Summary
Här presenteras metoder som ger detaljerade instruktioner för dissekering, dissociering, odling och patch-clamp-inspelning från vestibulära ganglion- och spiralganglieneuroner i innerörat.
Abstract
Den kompakta morfologin hos isolerade och odlade ganglieneuroner i innerörat möjliggör detaljerade karakteriseringar av jonkanalerna och neurotransmittorreceptorerna som bidrar till celldiversiteten i denna population. Detta protokoll beskriver de steg som krävs för framgångsrik dissekering, dissociering och kortvarig odling av somata i innerörats bipolära neuroner i syfte att patch-clamp inspelningar. Detaljerade instruktioner för beredning av vestibulära ganglieneuroner är försedda med de nödvändiga modifieringar som behövs för plätering av spiralganglieneuroner. Protokollet innehåller instruktioner för att utföra patch-clamp-inspelningar i hela cellen i konfigurationen med perforerad patch. Exempelresultat som karakteriserar spänningskläminspelningar av hyperpolarisationsaktiverade cykliska nukleotidstyrda (HCN)-medierade strömmar belyser stabiliteten hos inspelningskonfigurationen för perforerade fläckar i jämförelse med den mer vanliga konfigurationen med spruckna fläckar. Kombinationen av dessa metoder, isolerade somata plus perforerade-patch-clamp-inspelningar, kan användas för att studera cellulära processer som kräver långa, stabila registreringar och bevarande av intracellulära miljöer, såsom signalering genom G-proteinkopplade receptorer.
Introduction
De bipolära nervcellerna i den vestibulokokleära nerven förbinder de sensoriska hårcellerna i innerörat med hjärnstammen. De är de främsta förmedlarna av information om ljud och huvudrörelser; Skador på dessa viktiga celler leder till dövhet och balansstörningar. De vestibulära och auditiva delarna av nerven består var och en av distinkta celltyper som är morfologiskt och funktionellt olika 1,2. I det vestibulära systemet avfyras två afferenta subpopulationer spontant med intervaller som antingen är regelbundna eller oregelbundna2. Afferent spiktiming tros återspegla en underliggande mångfald i jonkanalssammansättningen 3,4. I hörselsystemet finns det två huvudsakliga subpopulationer av spiralganglieneuroner (SGN); medan SGN av typ I kontaktar enskilda inre hårceller5, kontaktar SGN av typ II flera yttre hårceller5. In vitro-registreringar från semi-intakta och organotypiska kulturer tyder på skillnader i membranegenskaperna hos SGN av typ I och typ II 6,7.
Många jonkanaler och neurotransmittorreceptorer som finns vid terminalerna av dessa neuroner finns också i deras cellkroppar. Som sådan kan kulturer av den isolerade vestibulära och spiralganglion somata studeras in vitro för att förstå hur jonkanaler och neurotransmittorreceptorer bidrar till svaret hos dessa neuroner. Den kompakta morfologin hos de isolerade cellkropparna möjliggör högkvalitativa elektriska inspelningar, lämpliga för detaljerad karakterisering av spänningsstyrda jonkanaler och neurotransmittorreceptorer. Enkel åtkomst till en representativ variation av neuronsubtyper möjliggör analys av celldiversitet med hög genomströmning.
Denna artikel presenterar en metod för att isolera och odla dissocierade gangliecellkroppar från den övre delen av det vestibulära gangliet hos råttor vid postnatal dag (P)9 till P20. Förslag ges också för att utvidga dessa metoder till spiralgangliet, utöver de steg som krävs för att framgångsrikt extrahera, dissociera och plätera gangliecellerna. Dessa metoder är en utveckling av de som utvecklats i publikationer från olika laboratorier 8,9,10. I detta dokument ingår också vägledning för att välja friska celler för patch-clamp-inspelningar.
Slutligen beskriver protokollet proceduren för patch-clamp-inspelning med hjälp av konfigurationen för perforerad patch11. Även om konfigurationen med perforerade plåster är mer tidskrävande och mer tekniskt utmanande än den vanligare konfigurationen med spruckna plåster, är den bättre för att upprätthålla den cytoplasmatiska miljön som möjliggör långa och stabila inspelningssessioner. Fördelarna med denna inspelningskonfiguration illustreras här genom den förbättrade stabiliteten hos hyperpolarisationsaktiverade katjonströmmar i perforerad patch i förhållande till spruckna patchinspelningar.
Detta protokoll är indelat i fem avsnitt. Avsnitt 1-3 beskriver lösningar och verktyg som kan förberedas och lagras i förväg. Avsnitt 4 beskriver stegen för dissekering och plätering av vestibulära och SGN:er. Avsnitt 5 beskriver stegen för registrering från neuronerna efter en period i odling. I våra händer utförs sektion 4 och sektion 5 under en period av 2 på varandra följande dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All användning av djur som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Southern California. Djuren i detta protokoll är P3- till P25-åldrade Long Evans-råttor av båda könen som erhållits från Charles River Laboratories, men dessa metoder kan tillämpas på andra gnagarstammar. Laboratorierock och handskar ska användas vid alla ingrepp, samt stänkskyddsglasögon vid tillverkning.
1. Förberedelser
OBS: Lösningarna och verktygen som beskrivs i detta avsnitt kan göras i god tid för att användas på dagen för dissektion och inspelning.
- Bered Liebovitz media kompletterat med 10 mM HEPES (L-15-lösning). Följande steg beskriver hur man gör 1 L L-15-lösning.
- Häll 990 ml avjoniserad H2O i en bägare. Mät upp och tillsätt 2,386 g (10 mM) HEPES. Tillsätt en flaska med 1 L L-15 lösningspulver.
OBS: Pulveriserad L-15 har längre hållbarhet och tar mindre lagringsutrymme. Alternativt kan du köpa L-15 lösning och komplettera med HEPES. Det senare alternativet har också möjlighet att använda en fenolfri lösning, vilket är användbart för fluorescensavbildning. - Rör om lösningen på en omrörningsplatta. Använd en pH-mätare och tillsätt långsamt 1 N natriumhydroxid (NaOH) för att få ett pH mellan 7,34 och 7,36.
- Tillsätt avjoniserad H2O tills lösningen når en volym på 1 000 ml. Filtrera lösningen med ett membran med en porstorlek på 0,22 μm.
OBS: L-15-lösning kan förvaras vid 4 °C i cirka 1-2 veckor. Om du använder L-15 gjord med fenolröd blir lösningen rosa om den är för basisk (pH > 7,4) eller orange om den är för sur (pH < 7,34).
- Häll 990 ml avjoniserad H2O i en bägare. Mät upp och tillsätt 2,386 g (10 mM) HEPES. Tillsätt en flaska med 1 L L-15 lösningspulver.
- Bered odlingsmediet för vestibulära ganglieneuroner (VGN) (med modifiering för SGN). Följ stegen nedan för att göra 50 ml odlingsmedium:
- Tillsätt 47,5 ml GluMAX-I minimum essential medium till en ren glasbägare.
- Mät upp och tillsätt 0,1194 g (10 mM) HEPES. Denna extra buffert motstår pH-förändringar medan cellerna sätter sig, innan de flyttas till inkubatorn.
- Tillsätt 2,5 ml fetalt bovint serum (FBS). Detta ger 5 volymprocent FBS i en total volym på 50 ml medium. För SGN-preparat ersätts 2,5 ml FBS med 0,5 ml N2 och 1 ml B27-lösningar.
- Rör om lösningen på en omrörningsplatta. Använd en pH-mätare och tillsätt långsamt 1 N NaOH för att få ett pH mellan 7.38 och 7.4.
- Tillsätt 0,5 ml penicillin-streptomycin. Filtrera lösningen genom ett 0,22 μm sterilt filter. Förvara lösningen vid 4 °C.
- Minst 30 minuter före användning överförs odlingsmediet till en vävnadskolv med ventilerad lock. Placera kolven med odlingssubstrat i en inkubator med en CO2-koncentration på 5 % vid 37 °C.
- Bered den perforerade inre lösningen
OBS: Här används 100 ml perforerad intern lösning för registrering av hela cellen (receptet sammanfattas i tabell 1). Dessa lösningar kan beredas i god tid och förvaras vid -20 °C. Alikvoter kan lagras på obestämd tid vid -20 °C om de inte genomgår en upprepad cykel av frysning och upptining.- Upp till 6 månader i förväg, gör och lagra lagerlösningar av följande: 1 M KCl, 0,5 M Mg2Cl (hexahydrat) och 0,5 M CaCl2. Förvaras i lufttäta flaskor i upp till 6 månader vid 4 °C.
OBS: Det är en bra idé att kontrollera stamlösningarnas osmolalitet (2 000 mOsm för stamlösningen på 1 M KCl; 1 500 mOsm för Mg2Cl- och CaCl2-lösningarna ) för att säkerställa att målkoncentrationen uppnås. Använd inte lösningen om den blir grumlig eller bildar utfällningar. Detta kan vara en möjlig pauspunkt.
- Upp till 6 månader i förväg, gör och lagra lagerlösningar av följande: 1 M KCl, 0,5 M Mg2Cl (hexahydrat) och 0,5 M CaCl2. Förvaras i lufttäta flaskor i upp till 6 månader vid 4 °C.
- På dagen för intern lösningstillverkning, följ stegen nedan med hjälp av stamlösningarna från steg 1.3.
- Mät upp 100 ml milli-Q (MQ)H2O. Dra ut 40 ml från 100 ml och lägg åt sidan i en ren bägare.
- Tillsätt de återstående 60 ml H2O till en ren och steril 100 ml bägare. Tillsätt 2,5 ml 1 M KCl, 1 ml 0,5 M Mg2Cl-hexahydrat och 0,02 ml 0,5 M CaCl2.
- Tillsätt en omrörningsstång och placera bägaren på en omrörningsplatta. Rör om tills det är helt upplöst. Tillsätt 1,307 g 2 KSO4. Rör om tills K2SO4 har lösts upp.
- Väg upp 0,1192 g HEPES (mål 5 mM i en 100 ml slutvolym) och tillsätt till lösningen. Rör om tills det är upplöst.
OBS: Se till att alla komponenter är helt upplösta, eftersom det ibland tar tid för K2SO4 att lösas upp. - Väg upp 0,1902 g etylenglykol-bis(β-aminoetyleter)-N,N,N′,N′-tetraättiksyra (EGTA) (mål 5 mM i en slutlig volym på 100 ml) och tillsätt till lösningen. Eftersom EGTA inte löser sig helt i en sur lösning, placera bägaren på en omrörningsplatta och sätt in pH-sonden.
- Under omrörning, titrera långsamt 1 M KOH tills EGTA är helt upplöst. Räkna med att detta sker när pH-värdet är mellan 6 och 7. Fortsätt att långsamt tillsätta KOH tills det slutliga pH-värdet är 7,35 (cirka 1,2 till 1,3 ml KOH totalt).
- Tillsätt MQH2O för att få lösningen till en slutlig volym på 100 ml och rör om. Kontrollera lösningens osmolalitet (mål 270 mOsm/kg för den perforerade lapplösningen) med en osmometer.
- Filtrera den perforerade plåsterlösningen med ett 0,22 μm sterilt filter. Förvaras i 5 ml alikvoter vid -20 °C. Använd en ny alikvot för varje ny inspelningssession.
OBS: Detta kan vara en möjlig pauspunkt.
2. Tillverkning av triturationspipetter
OBS: Triturationspipetter kan återanvändas för flera experiment. Spola pipetterna med etanol, vatten och L-15-lösning före varje användning och rengör dem med vatten och etanol efter varje användning. Förvara försiktigt mellan användningarna.
- För att förbereda triturationspipetter för celldissociation, håll en Pasteur-pipett av glas mot lågan på en bunsenbrännare. När glasspetsen börjar smälta, sträck ut glaset till önskad spetsdiameter. Dra ena änden av pipetten bort från lågan för att skapa en liten böjning.
- För den böjda pipetten nära ett mikroskop. Använd en skåra för att skåra och krossa glaset med önskad diameter.
- För spetsen på pipetten över toppen av Bunsen-brännarens låga. Detta kommer snabbt att polera de grova kanterna nära spetsen. Kontrollera att spetsen inte är förseglad av lågan.
- Upprepa processen tills fyra eller fem pipetter har beretts med varierande storlek.
3. Tillverkning av patchpipetter
OBS: Förbered en uppsättning patchpipetter före inspelningssessionen, men efter gangliondissektion och odling. Även om elektroder som tillverkas en i taget under inspelningssessionen är optimala i prestanda, har rimlig framgång uppnåtts när dessa görs som en sats kvällen innan. Förvara pipetterna i en täckt glasbehållare för att skydda spetsarna från damm.
- Använd en vertikal elektrodavdragare och 1.5 mm ytterdiameter/1.17 mm innerdiameter filament glaspipetter. Se till att glaset alltid hålls fritt från damm och fingeravtryck.
- Dra 8-10 inspelningspipetter med ett tvåstegsprogram, som rekommenderas för patchpipetter av tillverkaren.
- Inspektera och värmepolera varje inspelningspipettspets med en mikrosmedja; Värmepolering främjar bättre tätning. Målpipettresistansen är mellan 4 och 8 MΩ.
- Förvara de polerade pipetterna i en täckt behållare. Detta kan behandlas som en pauspunkt i experimentet.
OBS: Att optimera pipettdiametern för att nå målmotståndsområdet kräver en del försök och misstag med steg 3.2 och 3.3. De flesta kommersiella patch-clamp-system har en inbyggd membrantestfunktion för att mäta elektrodresistansen i badlösningen. Resistansen beräknas som ett förhållande mellan den stationära utgångsströmmen som svar på en applicerad 5 mV stegstimulus. Draginställningarna i steg 3.1 och poleringen i steg 3.2 måste först justeras med provpipetter, tills provpipetternas motstånd faller inom intervallet 4 till 8 MΩ. - På inspelningsdagen, belägg pipettspetsarna för att minska pipettkapacitansen och inspelningsbruset. För att göra det, linda en liten remsa paraffinfilm på pipettens skaft. Det är inte nödvändigt att linda hela vägen till spetsen.
OBS: En alternativ strategi är att belägga och värmehärda en silikonelastomer på pipettensskaft 12.
4. Extraktion av vestibulära ganglion och plätering av vestibulära nervceller
- Förberedelse för dissektion
- Bered en enzymblandning av L-15-lösning med 0,05 % kollagenas och 0,25 % trypsin. Tillsätt till exempel 0,001 g kollagenas och 0,005 g trypsin till 2 ml L-15-lösning i en bägare, tillsätt en liten magnetomrörare och rör om tills den är helt blandad. Ställ åt sidan i rumstemperatur.
- Förbered en kommersiellt framställd giljotin genom att placera pappershanddukar på sidan och under giljotinen för att minimera exponeringen av bänkskivan och andra ytor för blod och andra biologiska material.
- Lägg ut stora saxar i rostfritt stål, stora pincetter och stora fjädersaxar. Ha en stor sprayflaska med 70 % etanol till hands för huvudrengöring.
- Fyll en 100 ml bägare med L-15-lösning och lägg på is. Syresätt L-15-lösningen.
- Lägg ut fjädersaxen, operationssaxen, pincetten, skalpellen och överföringspipetten (se materialförteckning).
- Förbered en 60 mm petriskål (för grov dissektion) och två 35 mm petriskålar (för rengöring/findissektion av ganglierna). Fyll 60 mm skålen med syresatt L-15-lösning med en 30 ml spruta med en 0,22 μm filterspets.
- Avlivning, huvudrengöring och hemisektion
- Väg ungarna för att beräkna lämplig dos av fatal-plus-utspädning för intraperitonealt administrering (~0,01 ml per 10 g).
- När ett djupt anestesiplan har nåtts, vilket bedöms av bristande respons på tånypan, halshuggs du med giljotinen.
- Skölj huvudet noggrant med 70 % etanol och sedan noggrant med L-15-lösning.
- Ta bort huden helt från skallen. Dela huvudet i två delar med en stor fjädersax genom att börja vid ryggmärgens ingångspunkt till hjärnan och göra två snitt, det första skär genom toppen av skallen och det andra genom undersidan av käken. Avsluta med att dela huvudet med en kirurgisk sax.
- Placera båda halvorna av huvudet med hjärnsidan nedåt i en 60 mm petriskål fylld med L-15-lösning. Lägg den färska vävnaden som för närvarande inte dissekeras på is.
- Extraktion av det övre vestibulära gangliet
- Skopa ut hjärnan med en stängd kirurgisk sax. Skär av och ta bort kranialnerven för att helt lossa hjärnan från skallen.
OBS: Vid denna tidpunkt bör öronkapseln (formad som siffran 8) vara synlig på baksidan av huvudet. - Använd en pincett och börja på baksidan av huvudet och dra av klart membranmaterial.
- Klipp ut toppen av skallen med en kirurgisk sax. Ta bort överflödig vävnad från bakhuvudet och nacken för att göra dissektionsområdet och öronkapseln renare och lättare att komma åt.
OBS: Undvik att göra skålen för grumlig genom att kassera överflödig vävnad under hela proceduren. - Överför vävnaden till en annan petriskål med färsk L-15-lösning. Lokalisera öronkapseln och de auditiva, övre vestibulära och nedre vestibulära nerverna. Klipp bort hörselnerven och separera de övre och nedre ganglierna med hjälp av en liten fjädersax.
OBS: Även om somata i vestibulära nerven finns i både de nedre (tunnare) och övre (tjockare) ganglierna, har celler extraherade från det övre gangliet bättre överlevnad. - Använd en skalpell och raka försiktigt bort den beniga åsen för att försvaga det beniga området, under vilket nerven dyker in i den beniga kapseln. Ta försiktigt bort skräp med en fin pincett och exponera hela den svullna delen av ganglionet.
- Använd den fina fjädersaxen för att klippa och separera gangliet från den perifera nervgrenen som dyker mot utrikeln.
- Ta bort det övre gangliet med en fin pincett och se till att inte klämma för nära ganglievävnaden. Överför till en 35 mm petriskål med färsk L-15-lösning.
- Förvärm enzymlösningen innan du fortsätter: häll enzymblandningen i en 35 mm petriskål och ställ i en 37 °C inkubator i 10-15 minuter.
- Rengör gangliet med en fin pincett och en liten fjädersax genom att ta bort ben (som ser vitt och kristalliserat ut), överflödig vävnad, nervfibrer och andra överflödiga strukturer. Var noga med att minimera avlägsnandet av ganglievävnad.
- Skopa ut hjärnan med en stängd kirurgisk sax. Skär av och ta bort kranialnerven för att helt lossa hjärnan från skallen.
- Dissociation och plätering av vävnad
- Överför rengjorda ganglier till den förvärmda enzymlösningen och lägg tillbaka den i inkubatorn i 10 till 40 minuter. Enzymbehandlingen är klar när vävnaden börjar brytas sönder men förblir i ett stycke. Överbehandling av vävnaden med enzymer kommer att resultera i fullständig upplösning av ganglierna före triturering.
OBS: Hur lång tid vävnaden genomgår enzymatisk behandling beror på djurets ålder. Till exempel behandlas ganglier från P9-råttor med enzym i 25 minuter och ganglier från P15-råttor behandlas med enzym i 35 minuter. - Överför ganglierna till 35 mm petriskålen med färsk L-15-lösning och inkubera i 2-3 min.
- Överför ganglierna till en annan 35 mm petriskål fylld med filtrerade odlingssubstrat.
- Använd en 200 μL mikropipett och pipettera en ~150 μL droppe filtrerat odlingsmedium på en belagd glasbotten. Tillsätt inte för mycket lösning, eftersom det är viktigt att bibehålla ytspänningen för att bilda en bubbla av lösning som finns kvar över glastäcket.
- Överför önskat antal ganglier (en till fyra) till täckglaset.
- Dra en liten mängd odlingsmedium från odlingsskålen för att skölja triturationspipetten med medium för att förhindra att vävnaden fastnar på glaspipettens sidor. Triturera genom att försiktigt och upprepade gånger föra vävnaden genom pipetten tills ganglierna är tillräckligt dissocierade.
OBS: Överansträng inte vävnaden för att försöka med encellssuspensioner eller låt cellerna krascha till botten av skålen med överdrivet övertryck. Undvik också att bilda luftbubblor, eftersom detta kommer att minska cellöverlevnaden. Skonsam triturering är nyckeln till att uppnå framgångsrik cellöverlevnad. - Låt cellerna vila i 5 min. Kontrollera under ett ljusmikroskop om cellerna har lagt sig på täckglaset.
- Ställ försiktigt en odlingsskål i en 37 °C inkubator i 12-24 timmar. Återigen, se till att hålla bubblan av lösning intakt.
OBS: När du odlar längre än 24 timmar, uppdatera odlingsmediet dagligen. Detta kan vara en möjlig pauspunkt.
- Överför rengjorda ganglier till den förvärmda enzymlösningen och lägg tillbaka den i inkubatorn i 10 till 40 minuter. Enzymbehandlingen är klar när vävnaden börjar brytas sönder men förblir i ett stycke. Överbehandling av vävnaden med enzymer kommer att resultera i fullständig upplösning av ganglierna före triturering.
- Plätering av SGN
- Följ steg 4.2.1 till 4.2.5 i instruktionerna för vestibulära ganglioner för att dela huvudet.
- Leta reda på öronkapseln (formad som siffran 8) och extrahera från skallen genom att hacka bort kanterna med en trubbig pincett.
- Byt L-15-lösning. I den spiralformade delen av öronkapseln finns snäckan med Cortis organ. Slipa bort benet som ligger ovanför cochleans vridningar utan att skada den underliggande vävnaden, med en fin pincett som är parallell med benets kurva.
- När tillräckligt med ben har avlägsnats för att avslöja den fulla omfattningen av cochleans svängar, använd en liten fjädersax för att skära av modiolus (tjock, vit, fibrös vävnad som innehåller centrala axoner av SGN) vid basen av cochlean för att frigöra den från resten av otickapseln.
- Ta bort stria vascularis genom att nypa ihop stria vid basen med en fin pincett. Varva ner runt spiralen och upp till spetsen för att dra loss den från Corti-organet.
- Klipp Cortis organ i två eller tre varv med en liten fjädersax så att det ligger platt.
- Skär ut modiolus från varje varv med en liten fjädersax.
- Ta bort spiralgangliet genom att skära i kanten av där SGN-fiberkanalerna skjuter ut mot hårcellerna.
- Rengör gangliet med en fin pincett genom att ta bort ben (som verkar vitt och kristalliserat i strukturen), modiolus (som verkar vitt och fibröst) och alla andra överflödiga strukturer. Var noga med att minimera avlägsnandet av ganglievävnad.
- Följ samma procedur som för enzymatisk behandling av spiralgangliet som användes för vestibulärt gangli i avsnitt 4.4. Enzymatiska tider är vanligtvis kortare i spiralgangliet, som är mer långsträckt än det vestibulära gangliet. Använd triturationspipetter med mindre diameter för spiralgangliet jämfört med det vestibulära gangliet.
- Triturera spiralgangliet i odlingsmedium kompletterat med N2 och B27, som anges i receptet för odlingsmedier.
- Placera odlingsskålen som innehåller de dissocierade ganglierna i en 37 °C, 5 % CO2 inkubator i 12-24 timmar.
OBS: Protokollet kan pausas här.
5. Inspelning
OBS: I denna procedur utförs patch-clamp inspelningar från det isolerade gangliet utförs vanligtvis 12-24 timmar efter pläteringen. Andra laboratorier har rapporterat resultat från neuroner efter mycket längre perioder i odling10.
- Förbered inspelningskammaren
- Använd den snabba inspelningskammaren (eller motsvarande) som möjliggör patch-clamp-inspelningar direkt i odlingsskålen. Ställ upp kammaren på det inverterade mikroskopet.
- Sätt in odlingsskålarna med glasbotten i kammaren.
- Mata L-15-lösningen genom ett perfusionsslangsystem till registreringskammaren. Stabilisera perfusionens inflöde och utflöde i kammaren med en hastighet av 0,5-1 ml per minut.
- Förbered den interna lösningen för laddning av elektroder
- Tina en alikvot av den perforerade lappens inre lösning. Fördela 2,5 ml av lösningen på en 35 mm odlingsform. Sätt tillbaka locket på odlingsskålen och märk som "Tip Dip". Ställ åt sidan i en dammfri zon, eftersom det är mycket viktigt att hålla denna lösning så ren som möjligt.
- Väg upp 1 mg amfotericin-B och tillsätt 20 μl dimetylsulfoxid (DMSO). Virvla och snurra ner lösningen tills allt amfotericin-B finns i lösningen. Tillsätt 10 μl DMSO/amfotericin-B-lösningen till de återstående 2 ml av den upptinade inre lösningen med perforerad plåster. Dra upp och skingra lösningen med en pipett två eller tre gånger för att säkerställa att DMSO/amfotericin-B har blandats jämnt i den interna lösningen. Lösningen kommer att ha en mild-gulaktig nyans.
- Dra upp den perforerade inre lösningen av amfotericin-B i en 3 ml spruta. Tillsätt en spets på 34 G i sprutan. Linda in sprutan i aluminiumfolie och förvara sprutan på is.
OBS: Denna lösning måste beredas var 2:e timme för att säkerställa effektiviteten av amfotericin-B vid perforering av cellmembranet. Amfotericin-B är ljuskänsligt och måste skyddas från ljus med hjälp av aluminiumfolie eller andra metoder.
- Patch-clamp-inspelningar
- Visualisera neuronerna med ett 10x eller 20x mål. Justera belysningen och optimera optiken för att se gränser och skuggor runt cellen.
- Kontrollera kvaliteten på de isolerade neuronerna. Försök bara med neuroner med släta och jämna ytor som inte är alltför starkt kontrasterade och som bara har små, spridda kratrar. Se också till att undvika par av neuroner, neuroner omgivna av skräp eller andra celler.
- Under 100x förstoring, identifiera en neuron eller ett fält av neuroner för att lappa och rada upp dem i mitten av synfältet.
- Fyll spetsen på pipetten med en ren lösning som inte innehåller amfotericin genom att doppa spetsen (i ~20 s) i den rena lösningen som placerades i en odlingsskål. Kapillärverkan kommer att dra in en liten mängd lösning i spetsen.
OBS: Utför detta steg under ett stereodissektionsmikroskop, vilket gör det möjligt att bestämma hur väl spetsen håller Tip Dip-lösningen. Om lösningen inte håller i ~10-20 s är elektrodens form inte idealisk. Konfigurera i så fall om elektroddragningsprogrammet för att producera en längre spets. - Fyll sedan baksidan av pipetten med den inre lösningen som innehåller amfotericin. Filamentet i pipetten kommer att dra ner lösningen för att möta den rena lösningen i spetsen. Låt filamentet smidigt dra ner lösningen och försök inte knacka ut bubblor, eftersom detta kommer att tvinga amfotericinet till spetsen för snabbt.
- Använd en spruta för att dra ut lösningen som kan sitta längst bak på elektroden.
OBS: Det är mycket viktigt att arbeta snabbt från denna punkt till landning och bilda en tätning med hög resistans på önskad cell. - Sätt in pipetten i pipetthållaren. Kontrollera att pipetten sitter tätt i hållaren för att förhindra att pipetten glider. Om pipetten inte är stabil, byt ut de tätande O-ringarna fram och bak på pipetthållaren för att minimera avdrift och bibehålla starkt sug. Byt ut pipetten mot en som är nyfylld.
- Sänk ner pipetten i inspelningskammarens bad.
- Leta reda på pipettspetsen i mitten av synfältet. Se till att spetsen är fri från luftbubblor eller annat skräp.
- Applicera ett spänningssteg (5 mV) i membrantestet för att övervaka pipettresistansen. Fortsätt att övervaka ingångsmotståndet genom hela processen med att bilda en tätning på cellen.
- Avbryt pipettens offsetpotential, så att pipettströmmen visar noll i membrantestläget för pClamp.
- Korrigera för pipettkapacitansen med hjälp av snabbkapacitanskompensationsfunktionen på patch-clamp amplifier (Cp snabbrattar i Multiclamp Commander softpanel).
- Flytta pipetten ner till cellen.
- När pipetten är tillräckligt nära neuronen, byt till det högre förstoringsobjektivet och skicka bilden genom en kamera till en bildskärm (använd ett 40x objektiv, totalt 400x förstoring). Justera pipetten och centrera neuronen igen.
- Flytta registreringselektroden nära soma. Leta reda på mitten av neuronen på monitorn och placera inspelningselektroden ovanför neuronen.
- Närma dig neuronen ovanifrån, så att elektroden landar i mitten av den sfäriska cellen. Justera pipettförskjutningen för att nollställa de konstanta DC-potentialerna i systemet.
- Placera pipetten nära membranet. Landa stadigt på mitten av cellen.
OBS: Vid landning kommer en liten grop på neuronens yta och en fördubbling/tredubbling av ingångsmotståndet att inträffa. - Applicera undertryck (sug) med en spruta eller munpipett. Slå på hållpotentialen på -60 mV. Tätningsmotståndet bör öka tills det passerar en giga-ohm.
OBS: Arbeta snabbt för att minska tiden mellan att en elektrod fylls och landar på en cell. Det tar en begränsad tid innan amfotericin som tillsätts till den perforerade plåsterlösningen i steg 5.3.5 når elektrodspetsen. När spetsen väl är förorenad med amfotericin är det svårt att bilda tätningar med hög resistans, och motståndet planar ofta ut till ~200 megaohm. - När en giga-ohm-tätning bildas, släpp undertrycket. Så snart tätningen bildas, applicera snabbkapacitanskompensation för att minska amplituden för pipettkapacitanstransienterna i membrantestläge så mycket som möjligt.
- När amfotericin börjar verka, se hur ingångsresistansen långsamt minskar och strömmen som flyter som svar på 5 mV spänningssteget gradvis ökar när amfotericinet kommer in i membranet. En plötslig minskning av seriemotståndet i stället för en gradvis stabilisering tyder på att spontant brott har inträffat.
- Uppskatta helcellskapacitansen och serieresistansen med hjälp av förstärkarens kapacitiva transienta nollfunktion. Dokumentera och övervaka serieresistansen i början av, och regelbundet under, experimentet.
OBS: Serieresistansen kan ta allt från 5-20 minuter att stabilisera, beroende på elektrodens storlek och hur mycket ren lösning som dras in i pipetten. Spännings- och strömtängningslägen kan användas när serieresistansen har stabiliserats under 30 megaohm. Svullnad eller krympning av neuronerna under inspelning observeras ibland, men sällan när osmolariteten och pH hos lösningarna är korrekt justerade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att köra spännings-clamp-protokoll genom att tillämpa familjer av spänningssteg avslöjar den spänningsberoende aktiveringen av en mängd olika strömfamiljer. Representativa exempel på helcellsströmmar framkallade från ett VGN och anpassade från publicerade registreringar13 visas i figur 1A,B. Genom att applicera depolariserande spänningar (figur 1B) aktiveras en inåtström (negativ enligt konvention) som aktiveras och inaktiveras mycket snabbt (figur 1A). Detta är stereotypt för de spänningsstyrda egenskaperna hos natriumkanalerna14,15, som huvudsakligen driver uppslaget av aktionspotentialer16,17. Depolarisering aktiverar också en långvarig och relativt långsamt aktiverande utåtriktad ström som driver nedåtslaget av en aktionspotential. Farmakologi har visat att dessa strömmar till stor del bärs av en mängd olika kaliumkanaler i VGN 3,18,19,20,21.
Djupa, långvariga hyperpolariserande spänningar framkallar en långsamt aktiverande inåtgående ström som bärs av hyperpolarisationsaktiverade cykliska nukleotidstyrda (HCN) kanaler22 (figur 1C). Aktiveringen av dessa strömmar kan studeras med hjälp av svansströmsprotokollet som visas i figur 1D. Här sonderas aktiveringsprocenten för strömmen genom att plotta strömmen som flyter under svanssteget (Itail) som en funktion av konditioneringsspänningen. Aktiveringskurvan för ström och spänning har en sigmoidal form (figur 1E). Även om denna kanal är låst av lösliga andra budbärare som cyklisk AMP (cAMP), är aktiveringskurvorna som mäts med den perforerade patchkonfigurationen stabila under en lång inspelning. Däremot ändras kanalens storlek och spänningsaktiveringsområde (förmodligen på grund av urtvättning av cytosoliska komponenter) när inspelningen görs i den spruckna patchkonfigurationen.
Neuronal diversitet illustreras av de olika avfyrningsmönster som framkallas när strömmar injiceras i olika VGN och SGN (figur 2; överst respektive nederst). Vissa neuroner avfyras endast i början av ströminjektionen, medan andra avfyras flera gånger. Denna heterogenitet återspeglar en grundläggande mångfald i sammansättningen av underliggande natrium- och kaliumkanaler i både VGN och SGN 23,24,25.
Figur 1: Exempel på spänningstångsprotokoll för mätning av olika grupper av jonströmmar. (A,B) Exempel på helcellsströmmar (A) inducerade av en familj av spänningssteg (B). De inåtgående nettonatriumströmmarna (negativa strömmar) identifieras här genom deras transienta aktivering och inaktivering (märkt pil, Na+). De utgående nettoströmmarna (märkta pil, K+, långvariga positiva strömmar) bärs till stor del av kaliumjoner och har mycket långsammare aktiverings- och inaktiveringskinetik än natriumströmmar. (C,D) HCN-strömmar aktiveras av en familj av långvariga hyperpolariserande spänningar. (E,F) Stabilitet för jonkanalskarakterisering i den perforerade fläcken vid olika tidpunkter under inspelningen. De spänningsberoende aktiveringskurvorna för HCN-strömmar mättes i en perforerad patchkonfiguration I. Aktiveringskurvor för HCN-strömmar under en sprucken patchkonfiguration (F). Bilderna C-F har ändrats från13. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Olika avfyrningsmönster framkallas genom att injicera strömmande steg. (A) Avfyrningsmönster i fem vestibulära ganglion somata. (B) Avfyrningsmönster i fem SGN. (C) Motsvarande strömsteg. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoderna som presenteras här är specifika för inspelningar från isolerade neuroner; Tidigare studier har fokuserat på inspelningar från Axon-terminaler i en semi-intakt preparation. Jämfört med befintliga terminalinspelningstekniker erbjuder isolerade inspelningar överlägset rymdkläm- och isopotentialbeteende. Dessutom ger detta protokoll tillgång till ett bredare urval av neuroner, eftersom endast foderbärande subpopulationer är tillgängliga i semi-intakta registreringar av de vestibulära epitelerna. Slutligen möjliggör isolerade registreringar användning av perforerad plåsterteknik, vilket förhindrar störningar i den intracellulära miljön som ofta avbryts av dialys mellan den intracellulära lösningen och cytosolen vid inspelningar av spruckna plåster.
Lyckade inspelningar är först och främst beroende av kvaliteten på den isolerade och kultiverade somata. Ett kritiskt steg i cellöverlevnad är den kraft som krävs under trituration för att producera de isolerade nervcellerna. En varsam hand är avgörande för cellernas överlevnad. Triturationspipetter bör placeras högt upp i bubblan av L-15-lösning för att förhindra att neuroner med kraft stöts ut på botten av skålen. Om problem med cellöverlevnad uppstår bör extra försiktighet också iakttas för att förhindra att luftbubblor bildas eller att bubblan av lösning bryts, vilket förhindrar att de dissocierade cellerna sätter sig på täckglaset. Det är också bäst att ha värmepolerade triturationspipetter tillgängliga i en mängd olika storlekar, så att utredarna har flexibiliteten att välja en med en diameter så att gangliet upplever milt motstånd när det passerar genom pipetten. Värmepolering av pipetterna minskar skador som orsakas av att gangliet passerar över grova glaskanter. Att lämna en grov kant kan till en början tyckas vara mer effektivt för att bryta upp ganglierna, men detta tillvägagångssätt skadar somata och minskar överlevnaden efter odlingsperioden. Ett sista råd är att svartsjukt skydda en framgångsrik triturationspipett.
En annan faktor som är avgörande för cellöverlevnad är behandlingstiden med matsmältningsenzymer. Vid bestämning av enzymtiden måste utredarna noggrant justera tiden för att säkerställa att vävnaden bryts upp väl, men inte så mycket att det påverkar cellens överlevnad. Vi finner att effekten av enzymatisk behandling på cellöverlevnad och jonkanalsegenskaper är minimal, eftersom data som samlats in från enzymbehandlade celler verkar överensstämma med andra metoder som inte förlitar sig på detta tillvägagångssätt 19,26. Även om enzymatisk behandling minimerar den kraft som krävs för att triturera, kommer den med begränsningen att enzymatisk matsmältning (särskilt baserad på trypsin ensam eller papain) är känd för att orsaka skador på jonkanaler27. Således, även om vi rekommenderar vissa riktlinjer för enzymtiming beroende på djurets ålder, är det bäst att vara beredd att justera tiden baserat på resultaten. Slutligen uppmuntrar vi en "less is more"-inställning till trituration. Detta innebär att motstå frestelsen att bilda en encellssuspension och stoppa tritureringen efter tre eller fyra pass, även om det finns flera stora bitar av vävnad kvar.
En fördel med odling är att den verkar rengöra det somatiska cellmembranet och främjar utsöndring av de myelinbildande gliacellerna, vilket sedan möjliggör mer framgångsrik patch-clamping från neuronerna. Således är det isolerade och odlade gangliepreparatet särskilt användbart för att förlänga patch-clamp-inspelningar efter den 1:a postnatala veckan, varefter cellkropparna gradvis täcks med myelin, vilket hindrar patch-clamp-elektroden. Jonkanalsaktivitet observerad i patch-clamp-inspelningar från isolerade plus kortvarigt odlade (<24 timmar) VGN efter den 2:a postnatala veckan överensstämmer med zonala och mognadsförändringar i jonkanaluttryck som ses av immunhistokemi och direkta registreringar från foderterminaler i vestibulär epitel28,29. Det bör dock noteras att långvarig odling med hjälp av neurotrofiska faktorer och antibiotika också kan påverka jonkanalerna 30,31,32,33,34. Varje tillämpning av dessa tekniker måste noggrant överväga effekten av dessa faktorer på den underliggande biofysiken hos neuronerna och deras jonkanaler 30,31,32,33,34.
Sammantaget är patch-clamp-inspelningar från isolerade och odlade somata lämpliga för att studera mångfalden i jonkanalsegenskaperna hos nervceller i innerörat. Den långsiktiga stabiliteten hos den perforerade patchkonfigurationen är särskilt lämplig för att studera jonkanaler som HCN, vars aktiveringsegenskaper är föremål för modulering via cytosoliska andra budbärare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte föreligger några intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Jing Bing Xue och Ruth Anne Eatock för deras tidiga bidrag till dessa metoder. Detta arbete stöddes av NIH NIDCD R03 DC012652 och NIH NIDCD DC012653S, och R01 DC0155512 till RK och T32 DC009975 till DB, NN och KR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | For perforated patch recordings. |
| ATP di-sodium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additive to internal solution |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | additive to culture medium, for SGN |
| Beakers (1000, 100, 10) milliliter | |||
| bench-top centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
| Bunsen burner | |||
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Additive to internal solution |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
| DMSO | Biotium | 90082 | |
| Dnase I,from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 11284932001 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Dumont #3 Forceps (Blunt) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont #55 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additive to internal solution |
| Electrode Puller | Narashige | PC-10 | |
| Epi-illumination light source | Zeiss | CL 1500 ECO | |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | for cleaning head and around dissection bench |
| Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
| Fine-edged dissection blade | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Glass Pasteur Pipettes | VWR | 14673-010 | to pull trituration pipettes |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | additive to culture medium |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | for pH buffering all solutions in protocol |
| Hot plate / magnetic stirrers | VWR | 76549-914 | |
| Insulated bucket filled with ice | to keep all samples and solutions cool | ||
| K2SO4, Potassium Sulfate | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additive to internal solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additive to internal solution |
| KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | To bring internal solution to desired pH. |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 14133-13 | |
| Leibovitz medium | Sigma Aldrich | L4386 | dissection and bath solutions |
| Low-profile-bath recording chamber for culture dishes | Warner Instruments | 64-0236 | |
| luer-lok syringes, 30 ml | BD | 302832 | for drawing L-15/HEPES/HEPES solution. |
| MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | base of the culture medium |
| MgCl2-Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M1028 | Additive to internal solution |
| microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
| Microforge | Narashige | MF-90 | For electrode polishing. |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | additiive to culture medium, for SGN |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additive to internal solution |
| NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | for titration pH |
| Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
| Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing | USC Material Management | MEDOX200 (Identifier: 00015) | for dissolving into dissection and bath solutions |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| Pasteur pipette bulb (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | bulb for trituration pipettes |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | additive to prevent contamination of culture medium |
| Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) | MWI Animal Health | 15199 | for euthanasia |
| PES membrane filters , 0.2 micrometer | Nalgene | 566-0020 | for filtering solutions |
| PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | for filtering solutions drawn into syringes |
| Petri dishes, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration |
| Petri Dishes, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | for gross dissection |
| pH Meter | Mettler Toledo | Model S20 | |
| Pipettors (1000, 200, 10) microliter | USA Scientific | ||
| Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish | Mattek | P35GC-0-10-C | to plate neurons for culture |
| Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes | Warner Instruments | 64-0375 | |
| Reference Cell | World Precision Instruments | RC1T | |
| Scalpel blade | Miltex | 4-315 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| Serological Pipettes (10, 25) milliliter | Fisher Scientific | ||
| Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) | Warner Instruments | 64-0378 | |
| Small Animal Guillotine | Kent Scientific | DCAP | |
| Small animal guillotine | Kent Scientific | DCAP | for decapitation if dissecting rats older than P15. |
| Stereo Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Straight surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Syringe (3, 10, 30) milliliter | |||
| Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Tuberculin syringe | Covidien | 8881500105 | for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection |
| Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Volumetric flask, 1000 milliliter | |||
| Vortex | VWR | 945300 | |
| Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |
References
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Goldberg, J. M. Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways. Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).
- Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons. Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).
- Smith, C. E., Goldberg, J. M. A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents. Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).
- Berglund, A. M., Ryugo, D. K. Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse. The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).
- Jagger, D. J., Housley, G. D. Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice. Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).
- Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro). The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).
- Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).
- Mo, Z. L., Davis, R. L. Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).
- Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).
- Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse. Journal of Visualized Experiments. (48), e2442 (2010).
- Bronson, D., Kalluri, R. Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo. The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).
- Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons. Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).
- Bean, B. P. The action potential in mammalian central neurons. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).
- Izhikevich, E. M. Dynamical Systems in Neuroscience. , MIT Press. (2018).
- Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons. Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).
- Risner, J. R., Holt, J. R. Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).
- Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).
- Cervantes, B., Vega, R., Limón, A., Soto, E. Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons. Neuroscience. 240, 163-175 (2013).
- Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function. Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).
- Davis, R. L., Crozier, R. A. Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons. Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).
- Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery. Hearing Research. 336, 1-16 (2016).
- Eatock, R. A., Christov, F. Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear. , Elsevier. (2020).
- Kalluri, R. Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 710275 (2021).
- Armstrong, C. E., Roberts, W. M. Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).
- Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia. Brain Research. 1139, 117-125 (2007).
- Meredith, F. L., Rennie, K. J. Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals. Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).
- Cai, H. Q., et al. Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics. Hearing Research. 350, 122-132 (2017).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).
- Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).
- Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3. The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).
- Liu, X. -P., et al. Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents. Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).
