Summary
מוצגות כאן שיטות המספקות הוראות מפורטות לניתוח, ניתוק, תרבית ורישום מהדק טלאי מגנגליון שיווי המשקל ונוירוני גנגליון ספירלי באוזן הפנימית.
Abstract
המורפולוגיה הקומפקטית של נוירוני גנגליון באוזן הפנימית מבודדים ומתורבתים מאפשרת אפיון מפורט של תעלות היונים וקולטני המוליכים העצביים התורמים למגוון התאים באוכלוסייה זו. פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הדרושים לניתוח מוצלח, ניתוק, וטיפוח לטווח קצר של הסומטה של נוירונים דו-קוטביים באוזן הפנימית לצורך רישומי מהדק טלאי. הוראות מפורטות להכנת נוירונים גנגליון שיווי משקל מסופקים עם השינויים הדרושים עבור ציפוי נוירונים גנגליון ספירלי. הפרוטוקול כולל הוראות לביצוע הקלטות מהדק טלאי של תאים שלמים בתצורת התיקון המחורר. תוצאות לדוגמה המאפיינות את רישומי מהדק המתח של זרמים בתיווך נוקלאוטידים מחזוריים המופעלים על ידי היפרפולריזציה (HCN) מדגישות את היציבות של תצורת רישום טלאי מחורר בהשוואה לתצורת התיקון הקרוע הסטנדרטית יותר. השילוב של שיטות אלה, סומאטה מבודדת בתוספת רישומי מהדק טלאי מחורר, יכול לשמש לחקר תהליכים תאיים הדורשים הקלטות ארוכות ויציבות ושימור הסביבה התוך-תאית, כגון איתות באמצעות קולטנים מצומדים לחלבון G.
Introduction
הנוירונים הדו-קוטביים של עצב שיווי המשקל מחברים את תאי השערה הסנסוריים של האוזן הפנימית לגזע המוח. הם נשאים עיקריים של מידע על תנועות קול וראש; פגיעה בתאים חשובים אלה מובילה לחירשות ולהפרעות שיווי משקל. החלקים הווסטיבולריים והשמיעתיים של העצב מורכבים כל אחד מסוגי תאים נפרדים שהם מגוונים מורפולוגית ותפקודית 1,2. במערכת שיווי המשקל, שתי תת-אוכלוסיות afferent יורות באופן ספונטני במרווחי זמן קבועים או לא סדירים2. תזמון ספייק אפרנטי נחשב כמשקף גיוון בסיסי בהרכב תעלות היונים 3,4. במערכת השמיעה ישנן שתי תת-אוכלוסיות עיקריות של נוירוני גנגליון ספירליים (SGNs); בעוד SGNs מסוג I יוצרים מגע עם תאי שיער פנימיים בודדים5, SGNs מסוג II יוצרים מגע עם תאי שיער חיצוניים מרובים5. הקלטות במבחנה מתרבויות שלמות למחצה ואורגנוטיפיות מצביעות על הבדלים בתכונות הממברנה של סוג I וסוג II SGNs 6,7.
תעלות יונים וקולטנים רבים של מוליכים עצביים הנמצאים במסופים של תאי עצב אלה נמצאים גם בגופם התא. לכן, תרביות של שיווי המשקל המבודד והגנגליון הספירלי סומאטה יכולות להיחקר במבחנה כדי להבין כיצד תעלות יונים וקולטני מוליכים עצביים תורמים לתגובה של נוירונים אלה. המורפולוגיה הקומפקטית של גופי התא המבודדים מאפשרת הקלטות חשמליות באיכות גבוהה, המתאימה לאפיון מפורט של תעלות יונים מגודרות מתח וקולטנים של מוליכים עצביים. גישה נוחה למגוון מייצג של תת-סוגים של תאי עצב מאפשרת ניתוח בתפוקה גבוהה של מגוון התאים.
מאמר זה מציג שיטה לבידוד וטיפוח גופי תאי גנגליון מנותקים מהחלק העליון של גנגליון שיווי המשקל בחולדות ביום שלאחר הלידה (P)9 עד P20. כמו כן ניתנות הצעות להרחבת שיטות אלה לגנגליון הספירלי, בנוסף לשלבים הנדרשים לחילוץ, ניתוק וציפוי מוצלחים של תאי הגנגליון. שיטות אלה הן אבולוציה של אלה שהומצאו בפרסומים ממעבדות שונות 8,9,10. כמו כן כלולה במאמר זה הדרכה לבחירת תאים בריאים להקלטות מהדק טלאי.
לבסוף, הפרוטוקול מתאר את ההליך להקלטת מהדק טלאי באמצעות תצורת תיקוןמחורר 11. למרות שתצורת התיקון המחורר גוזלת זמן רב יותר ומאתגרת יותר מבחינה טכנית מאשר תצורת התיקון הקרוע הנפוצה יותר, היא טובה יותר לשמירה על הסביבה הציטופלזמית המאפשרת הקלטות ארוכות ויציבות. היתרונות של תצורת הקלטה זו מודגמים כאן באמצעות היציבות המשופרת של זרמים קטיוניים המופעלים על ידי היפרפולריזציה בטלאי מחורר ביחס להקלטות טלאי קרוע.
פרוטוקול זה מאורגן בחמישה חלקים. סעיפים 1-3 מתארים פתרונות וכלים שניתן להכין ולאחסן מבעוד מועד. סעיף 4 מתאר את השלבים לניתוח וציפוי שיווי המשקל וה-SGNs. סעיף 5 מתאר את השלבים להקלטה מהנוירונים לאחר תקופה בתרבית. בידינו, סעיף 4 וסעיף 5 מבוצעים על פני תקופה של יומיים רצופים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השימוש בבעלי חיים המתואר כאן אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת דרום קליפורניה. בעלי חיים בפרוטוקול זה הם חולדות לונג אוונס בגילאי P3 עד P25 משני המינים שהתקבלו ממעבדות נהר צ'ארלס, אך ניתן ליישם שיטות אלה על זני מכרסמים אחרים. יש ללבוש מעיל מעבדה וכפפות במהלך כל ההליכים, כמו גם משקפי מגן להתזה בעת הכנת פתרונות.
1. הכנות
הערה: ניתן להכין את הפתרונות והכלים המתוארים בסעיף זה זמן רב מראש לשימוש ביום הנתיחה וההקלטה.
- הכינו מדיה של ליבוביץ בתוספת HEPES של 10 mM (תמיסת L-15). השלבים הבאים מתארים יצירת 1 ליטר של תמיסת L-15.
- יוצקים 990 מ"ל של H2O נטול יונים לתוך אחת. למדוד ולהוסיף 2.386 גרם (10 mM) של HEPES. יש להוסיף בקבוק אחד של 1 ליטר אבקת תמיסת L-15.
הערה: אבקת L-15 בעלת חיי מדף ארוכים יותר ותופסת פחות מקום אחסון. לחלופין, לרכוש פתרון L-15 ולהשלים עם HEPES. באפשרות השנייה יש גם אפשרות להשתמש בתמיסה נטולת פנול, השימושית להדמיית פלואורסצנטיות. - מערבבים את התמיסה על צלחת ערבוב. באמצעות מד pH, להוסיף לאט 1 N נתרן הידרוקסידי (NaOH) כדי לקבל pH בין 7.34 ל 7.36.
- הוסף H2O שעבר דה-יוניזציה עד שהתמיסה תגיע לנפח של 1,000 מ"ל. סנן את התמיסה באמצעות קרום בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר.
הערה: ניתן לאחסן תמיסת L-15 בטמפרטורה של 4°C למשך כשבוע-שבועיים. אם משתמשים ב- L-15 המיוצר עם פנול-אדום, התמיסה תהפוך ורודה אם בסיסית מדי (pH > 7.4) או כתומה אם חומצית מדי (pH < 7.34).
- יוצקים 990 מ"ל של H2O נטול יונים לתוך אחת. למדוד ולהוסיף 2.386 גרם (10 mM) של HEPES. יש להוסיף בקבוק אחד של 1 ליטר אבקת תמיסת L-15.
- הכינו את מדיום התרבית עבור נוירוני גנגליון שיווי משקל (VGNs) (עם שינוי עבור SGNs). בצע את השלבים הבאים כדי להפוך 50 מ"ל של מדיום תרבות:
- הוסף 47.5 מ"ל של מדיום חיוני מינימלי GluMAX-I לכוס זכוכית נקייה.
- למדוד ולהוסיף 0.1194 גרם (10 mM) של HEPES. חיץ נוסף זה מתנגד לשינויי pH בזמן שהתאים מתיישבים, לפני שהוא מועבר לאינקובטור.
- הוסף 2.5 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS). זה עושה 5% על ידי נפח FBS בנפח כולל של 50 מ"ל של בינוני. עבור ההכנות SGN, 2.5 מ"ל של FBS מוחלף עם 0.5 מ"ל של N2 ו 1 מ"ל של פתרונות B27.
- מערבבים את התמיסה על צלחת ערבוב. באמצעות מד pH, להוסיף לאט 1 N NaOH כדי לקבל pH בין 7.38 ל 7.4.
- הוסף 0.5 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין. סנן את התמיסה דרך מסנן סטרילי של 0.22 מיקרומטר. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4°C.
- לפחות 30 דקות לפני השימוש, העבירו את מצע התרבית לבקבוק תרבית רקמות עם פקק מאוורר. מניחים את הבקבוק עם מדיה תרבית באינקובטור עם ריכוז CO2 5% ב 37 ° C.
- הכינו את התמיסה הפנימית המחוררת
הערה: כאן, 100 מ"ל של תמיסה פנימית מחוררת משמש לרישום תא שלם (המתכון מסוכם בטבלה 1). פתרונות אלה ניתן להכין זמן רב מראש ולאחסן ב -20 ° C. Aliquots ניתן לאחסן ללא הגבלת זמן ב -20 ° C אם הם לא עוברים מחזור חוזר של הקפאה והפשרה.- עד 6 חודשים מראש, צור ואחסן פתרונות מלאי של הפריטים הבאים: 1 M KCl, 0.5 M Mg2Cl (hexahydrate) ו- 0.5 M CaCl2. יש לאחסן בבקבוקים אטומים עד 6 חודשים בטמפרטורה של 4°C.
הערה: מומלץ לבדוק את האוסמוליות של תמיסות המלאי (2,000 mOsm עבור תמיסת המניות 1 M KCl; 1,500 mOsm עבור תמיסות Mg2Cl ו- CaCl2 ) כדי לוודא שריכוז היעד הושג. אין להשתמש אם התמיסה הופכת עכורה או יוצרת שקעים. זו יכולה להיות נקודת הפסקה אפשרית.
- עד 6 חודשים מראש, צור ואחסן פתרונות מלאי של הפריטים הבאים: 1 M KCl, 0.5 M Mg2Cl (hexahydrate) ו- 0.5 M CaCl2. יש לאחסן בבקבוקים אטומים עד 6 חודשים בטמפרטורה של 4°C.
- ביום יצירת הפתרונות הפנימיים, בצע את השלבים הבאים באמצעות פתרונות המלאי משלב 1.3.
- למדוד 100 מ"ל של מילי-Q (MQ)H2O. למשוך 40 מ"ל מתוך 100 מ"ל ולהניח בצד בכד נקי.
- הוסף את 60 מ"ל הנותרים של H2O לכוס נקייה וסטרילית של 100 מ"ל. הוסף 2.5 מ"ל של 1 M KCl, 1 מ"ל של 0.5 M Mg2Cl-hexahydrate, ו- 0.02 מ"ל של 0.5 M CaCl2.
- מוסיפים ערבוב ומניחים את הכד על צלחת ערבוב. מערבבים עד להמסה מלאה. הוסף 1.307 גרם של K2SO4. מערבבים עד שה-K2SO4 מתמוסס.
- שוקלים 0.1192 גרם HEPES (יעד 5 מילימטר בנפח סופי של 100 מ"ל) ומוסיפים לתמיסה. מערבבים עד להמסה.
הערה: ודא שכל הרכיבים מומסים במלואם, מכיוון שלפעמים לוקח זמן ל- K2SO4 להתמוסס. - שקלו 0.1902 גרם אתילן גליקול-ביס(β-אתר אמינואתיל)-N,N,N′,N′,N′-חומצה טטראצטית (EGTA) (יעד 5 מילימטר בנפח סופי של 100 מ"ל) והוסיפו לתמיסה. מכיוון ש- EGTA אינו מתמוסס לחלוטין בתמיסה חומצית, הניחו את הכד על צלחת ערבוב והכניסו את בדיקת ה- pH.
- תוך כדי ערבוב, מקציפים באיטיות 1 M KOH עד שה-EGTA מתמוסס לחלוטין. צפו שזה יקרה כאשר ה- pH הוא בין 6 ל -7. המשך להוסיף לאט KOH עד pH הסופי הוא 7.35 (כ 1.2 עד 1.3 מ"ל של KOH בסך הכל).
- הוסף MQH2O כדי להביא את התמיסה לנפח סופי של 100 מ"ל וערבב. בדוק את האוסמוליות של התמיסה (יעד 270 mOsm/kg לתמיסת המדבקה המחוררת) עם אוסמומטר.
- סנן את התמיסה הפנימית המחוררת באמצעות מסנן סטרילי של 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן ב 5 מ"ל aliquots ב -20 °C. השתמש ב- aliquot חדש עבור כל הפעלת הקלטה חדשה.
הערה: זו יכולה להיות נקודת השהיה אפשרית.
2. ייצור פיפטות טריטורציה
הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בפיפטות טריטורציה עבור ניסויים מרובים. יש לשטוף את הפיפטות באתנול, מים ותמיסת L-15 לפני כל שימוש ולנקות אותן במים ובאתנול לאחר כל שימוש. יש לאחסן בזהירות בין השימושים.
- כדי להכין פיפטות טריטורציה לדיסוציאציה של תאים, החזיקו פיפטת פסטר מזכוכית ללהבה של מבער בונזן. ברגע שקצה הזכוכית מתחיל להימס, מתחו את הכוס החוצה לקוטר הקצה הרצוי. משכו קצה אחד של הפיפטה הרחק מהלהבה כדי ליצור כיפוף קטן.
- קרבו את הפיפטה הכפופה למיקרוסקופ. בעזרת אריח ניקוד, הניקוד ושברו את הזכוכית בקוטר הרצוי.
- מעבירים את קצה הפיפטה מעל החלק העליון של להבת מבער הבונזן. פעולה זו תלטש במהירות את הקצוות המחוספסים ליד הקצה. בדקו שהקצה אינו אטום על ידי הלהבה.
- חזור על התהליך עד להכנת ארבע או חמש פיפטות בגדלים שונים.
3. ייצור פיפטות טלאי
הערה: הכינו סט של פיפטות טלאי לפני ההקלטה, אך לאחר נתיחת גנגליון ותרבות. למרות שאלקטרודות המיוצרות אחת בכל פעם במהלך סשן ההקלטה הן אופטימליות בביצועיהן, הושגה הצלחה סבירה כאשר הן מיוצרות כאצווה בלילה הקודם. אחסנו את הפיפטות במיכל זכוכית מכוסה כדי להגן על הקצוות מפני אבק.
- השתמש במושך אלקטרודות אנכי ופיפטות זכוכית בורוסיליקט בקוטר חיצוני של 1.5 מ"מ / בקוטר פנימי של 1.17 מ"מ. ודאו שהזכוכית נשמרת תמיד נקייה מאבק ומטביעות אצבע.
- משוך 8-10 פיפטות הקלטה באמצעות תוכנית דו-שלבית, כפי שהומלץ עבור פיפטות תיקון על ידי היצרן.
- לבדוק וללטש בחום כל קצה פיפטה הקלטה עם microforge; ליטוש בחום מקדם איטום טוב יותר. התנגדות פיפטת המטרה היא בין 4 ל 8 MΩ.
- אחסנו את הפיפטות המלוטשות בכלי מכוסה. ניתן להתייחס לכך כאל נקודת הפסקה בניסוי.
הערה: מיטוב קוטר פיפטה כדי להגיע לטווח התנגדות המטרה דורש קצת ניסוי וטעייה עם שלבים 3.2 ו -3.3. רוב מערכות הידוק הטלאים המסחריות כוללות תכונת בדיקת ממברנה מובנית למדידת התנגדות האלקטרודות בתמיסת האמבטיה. ההתנגדות מחושבת כיחס של זרם היציאה במצב יציב בתגובה לגירוי צעד 5 mV שהופעל. יש לכוונן תחילה את הגדרות המשיכה בשלב 3.1 ואת הליטוש בשלב 3.2 באמצעות פיפטות ניסיון, עד שההתנגדות של פיפטות הניסיון נופלת בטווח של 4 עד 8 MΩ. - ביום ההקלטה, מעילים את קצות פיפטה כדי להפחית את קיבול פיפטה ואת רעש ההקלטה. כדי לעשות זאת, לעטוף רצועה קטנה של סרט פרפין על פיר של פיפטה. אין צורך לעטוף עד הקצה.
הערה: אסטרטגיה חלופית היא לצפות ולחמם אלסטומר סיליקון על פיר פיפטה12.
4. מיצוי גנגליון שיווי המשקל וציפוי של נוירונים שיווי משקל
- הכנה לדיסקציה
- הכינו תערובת אנזימים של תמיסת L-15 עם 0.05% קולגנאז ו-0.25% טריפסין. לדוגמה, הוסיפו 0.001 גרם קולגן ו-0.005 גרם טריפסין ל-2 מ"ל של תמיסת L-15 לתוך כד, הוסיפו מערבל מגנטי קטן וערבבו עד לערבוב מלא. מניחים בצד בטמפרטורת החדר.
- הכינו גיליוטינה שהושגה באופן מסחרי על ידי הנחת מגבות נייר בצד ומתחת לגיליוטינה כדי למזער את החשיפה של הספסל ומשטחים אחרים לדם ולחומרים ביולוגיים אחרים.
- הניחו מספריים גדולים מנירוסטה, מלקחיים גדולים ומספריים קפיציים גדולים. שמור בקבוק תרסיס גדול עם אתנול 70% בהישג יד לניקוי הראש.
- ממלאים של 100 מ"ל בתמיסת L-15 ומניחים על קרח. חמצן את תמיסת L-15.
- הניחו את מספריים הקפיץ, מספריים כירורגיים, מלקחיים, אזמל ופיפטת העברה (ראו טבלת חומרים).
- הכינו צלחת פטרי 60 מ"מ (לדיסקציה ברוטו) ושתי צלחות פטרי 35 מ"מ (לניקוי/דיסקציה עדינה של הגרעינים). מלאו את הכלי בקוטר 60 מ"מ בתמיסת L-15 מחומצנת באמצעות מזרק 30 מ"ל עם קצה מסנן של 0.22 מיקרומטר.
- המתת חסד, ניקוי ראש והמיסקציה
- שקול את הגורים כדי לחשב את המינון המתאים של דילול קטלני פלוס למתן intraperitoneally (~ 0.01 מ"ל לכל 10 גרם).
- ברגע שמגיעים למישור עמוק של הרדמה, כפי שמוערך על ידי חוסר תגובה לצביטת הבוהן, ערפו את ראשו באמצעות הגיליוטינה.
- יש לשטוף את הראש ביסודיות עם אתנול 70% ולאחר מכן ביסודיות עם תמיסת L-15.
- להסיר לחלוטין את העור מן הגולגולת. חתכו את הראש באמצעות מספריים קפיציות גדולות על ידי התחלה בנקודת הכניסה של חוט השדרה למוח וביצוע שני חתכים, הראשון חתך דרך החלק העליון של הגולגולת והשני דרך החלק התחתון של הלסת. סיים לחתוך את הראש באמצעות מספריים כירורגיים.
- הניחו את שני חצאי המוח של הראש בצד כלפי מטה בצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ מלאה בתמיסת L-15. הניחו את הרקמה הטרייה שאינה מנותחת כרגע על קרח.
- חילוץ גנגליון שיווי המשקל העליון
- גרפו את המוח בעזרת מספריים כירורגיים סגורים. לנתק ולהסיר את עצב הגולגולת כדי לנתק לחלוטין את המוח מהגולגולת.
הערה: בשלב זה, הקפסולה האופטית (בצורת הספרה 8) אמורה להיות גלויה בחלק האחורי של הראש. - בעזרת מלקחיים ומתחילים בחלק האחורי של הראש, מושכים חומר קרום שקוף.
- חותכים את החלק העליון של הגולגולת החוצה באמצעות מספריים כירורגיים. הסר רקמות עודפות מהחלק האחורי של הראש והצוואר כדי להפוך את אזור הדיסקציה ואת הקפסולה האופטית לנקיים יותר וקלים יותר לגישה.
הערה: הימנע מהפיכת התבשיל לעכור מדי על ידי השלכת רקמות עודפות לאורך כל ההליך. - מעבירים את הרקמה לצלחת פטרי שנייה עם תמיסת L-15 טרייה. אתר את הקפסולה האופטית ואת עצבי שיווי המשקל השמיעתיים, העליונים ועצבי שיווי המשקל הנחותים. חותכים את עצב השמיעה ומפרידים את הגרעינים העליונים והנחותים באמצעות מספריים קפיציים קטנים.
הערה: למרות שהסומטה של עצב שיווי המשקל נמצאת הן בגרעינים הנחותים (הדקים יותר) והן בגרעינים העליונים (העבים יותר), לתאים המופקים מהגנגליון העליון יש הישרדות טובה יותר. - בעזרת אזמל, גלחו בעדינות את הרכס הגרמי כדי להחליש את האזור הגרמי, שמתחתיו העצב צולל לתוך הקפסולה הגרמית. בזהירות להסיר פסולת עם מלקחיים עדינים, לחשוף את כל החלק הנפוח של הגנגליון.
- השתמש במספריים הקפיציים העדינים כדי לגזור ולהפריד את הגנגליון מענף העצבים ההיקפי שצולל לכיוון החדר.
- הסר את הגנגליון העליון באמצעות מלקחיים עדינים, הקפד לא לצבוט קרוב מדי לרקמת הגנגליון. מעבירים לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ עם תמיסת L-15 טרייה.
- לפני שתמשיך, מחממים מראש את תמיסת האנזים: יוצקים את תערובת האנזימים לצלחת פטרי 35 מ"מ ומניחים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
- נקו את הגנגליון בעזרת מלקחיים עדינים ומספריים קפיציים קטנים על ידי הסרת עצם (שנראית לבנה ומגובשת במבנה), רקמה עודפת, סיבי עצב וכל מבנה מיותר אחר. דאג למזער את הסרת כל רקמת גנגליון.
- גרפו את המוח בעזרת מספריים כירורגיים סגורים. לנתק ולהסיר את עצב הגולגולת כדי לנתק לחלוטין את המוח מהגולגולת.
- דיסוציאציה וציפוי רקמות
- מעבירים גרעינים נקיים לתמיסת אנזים שחוממה מראש ומחזירים לאינקובטור למשך 10 עד 40 דקות. הטיפול באנזים מסתיים ברגע שהרקמה מתחילה להתפרק אך נשארת בחתיכה אחת. טיפול יתר ברקמה עם אנזימים יגרום לפירוק מוחלט של הגרעינים לפני הטריטורציה.
הערה: משך הזמן שהרקמה עוברת טיפול אנזימטי תלוי בגיל החיה. לדוגמה, גרעינים מחולדות P9 מטופלים באנזים במשך 25 דקות, וגרעינים מחולדות P15 מטופלים באנזים במשך 35 דקות. - מעבירים את הגרעינים לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ עם תמיסת L-15 טרייה ודגרים למשך 2-3 דקות.
- מעבירים את הגרעינים לצלחת פטרי נוספת בקוטר 35 מ"מ מלאה במצע תרבית מסונן.
- באמצעות מיקרופיפטה של 200 μL, פיפטה טיפה ~ 150 μL של מדיה תרבית מסוננת על צלחת מצופה זכוכית תחתית. אל תוסיפו יותר מדי תמיסה, שכן חשוב לשמור על מתח הפנים כדי ליצור בועה של תמיסה שנשארת מעל כיסוי הזכוכית.
- מעבירים את מספר הגרעינים הרצוי (אחד עד ארבעה) לתלוש הכיסוי.
- ציירו כמות קטנה של מדיום תרבית מצלחת התרבית כדי לשטוף את פיפטת הטיריטורציה עם מדיום כדי למנוע מהרקמה להידבק לדפנות פיפטת הזכוכית. Triturate על ידי בעדינות שוב ושוב להעביר את הרקמה דרך פיפטה עד הגרעינים מנותקים מספיק.
הערה: אין להעמיס יתר על המידה על הרקמה כדי לנסות תרחיפים חד-תאיים או לאפשר לתאים לקרוס לתחתית הצלחת באמצעות לחץ חיובי מוגזם. כמו כן, הימנעו מיצירת בועות אוויר, מכיוון שזה יפחית את הישרדות התא. טריטורציה עדינה היא המפתח להשגת הישרדות מוצלחת של תאים. - תנו לתאים לנוח במשך 5 דקות. בדוק תחת מיקרוסקופ אור כדי לראות אם התאים התיישבו על הכיסוי.
- מניחים בזהירות צלחת תרבות לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך 12-24 שעות. שוב, הקפידו לשמור על בועת התמיסה שלמה.
הערה: בעת טיפוח במשך יותר מ-24 שעות, רענן את מדיית התרבות מדי יום. זו יכולה להיות נקודת הפסקה אפשרית.
- מעבירים גרעינים נקיים לתמיסת אנזים שחוממה מראש ומחזירים לאינקובטור למשך 10 עד 40 דקות. הטיפול באנזים מסתיים ברגע שהרקמה מתחילה להתפרק אך נשארת בחתיכה אחת. טיפול יתר ברקמה עם אנזימים יגרום לפירוק מוחלט של הגרעינים לפני הטריטורציה.
- ציפוי SGNs
- בצע את שלבים 4.2.1 עד 4.2.5 של הוראות גנגליון שיווי המשקל כדי לחתוך את הראש.
- אתרו את הקפסולה האופטית (בצורת הספרה 8), וחלצו מהגולגולת על ידי חיתוך הקצוות באמצעות מלקחיים קהים.
- שנה את פתרון L-15. החלק הספירלי של הקפסולה האופטית מאכלס את השבלול עם האיבר של קורטי. יש לכרסם בעצם שמעל סיבובי השבלול מבלי לפגוע ברקמה שמתחתיה, בעזרת מלקחיים עדינים המקבילים לעקומת העצם.
- לאחר שהוסרה מספיק עצם כדי לחשוף את מלוא היקף סיבובי השבלול, השתמש במספריים קפיציים קטנים כדי לקטוע את המודיולוס (רקמה סיבית, עבה, לבנה וסיבית המכילה אקסונים מרכזיים של SGNs) בבסיס השבלול כדי לשחרר אותו משאר הקפסולה האוטית.
- הסר את הסטריה וסקולריס על ידי צביטת הסטריה בבסיס עם מלקחיים עדינים. הירגעו סביב הספירלה ועד לקודקוד כדי לקלף אותה ללא האיבר של קורטי.
- חותכים את האיבר של קורטי לשניים או שלושה סיבובים באמצעות מספריים קפיציים קטנים כך שהוא מונח שטוח.
- הבלו את modiolus מכל סיבוב עם מספריים קפיץ קטן.
- הסר את הגנגליון הספירלי על ידי חיתוך בקצה המקום שבו סיבי SGN מקרינים לכיוון תאי השערה.
- נקו את הגנגליון באמצעות מלקחיים עדינים על ידי הסרת עצם (שנראית לבנה ומגובשת במבנה), המודיולוס (שנראה לבן וסיבי) וכל מבנה מיותר אחר. דאג למזער את הסרת כל רקמת גנגליון.
- בצע את אותו הליך כמו לטיפול אנזימטי בגנגליון הספירלי כפי שהוא משמש לגנגליון שיווי המשקל בסעיף 4.4. זמנים אנזימטיים הם בדרך כלל קצרים יותר בגנגליון הספירלי, שהוא מוארך יותר מהגנגליון הווסטיבולרי. השתמש פיפטות טריטורציה בקוטר קטן יותר עבור גנגליון ספירלי בהשוואה גנגליון שיווי המשקל.
- Triturate גנגליון ספירלי במדיום תרבית בתוספת N2 ו B27, מצוין במתכון עבור מדיה תרבותית.
- מניחים את צלחת התרבית המכילה את הגרעינים המנותקים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 12-24 שעות.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
5. הקלטה
הערה: בהליך זה, הקלטות מהדק טלאי מהגנגליון המבודד מבוצעות בדרך כלל 12-24 שעות לאחר הציפוי. מעבדות אחרות דיווחו על תוצאות של תאי עצב לאחר תקופות ארוכות הרבה יותר בתרבית10.
- הכנת תא ההקלטה
- השתמש בתא ההקלטה להחלפה מהירה (או שווה ערך) המאפשר הקלטות מהדק טלאים ישירות בצלחת התרבית. הגדר את החדר על המיקרוסקופ ההפוך.
- הכניסו את צלחות התרבית בעלות תחתית הזכוכית לתוך התא.
- הזינו את תמיסת L-15 דרך מערכת צינורות זילוח לתא ההקלטה. לייצב את הזלוף פנימה זרימה החוצה בתא בקצב של 0.5-1 מ"ל לדקה.
- הכנת הפתרון הפנימי לטעינת אלקטרודות
- הפשירו אליציטוט של התמיסה הפנימית המחוררת. הקצו 2.5 מ"ל של התמיסה לצלחת תרבית של 35 מ"מ. החליפו את המכסה על מנת התרבית ותייגו כ"מטבל טיפ". הניחו בצד באזור ללא אבק, מכיוון שחשוב מאוד לשמור על פתרון זה נקי ככל האפשר.
- שקול 1 מ"ג של amphotericin-B ולהוסיף 20 μL של dimethyl sulfoxide (DMSO). מערבלים ומסובבים את התמיסה עד שכל האמפוטריצין-B נמצא בתמיסה. הוסף 10 μL של תמיסת DMSO/amphotericin-B ל-2 מ"ל הנותרים של התמיסה הפנימית המחוררת המופשרת. משכו ופזרו את התמיסה עם פיפטה פעמיים או שלוש כדי לוודא שה-DMSO/אמפוטריצין-B התערבב באופן אחיד בתמיסה הפנימית. הפתרון יהיה גוון צהבהב קל.
- ציירו את התמיסה הפנימית המחוררת של אמפוטריצין-B לתוך מזרק של 3 מ"ל. מוסיפים קצה של 34 גרם למזרק. עוטפים את המזרק ברדיד אלומיניום ושומרים את המזרק על קרח.
הערה: תמיסה זו חייבת להיות מיוצרת מחדש כל שעתיים כדי להבטיח את היעילות של אמפוטריצין-B בניקוב קרום התא. Amphotericin-B הוא רגיש לאור, והוא חייב להיות מוגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום או שיטות אחרות.
- הקלטות מהדק טלאי
- דמיינו את תאי העצב באמצעות מטרה של 10x או 20x. כוונן את התאורה ומטב את האופטיקה כדי לראות את הגבולות והצללים סביב התא.
- בדוק את איכות הנוירונים המבודדים. נסו רק תאי עצב עם משטחים חלקים ואחידים שאינם מנוגדים חזק מדי ויש להם רק מכתשים קטנים ומפוזרים. כמו כן, הקפידו להימנע מזוגות של נוירונים, תאי עצב המוקפים בפסולת או תאים אחרים.
- תחת הגדלה של פי 100, זהו תא עצב או שדה של תאי עצב כדי לתקן אותם ולסדר אותם במרכז שדה הראייה.
- ממלאים את קצה הפיפטה בתמיסה נקייה שאינה מכילה אמפוטריצין על ידי טבילת הקצה (במשך ~20 שניות) בתמיסה הנקייה שהונחה בצלחת תרבית. פעולה נימית תמשוך כמות קטנה של תמיסה לתוך הקצה.
הערה: בצע שלב זה תחת מיקרוסקופ דיסקציה סטריאופוני, המאפשר לקבוע עד כמה הקצה מחזיק את תמיסת Tip Dip. אם התמיסה אינה מחזיקה ~ 10-20 שניות, צורת האלקטרודה אינה אידיאלית. במקרה זה, הגדר מחדש את תוכנית משיכת האלקטרודות כדי להפיק קצה ארוך יותר. - לאחר מכן, למלא את החלק האחורי של פיפטה עם פתרון פנימי המכיל amphotericin. חוט הלהט בתוך פיפטה ימשוך למטה את התמיסה כדי לפגוש את הפתרון הנקי בקצה. אפשרו לחוט הלהט למשוך את התמיסה בצורה חלקה כלפי מטה, ואל תנסו להקיש על בועות, מכיוון שזה יאלץ את האמפוטריצין לקצה מהר מדי.
- השתמש מזרק כדי לשלוף תמיסה שעשויה להיות בחלק האחורי של האלקטרודה.
הערה: חשוב מאוד לעבוד מהר מנקודה זו ליבשה וליצור אטם בעל עמידות גבוהה על התא הרצוי. - הכנס את פיפטה לתוך מחזיק פיפטה. בדקו שהפיפטה צמודה למחזיק כדי למנוע סחף פיפטה. אם הפיפטה אינה יציבה, כבו את טבעות ה-O האוטמות בחלק הקדמי והאחורי של מחזיק הפיפטה, כדי למזער סחף ולשמור על יניקה חזקה. החליפו את פיפטה עם אחד כי הוא מלא טרי.
- הורידו את הפיפטה לאמבטיה של תא ההקלטה.
- אתר את קצה פיפטה באמצע שדה הראייה. ודאו שהקצה נקי מבועות אוויר או פסולת אחרת.
- החל שלב מתח (5 mV) בבדיקת הממברנה כדי לפקח על התנגדות פיפטה. המשך לעקוב אחר התנגדות הקלט לאורך כל התהליך של יצירת חותם על התא.
- בטל את פוטנציאל היסט הפיפטה, כך שזרם פיפטה קורא אפס במצב בדיקת הממברנה של pClamp.
- נכון עבור קיבול פיפטה באמצעות פונקציית פיצוי הקיבול המהיר במגבר מהדק התיקון (חוגות מהירות Cp בלוח הרך Multiclamp Commander).
- העבר את פיפטה למטה לתא.
- ברגע שהפיפטה קרובה מספיק לתא העצב, עברו למטרת ההגדלה הגבוהה יותר ושלחו את התמונה דרך מצלמה למוניטור (השתמשו במטרה של פי 40, הגדלה כוללת של פי 400). התאימו את פיפטה ומרכזו מחדש את תא העצב.
- הזז את אלקטרודת ההקלטה קרוב לסומה. אתר את מרכז תא העצב על הצג ומקם את אלקטרודת ההקלטה מעל תא העצב.
- התקרבו לתא העצב מלמעלה, כך שהאלקטרודה תנחת במרכז התא הכדורי. כוונן את היסט פיפטה לאפס את פוטנציאלי DC הקבועים במערכת.
- מקם את פיפטה קרוב לממברנה. נוחתים בחוזקה על מרכז התא.
הערה: בעת הנחיתה, תתרחש שקיעה קטנה על פני השטח של תא העצב והכפלה/שילוש של התנגדות הקלט. - יש להפעיל לחץ שלילי (יניקה) באמצעות מזרק או פיפטה בפה. הפעל את פוטנציאל ההחזקה של -60 mV. התנגדות האטם אמורה לגדול עד שהוא עובר ג'יגה-אוהם.
הערה: עבוד במהירות כדי לצמצם את הזמן בין מילוי אלקטרודה לנחיתה על תא. יש זמן מוגבל לפני שהאמפוטריצין שנוסף לתמיסה הפנימית המחוררת בשלב 5.3.5 מגיע לקצה האלקטרודה. ברגע שהקצה מזוהם באמפוטריצין, קשה ליצור אטמים בעלי עמידות גבוהה, וההתנגדות לעיתים קרובות מתיישבת ל~200 מגה-אוהם. - ברגע שנוצר חותם ג'יגה-אוהם, שחררו את הלחץ השלילי. ברגע שהחותם נוצר, החל פיצוי קיבוליות מהיר כדי להפחית את המשרעת של מעברי הקיבול פיפטה במצב בדיקת קרום ככל האפשר.
- כאשר האמפוטריצין מתחיל לעבוד, שימו לב כיצד התנגדות הכניסה פוחתת לאט והזרם הזורם בתגובה לשלב המתח של 5 mV גדל בהדרגה כאשר האמפוטריצין נכנס לממברנה. ירידה פתאומית בהתנגדות הסדרה במקום התייצבות הדרגתית מצביעה על כך שהתרחש קרע ספונטני.
- הערך את הקיבול של התא כולו ואת התנגדות הסדרה באמצעות פונקציית הביטול הארעי הקיבולי של המגבר. תעד ונטר את התנגדות הסדרה בתחילת הניסוי ובמהלכו באופן קבוע.
הערה: התנגדות הסדרה יכולה להימשך בין 5-20 דקות לייצוב, תלוי בגודל האלקטרודה וכמה תמיסה נקייה נשאבת לתוך הפיפטה. ניתן להשתמש במצבי מהדק מתח ומהדק זרם לאחר שהתנגדות הסדרה התייצבה מתחת ל- 30 מגה-אוהם. נפיחות או התכווצות של הנוירונים במהלך ההקלטה נצפית לפעמים, אך לעתים רחוקות כאשר האוסמולריות וה- pH של הפתרונות מותאמים כראוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפעלת פרוטוקולי מהדק מתח על ידי יישום משפחות של מדרגות מתח חושפת את ההפעלה תלוית המתח של מגוון משפחות זרמים שונות. דוגמאות מייצגות של זרמים של תאים שלמים שהתעוררו מ-VGN והותאמו מהקלטות שפורסמו13 מוצגות באיור 1A,B. הפעלת מתחים דה-פולריזציה (איור 1B) מפעילה זרם פנימי (שלילי לפי המוסכמות) שמופעל ומנוטרל במהירות רבה (איור 1A). זה סטריאוטיפי עבור התכונות מגודרות המתח של תעלות נתרן14,15, אשר בעיקר מניעות את העלייה של פוטנציאלי פעולה16,17. דפולריזציה מפעילה גם זרם חיצוני ארוך טווח ואיטי יחסית המניע את הירידה בפוטנציאל הפעולה. פרמקולוגיה גילתה כי זרמים אלה נישאים בעיקר על ידי מגוון של תעלות אשלגן ב VGNs 3,18,19,20,21.
מתחים היפרפולריזציה עמוקים וארוכי טווח מעוררים זרם פנימי הפועל לאט ונישא על-ידי תעלות HCN (Cyclic Nucleotide Gated Adriatic) המופעלות על-ידי היפרפולריזציה (HCN)22 (איור 1C). ניתן לחקור את ההפעלה של הזרמים האלה באמצעות פרוטוקול זרם הזנב שמוצג באיור 1D. כאן, אחוז ההפעלה של הזרם נבדק על ידי התוויית הזרם הזורם במהלך שלב הזנב (Itail) כפונקציה של מתח ההתניה. לעקומת ההפעלה של מתח זרם יש צורה סיגמואידית (איור 1E). למרות שערוץ זה מגודר על ידי שליחים שניים מסיסים כגון AMP מחזורי (cAMP), עקומות ההפעלה הנמדדות באמצעות תצורת התיקון המחורר יציבות לאורך הקלטה ארוכה. לעומת זאת, הגודל וטווח הפעלת המתח של התעלה משתנים (ככל הנראה עקב שטיפת רכיבים ציטוסוליים) כאשר ההקלטה מתבצעת בתצורת טלאי קרוע.
הגיוון העצבי מומחש על-ידי טווח דפוסי הירי שנוצרים כאשר זרמים מוזרקים לתוך VGNs ו-SGNs שונים (איור 2; למעלה ולמטה, בהתאמה). חלק מתאי העצב יורים רק בתחילת ההזרקה הנוכחית, בעוד שאחרים יורים מספר פעמים. הטרוגניות זו משקפת גיוון בסיסי בהרכב תעלות הנתרן והאשלגן הבסיסיות הן ב-VGNs והן ב-SGNs 23,24,25.
איור 1: דוגמאות לפרוטוקולי מהדק-מתח למדידת קבוצות מגוונות של זרמים יוניים. (A,B) זרמים לדוגמה של תאים שלמים (A) המושרים על-ידי משפחה של מדרגות מתח (B). זרמי הנתרן נטו פנימה (זרמים שליליים) מזוהים כאן על ידי ההפעלה וההשבתה הארעית שלהם (מסומנים כחץ, Na+). הזרמים החיצוניים נטו (המסומנים כחץ, K+, זרמים חיוביים ארוכי טווח) נישאים בעיקר על ידי יוני אשלגן ויש להם קינטיקה של שפעול ונטרול איטיים בהרבה מאשר זרמי נתרן. (ג,ד) זרמי HCN מופעלים על ידי משפחה של מתחים היפרפולריים ארוכי טווח. (ה,ו) יציבות אפיון תעלת היונים בטלאי המחורר בנקודות זמן שונות במהלך ההקלטה. עקומות ההפעלה תלויות המתח של זרמי HCN נמדדו בתצורת טלאי מחורר I. עקומות הפעלה של זרמי HCN במהלך תצורת טלאי קרוע (F). תמונות C-F שונו מ-13. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דפוסי ירי מגוונים מתעוררים על-ידי הזרקת זרמים. (A) דפוסי ירי בחמש סומטות גנגליון שיווי משקל. (B) דפוסי ירי בחמישה SGNs. (C) השלבים הנוכחיים המתאימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטות המוצגות כאן הן ספציפיות להקלטות מתאי עצב מבודדים; מחקרים קודמים התמקדו בהקלטות ממסופי אקסון בהכנה שלמה למחצה. בהשוואה לטכניקות הקלטה טרמינליות קיימות, הקלטות מבודדות מציעות התנהגות מעולה של מהדק חלל ופוטנציאל איזו. בנוסף, פרוטוקול זה מספק גישה למדגם רחב יותר של נוירונים, שכן רק תת-אוכלוסיות נושאות קליקס נגישות בהקלטות שלמות למחצה של אפיתל שיווי המשקל. לבסוף, הקלטות מבודדות מאפשרות שימוש בטכניקת המדבקה המחוררת, המונעת הפרעה בסביבה התוך-תאית שלעתים קרובות נקטעת על ידי הדיאליזה בין התמיסה התוך-תאית לבין הציטוזול ברישומי טלאי קרוע.
הקלטות מוצלחות מסתמכות קודם כל על איכות הסומטה המבודדת והתרבותית. שלב קריטי בהישרדות התא הוא הכוח הנדרש במהלך הטריטורציה כדי לייצר את תאי העצב המבודדים. יד עדינה חיונית להישרדות התא. פיפטות טריטורציה צריכות להיות ממוקמות גבוה בבועה של תמיסת L-15 כדי למנוע גירוש בכוח של נוירונים לתחתית המנה. אם מתעוררות בעיות של הישרדות תאים, יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע היווצרות בועות אוויר או לשבור את בועת התמיסה, מה שמונע מהתאים המנותקים להתיישב על הכיסוי. כמו כן, עדיף שיהיו פיפטות טריטורציה מלוטשות בחום זמינות במגוון גדלים, כך שלחוקרים תהיה הגמישות לבחור אחת בקוטר כך שהגנגליון יחווה התנגדות קלה כשהוא עובר דרך הפיפטה. ליטוש בחום של הפיפטות מפחית את הנזק הנגרם על ידי העברת הגנגליון על קצוות מחוספסים של זכוכית. השארת קצה מחוספס עשויה להיראות בתחילה יעילה יותר בפירוק הגרעינים, אך גישה זו פוגעת בסומטה ומפחיתה את ההישרדות לאחר התקופה בתרבית. עצה אחרונה היא לשמור בקנאות על פיפטת טריטורציה מוצלחת.
גורם נוסף שהוא קריטי להישרדות התא הוא משך הטיפול באנזימים מעכלים. בעת קביעת זמן האנזים, החוקרים צריכים להתאים בזהירות את הזמן כדי להבטיח שהרקמה מתפרקת היטב, אך לא עד כדי השפעה על הישרדות התא. אנו מוצאים כי ההשפעה של טיפול אנזימטי על הישרדות התא ותכונות תעלת היונים היא מינימלית, שכן נתונים שנאספו מתאים שטופלו באנזימים נראים עקביים עם שיטות אחרות שאינן מסתמכות על גישה זו19,26. למרות שטיפול אנזימטי ממזער את הכוח הדרוש לטריטראט, הוא מגיע עם המגבלה שעיכול אנזימטי (במיוחד המבוסס על טריפסין בלבד או פפאין) ידוע כגורם נזק לתעלות יונים27. לכן, למרות שאנו ממליצים על כמה הנחיות לתזמון האנזים בהתאם לגיל החיה, עדיף להיות מוכנים להתאים את הזמן בהתבסס על התוצאות. לבסוף, אנו מעודדים גישה של "פחות זה יותר" לטריטורציה. משמעות הדבר היא התנגדות לדחף ליצור תרחיף חד-תאי ועצירת טריטורציה לאחר שלושה או ארבעה מעברים, גם אם נותרו כמה גושים גדולים של רקמה.
יתרון של תרבית הוא שנראה שהיא מנקה את קרום התא הסומטי ומעודדת נשירה של תאי גליה יוצרי מיאלין, מה שמאפשר הידוק טלאים מוצלח יותר מהנוירונים. לפיכך, הכנת גנגליון מבודד ומתורבת שימושית במיוחד להארכת הקלטות מהדק טלאי מעבר לשבוע הראשון שלאחר הלידה, ולאחר מכן גופי התא מכוסים בהדרגה במיאלין, מה שמעכב את אלקטרודת המדבק. פעילות תעלות היונים שנצפתה ברישומי מהדק טלאי מ-VGNs מבודדים פלוס קצרי טווח בתרבית (<24 שעות) מעבר לשבוע השני שלאחר הלידה עקבית עם שינויים אזוריים ומתמטיים בביטוי תעלות יונים שנצפו על ידי אימונוהיסטוכימיה והקלטות ישירות ממסופי קליקס באפיתל שיווי משקל28,29. עם זאת, יש לציין כי תרבית ממושכת בסיוע גורמים נוירוטרופיים ואנטיביוטיקה עשויה להשפיע גם על תעלות יונים 30,31,32,33,34. כל יישום של טכניקות אלה חייב לשקול בזהירות את ההשפעה של גורמים אלה על הביופיזיקה הבסיסית של הנוירונים ותעלות היונים שלהם30,31,32,33,34.
באופן כללי, רישומי מהדק טלאי מסומאטה מבודדת ומתורבתת מתאימים לחקר השונות בתכונות תעלת היונים של נוירונים באוזן הפנימית. היציבות ארוכת הטווח של תצורת הטלאי המחורר מתאימה במיוחד לחקר תעלות יונים כגון HCN, שתכונות ההפעלה שלהן נתונות לאפנון באמצעות שליחים ציטוסוליים שניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר ג'ינג בינג שו וד"ר רות אן אטוק על תרומתן המוקדמת לשיטות אלה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH NIDCD R03 DC012652 ו- NIH NIDCD DC012653S, ו- R01 DC0155512 ל- RK ו- T32 DC009975 ל- DB, NN ו- KR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | For perforated patch recordings. |
| ATP di-sodium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additive to internal solution |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | additive to culture medium, for SGN |
| Beakers (1000, 100, 10) milliliter | |||
| bench-top centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
| Bunsen burner | |||
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Additive to internal solution |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
| DMSO | Biotium | 90082 | |
| Dnase I,from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 11284932001 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Dumont #3 Forceps (Blunt) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont #55 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additive to internal solution |
| Electrode Puller | Narashige | PC-10 | |
| Epi-illumination light source | Zeiss | CL 1500 ECO | |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | for cleaning head and around dissection bench |
| Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
| Fine-edged dissection blade | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Glass Pasteur Pipettes | VWR | 14673-010 | to pull trituration pipettes |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | additive to culture medium |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | for pH buffering all solutions in protocol |
| Hot plate / magnetic stirrers | VWR | 76549-914 | |
| Insulated bucket filled with ice | to keep all samples and solutions cool | ||
| K2SO4, Potassium Sulfate | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additive to internal solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additive to internal solution |
| KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | To bring internal solution to desired pH. |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 14133-13 | |
| Leibovitz medium | Sigma Aldrich | L4386 | dissection and bath solutions |
| Low-profile-bath recording chamber for culture dishes | Warner Instruments | 64-0236 | |
| luer-lok syringes, 30 ml | BD | 302832 | for drawing L-15/HEPES/HEPES solution. |
| MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | base of the culture medium |
| MgCl2-Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M1028 | Additive to internal solution |
| microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
| Microforge | Narashige | MF-90 | For electrode polishing. |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | additiive to culture medium, for SGN |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additive to internal solution |
| NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | for titration pH |
| Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
| Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing | USC Material Management | MEDOX200 (Identifier: 00015) | for dissolving into dissection and bath solutions |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| Pasteur pipette bulb (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | bulb for trituration pipettes |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | additive to prevent contamination of culture medium |
| Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) | MWI Animal Health | 15199 | for euthanasia |
| PES membrane filters , 0.2 micrometer | Nalgene | 566-0020 | for filtering solutions |
| PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | for filtering solutions drawn into syringes |
| Petri dishes, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration |
| Petri Dishes, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | for gross dissection |
| pH Meter | Mettler Toledo | Model S20 | |
| Pipettors (1000, 200, 10) microliter | USA Scientific | ||
| Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish | Mattek | P35GC-0-10-C | to plate neurons for culture |
| Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes | Warner Instruments | 64-0375 | |
| Reference Cell | World Precision Instruments | RC1T | |
| Scalpel blade | Miltex | 4-315 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| Serological Pipettes (10, 25) milliliter | Fisher Scientific | ||
| Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) | Warner Instruments | 64-0378 | |
| Small Animal Guillotine | Kent Scientific | DCAP | |
| Small animal guillotine | Kent Scientific | DCAP | for decapitation if dissecting rats older than P15. |
| Stereo Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Straight surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Syringe (3, 10, 30) milliliter | |||
| Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Tuberculin syringe | Covidien | 8881500105 | for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection |
| Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Volumetric flask, 1000 milliliter | |||
| Vortex | VWR | 945300 | |
| Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |
References
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Goldberg, J. M. Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways. Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).
- Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons. Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).
- Smith, C. E., Goldberg, J. M. A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents. Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).
- Berglund, A. M., Ryugo, D. K. Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse. The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).
- Jagger, D. J., Housley, G. D. Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice. Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).
- Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro). The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).
- Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).
- Mo, Z. L., Davis, R. L. Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).
- Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).
- Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse. Journal of Visualized Experiments. (48), e2442 (2010).
- Bronson, D., Kalluri, R. Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo. The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).
- Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons. Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).
- Bean, B. P. The action potential in mammalian central neurons. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).
- Izhikevich, E. M. Dynamical Systems in Neuroscience. , MIT Press. (2018).
- Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons. Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).
- Risner, J. R., Holt, J. R. Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).
- Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).
- Cervantes, B., Vega, R., Limón, A., Soto, E. Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons. Neuroscience. 240, 163-175 (2013).
- Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function. Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).
- Davis, R. L., Crozier, R. A. Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons. Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).
- Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery. Hearing Research. 336, 1-16 (2016).
- Eatock, R. A., Christov, F. Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear. , Elsevier. (2020).
- Kalluri, R. Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 710275 (2021).
- Armstrong, C. E., Roberts, W. M. Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).
- Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia. Brain Research. 1139, 117-125 (2007).
- Meredith, F. L., Rennie, K. J. Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals. Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).
- Cai, H. Q., et al. Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics. Hearing Research. 350, 122-132 (2017).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).
- Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).
- Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3. The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).
- Liu, X. -P., et al. Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents. Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).
