के लिए ऑर्गेनोइड्स को बनाए रखता है ताकि कोशिकाओं को ऑर्गेनोइड बनाने और उपयुक्त आकार तक बढ़ने की अनुमति मिल सके।
  9. डबल-स्ट्रैंड डीएनए ब्रेक को प्रेरित करने के लिए, 10 ग्रे (जीवाई) के साथ प्लेटेड ऑर्गेनोइड्स को विकिरण करें (विकिरण विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: इसमें 5-10 मिनट तक का समय लग सकता है।
  10. 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में अपने कल्चर मीडिया में ऑर्गेनोइड्स को इनक्यूबेट करें।

3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

नोट: वॉल्यूम 8-वेल चैंबर स्लाइड (~ 300 μL) के प्रति कुएं की मात्रा को संदर्भित करता है।

  1. ऑर्गेनोइड्स के विकिरण और इनक्यूबेशन के बाद, मीडिया को पिपेट के साथ सावधानी से एस्पिरेट करें, ताकि 3 डी मैट्रिक्स को बाधित न किया जा सके। पीबीएस के 300 μL के साथ धो लें।
  2. ऑर्गेनोइड्स को 10 मिनट के लिए 2% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 300 μL में ठीक करें।
    नोट: बहुत लंबे समय तक न छोड़ें, क्योंकि बीएमई डिपोलीमराइज्ड हो जाएगा और इसे बंद किया जा सकता है।
  3. ऑर्गेनोइड्स को 300 μL धुंधला बफर के साथ धोएं ( सामग्री की तालिका देखें)। 5 मिनट के लिए एक शेकर पर रखें।
  4. परमेबिलाइजेशन के लिए, धीरे से 300 μL परमेबिलाइजेशन बफर जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) और 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 300 μL धुंधला बफर से धो लें। 5 मिनट के लिए एक शेकर पर रखें।
  5. परमेबिलाइजेशन चरण को अवरुद्ध करने के लिए 300 μL धुंधला बफर जोड़ें। 30 मिनट के लिए एक शेकर पर रखें। पिपेट का उपयोग करके धुंधला बफर को बंद करें।
  6. धुंधला बफर में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी (खरगोश एंटी-आरएडी 51, माउस एंटी-जेमिनिन, खरगोश एंटी-आरपीए, माउस एंटी-एच 2 एएक्स, खरगोश एंटी-जेमिनिन, माउस एंटी-53 बीपी 1; सामग्री की तालिका देखें) के 300 μL जोड़ें। 16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: एक ही मेजबान जानवर के साथ सह-धुंधला होने से बचें। पड़ोसी कुओं में मिश्रित एंटीबॉडी से बचने के लिए ढक्कन को छोड़ दें।
  7. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को हटा दें। शेकर पर प्रत्येक पर 5 मिनट के लिए 300 μL धुंधला बफर के साथ तीन वॉश करें।
  8. द्वितीयक एंटीबॉडी के 300 μL जोड़ें (बकरी एंटी-माउस एलेक्सा फ्लोर 488 और बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा फ्लोर 647; सामग्री की तालिका देखें) घोल धुंधला बफर में पतला हो और अंधेरे में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: बाद के सभी चरणों को अंधेरे में किया जाना चाहिए।
  9. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान को एस्पिरेट करें। पतला DAPI का 300 μL जोड़ें। 5 मिनट के लिए एक शेकर पर रखें।
  10. शेकर पर प्रत्येक पर 5 मिनट के लिए 300 μL धुंधला बफर के साथ तीन वॉश करें। धुंधला बफर हटा दें और कक्ष स्लाइड के साथ शामिल निष्कासन किट का उपयोग करके कक्षों को अलग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: सुनिश्चित करें कि 3 डी मैट्रिक्स को बाधित करने के लिए बहुत दूर आगे न बढ़ें।
  11. टिप कट के साथ पी 200 पिपेट टिप का उपयोग करके, एक ऑर्गेनॉइड टैब के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से कवर करने के लिए माउंटिंग माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें (उदाहरण के लिए, प्रत्येक ऑर्गनॉइड टैब के लिए 20-30 μL)।
  12. बुलबुले से बचते हुए नमूने के ऊपर एक कवरस्लिप रखें।
  13. स्पष्ट नेल पॉलिश लें और स्लाइड को सील करने के लिए इसे कवर ग्लास के किनारों पर पेंट करें। इसे 1 घंटे के लिए सख्त होने दें और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: इमेजिंग के बाद, स्लाइड को प्रतिदीप्ति के न्यूनतम नुकसान के साथ कम से कम 6 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है।

4. इमेजिंग

  1. विसर्जन तेल के साथ 63x उद्देश्य पर एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके छवियां प्राप्त करें।
    नोट: यदि परमाणु प्रोटीन की इमेजिंग, 63x फायदेमंद है, लेकिन 40x भी स्वीकार्य है।
  2. आईपीस के माध्यम से ऑर्गेनोइड्स का पता लगाने के लिए DAPI का उपयोग करें। उपयोग किए गए फ्लोरोफोरे के आधार पर माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त फिल्टर का चयन करें। जेड-स्टैक छवियों को कैप्चर करने के लिए पैरामीटर सेट करें।
    नोट: अध्ययन में उपयोग किए गए फ्लोरोफोरे डीएपीआई, 488 और 647 थे। धुंधला होने की कल्पना करने के लिए 405, 488 और 638 लेजर चालू किए गए थे।
    नोट: अनुशंसित जेड-स्टैक उद्देश्य की समाधान शक्ति पर निर्भर करता है।
  3. लाइव छवि समायोजित करें: फोकस सेट करें, लेजर तीव्रता, आदि।
    नोट: लेजर तीव्रता जितनी अधिक होगी, नमूना फोटो-ब्लीच होने की संभावना उतनी ही अधिक होगी। इसलिए, एक इष्टतम लेजर तीव्रता का चयन करें।
  4. जेड-स्टैक प्राप्त करें।
    नोट: इसमें 5-10 मिनट तक का समय लग सकता है।
  5. जेड-स्टैक में एकत्र की गई छवियों से, प्रति स्टैक कम से कम तीन छवियों का स्क्रीनशॉट लें।
    नोट: पूरे स्टैक में स्क्रीनशॉट प्राप्त करना सुनिश्चित करें ताकि मात्रा निर्धारित करते समय नाभिक की नकल न की जा सके।
  6. प्रत्येक फ़ाइल को TIFF के रूप में सहेजें और विश्लेषण के लिए आगे बढ़ें (चरण 5)।

5. विश्लेषण

नोट: पहले प्रकाशित रिपोर्ट21 के बाद सभी छवि विश्लेषण के लिए JCountPro का उपयोग करें। इस सॉफ़्टवेयर को प्राप्त करने के लिए, संबंधित प्रकाशन का संदर्भ लें.

  1. फ़ाइल चयन टैब (प्रोग्राम के निचले भाग) में ऑब्जेक्ट विश्लेषण पैनल (प्रोग्राम के शीर्ष) के अंतर्गत , TIFF फ़ाइलों का चयन करें।
  2. चयनित फ़ाइलों को चयनित फ़ाइल समूह में ले जाने के लिए जोड़ें क्लिक करें. प्रदर्शन का चयन करें.
  3. विभाजन टैब के तहत, नाभिक के रंग के रूप में नीले रंग का चयन करें। नाभिक की दहलीज को अनुकूलित करने के लिए ऑटो विभाजन का चयन करें।
    नोट: यदि ऑटो विभाजन वस्तुओं की सटीक पहचान नहीं करता है, तो उपयोगकर्ता छवि में ठीक धुन और कच्ची धुन को समायोजित कर सकता है या विभाजन को और अनुकूलित करने के लिए उपयोगकर्ता मैनुअल देख सकता है।
  4. ऑब्जेक्ट पैनल के तहत, ऑटो विभाजित बड़ी वस्तुओं का चयन करें और नाभिक के आकार को अनुकूलित करें।
    नोट: नाभिक में आमतौर पर 5,000 पिक्सेल का बिना शर्त आकार होता है, जबकि सशर्त आकार 1,500 पिक्सेल होता है। ऑब्जेक्ट्स के आकार को और अनुकूलित करने के लिए उपयोगकर्ता मैनुअल देखें।
  5. पैरामीटर्स का परीक्षण करने के लिए ऑब्जेक्ट्स की पहचान करें का चयन करें.
    नोट: यदि ये पैरामीटर सटीक नहीं हैं, तो आकार और ट्यूनिंग को अन्य सेटिंग्स के साथ समायोजित किया जा सकता है। आगे अनुकूलन के बारे में निर्देशों के लिए उपयोगकर्ता मैनुअल देखें।
  6. छवि में मापदंडों को समायोजित करने के बाद, चयनित सभी छवियों में नाभिक की पहचान करने के लिए सभी छवियों में वस्तुओं की पहचान करें का चयन करें।
  7. फोसी विश्लेषण पैनल (प्रोग्राम के शीर्ष) का चयन करें।
  8. चयनित फ़ाइल टैब (प्रोग्राम के निचले भाग) के अंतर्गत, ऑब्जेक्ट विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली TIFF फ़ाइलों का चयन करें और छवियों को छवि फ़ाइल समूह में ले जाने के लिए तीर बटन (>>) का चयन करें।
  9. स्थानांतरित की गई छवि फ़ाइलों के नीचे निर्देशिका समूह में, मैन्युअल संपादन फ़ोल्डर पर डबल क्लिक करें और आईओसी फ़ाइलों को ऑब्जेक्ट संग्रह फ़ाइल समूह में ले जाने के लिए चुनें।
    नोट: चयनित सभी TIFFs आईओसी फ़ाइलों से मेल खाना चाहिए।
  10. चयनित फ़ाइल समूह में फ़ाइलों को ले जाने के लिए चयन दबाएँ . प्रोग्राम के निचले भाग में फॉसी गिनती टैब का चयन करें।
  11. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए पैरामीटर अनुकूलित करें।
    1. शीर्ष टोपी सेटिंग्स इंडेक्स: 12.
    2. फोकस चैनल: फॉसी के रंग का चयन करें (हरा: o-H2AX; लाल: RAD51)।
    3. एच गुंबद सेटिंग्स: गुंबद ऊंचाई %: 30; सीमा %: 28 और 28.
    4. आकार सेटिंग: न्यूनतम फ़ोकस आकार, पिक्सेल: 5. आकृति/आकार लागू करें का चयन करें. अधिकतम फोकस आकार (सशर्त): 32. मिन गोलाई, x100: 96. अधिकतम फोकस, पिक्सेल: 60.
    5. शोर फ़िल्टर: आकार 1.
      नोट: यदि यह निर्धारित किया जाता है कि क्या एक नाभिक जेमिनिन धुंधला होने के लिए सकारात्मक है, तो दूसरे चैनल के तहत हरे रंग का चयन करें, और विश्लेषण के तहत तीव्रता का चयन करें।
  12. पैरामीटर सेट का परीक्षण करने के लिए, क्रम में नीचे दिए गए बटन का चयन करें: शीर्ष टोपी > एच-डोम > फॉसी काउंट।
    नोट: यदि ये पैरामीटर काम नहीं करते हैं, तो आकार और ट्यूनिंग को अन्य सेटिंग्स के साथ समायोजित किया जा सकता है। छवि को और अनुकूलित कैसे किया जा सकता है, इसके बारे में अधिक जानने के लिए उपयोगकर्ता मैनुअल देखें।
  13. एक बार चयनित छवियों के लिए पैरामीटर अनुकूलित होने के बाद, प्रति नाभिक प्रत्येक छवि में फॉसी की गणना करने के लिए ऑटो काउंट का चयन करें। यदि दूसरा चैनल वांछित है, तो कार्यक्रम उस तीव्रता को निर्धारित करेगा जिसका उपयोग किया जा सकता है।

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Representative Results

प्रस्तुत प्रोटोकॉल ऑर्गेनोइड्स में परमाणु डीएनए क्षति मरम्मत प्रोटीन को सफलतापूर्वक दाग, कल्पना और मात्रा निर्धारित कर सकता है। इस तकनीक का उपयोग विकिरण से पहले और बाद में पीडीओ को दागने और मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। पीडीओ को विकिरण के 10 GY के संपर्क में लाया गया और निम्नलिखित बायोमाकर्स के लिए मूल्यांकन किया गया: -H2AX (चित्रा 1), डीएनए क्षति का एक मार्कर; RAD51 (चित्रा 2), HRR के लिए एक मार्कर; 53बीपी1, एनएचईजे का एक मार्कर; आरपीए, प्रतिकृति तनाव का एक मार्कर (चित्रा 3); और जेमिनिन, एक जी 2 / एस चरण सेल चक्र मार्कर14। डिम्बग्रंथि के कैंसर 6,22 में डीएनए क्षति का अध्ययन करने वाले पहले प्रकाशित शोधके आधार पर 10 GY की खुराक चुनी गई थी। जेकाउंटप्रो सॉफ्टवेयर का उपयोग नाभिक की पहचान करने और सचित्र मापदंडों13 (चित्रा 4) के साथ नाभिक के भीतर फॉसी की संख्या को निर्धारित करने के लिए किया गया था। सॉफ्टवेयर नाभिक (चित्रा 4 ए, बी), फिर परमाणु फॉसी (चित्रा 4 सी) की पहचान करता है, और जेमिनिन-पॉजिटिव कोशिकाओं (चित्रा 4 डी) से फॉसी को फ़िल्टर करता है।

Figure 1
चित्र 1: विकिरण से पहले और बाद में पीडीओ में एच 2 ए एक्स फॉसी। 63x इनसेट के साथ 10x पर विकिरण से पहले और बाद में पीडीओ में DAPI और O-H2AX फॉसी की प्रतिनिधि छवियां। स्केल पट्टियाँ: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: विकिरण से पहले और बाद में पीडीओ में आरएडी 51 फॉसी और जेमिनिन। 63x इनसेट के साथ 10x पर विकिरण से पहले और बाद में DAPI, Geminin, RAD51, और Geminin/RAD51 फॉसी पीडीओ के सह-धुंधलापन की प्रतिनिधि छवियां। स्केल पट्टियाँ: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: विकिरण से पहले और बाद में पीडीओ में आरपीए और 53बीपी 1। (ए) डीएपीआई, आरपीए की प्रतिनिधि छवियां; (बी) जेमिनिन, 53बीपी1, और 63 एक्स इनसेट के साथ 10x पर जेमिनिन/53BP1 फॉसी का सह-धुंधलापन। स्केल पट्टियाँ: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: JCountPro सॉफ्टवेयर परिमाणीकरण वर्कफ़्लो. (A) ऑब्जेक्ट विश्लेषण के तहत, नीले रंग की वस्तुओं, नाभिक की पहचान करने के लिए नीले चैनल का चयन किया जाता है, फिर इसे स्वचालित रूप से ऑटो विभाजन (लाल तीर) का चयन करके अनुकूलित किया जाता है। (बी) ऑटो विभाजन के तहत, वस्तु का आकार (नाभिक) छवि और आवर्धन के आकार के लिए अनुकूलित है। पैरामीटर (1) का परीक्षण करने के लिए पहचान ऑब्जेक्ट बटन का चयन किया जाता है, और प्रत्येक छवि के लिए वस्तुओं (नाभिक) की पहचान करने के लिए सभी छवियों (लाल तीर) बटन में वस्तुओं की पहचान करने का चयन किया जाता है। (सी) फॉसी विश्लेषण टैब के तहत, छवियों को इनपुट किया जाता है और फॉसी गिनती पैरामीटर सेट किए जाते हैं: सबसे पहले, फोकस चैनल के तहत फॉसी का रंग चुना जाता है, हरा; शीर्ष टोपी सूचकांक 12 पर सेट है; एच गुंबद सेटिंग्स में गुंबद ऊंचाई प्रतिशत 30 और 28 का दहलीज प्रतिशत निर्धारित किया गया है; फॉसी के आकार और आकार को 60 पर अधिकतम फोकस आकार पिक्सेल और 96 पर न्यूनतम गोलाई x 100 के मैनुअल मापदंडों के साथ छवि आकार के लिए अनुकूलित किया जाता है; अंत में, शोर फ़िल्टर लागू किया जाता है। शीर्ष टोपी, एच गुंबद और फॉसी गिनती (1-3) को लागू करके सेटिंग्स का परीक्षण किया जाता है। प्रति सेल में एच-एच 2 ए एक्स फॉसी की मात्रा निर्धारित करने के लिए, स्टार्ट (लाल तीर) दबाएं। (डी) RAD51 फॉसी के लिए, सेटिंग्स को लागू किया जाता है जैसा कि फोकस चैनल को छोड़कर, जिसे लाल रंग में बदल दिया जाता है; हालांकि, जेमिनिन से दाग वाले नाभिक की पहचान करने के लिए, दूसरे चैनल को हरे रंग के लिए चुना जाता है, और विश्लेषण को तीव्रता में बदल दिया जाता है। मापदंडों का परीक्षण शीर्ष टोपी, एच गुंबद और फॉसी गिनती (1-3) को लागू करके किया जाता है, फिर सभी आरएडी 51 फॉसी को मापने के लिए स्टार्ट (लाल तीर) दबाकर और प्रत्येक छवि में प्रति सेल हरे रंग की तीव्रता का मूल्यांकन किया जाता है। स्केल पट्टी: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

डीएनए क्षति प्रतिक्रिया डिम्बग्रंथि के कैंसर और कीमोथेरेपी प्रतिरोध दोनों के विकास में एक अभिन्न भूमिका निभाती है। इसलिए, डीएनए मरम्मत तंत्र की पूरी तरह से समझ अनिवार्य है। यहां, 3 डी, बरकरार ऑर्गेनोइड्स में डीएनए क्षति मरम्मत प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक पद्धति प्रस्तुत की गई है। डीएनए क्षति, समरूप पुनर्संयोजन, गैर-समरूप अंत जुड़ने और प्रतिकृति तनाव का मूल्यांकन करने के लिए हॉलमार्क एंटीबॉडी का उपयोग करके एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, विश्वसनीय प्रोटोकॉल विकसित किया गया है। महत्वपूर्ण रूप से, इन विधियों को आनुवंशिक रूप से संशोधित नियंत्रणों का उपयोग करके मान्य किया जाता है जो इन विधियों की विशिष्टता और संवेदनशीलता का प्रदर्शन करते हैं।

इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम ऑर्गेनोइड्स की चढ़ाना और निर्धारण है। यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से निर्धारण प्रक्रिया के दौरान बेसमेंट झिल्ली निकालने (बीएमई) की बारीकी से निगरानी के साथ 10 मिनट के लिए 2% पीएफए में ऑर्गेनोइड्स को इनक्यूबेट करता है। यह ऑर्गेनोइड्स में अन्य इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल से अलग है जो 10-60 मिनट23,24,25 के लिए 4% पीएफए का उपयोग करने का सुझाव देते हैं। यह पाया गया है कि यदि बीएमई के टैब बहुत लंबे समय तक पीएफए की केंद्रित मात्रा में हैं, तो टैब डीपोलीमराइज्ड होते हैं और आकांक्षा के अधीन होते हैं। ध्यान दें, विशिष्ट बीएमई के निर्माता अक्सर निर्धारण के बारे में सुझाव देते हैं। चर्चा का एक और महत्वपूर्ण बिंदु ऑर्गेनोइड्स की चढ़ाना है। धुंधला होने की प्रक्रिया के परिणामस्वरूप एक हिस्सा या सभी ऑर्गेनोइड्स खो सकते हैं। इसलिए, चढ़ाना के समय टैब जितना अधिक जटिल होगा, उतनी ही अधिक संभावना है कि नमूना धुंधला होने के चरणों का सफलतापूर्वक सामना करेगा।

इस प्रोटोकॉल की ताकत में परमाणु एंटीबॉडी धुंधलापन का सत्यापन, इम्यूनोफ्लोरेसेंस करने की क्षमता और बरकरार 3 डी ऑर्गेनोइड्स की इमेजिंग, और किसी भी उपचार या रुचि के अणु के लिए प्रोटोकॉल की अनुकूलनशीलता शामिल है।

इन प्रयोगों में उपयोग किए गए एंटीबॉडी को आनुवंशिक रूप से संशोधित डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं का उपयोग करके विशिष्टता के लिए सख्ती से मान्य किया गया था। विकिरण की बढ़ती खुराक के लिए पीडीओ को उजागर करके संवेदनशीलता के लिए विधियों को और मान्य किया गया था। इसके परिणामस्वरूप एचआरआर-कुशल पीडीओ में एच-एच 2 ए एक्स, आरएडी 51 और आरपीए फॉसी में वृद्धि हुई। अंत में, उद्देश्य परिमाणीकरण विधियां इस परख की प्रजनन क्षमता की सुविधा प्रदान करती हैं और मैनुअल परिमाणीकरण के व्यक्तिपरक पूर्वाग्रह से बचती हैं।

डीडीआर का पता लगाने के पारंपरिक तरीके सेल लाइनों के रूप में जानी जाने वाली 2 डी संवर्धन स्थितियों के माध्यम से हैं, लेकिन उनके पास मूल ट्यूमर की आनुवंशिक विषमता को बनाए रखने की क्षमता नहीं है। ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट डिम्बग्रंथि के कैंसर26,27,28 में ट्यूमरजेनिसिस और कीमोथेरेपी प्रतिरोध में महत्वपूर्ण है, इसलिए, ये मॉडल डीडीआर का अध्ययन करते समय 2 डी समरूप सेल संस्कृतियों के लिए एक लाभ प्रदान करते हैं। डीडीआर का अध्ययन करते समय, सेल चक्र के लिए नियंत्रण करना आवश्यक है ताकि विशिष्ट प्रकार के डीएनए मरम्मत करने में असमर्थता के गलत वर्गीकरण से बचा जा सके जो सेल चक्र विशिष्ट (यानी, एचआरआर) हैं। भविष्य का काम प्लेटिनम कीमोथेरेपी, पॉली (एडीपी-राइबोज) पोलीमरेज़ इनहिबिटर, या हाइड्रॉक्सीयूरिया के कारण विशिष्ट प्रकार के डीएनए घावों का अध्ययन करने पर केंद्रित है।

अंत में, यह प्रोटोकॉल पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए संशोधित किसी भी एंटीजन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलनीय है और नई दवा उपचारों के अध्ययन को समायोजित कर सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल डीडीआर प्रोटीन पर केंद्रित है, लेकिन एंटीबॉडी के एक सरल परिवर्तन के साथ, इस प्रोटोकॉल को अन्य प्रोटीन, ग्लाइकेन और छोटे अणुओं का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, चूंकि ऑर्गेनोइड्स विट्रो में संवर्धित हेटरोजेनस 3 डी मॉडल हैं, इसलिए ऑर्गेनोइड्स का कोई भी उपचार संभव है, जिसमें इम्यूनोथेरेपी, एंटीएंजियोजेनिक थेरेपी, मेटाबोलॉमिक्स थेरेपी और अन्य नए उपचार शामिल हैं जो समरूप सेल लाइनों 29,30,31 में मूल्यांकन करना मुश्किल है।

इस विधि की सीमाओं में असंगत संरचना और गैर-विशिष्ट धुंधलापन के साथ बीएमई का उपयोग करना शामिल है। चूंकि वाणिज्यिक बीएमई सेल लाइनों से उत्पादित होते हैं, प्रत्येक इकाई की संरचना काफी भिन्न हो सकती है। ये अंतर निर्धारण और धुंधलापन, साथ ही ऑर्गेनोइड पीढ़ी को प्रभावित कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, नमूने के आधार पर, बीएमई का गैर-विशिष्ट धुंधलापन हो सकता है, जो ब्याज के प्रोटीन को बाधित कर सकता है। बहरहाल, परमाणु धुंधला बहुत विशिष्ट है और स्पष्ट परमाणु फॉसी प्रदर्शित करता है जिसे आसानी से परिमाणित किया जा सकता है।

अंत में, ऑर्गेनोइड्स में डीडीआर प्रोटीन का मूल्यांकन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। जैसे-जैसे प्रौद्योगिकी आगे बढ़ती है, यह अनुमान लगाया जाता है कि इन 3 डी मॉडल में लाइव सेल डीएनए क्षति की मरम्मत का मूल्यांकन करने के लिए ऑर्गेनोइड्स का उपयोग किया जा सकेगा। इसके अतिरिक्त, संस्कृति के लिए सबसे प्रभावी तरीके के रूप में, ऑर्गेनोइडस्थापित किए जाएंगे, और डीएनए फाइबर और प्रतिकृति अंतर परख जैसे अधिक परिष्कृतपरख संभव होंगे।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम इस प्रोटोकॉल को स्थापित करने में पावेल लोबाचेवस्की, पीएचडी के मार्गदर्शन के लिए आभारी हैं। हम इस परियोजना के समर्थन के लिए सेंट लुइस के प्रसूति और स्त्री रोग विभाग और स्त्री रोग संबंधी ऑन्कोलॉजी विभाग, वाशिंगटन विश्वविद्यालय के डीन स्कॉलर प्रोग्राम, स्त्री रोग संबंधी ऑन्कोलॉजी ग्रुप फाउंडेशन और प्रजनन वैज्ञानिक विकास कार्यक्रम में वाशिंगटन विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन को भी स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) Sigma 14-040-133
1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) Fisher Scientific  ICN1860454
Ant-53BP1 Antibody  BD Biosciences 612522 diluted to 1:500 in staining buffer
Ant-Geminin Antibody  Abcam ab104306 diluted to 1:200 in staining buffer
Anti-Geminin Antibody  ProteinTech 10802-1-AP diluted to 1:400 in staining buffer
Anti-RAD51 Antibody  Abcam ab133534 diluted to 1:1000 in staining buffer
Anti-yH2AX Antibody  Millipore-Sigma 05-636 diluted to 1:500 in staining buffer
Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody Bethyl Laboratories  A300-245A-M diluted to 1:200 in staining buffer
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific  BP1605 100
Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge Thermo Scientific  75004240
Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 Leica  389584
Conical Tubes, 15 mL Corning  14-959-53A
Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine)  Thermo Scientific  AMQAF2000
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Scientific  C10228
Cover Slip LA Colors Any clear nail polish will suffice
Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2  R&D Systems  3533-010-02 Could probably use Matrigel or other BME Matrix 
DAPI  Thermo Scientific   R37606 NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS 
Glycine  Fisher Scientific  NC0756056
JCountPro JCountPro For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com 
Microcentrifuge Tubes  Fisher Scientific  07-000-243
Nail Polish  StatLab SL102450
Parafomraldehyde (PFA), 2%  Electron Microscopy Sciences  157-4 Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA
Permeabilization Buffer Made in Lab 0.2% X-100 Triton in PBS++ 
Pipette Rainin 17014382
Pipette Tips  Rainin  17014967
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Scientific   P36930
Staining Buffer  Made in Lab 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ 
Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System  Thermo Scientific  12-565-8
Triton X-100 Sigma-Alderich  11332481001
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Scientific  15250061
TrypLE Express Invitrogen 12604013 animal origin-free, recombinant enzyme
X-RAD 320 Biological Irradiator  Precision X-Ray Irradiation  X-RAD320

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References

  1. Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. Epithelial ovarian cancer. Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).
  2. Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).
  3. Tomasova, K., et al. DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome. Cancers. 12 (7), 1713 (2020).
  4. Mukhopadhyay, A., et al. Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).
  5. Graeser, M., et al. A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).
  6. Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
  7. Naipal, K. A. T., et al. Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).
  8. Tumiati, M., et al. A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).
  9. Mukhopadhyay, A., et al. Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival. Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).
  10. Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines. Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).
  11. Stefanou, D. T., et al. Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer. PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).
  12. Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).
  13. Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
  14. Fuh, K., et al. Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not. Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).
  15. Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
  16. Lee, E. K., Matulonis, U. A. PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies. Cancers. 12 (8), 2054 (2020).
  17. Panzarino, N. J., et al. Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response. Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).
  18. Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).
  19. Regan, J. L. Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids. Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).
  20. Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids. Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).
  21. Jakl, L., et al. Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes. International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).
  22. Mullen, M. M., et al. GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress. Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).
  23. van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
  24. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  25. O'Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells. Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).
  26. Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer. Cancers. 10 (8), 266 (2018).
  27. Ghoneum, A., et al. Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer. Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).
  28. Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).
  29. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  30. Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
  31. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  32. Cybulla, E., Vindigni, A. Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy. Nature Reviews. , (2022).

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कैंसर अनुसंधान अंक 192
इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख के <em>माध्यम से</em> रोगी-व्युत्पन्न डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड्स में डीएनए क्षति मरम्मत प्रोटीन की कल्पना करना
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van Biljon, L., Fashemi, B., Rodriguez, J., Graham, O., Compadre, A., Fuh, K., Khabele, D., Mullen, M. Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays. J. Vis. Exp. (192), e64881, doi:10.3791/64881 (2023).

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