Summary
Здесь представлены методы, содержащие подробные инструкции по препарированию, диссоциации, культивированию и записи патчей-зажимов из нейронов вестибулярного ганглия и спирального ганглия внутреннего уха.
Abstract
Компактная морфология изолированных и культивируемых ганглионарных нейронов внутреннего уха позволяет детально охарактеризовать ионные каналы и рецепторы нейротрансмиттеров, которые вносят свой вклад в разнообразие клеток в этой популяции. В этом протоколе описаны шаги, необходимые для успешного препарирования, диссоциации и кратковременного культивирования сомат биполярных нейронов внутреннего уха с целью записи патч-зажимов. Подробная инструкция по подготовке нейронов вестибулярного ганглия снабжена необходимыми модификациями, необходимыми для нанесения покрытия нейронов спиральных ганглиозов. Протокол включает в себя инструкции по выполнению записи с коммутационными зажимами всей ячейки в конфигурации перфорированного патча. Примеры результатов, характеризующих записи токов, опосредованных гиперполяризационными циклическими нуклеотидно-зависимыми (HCN)-опосредованными токами, подчеркивают стабильность конфигурации записи с перфорированным патчем по сравнению с более стандартной конфигурацией с разорванным патчем. Комбинация этих методов, изолированная сомата плюс перфорированные записи с заплатками-зажимами, может быть использована для изучения клеточных процессов, требующих длительных, стабильных записей и сохранения внутриклеточной среды, таких как передача сигналов через рецепторы, связанные с G-белком.
Introduction
Биполярные нейроны вестибулокохлеарного нерва соединяют сенсорные волосковые клетки внутреннего уха со стволом мозга. Они являются основными носителями информации о звуках и движениях головы; Повреждение этих важных клеток приводит к глухоте и нарушениям равновесия. Вестибулярная и слуховая части нерва состоят из различных типов клеток, которые морфологически и функционально разнообразны 1,2. В вестибулярном аппарате две афферентные субпопуляции спонтанно возбуждаются с интервалами, которые являются либо регулярными, либо нерегулярными. Считается, что время афферентного спайка отражает основное разнообразие в составе ионных каналов 3,4. В слуховой системе выделяют две основные субпопуляции нейронов спиральных ганглиозов (СГН); в то время как SGN типа I контактируют с отдельными внутренними волосковыми клетками5, SGN типа II контактируют с несколькими внешними волосковыми клетками5. Записи in vitro из полуинтактных и органотипических культур свидетельствуют о различиях в мембранных свойствах SGN I и II типов 6,7.
Многие ионные каналы и рецепторы нейротрансмиттеров, обнаруженные на концах этих нейронов, также находятся в их клеточных телах. Таким образом, культуры изолированных вестибулярных и спиральных ганглиозных сомат могут быть изучены in vitro , чтобы понять, как ионные каналы и рецепторы нейротрансмиттеров способствуют ответу этих нейронов. Компактная морфология изолированных клеточных тел позволяет получать высококачественные электрические записи, подходящие для детальной характеристики потенциал-зависимых ионных каналов и рецепторов нейротрансмиттеров. Легкий доступ к репрезентативному разнообразию подтипов нейронов позволяет проводить высокопроизводительный анализ разнообразия клеток.
В данной статье представлен метод выделения и культивирования диссоциированных тел ганглиозных клеток из верхней части вестибулярного ганглия у крыс на постнатальные сутки (Р)9–Р20. Также предлагаются варианты распространения этих методов на спиральный ганглий в дополнение к шагам, необходимым для успешного извлечения, диссоциации и покрытия ганглиозных клеток. Эти методы являются эволюцией методов, разработанных в публикациях различных лабораторий 8,9,10. Кроме того, в этот документ включено руководство по выбору здоровых клеток для записи с помощью патч-клэмпа.
Наконец, протокол описывает процедуру записи с использованием конфигурации 11 с использованием конфигурации11 с перфорированным патчем. Несмотря на то, что конфигурация с перфорированным пластырем является более трудоемкой и технически сложной, чем более распространенная конфигурация с разорванным пластырем, она лучше подходит для поддержания цитоплазматической среды, которая позволяет проводить длительные и стабильные сеансы записи. Преимущества этой конфигурации записи проиллюстрированы здесь улучшенной стабильностью гиперполяризационно-активированных катионных токов в перфорированном пластыре по сравнению с разорванным патчем.
Этот протокол состоит из пяти разделов. В разделах 1-3 описываются решения и инструменты, которые могут быть подготовлены и сохранены заранее. В разделе 4 описаны этапы препарирования и покрытия вестибулярного аппарата и СГН. В разделе 5 описаны этапы регистрации нейронов после определенного периода культивирования. В наших руках разделы 4 и 5 выполняются в течение 2 дней подряд.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все виды использования животных, описанные здесь, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Южной Калифорнии. Животными в этом протоколе являются крысы Лонг Эванс обоих полов в возрасте от P3 до P25, полученные из лабораторий Чарльз Ривер, но эти методы могут быть применены и к другим линиям грызунов. Во время всех процедур необходимо надевать лабораторный халат и перчатки, а также брызгозащитные очки при приготовлении растворов.
1. Подготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы и инструменты, описанные в этом разделе, могут быть изготовлены заблаговременно для использования в день вскрытия и записи.
- Приготовьте среду Liebovitz с добавлением 10 мМ HEPES (раствор L-15). Следующие шаги описывают приготовление 1 л раствора L-15.
- Налейте 990 мл деионизированногоH2Oв один стакан. Отмерьте и добавьте 2,386 г (10 мМ) HEPES. Добавьте один флакон 1 л порошка раствора L-15.
ПРИМЕЧАНИЕ: Порошкообразный L-15 имеет более длительный срок хранения и занимает меньше места при хранении. В качестве альтернативы приобретите раствор L-15 и дополните его HEPES. В последнем варианте также есть возможность использовать раствор без фенола, что полезно для флуоресцентной визуализации. - Перемешайте раствор на тарелке для перемешивания. С помощью рН-метра медленно добавьте 1 Н гидроксида натрия (NaOH), чтобы получить рН от 7,34 до 7,36.
- Добавляйте деионизированныйH2Oдо тех пор, пока раствор не достигнет объема 1000 мл. Отфильтруйте раствор с помощью мембраны с размером пор 0,22 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор L-15 можно хранить при температуре 4 °C около 1-2 недель. При использовании L-15, приготовленного с фенол-красным, раствор станет розовым, если он слишком щелочной (рН > 7,4), или оранжевым, если он слишком кислый (рН < 7,34).
- Налейте 990 мл деионизированногоH2Oв один стакан. Отмерьте и добавьте 2,386 г (10 мМ) HEPES. Добавьте один флакон 1 л порошка раствора L-15.
- Подготовьте питательную среду для нейронов вестибулярного ганглия (ВГН) (с модификацией для СГН). Выполните следующие действия, чтобы получить 50 мл питательной среды:
- Добавьте 47,5 мл минимальной необходимой среды GluMAX-I в чистый стеклянный стакан.
- Отмерьте и добавьте 0,1194 г (10 мМ) HEPES. Этот дополнительный буфер сопротивляется изменениям pH, пока клетки оседают, прежде чем их переместить в инкубатор.
- Добавьте 2,5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS). Это составляет 5% по объему ФБС в общем объеме 50 мл среды. Для препаратов СГН 2,5 мл ФБС заменяют 0,5 мл раствора N2 и 1 мл раствора В27.
- Перемешайте раствор на тарелке для перемешивания. Используя рН-метр, медленно добавляйте 1 Н NaOH, чтобы получить рН от 7,38 до 7,4.
- Добавьте 0,5 мл пенициллина-стрептомицина. Процеживают раствор через стерильный фильтр 0,22 мкм. Хранить раствор при температуре 4 °C.
- Не менее чем за 30 мин до использования переложите питательную среду в колбу для тканевых культур с вентилируемым колпачком. Поместите колбу с питательными средами в инкубатор с концентрациейСО2 5% при температуре 37 °C.
- Приготовьте перфорированный внутренний раствор
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь для регистрации всей клетки используется 100 мл внутреннего раствора перфорированного пластыря (рецепт обобщен в таблице 1). Эти растворы можно приготовить заблаговременно и хранить при температуре -20 °C. Аликвоты можно хранить неограниченное время при температуре -20 °C, если они не подвергаются повторному циклу замораживания и оттаивания.- За 6 месяцев до начала производства и хранения на складе растворы следующих веществ: 1 М KCl, 0,5 М Mg2Cl (гексагидрат) и 0,5 M CaCl2. Хранить в герметичных бутылках до 6 месяцев при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется проверить осмоляльность исходных растворов (2 000 мОсм для исходного раствора 1 М KCl; 1 500 мОсм для растворовMg2Cl и CaCl2 ), чтобы убедиться, что целевая концентрация достигнута. Не используйте, если раствор мутнеет или образует осадок. Это может быть возможной точкой паузы.
- За 6 месяцев до начала производства и хранения на складе растворы следующих веществ: 1 М KCl, 0,5 М Mg2Cl (гексагидрат) и 0,5 M CaCl2. Хранить в герметичных бутылках до 6 месяцев при температуре 4 °C.
- В день приготовления внутреннего раствора выполните следующие действия, используя исходные растворы из шага 1.3.
- Отмерьте 100 мл milli-Q (MQ)H2O. Вылейте 40 мл из 100 мл и отложите в чистую чашку.
- Добавьте оставшиеся 60 млH2Oв чистый и стерильный стакан объемом 100 мл. Добавьте 2,5 мл 1 М KCl, 1 мл 0,5 М мг2гексагидрата и 0,02 мл 0,5 М CaCl2.
- Добавьте перемешиватель и поместите стакан на тарелку для перемешивания. Перемешайте до полного растворения. Добавить 1,307 гК2СО4. Перемешивайте, пока K2SO4 не растворится.
- Взвесьте 0,1192 г HEPES (целевая концентрация 5 мМ в конечном объеме 100 мл) и добавьте в раствор. Перемешайте до полного растворения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все компоненты полностью растворены, так как иногда для растворения K2SO4 требуется время. - Взвесьте 0,1902 г этиленгликоль-бис(β-аминоэтилового эфира)-N,N,N′,N′-тетрауксусной кислоты (EGTA) (целевая 5 мМ в конечном объеме 100 мл) и добавьте в раствор. Поскольку EGTA не полностью растворяется в кислом растворе, поместите стакан на пластину для перемешивания и вставьте датчик pH.
- Помешивая, медленно титруйте 1 М КОН до полного растворения ЭГТА. Ожидайте, что это произойдет, когда pH будет между 6 и 7. Продолжайте медленно добавлять KOH до тех пор, пока окончательный pH не станет 7,35 (примерно от 1,2 до 1,3 мл KOH в общей сложности).
- Добавьте MQH2O, доведите раствор до конечного объема 100 мл и перемешайте. Осмоляльность раствора (целевая концентрация 270 мОсм/кг для раствора с перфорированным пластырем) проверяют с помощью осмометра.
- Отфильтруйте внутренний раствор перфорированного пластыря с помощью стерильного фильтра 0,22 мкм. Хранить в аликвотах по 5 мл при температуре -20 °C. Используйте новую аликвоту для каждого нового сеанса записи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть возможной точкой паузы.
2. Изготовление тритурационных пипеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Пипетки для растирания можно повторно использовать для нескольких экспериментов. Промывайте пипетки этанолом, водой и раствором L-15 перед каждым использованием и очищайте их водой и этанолом после каждого использования. Тщательно храните между использованиями.
- Чтобы подготовить тритурационные пипетки для диссоциации клеток, поднесите стеклянную пипетку Пастера к пламени горелки Бунзена. Как только стеклянный наконечник начнет плавиться, растяните стекло до желаемого диаметра. Оттяните один конец пипетки от пламени, чтобы создать небольшой изгиб.
- Поднесите согнутую пипетку к микроскопу. С помощью подрезной плитки надрежьте и разбейте стекло нужного диаметра.
- Проведите кончиком пипетки над пламенем горелки Бунзена. Это позволит быстро отполировать шероховатые края возле кончика. Убедитесь, что наконечник не запечатан пламенем.
- Повторяйте процесс до тех пор, пока не будут подготовлены четыре или пять пипеток разного размера.
3. Изготовление патч-пипеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте набор пластырных пипеток перед сеансом записи, но после рассечения ганглия и бактериологического исследования. Несмотря на то, что электроды, изготовленные по одному во время сеанса записи, являются оптимальными по производительности, разумный успех был достигнут, когда они были изготовлены партиями накануне вечером. Храните пипетки в закрытом стеклянном контейнере, чтобы защитить наконечники от пыли.
- Используйте вертикальный съемник электродов и пипетки из боросиликатного стекла с наружным диаметром 1,5 мм и внутренним диаметром 1,17 мм. Следите за тем, чтобы на стекле всегда не было пыли и отпечатков пальцев.
- Вытащите 8–10 записывающих пипеток с помощью двухступенчатой программы, рекомендованной производителем для патч-пипеток.
- Осмотрите и отполируйте каждый наконечник пипетки с помощью микрокузницы; Термическая полировка способствует лучшей герметизации. Целевое сопротивление пипетки составляет от 4 до 8 МОм.
- Храните полированные пипетки в закрытом контейнере. Это можно рассматривать как точку паузы в эксперименте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизация диаметра пипетки для достижения целевого диапазона сопротивления требует некоторых проб и ошибок на этапах 3.2 и 3.3. Большинство коммерческих систем с накладными зажимами имеют встроенную функцию тестирования мембраны для измерения сопротивления электродов в растворе ванны. Сопротивление вычисляется как отношение установившегося выходного тока в ответ на приложенный импульс с шагом 5 мВ. Настройки тяги на этапе 3.1 и полировки на шаге 3.2 должны быть сначала отрегулированы с помощью пробных пипеток до тех пор, пока сопротивление пробных пипеток не упадет в диапазоне от 4 до 8 МОм. - В день записи покройте наконечники пипеток, чтобы уменьшить емкость пипетки и шум при записи. Для этого оберните небольшую полоску парафиновой пленки на стержень пипетки. Не обязательно заворачивать до самого кончика.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативная стратегия заключается в нанесении покрытия и нагревании силиконового эластомера на стержне пипетки12.
4. Удаление вестибулярного ганглия и покрытие вестибулярных нейронов
- Подготовка к вскрытию
- Готовят ферментную смесь раствора L-15 с 0,05% коллагеназы и 0,25% трипсина. Например, добавьте в стакан 0,001 г коллагеназы и 0,005 г трипсина на 2 мл раствора L-15, добавьте небольшую магнитную мешалку и перемешайте до полного смешивания. Отложите при комнатной температуре.
- Подготовьте коммерческую гильотину, положив бумажные полотенца сбоку и под гильотину, чтобы свести к минимуму воздействие крови и других биологических материалов на столешницу и другие поверхности.
- Разложите большие ножницы из нержавеющей стали, большие щипцы и большие пружинные ножницы. Держите под рукой большую бутылку с 70% этанолом для мытья головы.
- Наполните стакан объемом 100 мл раствором L-15 и положите на лед. Насыщайте кислородом раствор L-15.
- Разложите пружинные ножницы, хирургические ножницы, щипцы, скальпель и пипетку для переноса (см. Таблицу материалов).
- Подготовьте чашку Петри диаметром 60 мм (для грубого рассечения) и две чашки Петри диаметром 35 мм (для очистки/тонкого рассечения ганглиесов). Наполните чашку диаметром 60 мм оксигенированным раствором L-15 с помощью шприца объемом 30 мл с фильтрующим наконечником 0,22 мкм.
- Эвтаназия, чистка головы и гемисекция
- Взвесьте щенков, чтобы рассчитать подходящую дозировку разведения fatal-plus для внутрибрюшинного введения (~0,01 мл на 10 г).
- После того, как будет достигнута глубокая анестезия, что оценивается по отсутствию реакции на защемление пальца ноги, обезглавьте с помощью гильотины.
- Тщательно промойте голову 70% этиловым спиртом, а затем тщательно раствором L-15.
- Полностью удалить кожу с черепа. Разделите голову пополам с помощью больших пружинных ножниц, начиная с точки входа спинного мозга в головной мозг и делая два надреза, первый разрез через верхнюю часть черепа, а второй через нижнюю часть челюсти. Закончите разрезать голову пополам хирургическими ножницами.
- Поместите обе половины головного мозга стороной вниз в чашку Петри диаметром 60 мм, наполненную раствором L-15. Положите свежую ткань, которая в данный момент не препарируется, на лед.
- Извлечение верхнего вестибулярного ганглия
- Вычерпайте мозг закрытыми хирургическими ножницами. Отрежьте и удалите черепно-мозговой нерв, чтобы полностью отделить мозг от черепа.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент ушная капсула (по форме напоминающая цифру 8) должна быть видна на затылке. - Используя щипцы, начиная с затылка, снимите прозрачный мембранный материал.
- Вырежьте верхнюю часть черепа хирургическими ножницами. Удалите лишнюю ткань с затылка и шеи, чтобы сделать область рассечения и капсулу ушной раковины более чистой и легкодоступной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не делайте блюдо слишком мутным, выбрасывая лишнюю ткань на протяжении всей процедуры. - Перенесите ткань во вторую чашку Петри со свежим раствором L-15. Определите местоположение ушной капсулы и слухового, верхнего вестибулярного и нижнего вестибулярных нервов. Отрежьте слуховой нерв и отделите верхний и нижний ганглии с помощью маленьких пружинных ножниц.
Примечание: Хотя соматы вестибулярного нерва обнаруживаются как в нижних (более тонких), так и в верхних (более толстых) ганглиях, клетки, извлеченные из верхнего ганглия, имеют лучшую выживаемость. - С помощью скальпеля аккуратно сбривают костный гребень, чтобы ослабить костный участок, под которым нерв погружается в костную капсулу. Осторожно удалите мусор тонкими щипцами, обнажив всю опухшую часть ганглия.
- С помощью тонких пружинных ножниц разрежьте и отделите ганглий от периферической нервной ветви, которая идет к утрикуле.
- Удалите верхний ганглий с помощью тонких щипцов, стараясь не зажимать слишком близко к ганглионарной ткани. Переложите в чашку Петри диаметром 35 мм со свежим раствором L-15.
- Перед началом работы ферментный раствор подогреть: перелить ферментную смесь в чашку Петри диаметром 35 мм и поместить в инкубатор при температуре 37 °С на 10-15 мин.
- Очистите ганглий с помощью тонких щипцов и маленьких пружинных ножниц, удалив кость (которая выглядит белой и кристаллизованной по структуре), лишнюю ткань, нервные волокна и любые другие лишние структуры. Позаботьтесь о том, чтобы свести к минимуму удаление любой ганглионарной ткани.
- Вычерпайте мозг закрытыми хирургическими ножницами. Отрежьте и удалите черепно-мозговой нерв, чтобы полностью отделить мозг от черепа.
- Диссоциация тканей и нанесение покрытий
- Очищенные ганглии переложить в предварительно подогретый раствор фермента и поместить обратно в инкубатор на 10-40 мин. Лечение ферментами завершается, как только ткань начинает распадаться, но остается целой. Чрезмерная обработка ткани ферментами приведет к полному растворению ганглиев перед трением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество времени, в течение которого ткань подвергается ферментативной обработке, зависит от возраста животного. Например, ганглии крыс Р9 обрабатывают ферментом в течение 25 мин, а ганглии крыс Р15 обрабатывают ферментом в течение 35 мин. - Переложить ганглии в чашку Петри диаметром 35 мм со свежим раствором L-15 и инкубировать 2-3 мин.
- Переносят ганглии в другую чашку Петри диаметром 35 мм, заполненную отфильтрованной питательной средой.
- С помощью микропипетки объемом 200 мкл капните ~150 мкл отфильтрованной питательной среды на чашку со стеклянным дном, покрытую покрытием. Не добавляйте слишком много раствора, так как важно поддерживать поверхностное натяжение, чтобы образовался пузырь раствора, который остается над стеклянным покровным стеклом.
- Перенесите нужное количество ганглиев (от одного до четырех) на покровное стекло.
- Наберите небольшое количество питательной среды из чашки для культивирования, чтобы промыть пипетку для растирания средой, чтобы предотвратить прилипание ткани к стенкам стеклянной пипетки. Растирайте, осторожно и многократно пропуская ткань через пипетку до тех пор, пока ганглии не будут достаточно диссоциированы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не переусердствуйте с тканями, чтобы попытаться получить одноклеточную суспензию, и не позволяйте клеткам падать на дно чашки при чрезмерном положительном давлении. Кроме того, избегайте образования пузырьков воздуха, так как это снизит выживаемость клеток. Щадящее растирание является ключом к успешному выживанию клеток. - Дайте клеткам отдохнуть в течение 5 минут. Проверьте под световым микроскопом, осели ли клетки на покровном стекле.
- Осторожно поместите чашку с культурой в инкубатор с температурой 37 °C на 12-24 ч. Опять же, убедитесь, что пузырь раствора не поврежден.
ПРИМЕЧАНИЕ: При культивировании более 24 часов ежедневно обновляйте питательные среды. Это может быть возможной точкой паузы.
- Очищенные ганглии переложить в предварительно подогретый раствор фермента и поместить обратно в инкубатор на 10-40 мин. Лечение ферментами завершается, как только ткань начинает распадаться, но остается целой. Чрезмерная обработка ткани ферментами приведет к полному растворению ганглиев перед трением.
- Гальваническое покрытие SGN
- Выполните шаги 4.2.1 - 4.2.5 инструкций по вестибулярному ганглию, чтобы разделить голову пополам.
- Найдите ушную капсулу (по форме похожую на цифру 8) и извлеките ее из черепа, отколов края тупыми щипцами.
- Замените раствор L-15. В спиральной части ушной капсулы находится улитка с органом Корти. Откалывайте кость, лежащую над кохлеарными витками, не повреждая подлежащие ткани, тонкими щипцами, параллельными изгибу кости.
- После того, как будет удалено достаточное количество кости, чтобы полностью обнажить кохлеарные повороты, используйте маленькие пружинные ножницы, чтобы разрезать модиол (толстая, белая, волокнистая ткань, содержащая центральные аксоны SGN) у основания улитки, чтобы освободить ее от остальной части ушной капсулы.
- Удалите сосудистую полосу, защипнув ее у основания тонкими щипцами. Раскрутите спираль и поднимитесь к вершине, чтобы освободить ее от органа Корти.
- Разрежьте орган корти на два-три витка маленькими пружинными ножницами так, чтобы он лежал ровно.
- Удалите модиол с каждого оборота маленькими пружинными ножницами.
- Удалите спиральный ганглий, разрезав по краю, где волокна SGN выступают в сторону волосковых клеток.
- Очистите ганглий с помощью тонких щипцов, удалив кость (которая кажется белой и кристаллизованной по структуре), модиол (который выглядит белым и волокнистым) и любые другие лишние структуры. Позаботьтесь о том, чтобы свести к минимуму удаление любой ганглионарной ткани.
- Следуйте той же процедуре, что и для ферментативной обработки спирального ганглия, используемой для вестибулярного ганглия в разделе 4.4. Ферментативное время, как правило, короче в спиральном ганглии, который более удлинен, чем вестибулярный ганглий. Используйте тритурационные пипетки меньшего диаметра для спирального ганглия по сравнению с вестибулярным ганглием.
- Растирают спиральный ганглий в питательной среде с добавлением N2 и B27, указанных в рецептуре питательных сред.
- Поместите чашку для культивирования, содержащую диссоциированные ганглии, в инкубатор с 5%СО2 при температуре 37 °C на 12-24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь.
5. Запись
ПРИМЕЧАНИЕ: При этой процедуре запись с помощью патч-зажима из изолированного ганглия обычно выполняется через 12-24 ч после нанесения покрытия. Другие лаборатории сообщили о результатах исследования нейронов после гораздо более длительных периодов в культуре10.
- Подготовьте записывающую камеру
- Используйте быстросменную записывающую камеру (или аналогичную), которая позволяет записывать с помощью патч-клэмпа непосредственно в чашке для культивирования. Установите камеру на инвертированный микроскоп.
- Вставьте в камеру чашки для культур со стеклянным дном.
- Подайте раствор L-15 через систему перфузионных трубок в регистрирующую камеру. Стабилизируйте входящий и исходящий поток перфузии в камере со скоростью 0,5-1 мл в минуту.
- Приготовьте внутренний раствор для загрузки электродов
- Разморозьте аликвоту перфорированного внутреннего раствора. Выделите 2,5 мл раствора на чашку для культуры диаметром 35 мм. Закройте чашку для культур крышкой и пометьте надписью «Tip Dip». Отложите в сторону, свободную от пыли, так как очень важно, чтобы этот раствор был как можно более чистым.
- Взвесьте 1 мг амфотерицина-В и добавьте 20 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Вихрь и вращайте раствор до тех пор, пока весь амфотерицин-В не окажется в растворе. Добавьте 10 мкл раствора ДМСО/амфотерицина-В к оставшимся 2 мл размороженного внутреннего раствора перфорированного пластыря. Удалите и рассейте раствор пипеткой два или три раза, чтобы убедиться, что ДМСО/амфотерицин-Б равномерно смешался с внутренним раствором. Раствор будет иметь слабо-желтоватый оттенок.
- Наберите внутренний раствор амфотерицина-В с перфорированным пластырем в шприц объемом 3 мл. Добавьте в шприц наконечник 34 г. Заверните шприц в алюминиевую фольгу и держите шприц на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор необходимо переваривать каждые 2 ч, чтобы обеспечить эффективность амфотерицина-B в перфорации клеточной мембраны. Амфотерицин-В чувствителен к свету, и его необходимо экранировать от света с помощью алюминиевой фольги или другими методами.
- Запись с помощью патч-зажима
- Визуализируйте нейроны с помощью объектива 10x или 20x. Отрегулируйте освещение и оптимизируйте оптику, чтобы увидеть границы и тени вокруг ячейки.
- Проверьте качество изолированных нейронов. Пробуйте только нейроны с гладкими и ровными поверхностями, которые не слишком сильно контрастируют и имеют только небольшие, рассеянные кратеры. Кроме того, избегайте пар нейронов, нейронов, окруженных мусором, или других клеток.
- При 100-кратном увеличении определите нейрон или поле нейронов, которые нужно заплатить, и выровняйте их в центре поля зрения.
- Наполните кончик пипетки чистым раствором, не содержащим амфотерицина, окунув наконечник (на ~20 с) в чистый раствор, помещенный в чашку для культивирования. Капиллярное действие втягивает небольшое количество раствора в наконечник.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг под стерео диссекционным микроскопом, который позволяет определить, насколько хорошо наконечник удерживает раствор Tip Dip. Если раствор не держится ~10-20 с, форма электрода не идеальна. В этом случае перенастройте программу вытягивания электрода, чтобы получить более длинный наконечник. - Затем заполните заднюю часть пипетки внутренним раствором, содержащим амфотерицин. Нить накаливания внутри пипетки будет втягивать раствор вниз, чтобы встретиться с чистым раствором в наконечнике. Позвольте нити плавно потянуть раствор вниз и не пытайтесь выстукивать пузырьки, так как это приведет к слишком быстрому присоединению амфотерицина к кончику.
- С помощью шприца вычеркните раствор, который может находиться в самой задней части электрода.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно работать быстро с этой точки, чтобы приземлиться и сформировать высокопрочное уплотнение на нужной ячейке. - Вставьте пипетку в держатель дозатора. Убедитесь, что пипетка плотно прилегает к держателю, чтобы предотвратить скольжение пипетки. Если пипетка неустойчива, замените уплотнительные кольца спереди и сзади держателя дозатора, чтобы свести к минимуму дрейф и обеспечить сильное всасывание. Замените пипетку свежезаполненной.
- Опустите пипетку в ванну записывающей камеры.
- Расположите наконечник пипетки в центре поля зрения. Убедитесь, что на наконечнике нет пузырьков воздуха или другого мусора.
- Примените шаг напряжения (5 мВ) при испытании мембраны, чтобы контролировать сопротивление пипетки. Продолжайте контролировать входное сопротивление на протяжении всего процесса формирования уплотнения на ячейке.
- Погасите потенциал смещения пипетки таким образом, чтобы ток пипетки показывал ноль в режиме тестирования мембраны pClamp.
- Отрегулируйте емкость пипетки с помощью функции быстрой компенсации емкости на усилителе с патч-клеммами (быстрые наборы Cp на программной панели Multiclamp Commander).
- Переместите пипетку вниз в ячейку.
- Как только пипетка окажется достаточно близко к нейрону, переключитесь на объектив с большим увеличением и отправьте изображение через камеру на монитор (используйте 40-кратный объектив, общее 400-кратное увеличение). Отрегулируйте пипетку и отцентрируйте нейрон.
- Переместите регистрирующий электрод ближе к соме. Найдите центр нейрона на мониторе и расположите регистрирующий электрод над нейроном.
- Подойдите к нейрону сверху так, чтобы электрод приземлился в центр сферической ячейки. Отрегулируйте смещение пипетки до нуля постоянных потенциалов постоянного тока в системе.
- Расположите пипетку близко к мембране. Приземляйтесь плотно по центру клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: При приземлении произойдет небольшое углубление на поверхности нейрона и удвоение/утроение входного сопротивления. - Применяют отрицательное давление (всасывание) с помощью шприца или ротовой пипетки. Включите удерживающий потенциал -60 мВ. Сопротивление уплотнения должно увеличиваться до тех пор, пока оно не пройдет гигаом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро, чтобы сократить время между заполнением электрода и посадкой на ячейку. Существует ограниченное время, прежде чем амфотерицин, добавленный во внутренний раствор перфорированного пластыря на этапе 5.3.5, достигнет кончика электрода. После того, как наконечник загрязнен амфотерицином, трудно сформировать высокопрочные уплотнения, и сопротивление часто выходит на плато до ~200 мегаом. - Как только образуется гигаомное уплотнение, сбросьте отрицательное давление. Как только сформируется уплотнение, примените быструю компенсацию емкости, чтобы максимально уменьшить амплитуду переходных процессов емкости пипетки в режиме мембранного теста.
- Когда амфотерицин начинает действовать, наблюдайте, как входное сопротивление медленно уменьшается, а ток, протекающий в ответ на шаг напряжения 5 мВ, постепенно увеличивается по мере того, как амфотерицин входит в мембрану. Внезапное снижение последовательного сопротивления вместо постепенной стабилизации говорит о том, что произошел спонтанный разрыв.
- Оцените емкость всей ячейки и последовательное сопротивление с помощью функции обнуления емкостных переходных процессов усилителя. Документируйте и контролируйте последовательное сопротивление в начале и во время эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стабилизация последовательного сопротивления может занять от 5 до 20 минут, в зависимости от размера электрода и количества чистого раствора, втягиваемого в пипетку. Режимы «напряжение-клещи» и «токоизмерительные клещи» можно использовать, как только последовательное сопротивление стабилизируется ниже 30 МОм. Иногда наблюдается набухание или сжатие нейронов во время записи, но редко при правильной настройке осмолярности и рН растворов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Запуск протоколов напряжения-подавления с применением семейств ступеней напряжения выявляет зависимую от напряжения активацию множества различных семейств токов. Репрезентативные примеры токов всей ячейки, вызванных VGN и адаптированных из опубликованных записей13, показаны на рисунке 1A,B. Применение деполяризационных напряжений (рис. 1B) активирует входящий ток (отрицательный по соглашению), который активируется и деактивируется очень быстро (рис. 1A). Это стереотипно для потенциал-зависимых свойств натриевых каналов14,15, которые в основном управляют восходящим ходом потенциалов действия16,17. Деполяризация также активирует длительный и относительно медленно активирующийся внешний ток, который приводит к нисходящему ходу потенциала действия. Фармакология показала, что эти токи в значительной степени переносятся различными калиевыми каналами в VGN 3,18,19,20,21.
Глубокие, длительно действующие гиперполяризационные напряжения вызывают медленно активирующийся внутренний ток, переносимый гиперполяризационно-активированными циклическими нуклеотидно-зависимыми каналами (HCN)22 (рис. 1C). Активация этих токов может быть изучена с помощью протокола хвостового тока, показанного на рисунке 1D. Здесь процент активации тока измеряется путем построения графика тока, протекающего во время хвостовой ступени (Itail), в зависимости от напряжения кондиционирования. Вольт-амперная кривая активации имеет сигмоидальную форму (рис. 1E). Несмотря на то, что этот канал закрыт растворимыми секундными мессенджерами, такими как циклический АМФ (цАМФ), кривые активации, измеренные с помощью конфигурации перфорированного патча, стабильны на протяжении всей длительной записи. В отличие от этого, размер и диапазон активации напряжения канала изменяются (предположительно из-за вымывания цитозольных компонентов), когда запись производится в конфигурации разорванного пластыря.
Разнообразие нейронов иллюстрируется диапазоном паттернов возбуждения, возникающих при инжекции токов в различные VGN и SGN (рис. 2; вверху и внизу, соответственно). Некоторые нейроны возбуждаются только в начале инъекции тока, в то время как другие возбуждаются несколько раз. Эта гетерогенность отражает фундаментальное разнообразие в составе нижележащих натриевых и калиевых каналов как в VGN, так и в SGN 23,24,25.
Рисунок 1: Примеры протоколов напряжения-клещей для измерения различных групп ионных токов. (A,B) Пример токов всей ячейки (A), индуцированных семейством ступеней напряжения (B). Суммарные входящие натриевые токи (отрицательные токи) идентифицируются здесь по их переходной активации и инактивации (помечена стрелкой, Na+). Суммарные внешние токи (помеченные стрелкой, K+, длительные положительные токи) переносятся в основном ионами калия и имеют гораздо более медленную кинетику активации и инактивации, чем натриевые токи. (С,Д) Токи HCN активируются семейством длительных гиперполяризационных напряжений. (Д,Ж) Стабильность характеристик ионных каналов в перфорированном участке в разные моменты времени во время записи. Кривые активации токов HCN в зависимости от напряжения были измерены в конфигурации с перфорированным патчем I. Кривые активации токов HCN в конфигурации с разорванным патчем (F). Изображения C-F были изменены с13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Различные паттерны возбуждения вызываются путем инжекции ступеней токов. (А) Паттерны возбуждения в пяти вестибулярных ганглиозных соматах. (B) Схемы стрельбы в пяти SGN. (C) Соответствующие текущие этапы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы, представленные здесь, специфичны для записей изолированных нейронов; Предыдущие исследования были сосредоточены на записях с окончаний аксонов в полуинтактном препарате. По сравнению с существующими методами терминальной записи, изолированные записи обеспечивают превосходные пространственные зажимы и изопотенциальные характеристики. Кроме того, этот протокол обеспечивает доступ к более широкой выборке нейронов, поскольку в полуинтактных записях вестибулярного эпителия доступны только субпопуляции, содержащие чашечку. Наконец, изолированные записи позволяют использовать технику перфорированного пластыря, которая предотвращает нарушение внутриклеточной среды, которое часто прерывается диализом между внутриклеточным раствором и цитозолью в записях разорванного пластыря.
Успешные записи в первую очередь зависят от качества изолированной и культивируемой соматы. Критическим этапом выживания клеток является сила, необходимая во время растирания для образования изолированных нейронов. Мягкая рука жизненно важна для выживания клетки. Пипетки для растирания следует помещать высоко в пузырь раствора L-15, чтобы предотвратить принудительное выталкивание нейронов на дно чашки. Если возникают проблемы с выживанием клеток, следует также принять дополнительные меры предосторожности, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха или разрушение пузырьков раствора, что предотвращает оседание диссоциированных клеток на покровном стекле. Кроме того, лучше всего иметь термоотполированные тритурационные пипетки различных размеров, чтобы исследователи могли выбрать пипетку с таким диаметром, чтобы ганглий испытывал умеренное сопротивление при прохождении через пипетку. Термическая полировка пипеток уменьшает повреждения, вызванные прохождением ганглия по шероховатым краям стекла. Оставление шероховатого края может показаться более эффективным для разрушения ганглиев, но этот подход повреждает соматы и снижает выживаемость после периода в культуре. И последний совет: ревностно беречь успешную пипетку для растирания.
Еще одним фактором, который имеет решающее значение для выживания клеток, является продолжительность лечения пищеварителями ферментами. При определении времени фермента исследователи должны тщательно отрегулировать время, чтобы убедиться, что ткань хорошо разрушается, но не настолько, чтобы повлиять на выживание клеток. Мы обнаружили, что влияние ферментативной обработки на выживаемость клеток и свойства ионных каналов минимально, поскольку данные, собранные из клеток, обработанных ферментами, по-видимому, согласуются с другими методами, которые не полагаются на этот подход19,26. Несмотря на то, что ферментативная обработка сводит к минимуму силу, необходимую для растирания, она сопряжена с ограничением, заключающимся в том, что ферментативное переваривание (особенно на основе только трипсина или папаина), как известно, вызывает повреждение ионных каналов27. Таким образом, несмотря на то, что мы рекомендуем некоторые рекомендации по срокам приема ферментов в зависимости от возраста животного, лучше быть готовым к корректировке времени в зависимости от результатов. Наконец, мы поощряем подход «лучше меньше, да лучше». Это означает, что нужно сопротивляться желанию образовать одноклеточную суспензию и останавливать растирание после трех или четырех проходов, даже если осталось несколько больших кусков ткани.
Преимущество культивирования заключается в том, что он, по-видимому, очищает мембрану соматических клеток и способствует отторжению миелинообразующих глиальных клеток, что затем позволяет более успешно зажимать участки нейронов. Таким образом, изолированный и культивируемый препарат ганглия особенно полезен для продления записей с заплатками после 1-й постнатальной недели, после чего клеточные тела постепенно покрываются миелином, препятствуя работе заплаточного электрода. Активность ионных каналов, наблюдаемая при регистрации патч-клэмпов из изолированных и кратковременных культивируемых (<24 ч) ВГН после 2-й постнатальной недели, согласуется с зональными и созревающими изменениями экспрессии ионных каналов, наблюдаемыми иммуногистохимическим методом и прямыми записями с окончаний чашечки в вестибулярном эпителии28,29. Однако следует отметить, что длительное культивирование с помощью нейротрофических факторов и антибиотиков может также влиять на ионные каналы 30,31,32,33,34. Любое применение этих методов должно тщательно учитывать влияние этих факторов на биофизику, лежащую в основе нейронов и их ионных каналов 30,31,32,33,34.
В целом, записи с помощью патч-зажимов из изолированных и культивируемых сомат пригодны для изучения разнообразия свойств ионных каналов нейронов внутреннего уха. Долговременная стабильность конфигурации перфорированного пластыря особенно подходит для изучения ионных каналов, таких как HCN, активационные свойства которых подвержены модуляции с помощью цитозольных вторых мессенджеров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы выражаем признательность докторам Цзин Бин Сюэ и Рут Энн Иток за их ранний вклад в эти методы. Эта работа была поддержана NIH NIDCD R03 DC012652 и NIH NIDCD DC012653S, а также R01 DC0155512 для РК и T32 DC009975 для DB, NN и KR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | For perforated patch recordings. |
| ATP di-sodium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additive to internal solution |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | additive to culture medium, for SGN |
| Beakers (1000, 100, 10) milliliter | |||
| bench-top centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
| Bunsen burner | |||
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Additive to internal solution |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
| DMSO | Biotium | 90082 | |
| Dnase I,from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 11284932001 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Dumont #3 Forceps (Blunt) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont #55 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additive to internal solution |
| Electrode Puller | Narashige | PC-10 | |
| Epi-illumination light source | Zeiss | CL 1500 ECO | |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | for cleaning head and around dissection bench |
| Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
| Fine-edged dissection blade | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Glass Pasteur Pipettes | VWR | 14673-010 | to pull trituration pipettes |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | additive to culture medium |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | for pH buffering all solutions in protocol |
| Hot plate / magnetic stirrers | VWR | 76549-914 | |
| Insulated bucket filled with ice | to keep all samples and solutions cool | ||
| K2SO4, Potassium Sulfate | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additive to internal solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additive to internal solution |
| KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | To bring internal solution to desired pH. |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 14133-13 | |
| Leibovitz medium | Sigma Aldrich | L4386 | dissection and bath solutions |
| Low-profile-bath recording chamber for culture dishes | Warner Instruments | 64-0236 | |
| luer-lok syringes, 30 ml | BD | 302832 | for drawing L-15/HEPES/HEPES solution. |
| MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | base of the culture medium |
| MgCl2-Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M1028 | Additive to internal solution |
| microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
| Microforge | Narashige | MF-90 | For electrode polishing. |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | additiive to culture medium, for SGN |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additive to internal solution |
| NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | for titration pH |
| Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
| Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing | USC Material Management | MEDOX200 (Identifier: 00015) | for dissolving into dissection and bath solutions |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| Pasteur pipette bulb (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | bulb for trituration pipettes |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | additive to prevent contamination of culture medium |
| Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) | MWI Animal Health | 15199 | for euthanasia |
| PES membrane filters , 0.2 micrometer | Nalgene | 566-0020 | for filtering solutions |
| PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | for filtering solutions drawn into syringes |
| Petri dishes, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration |
| Petri Dishes, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | for gross dissection |
| pH Meter | Mettler Toledo | Model S20 | |
| Pipettors (1000, 200, 10) microliter | USA Scientific | ||
| Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish | Mattek | P35GC-0-10-C | to plate neurons for culture |
| Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes | Warner Instruments | 64-0375 | |
| Reference Cell | World Precision Instruments | RC1T | |
| Scalpel blade | Miltex | 4-315 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| Serological Pipettes (10, 25) milliliter | Fisher Scientific | ||
| Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) | Warner Instruments | 64-0378 | |
| Small Animal Guillotine | Kent Scientific | DCAP | |
| Small animal guillotine | Kent Scientific | DCAP | for decapitation if dissecting rats older than P15. |
| Stereo Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Straight surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Syringe (3, 10, 30) milliliter | |||
| Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Tuberculin syringe | Covidien | 8881500105 | for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection |
| Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Volumetric flask, 1000 milliliter | |||
| Vortex | VWR | 945300 | |
| Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |
References
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Goldberg, J. M. Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways. Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).
- Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons. Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).
- Smith, C. E., Goldberg, J. M. A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents. Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).
- Berglund, A. M., Ryugo, D. K. Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse. The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).
- Jagger, D. J., Housley, G. D. Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice. Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).
- Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro). The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).
- Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).
- Mo, Z. L., Davis, R. L. Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).
- Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).
- Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse. Journal of Visualized Experiments. (48), e2442 (2010).
- Bronson, D., Kalluri, R. Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo. The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).
- Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons. Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).
- Bean, B. P. The action potential in mammalian central neurons. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).
- Izhikevich, E. M. Dynamical Systems in Neuroscience. , MIT Press. (2018).
- Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons. Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).
- Risner, J. R., Holt, J. R. Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).
- Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).
- Cervantes, B., Vega, R., Limón, A., Soto, E. Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons. Neuroscience. 240, 163-175 (2013).
- Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function. Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).
- Davis, R. L., Crozier, R. A. Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons. Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).
- Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery. Hearing Research. 336, 1-16 (2016).
- Eatock, R. A., Christov, F. Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear. , Elsevier. (2020).
- Kalluri, R. Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 710275 (2021).
- Armstrong, C. E., Roberts, W. M. Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).
- Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia. Brain Research. 1139, 117-125 (2007).
- Meredith, F. L., Rennie, K. J. Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals. Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).
- Cai, H. Q., et al. Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics. Hearing Research. 350, 122-132 (2017).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).
- Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).
- Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3. The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).
- Liu, X. -P., et al. Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents. Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).
