Summary
ここでは、内耳の前庭神経節および螺旋神経節ニューロンからの解剖、解離、培養、およびパッチクランプ記録の詳細な手順を提供する方法を示します。
Abstract
単離および培養された内耳神経節ニューロンのコンパクトな形態により、この集団全体の細胞の多様性に寄与するイオンチャネルと神経伝達物質受容体の詳細な特性評価が可能になります。このプロトコルはパッチクランプ記録の為に内耳の両極ニューロンの体細胞の巧妙な解剖、解離および短期培養に必要なステップを概説する。前庭神経節ニューロンを調製するための詳細な指示は、らせん神経節ニューロンをプレーティングするために必要な修正とともに提供される。このプロトコルには、穴あきパッチ構成で全セルパッチクランプ記録を実行するための手順が含まれています。過分極活性化環状ヌクレオチド(HCN)媒介電流の電圧クランプ記録を特徴付ける結果の例は、より標準的な破裂パッチ構成と比較して、穴あきパッチ記録構成の安定性を強調しています。単離体細胞と穿孔パッチクランプ記録というこれらの方法の組み合わせは、Gタンパク質共役受容体を介したシグナル伝達など、長く安定した記録や細胞内環境の保存を必要とする細胞プロセスの研究に使用できます。
Introduction
前庭蝸牛神経の双極ニューロンは、内耳の感覚有毛細胞を脳幹に接続します。それらは、音と頭の動きに関する情報の主要な担い手です。これらの重要な細胞の損傷は、難聴や平衡障害につながります。神経の前庭部分と聴覚部分は、それぞれ形態学的および機能的に多様な異なる細胞タイプで構成されています1,2。前庭系では、2つの求心性亜集団が規則的または不規則な間隔で自発的に発火する2。求心性スパイクのタイミングは、イオンチャネル組成の根本的な多様性を反映していると考えられている3,4。聴覚系には、らせん神経節ニューロン(SGN)の2つの主要な亜集団があります。一方、I型SGNは個々の内有毛細胞に接触し5、II型SGNは複数の外有毛細胞5に接触する。セミインタクト培養および器官型培養からのin vitro記録は、I型SGNとII型SGNの膜特性の違いを示唆しています6,7。
これらのニューロンの末端に見られる多くのイオンチャネルと神経伝達物質受容体は、それらの細胞体にも見られます。そのため、単離された前庭およびらせん神経節体細胞の培養を in vitro で研究して、イオンチャネルと神経伝達物質受容体がこれらのニューロンの応答にどのように寄与するかを理解することができます。単離された細胞体のコンパクトな形態により、電位依存性イオンチャネルや神経伝達物質受容体の詳細な特性評価に適した高品質の電気記録が可能になります。代表的なニューロンサブタイプに簡単にアクセスできるため、細胞多様性のハイスループット解析が可能です。
本稿では、ラットの出生後(P)9〜P20に、前庭神経節の上層部から解離した神経節細胞体を単離して培養する方法を紹介します。また、神経節細胞の抽出、解離、およびプレーティングを成功させるために必要なステップに加えて、これらの方法をらせん状神経節に拡張するための提案も提供されています。これらの方法は、さまざまな研究所の出版物で考案された方法の進化形です8,9,10。また、この論文には、パッチクランプ記録用の健康な細胞を選択するためのガイダンスも含まれています。
最後に、プロトコルは、穿孔パッチ構成11を使用したパッチクランプ記録の手順を概説する。穿孔パッチ構成は、より一般的な破裂パッチ構成よりも時間がかかり、技術的にも困難ですが、細胞質環境を維持するのに優れているため、長時間安定した記録セッションが可能です。この記録構成の利点は、破裂パッチ記録と比較して、穴あきパッチの過分極活性化カチオン電流の安定性が向上することで示されています。
このプロトコルは 5 つのセクションに分かれています。セクション 1 から 3 では、事前に準備して保存できるソリューションとツールについて説明します。セクション4では、前庭およびSGNを解剖およびプレーティングするステップについて説明し、セクション5では、培養期間後のニューロンから記録するステップを説明します。私たちの手では、セクション4とセクション5は2日間連続して実行されます。
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Protocol
ここに記載されているすべての動物の使用は、南カリフォルニア大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されています。このプロトコルの動物は、チャールズリバー研究所から入手した雌雄のP3〜P25年齢のロングエバンスラットですが、これらの方法は他のげっ歯類株にも適用できます。すべての手順では白衣と手袋を着用し、溶液を作るときは飛沫防止ゴーグルを着用する必要があります。
1. 事前準備
注:このセクションで説明するソリューションとツールは、解剖と記録の日に使用するために、事前に十分に作成することができます。
- 10 mM HEPES(L-15溶液)を添加したLiebovitz培地を調製します。次の手順では、1 L の L-15 溶液の製造について説明します。
- 990mLの脱イオンH2Oを1つのビーカーに注ぐ。2.386 g(10 mM)のHEPESを測定して添加します。1LのL-15溶液粉末を1本加えます。
注:粉末L-15は貯蔵寿命が長く、保管スペースが少なくて済みます。または、L-15溶液を購入し、HEPESを補充します。後者のオプションには、フェノールフリー溶液を使用するオプションもあり、蛍光イメージングに有用です。 - 攪拌プレート上で溶液をかき混ぜます。pHメーターを使用して、1Nの水酸化ナトリウム(NaOH)をゆっくりと加え、pHを7.34〜7.36にします。
- 溶液が1,000mLの体積に達するまで脱イオンH2Oを添加する。孔径0.22μmのメンブレンを使用して溶液をろ過します。
注:L-15溶液は、4°Cで約1〜2週間保存できます。フェノールレッドで作られたL-15を使用する場合、溶液は塩基性(pH > 7.4)すぎるとピンク色に変わり、酸性すぎるとオレンジ色(pH < 7.34)になります。
- 990mLの脱イオンH2Oを1つのビーカーに注ぐ。2.386 g(10 mM)のHEPESを測定して添加します。1LのL-15溶液粉末を1本加えます。
- 前庭神経節ニューロン(VGN)用の培地を調製します(SGN用に修飾)。以下の手順に従って、50 mLの培地を作ります。
- 47.5 mLのGluMAX-I最小必須培地を清潔なガラスビーカーに加えます。
- 0.1194 g(10 mM)のHEPESを測定して添加します。この追加の緩衝液は、細胞が沈降する間、インキュベーターに移される前にpHの変化に耐えます。
- 2.5 mLのウシ胎児血清(FBS)を加えます。これにより、50 mLの培地の総容量で5容量%のFBSが得られます。SGN製剤では、2.5 mLのFBSを0.5 mLのN2および1 mLのB27溶液で置換します。
- 攪拌プレート上で溶液をかき混ぜます。pH メーターを使用して、1 N NaOH をゆっくりと加え、7.38 から 7.4 の間の pH を取得します。
- 0.5 mLのペニシリン-ストレプトマイシンを追加します。.0.22μmの滅菌フィルターで溶液をろ過します。溶液を4°Cで保存します。
- 使用の少なくとも30分前に、培養液を通気キャップ付きの組織培養フラスコに移します。培地の入ったフラスコを、37°Cで5%CO2 濃度のインキュベーターに入れます。
- 穴あきパッチの内部溶液を準備します
注:ここでは、100 mLの穿孔パッチ内部溶液を全細胞記録に用います(レシピを 表1に要約します)。これらの溶液は、事前に十分に調製し、-20°Cで保存することができます。 アリコートは、凍結と融解のサイクルを繰り返さない限り、-20°Cで無期限に保存できます。- 最大 6 か月前に、1 M KCl、0.5 M Mg2Cl(六水和物)、0.5 M CaCl2 の原液を作成して保管します。密閉ボトルに入れて、4°Cで最長6ヶ月間保管してください。
注:原液の浸透圧(1 M KCl原液では2,000 mOsm、Mg2ClおよびCaCl2 原液では1,500 mOsm)をチェックして、目標濃度に達していることを確認することをお勧めします。溶液が濁ったり、沈殿したりする場合は使用しないでください。これは、一時停止ポイントである可能性があります。
- 最大 6 か月前に、1 M KCl、0.5 M Mg2Cl(六水和物)、0.5 M CaCl2 の原液を作成して保管します。密閉ボトルに入れて、4°Cで最長6ヶ月間保管してください。
- 社内溶液作成当日は、ステップ1.3の原液を用いて以下の手順で進めてください。
- 100 mLのミリQ(MQ)H2Oを測定し、100 mLから40 mLを取り出し、清潔なビーカーに入れておきます。
- 残りの60mLのH2Oを清潔で滅菌済みの100mLビーカーに加える。2.5 mL の 1 M KCl、1 mL の 0.5 M Mg2Cl-六水和物、および 0.02 mL の 0.5 M CaCl2 を添加します。
- 攪拌棒を追加し、ビーカーを攪拌プレートに置きます。完全に溶けるまでかき混ぜます。1.307gのK2SO4を加える。K2SO4 が溶解するまで攪拌する。
- 0.1192 g の HEPES を秤量し(最終容量 100 mL でターゲット 5 mM)、溶液に加えます。溶けるまでかき混ぜます。
注意: K2SO4 が溶解するのに時間がかかる場合があるため、すべての成分が完全に溶解していることを確認してください。 - 0.1902 g のエチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸(EGTA)(最終容量 100 mL でターゲット 5 mM)を秤量し、溶液に加えます。EGTAは酸性溶液に完全には溶解しないため、ビーカーを攪拌板の上に置き、pHプローブを挿入します。
- 攪拌しながら、EGTAが完全に溶解するまで1 M KOHをゆっくりと滴定します。これは、pHが6〜7のときに発生することを期待してください。最終pHが7.35(合計で約1.2〜1.3 mLのKOH)になるまで、KOHをゆっくりと添加し続けます。
- MQH2Oを加えて溶液を最終容量100mLにし、撹拌します。溶液の浸透圧(穴あきパッチ溶液の目標270 mOsm/kg)を浸透圧計で確認します。
- 0.22 μmの滅菌フィルターを使用して、穴あきパッチの内部溶液をろ過します。5 mLのアリコートで-20°Cで保存してください。 新しい録音セッションごとに新しいアリコートを使用します。
注: これは、一時停止ポイントである可能性があります。
2. 粉砕ピペットの製作
注:トリチュレーションピペットは、複数の実験に再利用できます。ピペットは、使用前にエタノール、水、L-15溶液で洗い流し、使用後は水とエタノールで洗浄してください。使用の合間に慎重に保管してください。
- 細胞解離用のトリチュレーションピペットを調製するには、ガラス製のパスツールピペットをブンゼンバーナーの炎にかざします。ガラスの先端が溶け始めたら、ガラスを希望の先端の直径まで伸ばします。ピペットの片方の端を炎から引き離し、小さな曲がりを作ります。
- 曲げたピペットを顕微鏡に近づけます。スコアリングタイルを使用して、希望の直径でガラスに切り込みを入れて割ります。
- ピペットの先端をブンゼンバーナーの炎の上に通します。これにより、先端付近の粗いエッジをすばやく磨きます。先端が炎で密閉されていないことを確認してください。
- さまざまなサイズのピペットを4〜5本用意するまで、このプロセスを繰り返します。
3. パッチピペットの製作
注:記録セッションの前、ガングリオンの解剖と培養後にパッチピペットのセットを準備します。録音セッション中に一度に1つずつ作成する電極は、パフォーマンス上は最適ですが、これらを前夜にバッチとして作成すると、それなりの成功を収めています。ピペットは蓋付きのガラス容器に保管し、チップをほこりから保護します。
- 垂直電極プーラーと外径1.5mm/内径1.17mmのフィラメント付きホウケイ酸ガラスピペットを使用してください。ガラスにほこりや指紋が付着していないことを確認してください。
- メーカーがパッチピペットに推奨する2ステッププログラムを使用して、8〜10個の記録ピペットを引き出します。
- すべての記録ピペットチップをマイクロフォージで検査し、熱研磨します。熱研磨により、密閉性が向上します。ピペットの目標抵抗は4〜8MΩです。
- 研磨したピペットは蓋付きの容器に保管してください。これは、実験の一時停止ポイントとして扱うことができます。
注:ピペットの直径を最適化して目標の抵抗範囲に達するには、手順3.2と3.3で試行錯誤する必要があります。ほとんどの市販のパッチクランプシステムには、浴溶液中の電極抵抗を測定するためのメンブレンテスト機能が組み込まれています。抵抗は、印加された5mVのステップ刺激に応答する定常状態の出力電流の比として計算されます。ステップ3.1のプル設定とステップ3.2の研磨は、トライアルピペットの抵抗が4〜8MΩの範囲内に収まるまで、まずトライアルピペットを使用して調整する必要があります。 - 記録当日は、ピペットチップをコーティングして、ピペットの静電容量と記録ノイズを低減します。これを行うには、ピペットのシャフトにパラフィンフィルムの小さなストリップを巻き付けます。先端まで巻く必要はありません。
注:別の戦略は、ピペット12のシャフトにシリコーンエラストマーをコーティングして熱硬化させることです。
4. 前庭神経節の摘出と前庭神経細胞のプレーティング
- 解剖の準備
- L-15溶液と0.05%コラゲナーゼおよび0.25%トリプシンの酵素混合物を調製します。例えば、2 mLのL-15溶液に0.001 gのコラゲナーゼと0.005 gのトリプシンをビーカーに加え、小型のマグネチックスターラーを加え、完全に混ざるまで撹拌します。室温で取っておきます。
- 市販のギロチンを準備します ペーパータオルをギロチンの側面と下に置き、ベンチトップやその他の表面が血液やその他の生物学的物質にさらされるのを最小限に抑えます。
- 大きなステンレス製のハサミ、大きな鉗子、大きなスプリングハサミをレイアウトします。70%エタノールが入った大きなスプレーボトルを頭の掃除に手元に置いてください。
- 100 mLのビーカーにL-15溶液を入れ、氷上に置いた。L-15溶液を酸素化します。
- スプリングハサミ、手術用ハサミ、鉗子、メス、トランスファーピペットをレイアウトします( 材料表を参照)。
- 60 mmのシャーレ(肉眼的解剖用)と2つの35 mmシャーレ(神経節の洗浄/微細解離用)を準備します。0.22 μmのフィルターチップを備えた30 mLシリンジを使用して、60 mmのディッシュに酸素化L-15溶液を充填します。
- 安楽死、頭部洗浄、半切除
- 子犬の体重を量って、腹腔内に投与する致死的および希釈の適切な投与量を計算します(10 gあたり~0.01 mL)。.
- つま先のつまみに対する反応の欠如によって評価されるように、麻酔の深い平面に達したら、ギロチンを使用して斬首します。
- ヘッドを70%エタノールで完全にすすぎ、次にL-15溶液で完全にすすぎます。
- 頭蓋骨から皮膚を完全に取り除きます。大きなスプリングハサミを使用して、脊髄から脳への入り口から始めて、頭蓋骨の上部と顎の下部を2回切ります。手術用ハサミを使用して頭を二等分します。
- 頭脳側の両半分を下にして、L-15溶液で満たされた60mmのシャーレに入れます。現在解剖されていない新鮮な組織を氷の上に置きます。
- 上前庭神経節の摘出
- 閉じた手術用ハサミを使用して脳をすくい取ります。脳神経を切断して除去し、頭蓋骨から脳を完全に切り離します。
注意: この時点で、耳嚢(数字の8のような形)が後頭部に見えるはずです。 - 鉗子を使用し、後頭部から始めて、透明な膜状の物質を引き抜きます。
- 外科用ハサミを使用して頭蓋骨の上部を切り取ります。頭頸部の後ろから余分な組織を取り除き、解剖領域と耳嚢を清潔でアクセスしやすくします。
注意: 手順全体を通して余分な組織を捨てて、皿を曇らせすぎないようにします。 - 新鮮なL-15溶液を入れた2番目のペトリ皿に組織を移します。耳嚢と聴覚神経、上前庭神経、下前庭神経を見つけます。聴神経を切除し、小さなスプリングハサミで上神経節と下神経節を分離します。
注:前庭神経の体細胞は下神経節(薄い)と上神経節(厚い)の両方に見られますが、上神経節から抽出された細胞は生存率が高くなります。 - メスを使用して、骨の隆起をそっと剃り落とし、神経が骨嚢に潜る骨領域を弱めます。細かい鉗子で破片を慎重に取り除き、神経節の腫れた部分全体を露出させます。
- 細いスプリングハサミを使用して、卵形嚢に向かって潜っている末梢神経枝から神経節を切断して分離します。
- 細かい鉗子を使用して上神経節を取り除き、神経節組織に近づきすぎないように注意してください。新鮮なL-15溶液を入れた35mmペトリ皿に移します。
- 先に進む前に、酵素溶液を予熱します:酵素混合物を35 mmのシャーレに注ぎ、37°Cのインキュベーターに10〜15分間置きます。
- 細かい鉗子と小さなスプリングハサミを使用して、骨(構造が白く結晶化しているように見える)、余分な組織、神経線維、およびその他の余分な構造を取り除き、神経節をきれいにします。神経節組織の除去を最小限に抑えるように注意してください。
- 閉じた手術用ハサミを使用して脳をすくい取ります。脳神経を切断して除去し、頭蓋骨から脳を完全に切り離します。
- 組織の解離とプレーティング
- 洗浄した神経節を予熱した酵素溶液に移し、インキュベーターに10〜40分間戻します。酵素処理は、組織がバラバラになり始めると完了ですが、1つの部分にとどまります。組織を酵素で過剰処理すると、粉砕前に神経節が完全に溶解します。
注:組織が酵素処理を受ける時間は、動物の年齢によって異なります。例えば、P9ラットの神経節を酵素で25分間処理し、P15ラットの神経節を酵素で35分間処理します。 - 神経節を新鮮なL-15溶液を入れた35mmシャーレに移し、2〜3分間インキュベートします。
- 濾過した培地で満たされた別の35 mmペトリ皿に神経節を移します。
- 200 μLのマイクロピペットを使用して、ろ過した培地~150 μLの滴をコーティングされたガラス底のディッシュにピペットで移します。ガラスカバーガラスの上に残る溶液の気泡を形成するために表面張力を維持することが重要であるため、溶液を添加しすぎないでください。
- 必要な数の神経節(1〜4)をカバーガラスに移します。
- 培養皿から少量の培地を取り出し、粉砕ピペットを培地ですすぎ、組織がガラスピペットの側面にくっつかないようにします。神経節が十分に解離するまで、組織をピペットに穏やかに繰り返し通すことにより、粉砕します。
注:組織を酷使して単一細胞懸濁液を試みたり、過度の陽圧を使用して細胞を皿の底に衝突させたりしないでください。また、気泡を形成すると細胞の生存率が低下するため、避けてください。穏やかな粉砕は、細胞の生存を成功させるための鍵です。 - 細胞を5分間休ませます。光学顕微鏡で、細胞がカバーガラスに沈殿しているかどうかを確認します。
- 培養皿を37°Cのインキュベーターに12〜24時間慎重に入れます。繰り返しになりますが、溶液の泡をそのままにしてください。
注:24時間以上培養する場合は、培地を毎日更新してください。これは、一時停止ポイントである可能性があります。
- 洗浄した神経節を予熱した酵素溶液に移し、インキュベーターに10〜40分間戻します。酵素処理は、組織がバラバラになり始めると完了ですが、1つの部分にとどまります。組織を酵素で過剰処理すると、粉砕前に神経節が完全に溶解します。
- SGNのめっき
- 前庭神経節の指示の手順4.2.1から4.2.5に従って、頭を二等分します。
- 耳嚢(数字の8のような形をした)を見つけ、鈍い鉗子を使用して端を削って頭蓋骨から抽出します。
- L-15溶液を変更します。耳嚢のらせん状の部分には、コルチの器官を備えた蝸牛があります。細い鉗子を骨のカーブに平行に使用して、下にある組織を傷つけることなく、蝸牛ターンの上にある骨を削り取ります。
- 蝸牛の回転の全容が明らかになるのに十分な骨を切除したら、小さなスプリングハサミを使用して、蝸牛の基部にあるモディオラス(SGNの中心軸索を含む厚くて白い線維組織)を切断し、耳嚢の残りの部分から解放します。
- 細い鉗子で基部の線条をつまんで、線条血管を取り除きます。螺旋の周りを巻き、頂点まで巻き戻して、コルティの器官から剥がします。
- コルティの器官を小さなスプリングハサミを使用して2〜3回転に切り、平らになるようにします。
- 小さなスプリングハサミで各ターンからモディオルスを取り除きます。
- SGN線維路が有毛細胞に向かって突出する場所の端を切断して、らせん状神経節を取り除きます。
- 骨(白く結晶化して構造が見える)、モディオラス(白くて繊維状に見える)、およびその他の余分な構造を取り除くことにより、細かい鉗子を使用して神経節をきれいにします。神経節組織の除去を最小限に抑えるように注意してください。
- セクション4.4で前庭神経節に使用したらせん神経節を酵素的に治療する場合と同じ手順に従います。酵素時間は、通常、前庭神経節よりも細長いらせん神経節の方が短くなります。前庭神経節と比較して、らせん神経節には小径の粉砕ピペットを使用してください。
- 培地のレシピに示されているN2およびB27を添加した培地でらせん状神経節を粉砕します。
- 解離した神経節を含む培養皿を37°C、5%CO2 インキュベーターに12〜24時間入れます。
注: プロトコルはここで一時停止できます。
5. 録音
注:この手順では、孤立した神経節からのパッチクランプ記録は、通常、メッキの12〜24時間後に実行されます。他の研究室では、培養期間がはるかに長い後のニューロンからの結果が報告されています10。
- 記録室を準備する
- 培養皿で直接パッチクランプ記録が可能なクイック交換記録チャンバー(または同等のもの)を使用してください。倒立顕微鏡にチャンバーをセットします。
- ガラス底の培養皿をチャンバーに挿入します。
- L-15溶液を灌流チューブシステムを通して記録チャンバーに供給します。チャンバー内の灌流流入と流出を毎分0.5〜1 mLの速度で安定させます。.
- 電極を装填するための内部溶液の調製
- 穴あきパッチの内部溶液のアリコートを解凍します。.2.5 mLの溶液を35 mmの培養皿に割り当てます。培養皿の蓋を元に戻し、「Tip Dip」とラベル付けします。この溶液をできるだけ清潔に保つことが非常に重要であるため、ほこりのないゾーンに置いておきます。
- 1 mg のアムホテリシン B を秤量し、20 μL のジメチルスルホキシド(DMSO)を加えます。すべてのアムホテリシンBが溶液中に入るまで、溶液をボルテックスしてスピンダウンします。解凍した穴あきパッチ内溶液の残りの2 mLに、DMSO/アムホテリシン-B溶液10 μLを加えます。ピペットで溶液を2〜3回引き出して排出し、DMSO/アムホテリシン-Bが内部溶液に均一に混ざり合っていることを確認します。溶液は軽度の黄色がかった色合いになります。
- アムホテリシン-B穿孔パッチ内溶液を3 mLシリンジに引き込みます。シリンジに34Gのチップを追加します。シリンジをアルミホイルで包み、シリンジを氷上に保管します。
注:この溶液は、細胞膜の穿孔におけるアムホテリシン-Bの有効性を確保するために、2時間ごとに作り直す必要があります。アムホテリシンBは光に敏感であり、アルミホイルなどを使用して光から遮蔽する必要があります。
- パッチクランプ録音
- 10 倍または 20 倍の目的関数を使用してニューロンを可視化します。照明を調整し、光学系を最適化して、セルの周囲の境界と影を確認します。
- 単離されたニューロンの品質を確認します。コントラストが強すぎず、小さく分散したクレーターしか持たない滑らかで均一な表面を持つニューロンのみを試みてください。また、ニューロンのペア、破片に囲まれたニューロン、または他の細胞は避けてください。
- 100倍の倍率で、パッチを当てるニューロンまたはニューロンのフィールドを識別し、視野の中央に並べます。
- 培養皿に入れた清浄な溶液に先端を(~20秒間)浸し、アムホテリシンを含まない清浄な溶液でピペットの先端を満たします。毛細管現象により、少量の溶液がチップに引き込まれます。
注:このステップは、チップがチップディップ溶液をどの程度保持しているかを判断できる実体解剖顕微鏡で実行してください。溶液が10~20秒間保持されない場合、電極の形状は理想的ではありません。この場合、電極引き抜きプログラムを再構成して、より長いチップを生成します。 - 次に、ピペットの背面にアムホテリシンを含む内部溶液を入れます。ピペット内のフィラメントは、チップ内のクリーンな溶液を満たすために溶液を引き出します。フィラメントが溶液をスムーズに引き下げるのを待ち、気泡をたたこうとすると、アムホテリシンが先端に押し込まれるのが速すぎるため、気泡を出そうとしないでください。
- シリンジを使用して、電極の一番後ろにある可能性のある溶液を引き出します。
注意: この時点から着陸まで迅速に作業し、目的のセルに高抵抗シールを形成することが非常に重要です。 - ピペットをピペットホルダーに挿入します。ピペットがホルダーにぴったりと収まっていることを確認して、ピペットのドリフトを防ぎます。ピペットが安定していない場合は、ピペットホルダーの前面と背面にあるシーリングOリングを交換して、ドリフトを最小限に抑え、強力な吸引力を維持します。ピペットを充填したばかりのピペットと交換してください。
- ピペットを記録室の槽に下ろします。
- 視野の真ん中にあるピペットチップの位置を確認します。先端に気泡やその他の破片がないことを確認してください。
- メンブレンテストで電圧ステップ(5 mV)を印加して、ピペットの抵抗を監視します。セルにシールを形成するプロセス全体を通して、入力抵抗を監視し続けます。
- pClampのメンブレンテストモードでピペット電流がゼロになるように、ピペットオフセット電位をキャンセルします。
- パッチクランプアンプの高速静電容量補正機能(Multiclamp CommanderソフトパネルのCp高速ダイヤル)を使用して、ピペット静電容量を修正します。
- ピペットをセルまで移動します。
- ピペットがニューロンに十分近づいたら、高倍率の対物レンズに切り替え、カメラを通して画像をモニターに送ります(40倍の対物レンズ、合計400倍の倍率を使用)。ピペットを調整し、ニューロンを再びセンタリングします。
- 記録電極を体に近づけます。モニター上のニューロンの中心を特定し、ニューロンの上に記録電極を配置します。
- 電極が球状細胞の中心に着地するように、上からニューロンに近づきます。ピペットのオフセットを調整して、システム内の一定のDC電位をゼロにします。
- ピペットをメンブレンの近くに配置します。セルの中央にしっかりと着地します。
注意: 着陸すると、ニューロンの表面に小さなくぼみができ、入力抵抗が2倍/3倍になります。 - シリンジまたはマウスピペットを使用して陰圧(吸引)を加えます。-60mVの保持電位をオンにします。シール抵抗は、ギガオームを通過するまで増加する必要があります。
注意: 電極を充填してからセルに着地するまでの時間を短縮するために、迅速に作業してください。ステップ5.3.5で穴あきパッチ内部溶液に添加されたアムホテリシンが電極先端に到達するまでには限られた時間があります。先端がアムホテリシンで汚染されると、高抵抗シールを形成することが困難になり、抵抗はしばしば~200メガオームに停滞します。 - ギガオームのシールが形成されたら、負圧を解放します。シールが形成されたらすぐに、高速静電容量補正を適用して、メンブレンテストモードでのピペット静電容量トランジェントの振幅を可能な限り低減します。
- アムホテリシンが働き始めると、入力抵抗がゆっくりと減少し、5mVの電圧ステップに応答して流れる電流が徐々に増加し、アムホテリシンが膜に入るのを観察します。漸進的な安定化ではなく、直列抵抗の急激な減少は、自然破裂が起こったことを示唆しています。
- アンプの容量性過渡ヌル化機能を使用して、セル全体の静電容量と直列抵抗を推定します。実験の開始時および実験中に定期的に直列抵抗を記録し、監視します。
注:直列抵抗は、電極のサイズとピペットに引き込まれる清浄液の量に応じて、安定するまでに5〜20分かかる場合があります。電圧クランプ・モードと電流クランプ・モードは、直列抵抗が30メガオーム以下で安定した後に使用できます。記録中のニューロンの膨潤または収縮が観察されることがありますが、溶液の浸透圧とpHが正しく調整されている場合はめったに観察されません。
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Representative Results
電圧ステップのファミリを印加して電圧クランププロトコルを実行すると、さまざまな電流ファミリの電圧依存的なアクティブ化が明らかになります。VGNから誘発され、公開された記録13から適応された全セル電流の代表例を図1A、Bに示す。脱分極電圧(図1B)を印加すると、非常に急速に活性化および不活性化する内向き電流(慣例により負)が活性化されます(図1A)。これは、主に活動電位16,17の上昇ストロークを駆動するナトリウムチャネル14,15の電位依存性特性のステレオタイプである。また、脱分極は、活動電位のダウンストロークを駆動する、長時間持続し、比較的ゆっくりと活性化する外向きの電流を活性化します。薬理学は、これらの電流がVGN3,18,19,20,21のさまざまなカリウムチャネルによって主に運ばれることを明らかにしました。
深く、長く持続する過分極電圧は、過分極活性化環状ヌクレオチド(HCN)チャネル22 (図1C)によって運ばれるゆっくりと活性化する内向き電流を誘発します。これらの電流の活性化は、 図1Dに示すテールカレントプロトコルを使用して調べることができます。ここで、電流の活性化率は、テールステップ(Itail)中に流れる電流をコンディショニング電圧の関数としてプロットすることによってプローブされます。電流-電圧活性化曲線はシグモイド形状をしています(図1E)。このチャネルはサイクリックAMP(cAMP)などの可溶性セカンドメッセンジャーによってゲートされますが、穿孔パッチ構成を使用して測定された活性化曲線は、長時間の記録を通じて安定しています。対照的に、破裂パッチ構成で記録が行われると、チャネルのサイズと電圧活性化範囲が変化します(おそらく細胞質成分のウォッシュアウトによる)。
ニューロンの多様性は、異なるVGNとSGNに電流を注入したときに引き出される発火パターンの範囲によって示されます(図2、それぞれ上と下)。電流注入の開始時にのみ発火するニューロンもあれば、複数回発火するニューロンもあります。この不均一性は、VGNとSGNの両方における基礎となるナトリウムチャネルとカリウムチャネルの組成の基本的な多様性を反映しています23,24,25。
図1:イオン電流の多様なグループを測定するための電圧クランププロトコルの例。 (A,B) 電圧ステップ(B)のファミリーによって誘導されるセル全体の電流(A)の例。正味の内向きのナトリウム電流(負の電流)は、ここでは、その過渡的な活性化と不活性化によって識別されます(矢印、Na+とラベル付けされています)。正味の外向き電流(矢印、K +、長持ちする正の電流)は、主にカリウムイオンによって運ばれ、ナトリウム電流よりもはるかに遅い活性化および不活性化速度論を持っています。(C、D)HCN電流は、長時間の過分極電圧ファミリーによって活性化されます。(E、F)記録中のさまざまな時点での穿孔パッチのイオンチャネル特性評価の安定性。HCN電流の電圧依存性活性化曲線は、穿孔パッチ構成で測定されました I. 破裂パッチ構成中のHCN電流の活性化曲線(F)。画像C-Fは13から変更されています。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:電流のステップを注入することで、多様な発火パターンが誘発される。 (A)5つの前庭神経節体誩の発火パターン。(B) 5 つの SGN の発火パターン。 (C) 対応する現在のステップ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで紹介する方法は、単離されたニューロンからの記録に固有のものです。これまでの研究では、半無傷の調製物における軸索終末からの記録に焦点が当てられてきた。既存の端子記録技術と比較すると、絶縁記録は優れたスペースクランプと等電位挙動を提供します。さらに、このプロトコルは、萼軸受の亜集団のみが前庭上皮の半無傷の記録でアクセス可能であるため、ニューロンのより広いサンプルへのアクセスを提供します。最後に、単離された記録では、破裂パッチ記録における細胞内溶液と細胞質の間の透析によってしばしば中断される細胞内環境の破壊を防ぐ穿孔パッチ技術の使用が可能になります。
録音の成功は、まず単離され培養されたソマタの品質にかかっています。細胞の生存における重要なステップは、単離されたニューロンを生成するためにトリチュレーション中に必要な力です。細胞の生存には、優しい手が不可欠です。トリチュレーションピペットは、L-15溶液の気泡の高い位置に置き、ニューロンが皿の底に強制的に排出されるのを防ぐ必要があります。細胞の生存に問題が発生した場合は、気泡の形成や溶液の気泡の破壊を防ぎ、解離した細胞がカバーガラスに沈殿しないように特別な注意を払う必要があります。また、研究者が神経節がピペットを通過するときに軽度の抵抗を経験するような直径のピペットを柔軟に選択できるように、さまざまなサイズの熱研磨された粉砕ピペットを用意するのが最善です。ピペットを熱研磨することで、ガラスの粗いエッジに神経節を通すことによる損傷を軽減します。粗いエッジを残すことは、最初は神経節を壊すのに効果的であるように見えるかもしれませんが、このアプローチは体細胞を損傷し、培養期間後の生存率を低下させます。最後のアドバイスは、成功したトリチュレーションピペットを嫉妬深く保護することです。
細胞の生存に不可欠なもう一つの要因は、消化酵素による治療期間です。酵素の時間を決定する際、研究者は時間を慎重に調整して、組織がうまく壊れるようにする必要がありますが、細胞の生存に影響を与えるほどではありません。酵素処理された細胞から収集されたデータは、このアプローチに依存しない他の方法と一致しているように見えるため、酵素処理が細胞の生存とイオンチャネル特性に与える影響は最小限であることがわかりました19,26。酵素処理は粉砕に必要な力を最小限にするが、酵素消化(特にトリプシン単独またはパパインに基づく)はイオンチャネルに損傷を与えることが知られているという制限を伴う27。したがって、動物の年齢に応じて酵素のタイミングに関するいくつかのガイドラインを推奨しますが、結果に基づいて時間を調整する準備をすることが最善です。最後に、私たちは、トリチュレーションに対する「少ないほど良い」アプローチを奨励します。これは、単一細胞懸濁液を形成したいという衝動に抵抗し、組織の大きな塊がいくつか残っている場合でも、3〜4回の通過後に粉砕を停止することを意味します。
培養の利点は、体細胞膜をきれいにし、ミエリンを形成するグリア細胞の脱落を促進し、ニューロンからのパッチクランプをより成功させることです。したがって、単離および培養された神経節調製物は、生後1週目以降にパッチクランプ記録を延長するのに特に有用であり、その後、細胞体は徐々にミエリンで覆われるようになり、パッチクランプ電極を妨害する。生後2週目以降の単離および短期培養(<24時間)VGNからのパッチクランプ記録で観察されたイオンチャネル活性は、免疫組織化学および前庭上皮の萼末端からの直接記録によって見られるイオンチャネル発現の帯状および成熟学的変化と一致しています28,29。しかしながら、神経栄養因子および抗生物質によって助けられた長期培養もまた、イオンチャネル30,31,32,33,34に影響を及ぼす可能性があることに留意すべきである。これらの技術の適用は、ニューロンとそのイオンチャネル30,31,32,33,34の基礎となる生物物理学に対するこれらの要因の影響を慎重に検討する必要があります。
全体として、単離および培養された体細胞からのパッチクランプ記録は、内耳ニューロンのイオンチャネル特性の多様性を研究するのに適しています。穿孔パッチ構成の長期安定性は、HCNなどのイオンチャネルの研究に特に適していますが、その活性化特性は細胞質のセカンドメッセンジャー を介して 調節されます。
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Disclosures
著者らは、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
Jing Bing Xue博士とRuth Anne Eatock博士には、これらの方法への初期の貢献に感謝します。この研究は、NIH NIDCD R03 DC012652とNIH NIDCD DC012653S、R01 DC0155512 から RK に、T32 DC009975 から DB、NN、および KR の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | For perforated patch recordings. |
| ATP di-sodium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additive to internal solution |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | additive to culture medium, for SGN |
| Beakers (1000, 100, 10) milliliter | |||
| bench-top centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
| Bunsen burner | |||
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Additive to internal solution |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
| DMSO | Biotium | 90082 | |
| Dnase I,from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 11284932001 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Dumont #3 Forceps (Blunt) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont #55 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additive to internal solution |
| Electrode Puller | Narashige | PC-10 | |
| Epi-illumination light source | Zeiss | CL 1500 ECO | |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | for cleaning head and around dissection bench |
| Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
| Fine-edged dissection blade | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Glass Pasteur Pipettes | VWR | 14673-010 | to pull trituration pipettes |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | additive to culture medium |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | for pH buffering all solutions in protocol |
| Hot plate / magnetic stirrers | VWR | 76549-914 | |
| Insulated bucket filled with ice | to keep all samples and solutions cool | ||
| K2SO4, Potassium Sulfate | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additive to internal solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additive to internal solution |
| KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | To bring internal solution to desired pH. |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 14133-13 | |
| Leibovitz medium | Sigma Aldrich | L4386 | dissection and bath solutions |
| Low-profile-bath recording chamber for culture dishes | Warner Instruments | 64-0236 | |
| luer-lok syringes, 30 ml | BD | 302832 | for drawing L-15/HEPES/HEPES solution. |
| MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | base of the culture medium |
| MgCl2-Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M1028 | Additive to internal solution |
| microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
| Microforge | Narashige | MF-90 | For electrode polishing. |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | additiive to culture medium, for SGN |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additive to internal solution |
| NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | for titration pH |
| Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
| Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing | USC Material Management | MEDOX200 (Identifier: 00015) | for dissolving into dissection and bath solutions |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| Pasteur pipette bulb (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | bulb for trituration pipettes |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | additive to prevent contamination of culture medium |
| Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) | MWI Animal Health | 15199 | for euthanasia |
| PES membrane filters , 0.2 micrometer | Nalgene | 566-0020 | for filtering solutions |
| PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | for filtering solutions drawn into syringes |
| Petri dishes, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration |
| Petri Dishes, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | for gross dissection |
| pH Meter | Mettler Toledo | Model S20 | |
| Pipettors (1000, 200, 10) microliter | USA Scientific | ||
| Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish | Mattek | P35GC-0-10-C | to plate neurons for culture |
| Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes | Warner Instruments | 64-0375 | |
| Reference Cell | World Precision Instruments | RC1T | |
| Scalpel blade | Miltex | 4-315 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| Serological Pipettes (10, 25) milliliter | Fisher Scientific | ||
| Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) | Warner Instruments | 64-0378 | |
| Small Animal Guillotine | Kent Scientific | DCAP | |
| Small animal guillotine | Kent Scientific | DCAP | for decapitation if dissecting rats older than P15. |
| Stereo Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Straight surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Syringe (3, 10, 30) milliliter | |||
| Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Tuberculin syringe | Covidien | 8881500105 | for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection |
| Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Volumetric flask, 1000 milliliter | |||
| Vortex | VWR | 945300 | |
| Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |
References
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