Summary
A continuación se presentan métodos que proporcionan instrucciones detalladas para la disección, la disociación, el cultivo y el registro de pinzas de parche de las neuronas ganglionares vestibulares y ganglionares espirales del oído interno.
Abstract
La morfología compacta de las neuronas ganglionares del oído interno aisladas y cultivadas permite caracterizaciones detalladas de los canales iónicos y los receptores de neurotransmisores que contribuyen a la diversidad celular en esta población. Este protocolo describe los pasos necesarios para la disección, disociación y cultivo a corto plazo exitosos de la somata de las neuronas bipolares del oído interno con el fin de realizar registros de pinzas de parche. Se proporcionan instrucciones detalladas para preparar las neuronas ganglionares vestibulares con las modificaciones necesarias para colocar placas en las neuronas ganglionares espirales. El protocolo incluye instrucciones para realizar registros de patch-clamp de celda completa en la configuración de patch perforado. Los resultados de ejemplo que caracterizan los registros de pinza de voltaje de corrientes mediadas por nucleótidos cíclicos activados por hiperpolarización (HCN) resaltan la estabilidad de la configuración de registro de parches perforados en comparación con la configuración de parches rotos más estándar. La combinación de estos métodos, somata aislado más registros de pinza de parche perforado, se puede utilizar para estudiar procesos celulares que requieren registros largos y estables y la preservación del medio intracelular, como la señalización a través de receptores acoplados a proteínas G.
Introduction
Las neuronas bipolares del nervio vestibulococlear conectan las células ciliadas sensoriales del oído interno con el tronco encefálico. Son los principales portadores de información sobre el sonido y los movimientos de la cabeza; El daño a estas células importantes conduce a la sordera y a los trastornos del equilibrio. Las porciones vestibular y auditiva del nervio están compuestas por distintos tipos de células que son morfológica y funcionalmente diversas 1,2. En el sistema vestibular, dos subpoblaciones aferentes disparan espontáneamente a intervalos regulares o irregulares2. Se cree que la sincronización de picos aferentes refleja una diversidad subyacente en la composición de los canales iónicos 3,4. En el sistema auditivo, hay dos subpoblaciones principales de neuronas ganglionares espirales (SGN); mientras que las SGN de tipo I entran en contacto con células ciliadas internas individuales5, las SGN de tipo II contactan con múltiples células ciliadas externas5. Los registros in vitro de cultivos semiintactos y organotípicos sugieren diferencias en las propiedades de membrana de las SGN de tipo I y tipo II 6,7.
Muchos canales iónicos y receptores de neurotransmisores que se encuentran en las terminales de estas neuronas también se encuentran en sus cuerpos celulares. Como tal, los cultivos del soma vestibular aislado y del ganglio espiral se pueden estudiar in vitro para comprender cómo los canales iónicos y los receptores de neurotransmisores contribuyen a la respuesta de estas neuronas. La morfología compacta de los cuerpos celulares aislados permite registros eléctricos de alta calidad, adecuados para la caracterización detallada de canales iónicos dependientes de voltaje y receptores de neurotransmisores. El fácil acceso a una variedad representativa de subtipos de neuronas permite un análisis de alto rendimiento de la diversidad celular.
Este artículo presenta un método para aislar y cultivar cuerpos de células ganglionares disociadas de la porción superior del ganglio vestibular en ratas en el día postnatal (P)9 a P20. También se proporcionan sugerencias para extender estos métodos al ganglio espiral, además de los pasos necesarios para extraer, disociar y colocar placas con éxito en las células ganglionares. Estos métodos son una evolución de los ideados en publicaciones de diversos laboratorios 8,9,10. También se incluye en este documento una guía para seleccionar células sanas para los registros de patch-clamp.
Por último, el protocolo describe el procedimiento para el registro de patch-clamp utilizando la configuración de patch-patch-perforado11. Aunque la configuración de parche perforado requiere más tiempo y es más desafiante técnicamente que la configuración de parche roto más común, es mejor para mantener el entorno citoplasmático que permite sesiones de grabación largas y estables. Los beneficios de esta configuración de grabación se ilustran aquí a través de la estabilidad mejorada de las corrientes catiónicas activadas por hiperpolarización en parches perforados en relación con los registros de parches rotos.
Este protocolo está organizado en cinco secciones. En las secciones 1 a 3 se describen las soluciones y herramientas que se pueden preparar y almacenar con antelación. En la sección 4 se describen los pasos para la disección y la siembra de las células vestibulares y las SGN, y en la sección 5 se describen los pasos para el registro de las neuronas después de un período de cultivo. En nuestras manos, la sección 4 y la sección 5 se realizan durante un período de 2 días consecutivos.
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Protocol
Todo el uso de animales descrito aquí ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad del Sur de California. Los animales en este protocolo son ratas Long Evans de P3 a P25 de ambos sexos obtenidas de Charles River Laboratories, pero estos métodos se pueden aplicar a otras cepas de roedores. Se debe usar una bata de laboratorio y guantes durante todos los procedimientos, así como gafas protectoras contra salpicaduras cuando se preparan soluciones.
1. Preparativos
NOTA: Las soluciones y herramientas descritas en esta sección se pueden preparar con mucha anticipación para ser utilizadas el día de la disección y el registro.
- Prepare medios Liebovitz suplementados con 10 mM de HEPES (solución L-15). Los siguientes pasos describen la preparación de 1 litro de solución L-15.
- Vierta 990 ml de H2O desionizado en un vaso de precipitados. Mide y añade 2,386 g (10 mM) de HEPES. Agregue una botella de 1 litro de polvo de solución L-15.
NOTA: El L-15 en polvo tiene una vida útil más larga y ocupa menos espacio de almacenamiento. Alternativamente, compre una solución L-15 y complemente con HEPES. Esta última opción también tiene la opción de utilizar una solución sin fenol, que es útil para la obtención de imágenes de fluorescencia. - Revuelva la solución en una placa para revolver. Con un medidor de pH, agregue lentamente 1 N de hidróxido de sodio (NaOH) para obtener un pH entre 7,34 y 7,36.
- Añadir H2O desionizado hasta que la solución alcance un volumen de 1.000 mL. Filtre la solución con una membrana de 0,22 μm de tamaño de poro.
NOTA: La solución de L-15 puede almacenarse a 4 °C durante aproximadamente 1-2 semanas. Si se usa L-15 hecho con rojo de fenol, la solución se volverá rosa si es demasiado básica (pH > 7.4) o naranja si es demasiado ácida (pH < 7.34).
- Vierta 990 ml de H2O desionizado en un vaso de precipitados. Mide y añade 2,386 g (10 mM) de HEPES. Agregue una botella de 1 litro de polvo de solución L-15.
- Preparar el medio de cultivo para las neuronas ganglionares vestibulares (VGN) (con modificación para SGN). Siga los pasos a continuación para hacer 50 ml de medio de cultivo:
- Agregue 47,5 ml de medio esencial mínimo GluMAX-I a un vaso de precipitados de vidrio limpio.
- Mida y agregue 0,1194 g (10 mM) de HEPES. Este tampón adicional resiste los cambios de pH mientras las células se asientan, antes de ser trasladadas a la incubadora.
- Añadir 2,5 mL de suero fetal bovino (FBS). Esto hace un 5% por volumen de FBS en un volumen total de 50 mL de medio. Para las preparaciones de SGN, se sustituyen 2,5 mL de FBS por 0,5 mL de soluciones de N2 y 1 mL de B27.
- Revuelva la solución en una placa para revolver. Con un medidor de pH, agregue lentamente 1 N NaOH para obtener un pH entre 7.38 y 7.4.
- Añadir 0,5 ml de penicilina-estreptomicina. Filtrar la solución a través de un filtro estéril de 0,22 μm. Almacenar la solución a 4 °C.
- Al menos 30 minutos antes de su uso, transfiera el medio de cultivo a un matraz de cultivo de tejidos con una tapa ventilada. Introducir el matraz con medios de cultivo en una incubadora con una concentración de CO2 al 5% a 37 °C.
- Preparar la solución interna del parche perforado
NOTA: Aquí, se utilizan 100 ml de solución interna de parche perforado para el registro de células enteras (la receta se resume en la Tabla 1). Estas soluciones pueden prepararse con mucha antelación y almacenarse a -20 °C. Las alícuotas pueden almacenarse indefinidamente a -20 °C si no se someten a un ciclo repetido de congelación y descongelación.- Con hasta 6 meses de anticipación, prepare y almacene soluciones madre de lo siguiente: 1 M KCl, 0.5 M Mg2Cl (hexahidrato) y 0.5 M CaCl2. Conservar en frascos herméticos hasta 6 meses a 4 °C.
NOTA: Es una buena idea comprobar la osmolalidad de las soluciones madre (2.000 mOsm para la solución madre de KCl 1 M; 1.500 mOsm para las soluciones de Mg2Cl y CaCl2 ) para asegurarse de que se alcanza la concentración objetivo. No lo use si la solución se vuelve turbia o forma precipitados. Esto puede ser un posible punto de pausa.
- Con hasta 6 meses de anticipación, prepare y almacene soluciones madre de lo siguiente: 1 M KCl, 0.5 M Mg2Cl (hexahidrato) y 0.5 M CaCl2. Conservar en frascos herméticos hasta 6 meses a 4 °C.
- El día de la fabricación de la solución interna, siga los pasos a continuación utilizando las soluciones madre del paso 1.3.
- Mida 100 ml de mili-Q (MQ)H2O. Extraiga 40 ml de los 100 ml y déjelos a un lado en un vaso de precipitados limpio.
- Agregue los 60 ml restantes de H2O a un vaso de precipitados limpio y estéril de 100 ml. Añadir 2,5 mL de KCl 1 M, 1 mL de 0,5 M Mg2de Cl-hexahidratado y 0,02 mL de CaCl2 0,5 M.
- Agregue una barra para revolver y coloque el vaso de precipitados en una fuente para revolver. Revuelva hasta que se disuelva por completo. Añadir 1.307 g de K2SO4. Revuelva hasta que el K2SO4 se disuelva.
- Pesar 0,1192 g de HEPES (objetivo 5 mM en un volumen final de 100 mL) y añadir a la solución. Revuelva hasta que se disuelva.
NOTA: Asegúrese de que todos los componentes estén completamente disueltos, ya que a veces el K2SO4 tarda en disolverse. - Pesar 0,1902 g de ácido etilenglicol-bis(β-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-tetraacético (EGTA) (objetivo 5 mM en un volumen final de 100 mL) y añadir a la solución. Como EGTA no se disuelve completamente en una solución ácida, coloque el vaso de precipitados en una placa de agitación e inserte la sonda de pH.
- Mientras revuelve, valore lentamente 1 M KOH hasta que el EGTA se disuelva por completo. Espere que esto ocurra cuando el pH esté entre 6 y 7. Continúe agregando KOH lentamente hasta que el pH final sea de 7.35 (aproximadamente 1.2 a 1.3 mL de KOH en total).
- Agregue MQH2O para llevar la solución a un volumen final de 100 ml y agite. Compruebe la osmolalidad de la solución (objetivo 270 mOsm/kg para la solución de parche perforado) con un osmómetro.
- Filtre la solución interna del parche perforado con un filtro estéril de 0,22 μm. Conservar en alícuotas de 5 ml a -20 °C. Utilice una nueva alícuota para cada nueva sesión de grabación.
NOTA: Este puede ser un posible punto de pausa.
2. Fabricación de pipetas de trituración
NOTA: Las pipetas de trituración se pueden reutilizar para múltiples experimentos. Enjuague las pipetas con etanol, agua y solución L-15 antes de cada uso y límpielas con agua y etanol después de cada uso. Guárdelo cuidadosamente entre usos.
- Para preparar pipetas de trituración para la disociación celular, sostenga una pipeta Pasteur de vidrio sobre la llama de un quemador Bunsen. Una vez que la punta del vidrio comience a derretirse, estírelo hasta el diámetro deseado de la punta. Tire de un extremo de la pipeta para separarlo de la llama para crear una pequeña curva.
- Acerque la pipeta doblada a un microscopio. Con una baldosa de incisión, marque y rompa el vidrio en el diámetro deseado.
- Pase la punta de la pipeta por encima de la llama del quemador Bunsen. Esto pulirá rápidamente los bordes ásperos cerca de la punta. Verifique que la punta no esté sellada por la llama.
- Repita el proceso hasta que se hayan preparado cuatro o cinco pipetas de diferentes tamaños.
3. Fabricación de pipetas de parche
NOTA: Prepare un juego de pipetas de parche antes de la sesión de grabación, pero después de la disección y el cultivo de los ganglios. Aunque los electrodos que se fabrican de uno en uno durante la sesión de grabación tienen un rendimiento óptimo, se ha logrado un éxito razonable cuando se fabrican por lotes la noche anterior. Guarde las pipetas en un recipiente de vidrio tapado para proteger las puntas del polvo.
- Utilice un extractor de electrodos vertical y pipetas de vidrio de borosilicato filamentado de 1,5 mm de diámetro exterior y 1,17 mm de diámetro interior. Asegúrese de que el vidrio siempre se mantenga libre de polvo y huellas dactilares.
- Extraiga de 8 a 10 pipetas de grabación utilizando un programa de dos pasos, como recomienda el fabricante para las pipetas de parche.
- Inspeccione y pula con calor cada punta de pipeta de grabación con una microforja; El pulido térmico promueve un mejor sellado. La resistencia objetivo de la pipeta está entre 4 y 8 MΩ.
- Guarde las pipetas pulidas en un recipiente tapado. Esto se puede tratar como un punto de pausa en el experimento.
NOTA: La optimización del diámetro de la pipeta para alcanzar el rango de resistencia objetivo requiere un poco de prueba y error con los pasos 3.2 y 3.3. La mayoría de los sistemas comerciales de abrazadera de parche tienen una función de prueba de membrana incorporada para medir la resistencia del electrodo en la solución de baño. La resistencia se calcula como una relación de la corriente de salida en estado estacionario en respuesta a un estímulo escalonado de 5 mV aplicado. Los ajustes de tracción en el paso 3.1 y el pulido en el paso 3.2 deben ajustarse primero con pipetas de prueba, hasta que la resistencia de las pipetas de prueba se encuentre dentro del rango de 4 a 8 MΩ. - El día de la grabación, recubra las puntas de pipeta para reducir la capacitancia de la pipeta y el ruido de grabación. Para ello, envuelva una pequeña tira de película de parafina en el eje de la pipeta. No es necesario envolver hasta la punta.
NOTA: Una estrategia alternativa es recubrir y calentar un elastómero de silicona en el eje de la pipeta12.
4. Extracción del ganglio vestibular y placa de las neuronas vestibulares
- Preparación para la disección
- Preparar una mezcla enzimática de solución de L-15 con colagenasa al 0,05% y tripsina al 0,25%. Por ejemplo, agregue 0,001 g de colagenasa y 0,005 g de tripsina a 2 ml de solución de L-15 en un vaso de precipitados, agregue un pequeño agitador magnético y revuelva hasta que esté completamente mezclado. Dejar reposar a temperatura ambiente.
- Prepare una guillotina obtenida comercialmente colocando toallas de papel a un lado y debajo de la guillotina para minimizar la exposición de la mesa de trabajo y otras superficies a la sangre y otros materiales biológicos.
- Coloca tijeras grandes de acero inoxidable, pinzas grandes y tijeras grandes de resorte. Tenga a mano una botella de spray grande con etanol al 70% para limpiar la cabeza.
- Llene un vaso de precipitados de 100 ml con solución L-15 y colóquelo en hielo. Oxigenar la solución de L-15.
- Coloque las tijeras de resorte, las tijeras quirúrgicas, las pinzas, el bisturí y la pipeta de transferencia (consulte la Tabla de materiales).
- Prepare una placa de Petri de 60 mm (para la disección macroscópica) y dos placas de Petri de 35 mm (para la limpieza/disección fina de los ganglios). Llene el plato de 60 mm con solución oxigenada de L-15 utilizando una jeringa de 30 ml con una punta de filtro de 0,22 μm.
- Eutanasia, limpieza de la cabeza y hemisección
- Pesar a las crías para calcular la dosis adecuada de dilución fatal-plus para administrar por vía intraperitoneal (~0,01 ml por 10 g).
- Una vez que se alcanza un plano profundo de anestesia, evaluado por la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie, decapitar con la guillotina.
- Enjuague bien el cabezal con etanol al 70% y luego abundantemente con solución L-15.
- Retire completamente la piel del cráneo. Divida la cabeza con unas tijeras de resorte grandes comenzando en el punto de entrada de la médula espinal al cerebro y haciendo dos cortes, el primero a través de la parte superior del cráneo y el segundo a través de la parte inferior de la mandíbula. Termina de dividir la cabeza con unas tijeras quirúrgicas.
- Coloque ambas mitades de la cabeza con el cerebro hacia abajo en una placa de Petri de 60 mm llena de solución L-15. Coloque el tejido fresco que no se está diseccionando actualmente en hielo.
- Extracción del ganglio vestibular superior
- Saque el cerebro con unas tijeras quirúrgicas cerradas. Cortar y extirpar el nervio craneal para separar completamente el cerebro del cráneo.
NOTA: En este punto, la cápsula ótica (con forma de número 8) debe ser visible en la parte posterior de la cabeza. - Con fórceps y comenzando por la parte posterior de la cabeza, retire el material membranoso transparente.
- Corta la parte superior del cráneo con unas tijeras quirúrgicas. Retire el exceso de tejido de la parte posterior de la cabeza y el cuello para que el área de disección y la cápsula ótica estén más limpios y sean más fáciles de acceder.
NOTA: Evite enturbiar demasiado el plato desechando el exceso de tejido durante todo el procedimiento. - Transfiera el tejido a una segunda placa de Petri con una solución fresca de L-15. Localiza la cápsula ótica y los nervios auditivo, vestibular superior y vestibular inferior. Corta el nervio auditivo y separa los ganglios superior e inferior con unas tijeras de resorte pequeñas.
NOTA: Aunque los somas del nervio vestibular se encuentran tanto en los ganglios inferiores (más delgados) como en los superiores (más gruesos), las células extraídas del ganglio superior tienen una mejor supervivencia. - Con un bisturí, afeite suavemente la cresta ósea para debilitar el área ósea, debajo de la cual el nervio se sumerge en la cápsula ósea. Retire cuidadosamente los residuos con pinzas finas, exponiendo toda la parte inflamada del ganglio.
- Use las tijeras de resorte finas para cortar y separar el ganglio de la rama del nervio periférico que se sumerge hacia el utrículo.
- Retire el ganglio superior con unas pinzas finas, asegurándose de no pellizcar demasiado cerca del tejido ganglionar. Transfiera a una placa de Petri de 35 mm con una solución fresca de L-15.
- Antes de continuar, precalentar la solución enzimática: verter la mezcla de enzimas en una placa de Petri de 35 mm y colocar en una incubadora a 37 °C durante 10-15 min.
- Limpie el ganglio con pinzas finas y tijeras de resorte pequeñas eliminando el hueso (que parece blanco y cristalizado en estructura), el exceso de tejido, las fibras nerviosas y cualquier otra estructura superflua. Tenga cuidado de minimizar la extirpación de cualquier tejido ganglionar.
- Saque el cerebro con unas tijeras quirúrgicas cerradas. Cortar y extirpar el nervio craneal para separar completamente el cerebro del cráneo.
- Disociación tisular y colocación de placas
- Transfiera los ganglios limpios a la solución enzimática precalentada y vuelva a colocarlos en la incubadora durante 10 a 40 minutos. El tratamiento enzimático se completa una vez que el tejido comienza a romperse, pero permanece en una sola pieza. El tratamiento excesivo del tejido con enzimas dará como resultado la disolución completa de los ganglios antes de la trituración.
NOTA: La cantidad de tiempo que el tejido se somete a un tratamiento enzimático depende de la edad del animal. Por ejemplo, los ganglios de las ratas P9 se tratan con enzimas durante 25 min, y los ganglios de las ratas P15 se tratan con enzimas durante 35 min. - Transfiera los ganglios a la placa de Petri de 35 mm con una solución fresca de L-15 e incube durante 2-3 minutos.
- Transfiera los ganglios a otra placa de Petri de 35 mm llena de medios de cultivo filtrados.
- Con una micropipeta de 200 μL, pipetee una gota de ~150 μL de medio de cultivo filtrado en una placa con fondo de vidrio recubierto. No agregue demasiada solución, ya que es importante mantener la tensión superficial para formar una burbuja de solución que permanezca sobre el cubreobjetos de vidrio.
- Transfiera el número deseado de ganglios (de uno a cuatro) al cubreobjetos.
- Extraiga una pequeña cantidad de medio de cultivo de la placa de cultivo para enjuagar la pipeta de trituración con medio para evitar que el tejido se pegue a los lados de la pipeta de vidrio. Triturar pasando suave y repetidamente el tejido a través de la pipeta hasta que los ganglios estén suficientemente disociados.
NOTA: No trabaje demasiado el tejido para intentar suspensiones unicelulares ni permita que las células se estrellen contra el fondo del plato usando una presión positiva excesiva. Además, evite la formación de burbujas de aire, ya que esto reducirá la supervivencia celular. La trituración suave es la clave para lograr una supervivencia celular exitosa. - Deja reposar las células durante 5 min. Revise bajo un microscopio óptico para ver si las células se han asentado en el cubreobjetos.
- Coloque con cuidado una placa de cultivo en una incubadora a 37 °C durante 12-24 h. Nuevamente, asegúrese de mantener intacta la burbuja de solución.
NOTA: Cuando se cultive durante más de 24 horas, refresque el medio de cultivo diariamente. Esto puede ser un posible punto de pausa.
- Transfiera los ganglios limpios a la solución enzimática precalentada y vuelva a colocarlos en la incubadora durante 10 a 40 minutos. El tratamiento enzimático se completa una vez que el tejido comienza a romperse, pero permanece en una sola pieza. El tratamiento excesivo del tejido con enzimas dará como resultado la disolución completa de los ganglios antes de la trituración.
- Enchapado de SGN
- Siga los pasos 4.2.1 a 4.2.5 de las instrucciones del ganglio vestibular para dividir la cabeza.
- Localiza la cápsula ótica (con la forma del número 8) y extráela del cráneo cortando los bordes con unas pinzas romas.
- Cambie la solución L-15. La porción espiral de la cápsula ótica alberga la cóclea con el órgano de Corti. Astillar el hueso que recubre la cóclea sin dañar el tejido subyacente, con pinzas finas paralelas a la curva del hueso.
- Una vez que se haya extraído suficiente hueso para revelar la extensión total de los giros cocleares, use unas tijeras pequeñas de resorte para cortar el modiolo (tejido grueso, blanco y fibroso que contiene axones centrales de SGN) en la base de la cóclea para liberarlo del resto de la cápsula ótica.
- Retire la estría vascular pellizcándola en la base con pinzas finas. Desenrolle alrededor de la espiral y suba hasta el ápice para despegarla del órgano de Corti.
- Corta el órgano de Corti en dos o tres vueltas con unas tijeras de resorte pequeñas de modo que quede plano.
- Extirpe el modiolo de cada vuelta con unas tijeras de resorte pequeñas.
- Retire el ganglio espiral cortando en el borde de donde los tractos de fibras SGN se proyectan hacia las células ciliadas.
- Limpie el ganglio con pinzas finas retirando el hueso (que parece blanco y cristalizado en estructura), el modiolo (que parece blanco y fibroso) y cualquier otra estructura superflua. Tenga cuidado de minimizar la extirpación de cualquier tejido ganglionar.
- Siga el mismo procedimiento que para el tratamiento enzimático del ganglio espiral que se utiliza para el ganglio vestibular en la sección 4.4. Los tiempos enzimáticos suelen ser más cortos en el ganglio espiral, que es más alargado que el ganglio vestibular. Utilice pipetas de trituración de menor diámetro para el ganglio espiral en comparación con el ganglio vestibular.
- Triturar el ganglio espiral en medio de cultivo suplementado con N2 y B27, indicado en la receta para medios de cultivo.
- Colocar la placa de cultivo que contiene los ganglios disociados en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante 12-24 h.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
5. Grabación
NOTA: En este procedimiento, los registros de patch-clamp del ganglio aislado se realizan típicamente 12-24 h después de la colocación de la placa. Otros laboratorios han reportado resultados de neuronas después de períodos mucho más largos en cultivo10.
- Preparación de la cámara de grabación
- Utilice la cámara de grabación de intercambio rápido (o equivalente) que permite realizar grabaciones de patch-clamp directamente en la placa de cultivo. Coloque la cámara en el microscopio invertido.
- Inserte las placas de cultivo con fondo de vidrio en la cámara.
- Alimente la solución L-15 a través de un sistema de tubos de perfusión a la cámara de registro. Estabilizar el flujo de entrada y salida de perfusión en la cámara a una velocidad de 0,5-1 ml por minuto.
- Preparar la solución interna para cargar los electrodos
- Descongele una alícuota de la solución interna del parche perforado. Asigne 2,5 ml de la solución en una placa de cultivo de 35 mm. Vuelva a colocar la tapa de la placa de cultivo y etiquétela como "Tip Dip". Dejar a un lado en una zona libre de polvo, ya que es muy importante mantener esta solución lo más limpia posible.
- Pesar 1 mg de anfotericina-B y añadir 20 μL de dimetilsulfóxido (DMSO). Haga un vórtice y gire la solución hacia abajo hasta que toda la anfotericina-B esté en la solución. Añadir 10 μL de la solución de DMSO/anfotericina-B a los 2 mL restantes de la solución interna del parche perforado descongelado. Retire y disipe la solución con una pipeta dos o tres veces para asegurarse de que el DMSO/anfotericina-B se haya mezclado uniformemente con la solución interna. La solución tendrá un tinte amarillento suave.
- Extraiga la solución interna del parche perforado de anfotericina-B en una jeringa de 3 ml. Añade una punta de 34 g a la jeringa. Envuelva la jeringa en papel de aluminio y manténgala en hielo.
NOTA: Esta solución debe rehacerse cada 2 h para garantizar la eficacia de la anfotericina-B en la perforación de la membrana celular. La anfotericina-B es sensible a la luz y debe protegerse de la luz con papel de aluminio u otros métodos.
- Grabaciones de patch-clamp
- Visualiza las neuronas usando un objetivo de 10x o 20x. Ajusta la iluminación y optimiza la óptica para ver los límites y las sombras alrededor de la célula.
- Comprobar la calidad de las neuronas aisladas. Pruebe solo con neuronas con superficies lisas y uniformes que no estén demasiado contrastadas y que solo tengan cráteres pequeños y dispersos. Además, asegúrese de evitar pares de neuronas, neuronas rodeadas de desechos u otras células.
- Con un aumento de 100x, identifique una neurona o un campo de neuronas para parchearlas y alinéelas en el centro del campo de visión.
- Llene la punta de la pipeta con una solución limpia que no contenga anfotericina sumergiendo la punta (durante ~20 s) en la solución limpia que se colocó en una placa de cultivo. La acción capilar atraerá una pequeña cantidad de solución hacia la punta.
NOTA: Realice este paso bajo un microscopio de disección estereoscópica, que permite determinar qué tan bien la punta contiene la solución de inmersión de punta. Si la solución no se mantiene durante ~10-20 s, la forma del electrodo no es la ideal. En este caso, vuelva a configurar el programa de extracción de electrodos para producir una punta más larga. - A continuación, llene la parte posterior de la pipeta con la solución interna que contiene anfotericina. El filamento dentro de la pipeta extraerá la solución para encontrarse con la solución limpia en la punta. Deja que el filamento tire suavemente de la solución hacia abajo y no intentes sacar las burbujas, ya que esto obligará a la anfotericina a llegar a la punta demasiado rápido.
- Use una jeringa para extraer la solución que puede estar en la parte posterior del electrodo.
NOTA: Es muy importante trabajar rápido desde este punto para aterrizar y formar un sello de alta resistencia en la celda deseada. - Inserte la pipeta en el soporte de la pipeta. Compruebe que la pipeta esté ajustada en el soporte para evitar que la pipeta se desvíe. Si la pipeta no es estable, cambie las juntas tóricas de sellado en la parte delantera y trasera del soporte de la pipeta para minimizar la deriva y mantener una succión fuerte. Sustituya la pipeta por una que esté recién llena.
- Baje la pipeta en el baño de la cámara de grabación.
- Coloque la punta de la pipeta en el centro del campo de visión. Asegúrese de que la punta esté libre de burbujas de aire u otros residuos.
- Aplique un paso de tensión (5 mV) en la prueba de membrana para controlar la resistencia de la pipeta. Continúe monitoreando la resistencia de entrada durante todo el proceso de formación de un sello en la celda.
- Cancele el potencial de compensación de la pipeta, de modo que la corriente de la pipeta sea cero en el modo de prueba de membrana de pClamp.
- Corrija la capacitancia de la pipeta utilizando la función de compensación rápida de capacitancia en el amplificador de abrazadera de parche (diales rápidos de Cp en el panel de software Multiclamp Commander).
- Mueva la pipeta hacia abajo hasta la celda.
- Una vez que la pipeta esté lo suficientemente cerca de la neurona, cambie al objetivo de mayor aumento y envíe la imagen a través de una cámara a un monitor (use un objetivo de 40x, aumento total de 400x). Ajuste la pipeta y vuelva a centrar la neurona.
- Acerque el electrodo de registro al soma. Ubique el centro de la neurona en el monitor y coloque el electrodo de registro sobre la neurona.
- Acércate a la neurona desde arriba, de modo que el electrodo aterrice en el centro de la celda esférica. Ajuste el desplazamiento de la pipeta a cero los potenciales de CC constantes en el sistema.
- Coloque la pipeta cerca de la membrana. Aterriza firmemente en el centro de la celda.
NOTA: Al aterrizar, se producirá un pequeño hoyuelo en la superficie de la neurona y una duplicación/triplicación de la resistencia de entrada. - Aplique presión negativa (succión) con una jeringa o pipeta bucal. Encienda el potencial de retención de -60 mV. La resistencia del sello debe aumentar hasta que pase un giga-ohmio.
NOTA: Trabaje rápido para reducir el tiempo entre el llenado de un electrodo y el aterrizaje en una celda. Hay un tiempo limitado antes de que la anfotericina añadida a la solución interna del parche perforado en el paso 5.3.5 llegue a la punta del electrodo. Una vez que la punta está contaminada con anfotericina, es difícil formar sellos de alta resistencia, y la resistencia a menudo se estabiliza a ~ 200 megaohmios. - Una vez que se forme un sello de giga-ohmios, libere la presión negativa. Tan pronto como se forme el sello, aplique una compensación de capacitancia rápida para reducir la amplitud de los transitorios de capacitancia de la pipeta en el modo de prueba de membrana tanto como sea posible.
- A medida que la anfotericina comienza a funcionar, observe cómo la resistencia de entrada disminuye lentamente y la corriente que fluye en respuesta al paso de voltaje de 5 mV aumenta progresivamente a medida que la anfotericina ingresa a la membrana. Una disminución repentina de la resistencia en serie en lugar de una estabilización gradual sugiere que se ha producido una ruptura espontánea.
- Calcule la capacitancia de toda la celda y la resistencia en serie utilizando la función de anulación transitoria capacitiva del amplificador. Documente y controle la resistencia en serie al comienzo del experimento y regularmente durante el mismo.
NOTA: La resistencia en serie puede tardar entre 5 y 20 minutos en estabilizarse, dependiendo del tamaño del electrodo y de la cantidad de solución limpia que se introduzca en la pipeta. Los modos de pinza de voltaje y pinza de corriente se pueden usar una vez que la resistencia en serie se haya estabilizado por debajo de 30 megaohmios. A veces se observa hinchazón o encogimiento de las neuronas durante el registro, pero rara vez cuando la osmolaridad y el pH de las soluciones se ajustan correctamente.
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Representative Results
La ejecución de protocolos de pinza de voltaje mediante la aplicación de familias de pasos de voltaje revela la activación dependiente del voltaje de una variedad de diferentes familias de corrientes. En la Figura 1A,B se muestran ejemplos representativos de corrientes de células enteras evocadas a partir de una VGN y adaptadas de grabaciones publicadas13. La aplicación de voltajes despolarizantes (Figura 1B) activa una corriente interna (negativa por convención) que se activa e inactiva muy rápidamente (Figura 1A). Esto es estereotipado para las propiedades dependientes de voltaje de los canales de sodio14,15, que impulsan principalmente la carrera ascendente de los potenciales de acción16,17. La despolarización también activa una corriente de salida de larga duración y activación relativamente lenta que impulsa la carrera descendente de un potencial de acción. La farmacología ha revelado que estas corrientes son transportadas en gran medida por una variedad de canales de potasio en los VGN 3,18,19,20,21.
Los voltajes hiperpolarizantes profundos y duraderos evocan una corriente interna de activación lenta transportada por los canales22 activados por nucleótidos cíclicos activados por hiperpolarización (HCN) (Figura 1C). La activación de estas corrientes se puede estudiar utilizando el protocolo de corriente de cola que se muestra en la Figura 1D. Aquí, el porcentaje de activación de la corriente se sondea trazando la corriente que fluye durante el paso de cola (Itail) en función de la tensión de acondicionamiento. La curva de activación corriente-voltaje tiene una forma sigmoidal (Figura 1E). Aunque este canal está controlado por segundos mensajeros solubles como el AMP cíclico (AMPc), las curvas de activación medidas utilizando la configuración de parche perforado son estables a lo largo de una grabación larga. Por el contrario, el tamaño y el rango de activación de voltaje del canal se alteran (presumiblemente debido al lavado de componentes citosólicos) cuando el registro se realiza en la configuración de parche roto.
La diversidad neuronal se ilustra por la gama de patrones de disparo provocados cuando se inyectan corrientes en diferentes VGN y SGN (Figura 2; arriba y abajo, respectivamente). Algunas neuronas se activan solo al inicio de la inyección de corriente, mientras que otras se activan varias veces. Esta heterogeneidad refleja una diversidad fundamental en la composición de los canales subyacentes de sodio y potasio tanto en los VGN como en los SGN 23,24,25.
Figura 1: Ejemplos de protocolos de pinza amperimétrica para medir diversos grupos de corrientes iónicas. (A,B) Ejemplo de corrientes de celda completa (A) inducidas por una familia de pasos de voltaje (B). Las corrientes netas de sodio entrantes (corrientes negativas) se identifican aquí por su activación e inactivación transitoria (flecha etiquetada, Na+). Las corrientes netas hacia afuera (flecha etiquetada, K+, corrientes positivas de larga duración) son transportadas en gran medida por iones de potasio y tienen una cinética de activación e inactivación mucho más lenta que las corrientes de sodio. (C,D) Las corrientes HCN son activadas por una familia de voltajes hiperpolarizantes de larga duración. (E,F) Estabilidad de la caracterización del canal iónico en el parche perforado en diferentes puntos de tiempo durante el registro. Las curvas de activación dependientes de la tensión de las corrientes de HCN se midieron en una configuración de parche perforado I. Curvas de activación de las corrientes de HCN durante una configuración de parche roto (F). Las imágenes C-F han sido modificadas de13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Se evocan diversos patrones de disparo mediante la inyección de pasos de corrientes. (A) Patrones de disparo en cinco somas ganglionares vestibulares. (B) Patrones de disparo en cinco SGN. (C) Pasos de corriente correspondientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los métodos presentados aquí son específicos para grabaciones de neuronas aisladas; Estudios anteriores se han centrado en grabaciones de terminales axónicos en una preparación semiintacta. En comparación con las técnicas de grabación de terminales existentes, las grabaciones aisladas ofrecen un comportamiento superior de fijación de espacio e isopotencial. Además, este protocolo proporciona acceso a una muestra más amplia de neuronas, ya que solo las subpoblaciones portadoras de cáliz son accesibles en los registros semiintactos del epitelio vestibular. Por último, los registros aislados permiten el uso de la técnica del parche perforado, que evita la alteración del medio intracelular que a menudo se ve interrumpida por la diálisis entre la solución intracelular y el citosol en los registros de parches rotos.
El éxito de las grabaciones se basa primero en la calidad del somata aislado y cultivado. Un paso crítico en la supervivencia celular es la fuerza requerida durante la trituración para producir las neuronas aisladas. Una mano suave es vital para la supervivencia celular. Las pipetas de trituración deben colocarse en lo alto de la burbuja de la solución L-15 para evitar la expulsión forzada de neuronas al fondo de la placa. Si surgen problemas de supervivencia celular, también se debe tener especial cuidado para evitar la formación de burbujas de aire o la ruptura de la burbuja de solución, lo que evita que las células disociadas se depositen en el cubreobjetos. También es mejor tener pipetas de trituración pulidas con calor disponibles en una variedad de tamaños, para que los investigadores tengan la flexibilidad de elegir una con un diámetro tal que el ganglio experimente una resistencia leve a medida que pasa a través de la pipeta. El pulido térmico de las pipetas reduce el daño causado por el paso del ganglio por los bordes ásperos del vidrio. Dejar un borde áspero puede parecer inicialmente más efectivo para romper los ganglios, pero este enfoque daña el somata y reduce la supervivencia después del período de cultivo. Un último consejo es proteger celosamente una pipeta de trituración exitosa.
Otro factor que es crítico para la supervivencia celular es la duración del tratamiento con enzimas digestivas. Al determinar el tiempo enzimático, los investigadores deben ajustar cuidadosamente el tiempo para asegurarse de que el tejido se rompa bien, pero no tanto como para afectar la supervivencia celular. Encontramos que el impacto del tratamiento enzimático sobre la supervivencia celular y las propiedades de los canales iónicos es mínimo, ya que los datos recopilados de las células tratadas con enzimas parecen ser consistentes con otros métodos que no se basan en este enfoque19,26. Aunque el tratamiento enzimático minimiza la fuerza requerida para triturar, viene con la limitación de que se sabe que la digestión enzimática (particularmente a base de tripsina sola o papaína) causa daño alos canales iónicos. Por lo tanto, aunque recomendamos algunas pautas para el tiempo enzimático dependiendo de la edad del animal, es mejor estar preparado para ajustar el tiempo en función de los resultados. Por último, fomentamos un enfoque de "menos es más" para la trituración. Esto significa resistir la tentación de formar una suspensión unicelular y detener la trituración después de tres o cuatro pasadas, incluso si quedan varios trozos grandes de tejido.
Una ventaja del cultivo es que parece limpiar la membrana de la célula somática y promueve el desprendimiento de las células gliales formadoras de mielina, lo que permite una fijación más exitosa de las neuronas. Por lo tanto, la preparación de ganglios aislados y cultivados es especialmente útil para extender los registros de patch-clamp más allá de la 1ª semana postnatal, después de la cual los cuerpos celulares se cubren progresivamente de mielina, impidiendo el electrodo patch-clamp. La actividad de los canales iónicos observada en los registros de patch-clamp de VGNs aislados más cultivados a corto plazo (<24 h) más allá de la 2ª semana postnatal es consistente con los cambios zonales y madurativos en la expresión de los canales iónicos observados por inmunohistoquímica y registros directos de los terminales del cáliz en epitelios vestibulares28,29. Sin embargo, cabe señalar que el cultivo prolongado ayudado por factores neurotróficos y antibióticos también puede afectar los canales iónicos 30,31,32,33,34. Cualquier aplicación de estas técnicas debe considerar cuidadosamente el impacto de estos factores en la biofísica subyacente de las neuronas y sus canales iónicos 30,31,32,33,34.
En general, los registros de patch-clamp de somata aislados y cultivados son adecuados para estudiar la diversidad en las propiedades de los canales iónicos de las neuronas del oído interno. La estabilidad a largo plazo de la configuración de parches perforados es especialmente adecuada para el estudio de canales iónicos como el HCN, cuyas propiedades de activación están sujetas a modulación a través de segundos mensajeros citosólicos.
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Disclosures
Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a los doctores Jing Bing Xue y Ruth Anne Eatock por sus primeras contribuciones a estos métodos. Este trabajo fue apoyado por NIH NIDCD R03 DC012652 y NIDH NIDCD DC012653S, y R01 DC0155512 a RK y T32 DC009975 a DB, NN y KR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | For perforated patch recordings. |
| ATP di-sodium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additive to internal solution |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | additive to culture medium, for SGN |
| Beakers (1000, 100, 10) milliliter | |||
| bench-top centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
| Bunsen burner | |||
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Additive to internal solution |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
| DMSO | Biotium | 90082 | |
| Dnase I,from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 11284932001 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Dumont #3 Forceps (Blunt) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont #55 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additive to internal solution |
| Electrode Puller | Narashige | PC-10 | |
| Epi-illumination light source | Zeiss | CL 1500 ECO | |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | for cleaning head and around dissection bench |
| Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
| Fine-edged dissection blade | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Glass Pasteur Pipettes | VWR | 14673-010 | to pull trituration pipettes |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | additive to culture medium |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | for pH buffering all solutions in protocol |
| Hot plate / magnetic stirrers | VWR | 76549-914 | |
| Insulated bucket filled with ice | to keep all samples and solutions cool | ||
| K2SO4, Potassium Sulfate | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additive to internal solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additive to internal solution |
| KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | To bring internal solution to desired pH. |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 14133-13 | |
| Leibovitz medium | Sigma Aldrich | L4386 | dissection and bath solutions |
| Low-profile-bath recording chamber for culture dishes | Warner Instruments | 64-0236 | |
| luer-lok syringes, 30 ml | BD | 302832 | for drawing L-15/HEPES/HEPES solution. |
| MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | base of the culture medium |
| MgCl2-Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M1028 | Additive to internal solution |
| microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
| Microforge | Narashige | MF-90 | For electrode polishing. |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | additiive to culture medium, for SGN |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additive to internal solution |
| NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | for titration pH |
| Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
| Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing | USC Material Management | MEDOX200 (Identifier: 00015) | for dissolving into dissection and bath solutions |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| Pasteur pipette bulb (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | bulb for trituration pipettes |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | additive to prevent contamination of culture medium |
| Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) | MWI Animal Health | 15199 | for euthanasia |
| PES membrane filters , 0.2 micrometer | Nalgene | 566-0020 | for filtering solutions |
| PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | for filtering solutions drawn into syringes |
| Petri dishes, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration |
| Petri Dishes, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | for gross dissection |
| pH Meter | Mettler Toledo | Model S20 | |
| Pipettors (1000, 200, 10) microliter | USA Scientific | ||
| Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish | Mattek | P35GC-0-10-C | to plate neurons for culture |
| Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes | Warner Instruments | 64-0375 | |
| Reference Cell | World Precision Instruments | RC1T | |
| Scalpel blade | Miltex | 4-315 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| Serological Pipettes (10, 25) milliliter | Fisher Scientific | ||
| Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) | Warner Instruments | 64-0378 | |
| Small Animal Guillotine | Kent Scientific | DCAP | |
| Small animal guillotine | Kent Scientific | DCAP | for decapitation if dissecting rats older than P15. |
| Stereo Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Straight surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Syringe (3, 10, 30) milliliter | |||
| Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Tuberculin syringe | Covidien | 8881500105 | for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection |
| Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Volumetric flask, 1000 milliliter | |||
| Vortex | VWR | 945300 | |
| Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |
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