Summary
Her præsenteres metoder, der giver detaljerede instruktioner til dissekering, dissociering, dyrkning og patch-clamp-optagelse fra vestibulær ganglion og spiralganglionneuroner i det indre øre.
Abstract
Den kompakte morfologi af isolerede og dyrkede ganglionneuroner i det indre øre muliggør detaljerede karakteriseringer af ionkanalerne og neurotransmitterreceptorerne, der bidrager til cellediversitet på tværs af denne population. Denne protokol skitserer de trin, der er nødvendige for vellykket dissekering, dissociering og kortvarig dyrkning af somata af bipolære neuroner i det indre øre med henblik på patch-clamp-optagelser. Detaljerede instruktioner til fremstilling af vestibulære ganglionneuroner er forsynet med de nødvendige modifikationer, der er nødvendige til plettering af spiralganglionneuroner. Protokollen indeholder instruktioner til udførelse af helcelle patch-clamp-optagelser i perforeret patch-konfigurationen. Eksempelresultater, der karakteriserer spændingsklemmeoptagelserne af hyperpolariseringsaktiverede cykliske nukleotid-gated (HCN)-medierede strømme, fremhæver stabiliteten af perforeret patch-optagelseskonfiguration sammenlignet med den mere standard ruptured-patch-konfiguration. Kombinationen af disse metoder, isolerede somata plus perforerede patch-clamp-optagelser, kan bruges til at studere cellulære processer, der kræver lange, stabile optagelser og bevarelse af intracellulært miljø, såsom signalering gennem G-proteinkoblede receptorer.
Introduction
De bipolære neuroner i vestibulocochlear nerven forbinder de sensoriske hårceller i det indre øre til hjernestammen. De er de vigtigste bærere af information om lyd og hovedbevægelser; Skader på disse vigtige celler fører til døvhed og balanceforstyrrelser. De vestibulære og auditive dele af nerven består hver især af forskellige celletyper, der er morfologisk og funktionelt forskellige 1,2. I det vestibulære system skyder to afferente subpopulationer spontant med intervaller, der enten er regelmæssige eller uregelmæssige2. Afferent spike timing menes at afspejle en underliggende mangfoldighed i ionkanalsammensætning 3,4. I det auditive system er der to hovedunderpopulationer af spiralganglionneuroner (SGN'er); Mens type I SGN'er kommer i kontakt med individuelle indre hårceller5, kommer type II SGN'er i kontakt med flere ydre hårceller5. In vitro-optagelser fra semiintakte og organotypiske kulturer tyder på forskelle i membranegenskaberne af type I og type II SGN 6,7.
Mange ionkanaler og neurotransmitterreceptorer, der findes ved terminalerne af disse neuroner, findes også i deres cellelegemer. Som sådan kan kulturer af den isolerede vestibulære og spiralganglionsomata studeres in vitro for at forstå, hvordan ionkanaler og neurotransmitterreceptorer bidrager til responsen af disse neuroner. Den kompakte morfologi af de isolerede cellelegemer muliggør elektriske optagelser af høj kvalitet, der er egnede til detaljeret karakterisering af spændingsstyrede ionkanaler og neurotransmitterreceptorer. Nem adgang til en repræsentativ række neuronundertyper giver mulighed for high-throughput analyse af cellediversitet.
Denne artikel præsenterer en metode til isolering og dyrkning af dissocierede ganglioncellelegemer fra den overordnede del af den vestibulære ganglion hos rotter på postnatal dag (P)9 til P20. Der gives også forslag til udvidelse af disse metoder til spiralganglion ud over de trin, der kræves for vellykket ekstraktion, dissociering og plettering af ganglioncellerne. Disse metoder er en videreudvikling af dem, der er udtænkt i publikationer fra forskellige laboratorier 8,9,10. Også inkluderet i dette papir er vejledning til udvælgelse af sunde celler til patch-clamp optagelser.
Endelig skitserer protokollen proceduren for patch-clamp-optagelse ved hjælp af perforeret patch-konfiguration11. Selvom konfigurationen med perforeret patch er mere tidskrævende og mere teknisk udfordrende end den mere almindelige ruptured-patch-konfiguration, er den bedre til at opretholde det cytoplasmatiske miljø, der giver mulighed for lange og stabile optagelsessessioner. Fordelene ved denne optagelseskonfiguration illustreres her gennem den forbedrede stabilitet af hyperpolarisationsaktiverede kationiske strømme i perforeret patch i forhold til bristede patch-optagelser.
Denne protokol er organiseret i fem sektioner. Afsnit 1-3 beskriver løsninger og værktøjer, der kan forberedes og opbevares på forhånd. Afsnit 4 beskriver trinene til dissekering og plettering af vestibulære og SGN'er. Afsnit 5 beskriver trinene til optagelse fra neuronerne efter en periode i kultur. I vores hænder udføres afsnit 4 og afsnit 5 over en periode på 2 på hinanden følgende dage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al brug af dyr, der er beskrevet her, er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Southern California. Dyr i denne protokol er P3- til P25-alderen Long Evans rotter af begge køn opnået fra Charles River Laboratories, men disse metoder kan anvendes på andre gnaverstammer. En laboratoriefrakke og handsker skal bæres under alle procedurer samt stænkbeskyttende beskyttelsesbriller, når der laves løsninger.
1. Forberedelser
BEMÆRK: De løsninger og værktøjer, der er beskrevet i dette afsnit, kan laves i god tid til brug på dagen for dissektion og optagelse.
- Forbered Liebovitz-medier suppleret med 10 mM HEPES (L-15-opløsning). Følgende trin beskriver fremstilling af 1 L L-15-opløsning.
- 990 ml deioniseretH2Ohældes i ét bægerglas. Mål og tilsæt 2,386 g (10 mM) HEPES. Tilsæt en flaske med 1 liter L-15 opløsningspulver.
BEMÆRK: Pulveriseret L-15 har længere holdbarhed og optager mindre lagerplads. Alternativt kan du købe L-15-opløsning og supplere med HEPES. Sidstnævnte mulighed har også mulighed for at anvende en phenolfri opløsning, som er nyttig til fluorescensbilleddannelse. - Rør opløsningen på en omrøringsplade. Brug en pH-meter til langsomt at tilsætte 1 N natriumhydroxid (NaOH) for at opnå en pH-værdi mellem 7,34 og 7,36.
- Der tilsættes deioniseretH2O, indtil opløsningen når et volumen på 1.000 ml. Opløsningen filtreres ved hjælp af en 0,22 μm porestørrelsesmembran.
BEMÆRK: L-15-opløsningen kan opbevares ved 4 °C i ca. 1-2 uger. Hvis du bruger L-15 lavet med phenolrød, bliver opløsningen lyserød, hvis den er for basisk (pH > 7,4) eller orange, hvis den er for sur (pH < 7,34).
- 990 ml deioniseretH2Ohældes i ét bægerglas. Mål og tilsæt 2,386 g (10 mM) HEPES. Tilsæt en flaske med 1 liter L-15 opløsningspulver.
- Forbered kulturmediet til vestibulære ganglionneuroner (VGN'er) (med modifikation for SGN'er). Følg nedenstående trin for at fremstille 50 ml kulturmedium:
- Tilsæt 47,5 ml GluMAX-I minimum essential medium til et rent glasbægerglas.
- Mål og tilsæt 0,1194 g (10 mM) HEPES. Denne ekstra buffer modstår pH-ændringer, mens cellerne sætter sig, før de flyttes til inkubatoren.
- Tilsæt 2,5 ml føtalt bovint serum (FBS). Dette giver 5% volumen FBS i et samlet volumen på 50 ml medium. Til SGN-præparater erstattes 2,5 ml FBS med 0,5 ml N2 og 1 ml B27-opløsninger.
- Rør opløsningen på en omrøringsplade. Brug en pH-meter til langsomt at tilføje 1 N NaOH for at opnå en pH-værdi mellem 7,38 og 7,4.
- Tilsæt 0,5 ml penicillin-streptomycin. Opløsningen filtreres gennem et 0,22 μm sterilt filter. Opløsningen opbevares ved 4 °C.
- Mindst 30 minutter før brug overføres dyrkningsmediet til en vævskulturkolbe med en ventileret hætte. Kolben med dyrkningsmedier anbringes i en inkubator med 5% CO2 koncentration ved 37 °C.
- Klargør den interne perforerede plasteropløsning
BEMÆRK: Her anvendes 100 ml perforeret plaster intern opløsning til helcelleoptagelse (opskriften er opsummeret i tabel 1). Disse opløsninger kan tilberedes i god tid og opbevares ved -20 °C. Alikvoter kan opbevares på ubestemt tid ved -20 °C, hvis de ikke gennemgår en gentagen cyklus med frysning og optøning.- Op til 6 måneder i forvejen fremstilles og opbevares lageropløsninger af følgende: 1 M KCl, 0,5 M Mg2Cl (hexahydrat) og 0,5 M CaCl2. Opbevares i lufttætte flasker i op til 6 måneder ved 4 °C.
BEMÆRK: Det er en god ide at kontrollere stamopløsningernes osmolalitet (2.000 mOsm for 1 M KCl-stamopløsningen; 1.500 mOsm for Mg2Cl- og CaCl 2-opløsningerne) for at sikre, at målkoncentrationen nås. Må ikke anvendes, hvis opløsningen bliver uklar eller danner bundfald. Dette kan være et muligt pausepunkt.
- Op til 6 måneder i forvejen fremstilles og opbevares lageropløsninger af følgende: 1 M KCl, 0,5 M Mg2Cl (hexahydrat) og 0,5 M CaCl2. Opbevares i lufttætte flasker i op til 6 måneder ved 4 °C.
- På dagen for intern løsningsfremstilling skal du følge nedenstående trin ved hjælp af lageropløsningerne fra trin 1.3.
- Der måles 100 ml milli-Q (MQ)H2O. Der trækkes 40 ml ud af de 100 ml og lægges til side i et rent bægerglas.
- De resterende 60 ml H2O tilsættes et rent og sterilt 100 ml bægerglas. Der tilsættes 2,5 ml 1 M KCl, 1 ml 0,5 M Mg2Cl-hexahydrat og 0,02 ml 0,5 MCaCl2.
- Tilsæt en rørestang og læg bægerglasset på en røreplade. Rør indtil helt opløst. Tilsæt 1.307 g K2SO4. Rør, indtil K2SO4 opløses.
- Vej 0,1192 g HEPES (mål 5 mM i et slutvolumen på 100 ml) og tilsæt til opløsningen. Rør indtil opløst.
BEMÆRK: Sørg for, at alle komponenter er helt opløst, da det nogle gange tager tid for K2SO4 at opløses. - Der afvejes 0,1902 g ethylenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraeddikesyre (EGTA) (mål 5 mM i et slutvolumen på 100 ml) og tilsættes til opløsningen. Da EGTA ikke opløses fuldstændigt i en sur opløsning, anbringes bægerglasset på en omrøringsplade, og pH-sonden indsættes.
- Under omrøring titreres langsomt 1 M KOH, indtil EGTA'en er helt opløst. Forvent at dette sker, når pH er mellem 6 og 7. Fortsæt langsomt med at tilføje KOH, indtil den endelige pH er 7,35 (ca. 1,2 til 1,3 ml KOH i alt).
- Der tilsættes MQH2O for at bringe opløsningen til et slutvolumen på 100 ml og omrøres. Opløsningens osmolalitet kontrolleres (målet er 270 mOsm/kg for opløsningen med perforeret plaster) med et osmometer.
- Den interne perforerede plasteropløsning filtreres ved hjælp af et 0,22 μm sterilt filter. Opbevares i 5 ml alikvoter ved -20 °C. Brug en ny prøve til hver ny optagelsessession.
BEMÆRK: Dette kan være et muligt pausepunkt.
2. Fremstilling af triturationspipetter
BEMÆRK: Triturationspipetter kan genbruges til flere eksperimenter. Skyl pipetterne med ethanol, vand og L-15-opløsning før hver brug, og rengør dem med vand og ethanol efter hver brug. Opbevar forsigtigt mellem brug.
- For at forberede triturationspipetter til celledissociation skal du holde en glaspasteurpipette til flammen på en bunsenbrænder. Når glasspidsen begynder at smelte, strækkes glasset ud til den ønskede spidsdiameter. Træk den ene ende af pipetten væk fra flammen for at skabe en lille bøjning.
- Bring den bøjede pipette tæt på et mikroskop. Brug en scoringsflise til at score og bryde glasset med den ønskede diameter.
- Før pipettens spids over toppen af Bunsen-brænderflammen. Dette vil hurtigt polere de ru kanter nær spidsen. Kontroller, at spidsen ikke er forseglet af flammen.
- Gentag processen, indtil fire eller fem pipetter er fremstillet i forskellige størrelser.
3. Fremstilling af patchpipetter
BEMÆRK: Forbered et sæt plasterpipetter før optagelsessessionen, men efter gangliondissektion og kultur. Selvom elektroder, der fremstilles en ad gangen under optagelsessessionen, er optimale i ydeevne, er der opnået rimelig succes, når disse fremstilles som et parti natten før. Opbevar pipetterne i en overdækket glasbeholder for at beskytte spidserne mod støv.
- Brug en lodret elektrodetrækker og 1,5 mm udvendig diameter/1,17 mm filamenterede borosilikatglaspipetter med indvendig diameter. Sørg for, at glasset altid holdes fri for støv og fingeraftryk.
- Træk 8-10 optagepipetter ved hjælp af et totrinsprogram, som anbefalet til patchpipetter af producenten.
- Undersøg og varmepoler hver optagepipettespids med en mikrosmedje; Varmepolering fremmer bedre tætning. Målpipettemodstanden er mellem 4 og 8 MΩ.
- Opbevar de polerede pipetter i en overdækket beholder. Dette kan behandles som et pausepunkt i eksperimentet.
BEMÆRK: Optimering af pipettediameteren for at nå målmodstandsområdet kræver nogle forsøg og fejl med trin 3.2 og 3.3. De fleste kommercielle patch-clamp-systemer har en indbygget membrantestfunktion til måling af elektrodemodstanden i badopløsningen. Modstanden beregnes som et forhold mellem steady-state udgangsstrømmen som reaktion på en påført 5 mV trinstimulus. Trækindstillingerne i trin 3.1 og poleringen i trin 3.2 skal først justeres ved hjælp af prøvepipetter, indtil prøvepipetternes modstand falder inden for området 4 til 8 MΩ. - På optagelsesdagen skal du belægge pipettespidserne for at reducere pipettens kapacitans og optagestøj. For at gøre dette skal du pakke en lille strimmel paraffinfilm på pipettens skaft. Det er ikke nødvendigt at pakke helt til spidsen.
BEMÆRK: En alternativ strategi er at belægge og varmesætte en silikoneelastomer på pipettens skaft12.
4. Ekstraktion af vestibulær ganglion og plating af vestibulære neuroner
- Forberedelse til dissektion
- Forbered en enzymblanding af L-15-opløsning med 0,05% kollagenase og 0,25% trypsin. For eksempel tilsættes 0,001 g kollagenase og 0,005 g trypsin til 2 ml L-15-opløsning i et bægerglas, tilsæt en lille magnetisk omrører og rør, indtil den er helt blandet. Sæt til side ved stuetemperatur.
- Forbered en kommercielt fremstillet guillotin ved at placere papirhåndklæder til siden og under guillotinen for at minimere eksponering af bordpladen og andre overflader for blod og andre biologiske materialer.
- Læg en saks i stort rustfrit stål, en pincet og en stor fjedersaks ud. Opbevar en stor sprayflaske med 70% ethanol praktisk til hovedrengøring.
- Fyld et 100 ml bægerglas med L-15-opløsning og læg det på is. Oxygener L-15-opløsningen.
- Læg fjedersaksen, operationssaksen, pincetten, skalpellen og overførselspipetten ud (se materialetabel).
- Forbered en 60 mm petriskål (til grov dissektion) og to 35 mm petriskåle (til rengøring/fin dissektion af ganglierne). Fyld 60 mm skålen med iltet L-15 opløsning ved hjælp af en 30 ml sprøjte med en 0,22 μm filterspids.
- Aflivning, hovedrensning og hemisektion
- Vej hvalpene for at beregne den passende dosis af dødelig plus fortynding til administration intraperitonealt (~ 0,01 ml pr. 10 g).
- Når et dybt anæstesiplan er nået, vurderet ved manglende respons på tåklemmen, halshugges ved hjælp af guillotinen.
- Skyl hovedet grundigt med 70% ethanol og derefter grundigt med L-15-opløsning.
- Fjern huden helt fra kraniet. Skær hovedet ved hjælp af en stor fjedersaks ved at starte ved rygmarvens indgangspunkt til hjernen og lave to snit, det første snit gennem toppen af kraniet og det andet gennem bunden af kæben. Afslut gennemskæring af hovedet ved hjælp af kirurgisk saks.
- Placer begge halvdele af hovedhjernesiden nedad i en 60 mm petriskål fyldt med L-15-opløsning. Anbring det friske væv, der ikke i øjeblikket dissekeres, på is.
- Udtrækning af den overlegne vestibulære ganglion
- Øs hjernen ud ved hjælp af lukket kirurgisk saks. Afbryd og fjern kranienerven for helt at løsne hjernen fra kraniet.
BEMÆRK: På dette tidspunkt skal den otiske kapsel (formet som tallet 8) være synlig bag på hovedet. - Brug tang og start bag på hovedet, træk klart membranøst materiale af.
- Klip toppen af kraniet ud ved hjælp af kirurgisk saks. Fjern overskydende væv fra bagsiden af hoved og nakke for at gøre dissektionsområdet og otisk kapsel renere og lettere at få adgang til.
BEMÆRK: Undgå at gøre skålen for uklar ved at kassere overskydende væv under hele proceduren. - Overfør vævet til en anden petriskål med frisk L-15-opløsning. Find den otiske kapsel og de auditive, overlegne vestibulære og ringere vestibulære nerver. Skær den auditive nerve væk og adskil de overlegne og ringere ganglier ved hjælp af en lille fjedersaks.
BEMÆRK: Selvom somata af den vestibulære nerve findes i både de ringere (tyndere) og overlegne (tykkere) ganglier, har celler ekstraheret fra den overlegne ganglion bedre overlevelse. - Brug en skalpel til forsigtigt at barbere den benede ryg af for at svække det benede område, hvorunder nerven dykker ned i knoglekapslen. Fjern forsigtigt snavs med fine tang, og udsæt hele den hævede del af ganglionen.
- Brug den fine fjedersaks til at klippe og adskille ganglionen fra den perifere nervegren, der dykker mod utricleen.
- Fjern den overlegne ganglion ved hjælp af fine tang, og sørg for ikke at klemme for tæt på ganglionvævet. Overfør til en 35 mm petriskål med frisk L-15-opløsning.
- Før du fortsætter, forvarm enzymopløsningen: hæld enzymblandingen i en 35 mm petriskål og læg den i en 37 °C inkubator i 10-15 min.
- Rens ganglionen ved hjælp af fine tang og små fjedersaks ved at fjerne knogle (som ser hvid og krystalliseret ud i struktur), overskydende væv, nervefibre og andre overflødige strukturer. Pas på at minimere fjernelsen af ganglionisk væv.
- Øs hjernen ud ved hjælp af lukket kirurgisk saks. Afbryd og fjern kranienerven for helt at løsne hjernen fra kraniet.
- Vævsdissociation og plettering
- Overfør rensede ganglier til den forvarmede enzymopløsning og læg den tilbage i inkubatoren i 10 til 40 minutter. Enzymbehandling er afsluttet, når vævet begynder at bryde fra hinanden, men forbliver i ét stykke. Overbehandling af vævet med enzymer vil resultere i fuldstændig opløsning af ganglierne før trituration.
BEMÆRK: Den tid, vævet gennemgår enzymatisk behandling, afhænger af dyrets alder. For eksempel behandles ganglier fra P9-rotter med enzym i 25 min, og ganglier fra P15-rotter behandles med enzym i 35 min. - Overfør ganglierne til 35 mm petriskålen med frisk L-15-opløsning og inkuber i 2-3 min.
- Overfør ganglierne til en anden 35 mm petriskål fyldt med filtrerede kulturmedier.
- Brug en 200 μL mikropipette til at pipette en ~150 μL dråbe filtrerede dyrkningsmedier på en belagt skål med glasbund. Tilsæt ikke for meget opløsning, da det er vigtigt at opretholde overfladespændingen for at danne en boble af opløsning, der forbliver over glasdækslet.
- Overfør det ønskede antal ganglier (en til fire) til dæksedlen.
- Træk en lille mængde dyrkningsmedium ud af kulturskålen for at skylle triturationspipetten med medium for at forhindre, at vævet klæber til siderne af glaspipetten. Triturere ved forsigtigt og gentagne gange at føre vævet gennem pipetten, indtil ganglierne er tilstrækkeligt dissocierede.
BEMÆRK: Overanstreng ikke vævet for at forsøge enkeltcellesuspensioner eller lad cellerne styrte ned til bunden af skålen ved hjælp af for stort positivt tryk. Undgå også at danne luftbobler, da dette vil reducere celleoverlevelsen. Blid trituration er nøglen til at opnå vellykket celleoverlevelse. - Lad cellerne hvile i 5 min. Kontroller under et lysmikroskop for at se, om cellerne har lagt sig på dæksedlen.
- Anbring forsigtigt en kulturskål i en 37 °C inkubator i 12-24 timer. Igen skal du sørge for at holde boblen af opløsning intakt.
BEMÆRK: Ved dyrkning i mere end 24 timer skal du opdatere kulturmediet dagligt. Dette kan være et muligt pausepunkt.
- Overfør rensede ganglier til den forvarmede enzymopløsning og læg den tilbage i inkubatoren i 10 til 40 minutter. Enzymbehandling er afsluttet, når vævet begynder at bryde fra hinanden, men forbliver i ét stykke. Overbehandling af vævet med enzymer vil resultere i fuldstændig opløsning af ganglierne før trituration.
- Plettering SGN'er
- Følg trin 4.2.1 til 4.2.5 i vestibulære ganglioninstruktioner for at skære hovedet.
- Find den otiske kapsel (formet som tallet 8), og ekstrakt fra kraniet ved at skære væk i kanterne ved hjælp af stump tang.
- Skift L-15-opløsningen. Den spiralformede del af den otiske kapsel huser cochlea med Corti-organet. Chip væk ved knoglen overliggende cochlear drejninger uden at beskadige det underliggende væv, med fine tang parallelt med knoglens kurve.
- Når der er fjernet nok knogle til at afsløre det fulde omfang af cochlear drejninger, skal du bruge en lille fjedersaks til at skære modiolus (tykt, hvidt, fibrøst væv indeholdende centrale axoner af SGN'er) i bunden af cochlea for at frigøre det fra resten af den otiske kapsel.
- Fjern stria vaskularis ved at klemme stria i bunden med fine tang. Slap af rundt om spiralen og op til toppen for at skrælle den fri af Corti-organet.
- Skær Corti-orgelet i to eller tre omdrejninger ved hjælp af en lille fjedersaks, så den ligger fladt.
- Skær modiolus fra hver tur med en lille fjedersaks.
- Fjern spiralganglionen ved at skære i kanten af, hvor SGN-fiberkanaler projicerer mod hårcellerne.
- Rens ganglion ved hjælp af fine tang ved at fjerne knogle (som fremstår hvid og krystalliseret i struktur), modiolus (som fremstår hvid og fibrøs) og andre overflødige strukturer. Pas på at minimere fjernelsen af ganglionisk væv.
- Følg samme procedure som ved enzymatisk behandling af spiralganglion som anvendt til vestibulær ganglion i pkt. 4.4. Enzymatiske tider er typisk kortere i spiralganglionen, som er mere langstrakt end den vestibulære ganglion. Brug triturationspipetter med mindre diameter til spiralganglionen sammenlignet med den vestibulære ganglion.
- Triturere spiralganglionen i kulturmedium suppleret med N2 og B27, angivet i opskriften på kulturmedier.
- Kulturskålen indeholdende de dissocierede ganglier anbringes i en 5% CO2 -inkubator på 37 °C i 12-24 timer.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
5. Optagelse
BEMÆRK: I denne procedure udføres patch-clamp-optagelser fra den isolerede ganglion typisk 12-24 timer efter pletteringen. Andre laboratorier har rapporteret resultater fra neuroner efter meget længere perioder i kultur10.
- Klargør optagelseskammeret
- Brug hurtigudskiftningsoptagelseskammeret (eller tilsvarende), der giver mulighed for patch-clamp-optagelser direkte i kulturskålen. Opsæt kammeret på det omvendte mikroskop.
- Indsæt glasbundskulturskålene i kammeret.
- Før L-15-opløsningen gennem et perfusionsrørsystem til optagekammeret. Stabiliser perfusionen ind- og udstrømning i kammeret med en hastighed på 0,5-1 ml pr. Minut.
- Forbered den interne opløsning til ilægning af elektroder
- Optø en delprøve af den perforerede plaster interne opløsning. 2,5 ml af opløsningen fordeles på en 35 mm kulturskål. Sæt låget på kulturskålen på igen, og mærk det som "Tip Dip". Sæt til side i en støvfri zone, da det er meget vigtigt at holde denne løsning så ren som muligt.
- Der afvejes 1 mg amfotericin-B, og der tilsættes 20 μL dimethylsulfoxid (DMSO). Vortex og drej ned opløsningen, indtil al amfitericin-B er i opløsningen. Der tilsættes 10 μL DMSO/amphotericin-B-opløsning til de resterende 2 ml af den optøede interne perforerede plasteropløsning. Udtag og fjern opløsningen med en pipette to eller tre gange for at sikre, at DMSO/amphotericin-B er blandet ensartet i den interne opløsning. Opløsningen vil have en mild-gullig tinge.
- Træk den interne amphotericin-B perforerede plasteropløsning i en 3 ml sprøjte. Tilsæt en 34 G spids til sprøjten. Pak sprøjten ind i aluminiumsfolie og opbevar sprøjten på is.
BEMÆRK: Denne opløsning skal laves om hver 2. time for at sikre effektiviteten af amfotericin-B til perforering af cellemembranen. Amfotericin-B er lysfølsom, og det skal afskærmes mod lys ved hjælp af aluminiumsfolie eller andre metoder.
- Patch-clamp optagelser
- Visualiser neuronerne ved hjælp af et 10x eller 20x mål. Juster belysningen og optimer optikken for at se grænserne og skyggerne omkring cellen.
- Kontroller kvaliteten af de isolerede neuroner. Forsøg kun neuroner med glatte og jævne overflader, der ikke er for stærkt kontrasterede og kun har små, spredte kratere. Sørg også for at undgå par neuroner, neuroner omgivet af snavs eller andre celler.
- Under 100x forstørrelse skal du identificere en neuron eller et felt af neuroner for at lappe og stille dem op i midten af synsfeltet.
- Fyld pipettens spids med en ren opløsning, der ikke indeholder amphotericin, ved at dyppe spidsen (i ~20 s) i den rene opløsning, der blev anbragt i en kulturskål. Kapillær virkning vil trække en lille mængde opløsning ind i spidsen.
BEMÆRK: Udfør dette trin under et stereodissektionsmikroskop, som gør det muligt at bestemme, hvor godt spidsen holder Tip Dip-opløsningen. Hvis opløsningen ikke holder i ~ 10-20 s, er elektrodens form ikke ideel. I dette tilfælde skal du omkonfigurere elektrodetrækningsprogrammet for at producere en længere spids. - Fyld derefter pipettens bagside med den interne opløsning indeholdende amphotericin. Glødetråden i pipetten trækker opløsningen ned for at opfylde den rene opløsning i spidsen. Lad filamentet trække opløsningen jævnt ned, og forsøg ikke at tappe bobler ud, da dette vil tvinge amfotericinet til spidsen for hurtigt.
- Brug en sprøjte til at trække opløsning ud, der kan være helt bag på elektroden.
BEMÆRK: Det er meget vigtigt at arbejde hurtigt fra dette punkt til land og danne en tætning med høj modstand på den ønskede celle. - Sæt pipetten i pipetteholderen. Kontroller, at pipetten sidder tæt i holderen for at forhindre pipetteafdrift. Hvis pipetten ikke er stabil, skal du udskifte O-tætningsringene foran og bag på pipetteholderen for at minimere afdrift og opretholde et kraftigt sug. Udskift pipetten med en, der er nyfyldt.
- Sænk pipetten ned i badet i optagekammeret.
- Find pipettespidsen midt i synsfeltet. Sørg for, at spidsen er fri for luftbobler eller andet snavs.
- Anvend et spændingstrin (5 mV) i membrantesten for at overvåge pipettens modstand. Fortsæt med at overvåge indgangsmodstanden gennem hele processen med at danne en forsegling på cellen.
- Annuller pipettens forskydningspotentiale, således at pipettestrømmen læser nul i membrantesttilstanden for pClamp.
- Korrektion for pipettekapacitansen ved hjælp af funktionen til hurtig kapacitanskompensation på patch-clamp-forstærkeren (Cp fast-dials i Multiclamp Commander-softpanelet).
- Flyt pipetten ned til cellen.
- Når pipetten er tæt nok på neuronen, skal du skifte til det højere forstørrelsesmål og sende billedet gennem et kamera til en skærm (brug et 40x mål, total 400x forstørrelse). Juster pipetten og centrer neuronen igen.
- Flyt optageelektroden tæt på somaen. Find midten af neuronen på skærmen, og placer optageelektroden over neuronen.
- Gå ind i neuronen ovenfra, således at elektroden lander i midten af den sfæriske celle. Juster pipetteforskydningen til nul de konstante DC-potentialer i systemet.
- Placer pipetten tæt på membranen. Land fast på midten af cellen.
BEMÆRK: Ved landing vil der forekomme en lille dimpling på overfladen af neuronen og en fordobling / tredobling af indgangsmodstanden. - Påfør undertryk (sugning) ved hjælp af en sprøjte eller mundpipette. Tænd for holdepotentialet på -60 mV. Tætningsmodstanden skal øges, indtil den passerer en giga-ohm.
BEMÆRK: Arbejd hurtigt for at reducere tiden mellem påfyldning af en elektrode og landing på en celle. Der er et begrænset tidsrum, før amphoterikinet, der tilsættes den perforerede plaster i den interne opløsning i trin 5.3.5, når elektrodespidsen. Når spidsen er forurenet med amfotericin, er det vanskeligt at danne tætninger med høj modstand, og modstanden plateauer ofte til ~ 200 megaohm. - Når der dannes en giga-ohm-tætning, frigøres undertrykket. Så snart forseglingen dannes, påføres hurtig kapacitanskompensation for at reducere amplituden af pipettens kapacitanstransienter i membrantesttilstand så meget som muligt.
- Når amphotericin begynder at arbejde, skal du se, hvordan indgangsmodstanden langsomt falder, og strømmen, der strømmer som reaktion på 5 mV spændingstrinnet, øges gradvist, når amfotericinet kommer ind i membranen. Et pludseligt fald i seriemodstand i stedet for gradvis stabilisering tyder på, at spontan brud har fundet sted.
- Anslå helcellekapacitansen og seriemodstanden ved hjælp af forstærkerens kapacitive transiente nulstillingsfunktion. Dokumentere og overvåge seriemodstanden ved begyndelsen af og regelmæssigt under eksperimentet.
BEMÆRK: Det kan tage alt fra 5-20 minutter at stabilisere seriens modstand, afhængigt af elektrodens størrelse og hvor meget ren opløsning der trækkes ind i pipetten. Spændingsklemme- og strømklemmetilstande kan bruges, når seriemodstanden har stabiliseret sig under 30 megaohm. Hævelse eller krympning af neuronerne under optagelse observeres undertiden, men sjældent, når opløsningernes osmolaritet og pH justeres korrekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kørsel af spændingsklemmeprotokoller ved at anvende familier af spændingstrin afslører den spændingsafhængige aktivering af en række forskellige strømfamilier. Repræsentative eksempler på helcellestrømme fremkaldt fra et VGN og tilpasset fra offentliggjorte optagelser13 er vist i figur 1A,B. Anvendelse af depolariserende spændinger (figur 1B) aktiverer en indadgående strøm (negativ ved konvention), der aktiveres og inaktiveres meget hurtigt (figur 1A). Dette er stereotypt for de spændingsstyrede egenskaber af natriumkanalerne 14,15, som hovedsageligt driver opvandringen af aktionspotentialer16,17. Depolarisering aktiverer også en langvarig og relativt langsomt aktiverende udadgående strøm, der driver nedslaget af et handlingspotentiale. Farmakologi har afsløret, at disse strømme stort set bæres af en række kaliumkanaler i VGNs 3,18,19,20,21.
Dybe, langvarige hyperpolariserende spændinger fremkalder en langsomt aktiverende indadgående strøm, der bæres af hyperpolariseringsaktiverede cykliske nukleotid-gated (HCN) kanaler22 (figur 1C). Aktiveringen af disse strømme kan studeres ved hjælp af halestrømsprotokollen vist i figur 1D. Her undersøges aktiveringsprocenten af strømmen ved at plotte strømmen, der strømmer under haletrinnet (Itail) som en funktion af konditioneringsspændingen. Strømspændingsaktiveringskurven har en sigmoid form (figur 1E). Selvom denne kanal er lukket af opløselige sekundbudbringere, såsom cyklisk AMP (cAMP), er aktiveringskurverne målt ved hjælp af perforeret patch-konfigurationen stabile gennem en lang optagelse. I modsætning hertil ændres kanalens størrelse og spændingsaktiveringsområde (formodentlig på grund af udvaskning af cytosoliske komponenter), når optagelsen foretages i den bristede patchkonfiguration.
Neuronal mangfoldighed illustreres af rækken af fyringsmønstre, der fremkaldes, når strømme injiceres i forskellige VGN'er og SGN'er (figur 2; henholdsvis top og bund). Nogle neuroner fyrer kun ved begyndelsen af den aktuelle injektion, mens andre fyrer flere gange. Denne heterogenitet afspejler en grundlæggende mangfoldighed i sammensætningen af underliggende natrium- og kaliumkanaler i både VGN'er og SGN'er 23,24,25.
Figur 1: Eksempler på spændingsklemmeprotokoller til måling af forskellige grupper af ioniske strømme. (A,B) Eksempel på helcellestrømme (A) induceret af en familie af spændingstrin (B). De indadgående natriumstrømme (negative strømme) identificeres her ved deres forbigående aktivering og inaktivering (mærket pil, Na+). Netto udadgående strømme (mærket pil, K +, langvarige positive strømme) bæres stort set af kaliumioner og har meget langsommere aktivering og inaktiveringskinetik end natriumstrømme. (C,D) HCN-strømme aktiveres af en familie af langvarige hyperpolariserende spændinger. (E,F) Stabilitet af ionkanalkarakterisering i perforeret plaster på forskellige tidspunkter under optagelse. De spændingsafhængige aktiveringskurver for HCN-strømme blev målt i en perforeret patch-konfiguration I. Aktiveringskurver for HCN-strømme under en bristet patch-konfiguration (F). Billeder C-F er blevet ændret fra13. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Forskellige affyringsmønstre fremkaldes ved at injicere strømtrin. (A) Affyringsmønstre i fem vestibulære ganglion somata. (B) Affyringsmønstre i fem SGN'er. (C) Tilsvarende aktuelle trin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder, der præsenteres her, er specifikke for optagelser fra isolerede neuroner; Tidligere undersøgelser har fokuseret på optagelser fra axonterminaler i et semi-intakt præparat. Sammenlignet med eksisterende terminaloptagelsesteknikker tilbyder isolerede optagelser overlegen rumklemme og iso-potentiel adfærd. Derudover giver denne protokol adgang til en bredere prøve af neuroner, da kun calyxbærende subpopulationer er tilgængelige i semi-intakte optagelser af den vestibulære epitel. Endelig giver isolerede optagelser mulighed for anvendelse af perforeret plasterteknik, som forhindrer forstyrrelse af det intracellulære miljø, der ofte afbrydes af dialysen mellem den intracellulære opløsning og cytosol i bristede patchoptagelser.
Vellykkede optagelser afhænger først og fremmest af kvaliteten af den isolerede og kultiverede somata. Et kritisk trin i celleoverlevelse er den kraft, der kræves under trituration for at producere de isolerede neuroner. En blid hånd er afgørende for cellens overlevelse. Triturationspipetter skal placeres højt i boblen af L-15-opløsning for at forhindre kraftig udvisning af neuroner på bunden af skålen. Hvis der opstår problemer med celleoverlevelse, skal der også udvises ekstra omhu for at forhindre dannelse af luftbobler eller ved at bryde opløsningsboblen, hvilket forhindrer de dissocierede celler i at slå sig ned på dæksedlen. Det er også bedst at have varmepolerede triturationspipetter tilgængelige i forskellige størrelser, så undersøgerne har fleksibilitet til at vælge en med en diameter, så ganglionen oplever mild modstand, når den passerer gennem pipetten. Varmepolering af pipetterne reducerer skader forårsaget af at føre ganglion over ru glaskanter. At efterlade en grov kant kan i første omgang synes at være mere effektiv til at bryde ganglierne op, men denne tilgang beskadiger somata og reducerer overlevelsen efter perioden i kultur. Et sidste råd er nidkært at beskytte en vellykket triturationspipette.
En anden faktor, der er kritisk for celleoverlevelse, er varigheden af behandlingen med fordøjende enzymer. Ved bestemmelse af enzymtid skal efterforskere omhyggeligt justere tiden for at sikre, at vævet bryder godt op, men ikke så meget, at det påvirker celleoverlevelsen. Vi finder, at virkningen af enzymatisk behandling på celleoverlevelse og ionkanalegenskaber er minimal, da data indsamlet fra enzymbehandlede celler synes at være i overensstemmelse med andre metoder, der ikke er afhængige af denne tilgang 19,26. Selvom enzymatisk behandling minimerer den kraft, der kræves for at triturere, kommer det med den begrænsning, at enzymatisk fordøjelse (især baseret på trypsin alene eller papain) vides at forårsage skade på ionkanaler27. Selvom vi anbefaler nogle retningslinjer for enzymtiming afhængigt af dyrets alder, er det bedst at være forberedt på at justere tiden baseret på resultaterne. Endelig opfordrer vi til en "less is more"-tilgang til trituration. Dette betyder at modstå trangen til at danne en enkeltcellesuspension og stoppe trituration efter tre eller fire passager, selvom der er flere store klumper væv tilbage.
En fordel ved dyrkning er, at det ser ud til at rense den somatiske cellemembran og fremmer afgivelse af de myelindannende gliaceller, hvilket derefter giver mulighed for mere vellykket patch-clamping fra neuronerne. Således er det isolerede og dyrkede ganglionpræparat især nyttigt til at forlænge patch-clamp-optagelser forbi den 1. postnatale uge, hvorefter cellelegemerne gradvist bliver dækket af myelin, hvilket hæmmer patch-clamp-elektroden. Ionkanalaktivitet observeret i patch-clamp-optagelser fra isolerede plus kortvarigt dyrkede (<24 timer) VGN'er ud over 2. postnatale uge er i overensstemmelse med zonale og modningsmæssige ændringer i ionkanalekspression set ved immunhistokemi og direkte optagelser fra calyxterminaler i vestibulær epitel28,29. Det skal dog bemærkes, at langvarig dyrkning hjulpet af neurotrofiske faktorer og antibiotika også kan påvirke ionkanalerne 30,31,32,33,34. Enhver anvendelse af disse teknikker skal nøje overveje virkningen af disse faktorer på neuronernes underliggende biofysik og deres ionkanaler 30,31,32,33,34.
Samlet set er patch-clamp-optagelser fra isolerede og dyrkede somata velegnede til at studere mangfoldighed i ionkanalegenskaberne hos neuroner i det indre øre. Den langsigtede stabilitet af perforeret patch-konfigurationen er især velegnet til at studere ionkanaler såsom HCN, hvis aktiveringsegenskaber er underlagt modulering via cytosoliske sekundbudbringere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi anerkender Dr. Jing Bing Xue og Ruth Anne Eatock for deres tidlige bidrag til disse metoder. Dette arbejde blev støttet af NIH NIDCD R03 DC012652 og NIH NIDCD DC012653S, og R01 DC0155512 til RK og T32 DC009975 til DB, NN og KR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | For perforated patch recordings. |
| ATP di-sodium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additive to internal solution |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | additive to culture medium, for SGN |
| Beakers (1000, 100, 10) milliliter | |||
| bench-top centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
| Bunsen burner | |||
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Additive to internal solution |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
| DMSO | Biotium | 90082 | |
| Dnase I,from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 11284932001 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Dumont #3 Forceps (Blunt) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont #55 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additive to internal solution |
| Electrode Puller | Narashige | PC-10 | |
| Epi-illumination light source | Zeiss | CL 1500 ECO | |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | for cleaning head and around dissection bench |
| Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
| Fine-edged dissection blade | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Glass Pasteur Pipettes | VWR | 14673-010 | to pull trituration pipettes |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | additive to culture medium |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | for pH buffering all solutions in protocol |
| Hot plate / magnetic stirrers | VWR | 76549-914 | |
| Insulated bucket filled with ice | to keep all samples and solutions cool | ||
| K2SO4, Potassium Sulfate | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additive to internal solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additive to internal solution |
| KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | To bring internal solution to desired pH. |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 14133-13 | |
| Leibovitz medium | Sigma Aldrich | L4386 | dissection and bath solutions |
| Low-profile-bath recording chamber for culture dishes | Warner Instruments | 64-0236 | |
| luer-lok syringes, 30 ml | BD | 302832 | for drawing L-15/HEPES/HEPES solution. |
| MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | base of the culture medium |
| MgCl2-Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M1028 | Additive to internal solution |
| microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
| Microforge | Narashige | MF-90 | For electrode polishing. |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | additiive to culture medium, for SGN |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additive to internal solution |
| NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | for titration pH |
| Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
| Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing | USC Material Management | MEDOX200 (Identifier: 00015) | for dissolving into dissection and bath solutions |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| Pasteur pipette bulb (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | bulb for trituration pipettes |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | additive to prevent contamination of culture medium |
| Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) | MWI Animal Health | 15199 | for euthanasia |
| PES membrane filters , 0.2 micrometer | Nalgene | 566-0020 | for filtering solutions |
| PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | for filtering solutions drawn into syringes |
| Petri dishes, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration |
| Petri Dishes, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | for gross dissection |
| pH Meter | Mettler Toledo | Model S20 | |
| Pipettors (1000, 200, 10) microliter | USA Scientific | ||
| Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish | Mattek | P35GC-0-10-C | to plate neurons for culture |
| Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes | Warner Instruments | 64-0375 | |
| Reference Cell | World Precision Instruments | RC1T | |
| Scalpel blade | Miltex | 4-315 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| Serological Pipettes (10, 25) milliliter | Fisher Scientific | ||
| Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) | Warner Instruments | 64-0378 | |
| Small Animal Guillotine | Kent Scientific | DCAP | |
| Small animal guillotine | Kent Scientific | DCAP | for decapitation if dissecting rats older than P15. |
| Stereo Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Straight surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Syringe (3, 10, 30) milliliter | |||
| Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Tuberculin syringe | Covidien | 8881500105 | for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection |
| Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Volumetric flask, 1000 milliliter | |||
| Vortex | VWR | 945300 | |
| Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |
References
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Goldberg, J. M. Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways. Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).
- Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons. Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).
- Smith, C. E., Goldberg, J. M. A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents. Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).
- Berglund, A. M., Ryugo, D. K. Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse. The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).
- Jagger, D. J., Housley, G. D. Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice. Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).
- Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro). The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).
- Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).
- Mo, Z. L., Davis, R. L. Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).
- Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).
- Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse. Journal of Visualized Experiments. (48), e2442 (2010).
- Bronson, D., Kalluri, R. Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo. The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).
- Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons. Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).
- Bean, B. P. The action potential in mammalian central neurons. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).
- Izhikevich, E. M. Dynamical Systems in Neuroscience. , MIT Press. (2018).
- Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons. Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).
- Risner, J. R., Holt, J. R. Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).
- Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).
- Cervantes, B., Vega, R., Limón, A., Soto, E. Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons. Neuroscience. 240, 163-175 (2013).
- Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function. Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).
- Davis, R. L., Crozier, R. A. Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons. Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).
- Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery. Hearing Research. 336, 1-16 (2016).
- Eatock, R. A., Christov, F. Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear. , Elsevier. (2020).
- Kalluri, R. Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 710275 (2021).
- Armstrong, C. E., Roberts, W. M. Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).
- Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia. Brain Research. 1139, 117-125 (2007).
- Meredith, F. L., Rennie, K. J. Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals. Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).
- Cai, H. Q., et al. Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics. Hearing Research. 350, 122-132 (2017).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).
- Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).
- Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3. The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).
- Liu, X. -P., et al. Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents. Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).
