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Neuroscience

पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए नवजात कृन्तकों से वेस्टिबुलर और सर्पिल गैंग्लियन सोमाता को अलग करना और संवर्धन करना

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/64908
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Caruso Department of Otolaryngology Head & Neck Surgery, Zilkha Neurogenetics Institute, Hearing and Communications Neuroscience Training Program, University of Southern California

Summary

यहाँ प्रस्तुत तरीके विदारक के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान कर रहे हैं, dissociating, संवर्धन, और भीतरी कान के वेस्टिबुलर नाड़ीग्रन्थि और सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स से पैच-दबाना रिकॉर्डिंग.

Abstract

पृथक और सुसंस्कृत आंतरिक कान नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स की कॉम्पैक्ट आकृति विज्ञान आयन चैनलों और न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स के विस्तृत लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है जो इस आबादी में सेल विविधता में योगदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के उद्देश्य से आंतरिक कान द्विध्रुवी न्यूरॉन्स के सोमाता के सफल विदारक, पृथक्करण और अल्पकालिक संवर्धन के लिए आवश्यक चरणों की रूपरेखा तैयार करता है। वेस्टिबुलर गैंग्लियन न्यूरॉन्स तैयार करने के लिए विस्तृत निर्देश सर्पिल गैंग्लियन न्यूरॉन्स चढ़ाना के लिए आवश्यक आवश्यक संशोधनों के साथ प्रदान किए जाते हैं। प्रोटोकॉल में छिद्रित-पैच कॉन्फ़िगरेशन में पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग करने के निर्देश शामिल हैं। हाइपरपोलराइजेशन-सक्रिय चक्रीय न्यूक्लियोटाइड-गेटेड (एचसीएन) -मध्यस्थता धाराओं के वोल्टेज-क्लैंप रिकॉर्डिंग की विशेषता वाले उदाहरण परिणाम अधिक मानक टूट-पैच कॉन्फ़िगरेशन की तुलना में छिद्रित-पैच रिकॉर्डिंग कॉन्फ़िगरेशन की स्थिरता को उजागर करते हैं। इन विधियों का संयोजन, पृथक सोमाता प्लस छिद्रित-पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग, का उपयोग सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जिनके लिए लंबी, स्थिर रिकॉर्डिंग और इंट्रासेल्युलर मील के संरक्षण की आवश्यकता होती है, जैसे कि जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स के माध्यम से सिग्नलिंग।

Introduction

वेस्टिबुलोकोक्लियर तंत्रिका के द्विध्रुवी न्यूरॉन्स आंतरिक कान की संवेदी बाल कोशिकाओं को ब्रेनस्टेम से जोड़ते हैं। वे ध्वनि और सिर आंदोलनों के बारे में जानकारी के प्रमुख वाहक हैं; इन महत्वपूर्ण कोशिकाओं को नुकसान से बहरापन और संतुलन विकार होता है। तंत्रिका के वेस्टिबुलर और श्रवण भागों में प्रत्येक अलग-अलग सेल प्रकार शामिल होते हैं जो रूपात्मक और कार्यात्मक रूप से विविध 1,2 होते हैं। वेस्टिबुलर प्रणाली में, दो अभिवाही उप-जनसंख्या अंतराल पर अनायास आग लगाते हैं जो या तो नियमित या अनियमित होते हैं2. अभिवाही स्पाइक समय आयन चैनल संरचना 3,4 में एक अंतर्निहित विविधता को प्रतिबिंबित करने के लिए सोचा है. श्रवण प्रणाली में, सर्पिल गैंग्लियन न्यूरॉन्स (एसजीएन) के दो मुख्य उप-जनसंख्या हैं; जबकि टाइप I SGN व्यक्तिगत आंतरिक बाल कोशिकाओं से संपर्क करते हैं5, टाइप II SGN कई बाहरी बाल कोशिकाओं से संपर्क करतेहैं 5. अर्ध-बरकरार और organotypic संस्कृतियों से इन विट्रो रिकॉर्डिंग प्रकार मैं और प्रकार द्वितीय SGNs 6,7 की झिल्ली गुणों में अंतर का सुझाव.

इन न्यूरॉन्स के टर्मिनलों पर पाए जाने वाले कई आयन चैनल और न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स भी उनके सेल बॉडी में पाए जाते हैं। जैसे, पृथक वेस्टिबुलर और सर्पिल नाड़ीग्रन्थि सोमाटा की संस्कृतियों का अध्ययन इन विट्रो में किया जा सकता है ताकि यह समझा जा सके कि आयन चैनल और न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स इन न्यूरॉन्स की प्रतिक्रिया में कैसे योगदान करते हैं। पृथक सेल निकायों की कॉम्पैक्ट आकृति विज्ञान उच्च गुणवत्ता वाली विद्युत रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है, जो वोल्टेज-गेटेड आयन चैनलों और न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स के विस्तृत लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त है। न्यूरॉन उपप्रकारों की एक प्रतिनिधि किस्म के लिए आसान पहुँच सेल विविधता के उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण के लिए अनुमति देता है।

यह लेख प्रसवोत्तर दिन (पी) 9 से पी 20 में चूहों में वेस्टिबुलर गैंग्लियन के बेहतर हिस्से से अलग नाड़ीग्रन्थि सेल निकायों को अलग करने और संवर्धन के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं को सफलतापूर्वक निकालने, अलग करने और चढ़ाना के लिए आवश्यक चरणों के अलावा, सर्पिल नाड़ीग्रन्थि के लिए इन तरीकों का विस्तार करने के लिए सुझाव भी प्रदान किए जाते हैं। ये विधियां विभिन्न प्रयोगशालाओं 8,9,10 के प्रकाशनों में तैयार किए गए लोगों का एक विकास हैं। इसके अलावा इस पत्र में शामिल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए स्वस्थ कोशिकाओं का चयन करने के लिए मार्गदर्शन है.

अंत में, प्रोटोकॉल छिद्रित पैच विन्यास11 का उपयोग कर पैच-दबाना रिकॉर्डिंग के लिए प्रक्रिया की रूपरेखा. हालांकि छिद्रित-पैच कॉन्फ़िगरेशन अधिक समय लेने वाली और अधिक सामान्य टूट-पैच कॉन्फ़िगरेशन की तुलना में अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, यह साइटोप्लाज्मिक परिवेश को बनाए रखने के लिए बेहतर है जो लंबे और स्थिर रिकॉर्डिंग सत्रों की अनुमति देता है। इस रिकॉर्डिंग विन्यास के लाभों को टूट-पैच रिकॉर्डिंग के सापेक्ष छिद्रित-पैच में हाइपरपोलराइजेशन सक्रिय धनायनित धाराओं की बेहतर स्थिरता के माध्यम से यहां चित्रित किया गया है।

इस प्रोटोकॉल को पांच खंडों में व्यवस्थित किया गया है। अनुभाग 1-3 उन समाधानों और उपकरणों का वर्णन करते हैं जिन्हें समय से पहले तैयार और संग्रहीत किया जा सकता है। धारा 4 विदारक और वेस्टिबुलर और SGN चढ़ाना के लिए चरणों का वर्णन करता है. धारा 5 संस्कृति में एक अवधि के बाद न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग के लिए चरणों का वर्णन करता है. हमारे हाथों में, धारा 4 और धारा 5 लगातार 2 दिनों की अवधि में किए जाते हैं।

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Protocol

यहां वर्णित सभी जानवरों के उपयोग को दक्षिणी कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है। इस प्रोटोकॉल में पशु चार्ल्स नदी प्रयोगशालाओं से प्राप्त दोनों लिंगों के पी 3- से पी 25-वृद्ध लांग इवांस चूहे हैं, लेकिन इन विधियों को अन्य कृंतक उपभेदों पर लागू किया जा सकता है। एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने सभी प्रक्रियाओं के दौरान पहना जाना चाहिए, साथ ही समाधान बनाते समय छप-सुरक्षात्मक चश्मे भी।

1. तैयारी

नोट: इस खंड में वर्णित समाधान और उपकरण विच्छेदन और रिकॉर्डिंग के दिन उपयोग किए जाने के लिए समय से पहले अच्छी तरह से बनाए जा सकते हैं।

  1. 10 मिमी HEPES (एल -15 समाधान) के साथ पूरक Liebovitz मीडिया तैयार करें. निम्नलिखित चरण एल -15 समाधान के 1 एल बनाने का वर्णन करते हैं।
    1. एक बीकर में विआयनीकृत एच2ओ के 990 एमएल डालो. HEPES के 2.386 ग्राम (10 मिमी) को मापें और जोड़ें। एल -15 समाधान पाउडर के 1 एल की एक बोतल जोड़ें।
      नोट: पाउडर एल -15 में एक लंबा शेल्फ जीवन है और कम भंडारण स्थान लेता है। वैकल्पिक रूप से, एल -15 समाधान खरीदें और HEPES के साथ पूरक करें। बाद वाले विकल्प में फिनोल-मुक्त समाधान का उपयोग करने का विकल्प भी है, जो प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए उपयोगी है।
    2. एक हलचल प्लेट पर समाधान हिलाओ। पीएच मीटर का उपयोग करके, 7.34 और 7.36 के बीच पीएच प्राप्त करने के लिए धीरे-धीरे 1 एन सोडियम हाइड्रॉक्साइड (NaOH) जोड़ें।
    3. विआयनीकृत एच2ओ जोड़ें जब तक कि समाधान 1,000 एमएल की मात्रा तक नहीं पहुंच जाता। एक 0.22 माइक्रोन ताकना आकार झिल्ली का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर.
      नोट: एल-15 समाधान लगभग 1-2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। यदि फिनोल-लाल के साथ बने एल -15 का उपयोग करते हैं, तो समाधान गुलाबी हो जाएगा यदि बहुत बुनियादी (पीएच > 7.4) या नारंगी यदि बहुत अम्लीय (पीएच < 7.34)।
  2. वेस्टिबुलर गैंग्लियन न्यूरॉन्स (वीजीएन) (एसजीएन के लिए संशोधन के साथ) के लिए संस्कृति माध्यम तैयार करें। संस्कृति माध्यम के 50 एमएल बनाने के लिए नीचे दिए गए चरणों का पालन करें:
    1. एक साफ ग्लास बीकर के लिए GluMAX-I न्यूनतम आवश्यक माध्यम के 47.5 एमएल जोड़ें।
    2. HEPES के 0.1194 ग्राम (10 मिमी) को मापें और जोड़ें। यह अतिरिक्त बफर पीएच परिवर्तन का विरोध करता है, जबकि कोशिकाओं को बसने से पहले, इनक्यूबेटर में ले जाया जा रहा है।
    3. भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 2.5 एमएल जोड़ें। यह मध्यम के 50 एमएल की कुल मात्रा में मात्रा एफबीएस द्वारा 5% बनाता है। एसजीएन तैयारी के लिए, एफबीएस के 2.5 एमएल को एन 2 के 0.5 एमएल और बी 27 समाधानों के 1 एमएल के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है।
    4. एक हलचल प्लेट पर समाधान हिलाओ। पीएच मीटर का उपयोग करके, 7.38 और 7.4 के बीच पीएच प्राप्त करने के लिए धीरे-धीरे 1 एन एनएओएच जोड़ें।
    5. पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के 0.5 एमएल जोड़ें। एक 0.22 माइक्रोन बाँझ फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर. समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    6. उपयोग करने से पहले कम से कम 30 मिनट, संस्कृति मीडिया को एक टिशू कल्चर फ्लास्क में एक वेंटेड कैप के साथ स्थानांतरित करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 एकाग्रता के साथ एक इनक्यूबेटर में संस्कृति मीडिया के साथ फ्लास्क रखें.
  3. छिद्रित-पैच आंतरिक समाधान तैयार करें
    नोट: यहां, छिद्रित-पैच आंतरिक समाधान के 100 एमएल का उपयोग पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए किया जाता है (नुस्खा तालिका 1में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है)। इन समाधानों को पहले से अच्छी तरह से तैयार किया जा सकता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। एलिकोट्स को -20 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल तक संग्रहीत किया जा सकता है यदि वे ठंड और विगलन के बार-बार चक्र से नहीं गुजरते हैं।
    1. समय से 6 महीने पहले, निम्नलिखित के स्टॉक समाधान बनाएं और स्टोर करें: 1 एम केसीएल, 0.5 एम एमजी2सीएल (हेक्साहाइड्रेट), और 0.5 एम सीएसीएल2। एयरटाइट बोतलों में 6 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: स्टॉक समाधानों की परासरणीयता (1 M KCl स्टॉक समाधान के लिए 2,000 mOsm; Mg2Cl और CaCl2 समाधानों के लिए 1,500 mOsm) की जांच करना एक अच्छा विचार है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि लक्ष्य एकाग्रता तक पहुँच गया है। यदि घोल धुंधला हो जाता है या अवक्षेपित हो जाता है तो इसका उपयोग न करें। यह एक संभावित ठहराव बिंदु हो सकता है।
  4. आंतरिक समाधान बनाने के दिन, चरण 1.3 से स्टॉक समाधान का उपयोग करके नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    1. मिली-क्यू (एमक्यू) एच2ओ के 100 एमएल को मापें 100 एमएल से 40 एमएल निकालें और एक साफ बीकर में अलग सेट करें।
    2. एच2ओ के शेष 60 एमएल को एक साफ और बाँझ 100 एमएल बीकर में जोड़ें। 1 एम केसीएल के 2.5 एमएल, 0.5 एम एमजी2सीएल-हेक्साहाइड्रेट के 1 एमएल, और 0.5 एम सीएसीएल2 के 0.02 एमएल जोड़ें।
    3. एक हलचल बार जोड़ें और एक हलचल प्लेट पर बीकर जगह. पूरी तरह से घुलने तक हिलाएं। K2SO4 का 1.307 ग्राम जोड़ें। K2SO4 के घुलने तक हिलाएं।
    4. HEPES के 0.1192 ग्राम (100 एमएल अंतिम मात्रा में लक्ष्य 5 मिमी) वजन करें और समाधान में जोड़ें। घुलने तक हिलाएं।
      NOTE: सुनिश्चित गर्नुहोस् कि सबै कम्पोनेन्टहरू पूर्ण रूपमा भलो छन्, किनकि कद-कधीही K2SO4 भळण्यासाठी वेळ लागतात.
    5. एथिलीन ग्लाइकॉल-बीआईएस (β-एमिनोएथिल ईथर) के 0.1902 ग्राम वजन) -एन, एन, एन', एन'-टेट्राएसेटिक एसिड (ईजीटीए) (100 एमएल अंतिम मात्रा में लक्ष्य 5 मिमी) और समाधान में जोड़ें। चूंकि ईजीटीए एक अम्लीय घोल में पूरी तरह से नहीं घुलता है, इसलिए बीकर को हलचल प्लेट पर रखें और पीएच जांच डालें।
    6. सरगर्मी करते समय, धीरे-धीरे 1 M KOH को तब तक टाइट्रेट करें जब तक कि EGTA पूरी तरह से घुल न जाए। यह तब होने की उम्मीद है जब पीएच 6 और 7 के बीच हो। अंतिम पीएच 7.35 (कुल में केओएच के लगभग 1.2 से 1.3 एमएल) होने तक धीरे-धीरे केओएच जोड़ना जारी रखें।
    7. 100 एमएल की अंतिम मात्रा में समाधान लाने के लिए एमक्यूएच2ओ जोड़ें और हलचल करें। एक ऑस्मोमीटर के साथ समाधान की परासरणता (छिद्रित-पैच समाधान के लिए लक्ष्य 270 mOsm/kg) की जाँच करें।
    8. 0.22 माइक्रोन बाँझ फिल्टर का उपयोग करके छिद्रित-पैच आंतरिक समाधान फ़िल्टर करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 5 एमएल एलिकोट में स्टोर करें। प्रत्येक नए रिकॉर्डिंग सत्र के लिए एक नया विभाज्य का प्रयोग करें.
      नोट: यह एक संभावित ठहराव बिंदु हो सकता है।

2. विचूर्णन पिपेट बनाना

नोट: विचूर्णन पिपेट कई प्रयोगों के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है। प्रत्येक उपयोग से पहले इथेनॉल, पानी, और एल -15 समाधान के साथ पिपेट फ्लश और प्रत्येक उपयोग के बाद उन्हें पानी और इथेनॉल के साथ साफ. उपयोग के बीच सावधानी से स्टोर करें।

  1. सेल पृथक्करण के लिए विचूर्णन पिपेट तैयार करने के लिए, एक बन्सन बर्नर की लौ के लिए एक गिलास पाश्चर विंदुक पकड़ो. एक बार जब कांच की नोक पिघलने लगे, तो ग्लास को वांछित टिप व्यास तक फैलाएं। विंदुक के एक छोर को लौ से दूर खींचो एक छोटा मोड़ बनाने के लिए।
  2. एक खुर्दबीन के पास तुला विंदुक लाओ. एक स्कोरिंग टाइल का प्रयोग, स्कोर और वांछित व्यास पर कांच को तोड़ने.
  3. बन्सन बर्नर लौ के शीर्ष पर विंदुक की नोक पास करें। यह टिप के पास खुरदरे किनारों को जल्दी से पॉलिश करेगा। यह सुनिश्चित करने के लिए जांचें कि टिप लौ से सील नहीं है।
  4. प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि अलग-अलग आकारों के साथ चार या पांच पिपेट तैयार न हो जाएं।

3. पैच पिपेट बनाना

नोट: रिकॉर्डिंग सत्र से पहले पैच पिपेट का एक सेट तैयार करें, लेकिन नाड़ीग्रन्थि विच्छेदन और संस्कृति के बाद। हालांकि रिकॉर्डिंग सत्र के दौरान एक समय में एक किए गए इलेक्ट्रोड प्रदर्शन में इष्टतम हैं, उचित सफलता हासिल की गई है जब इन्हें रात से पहले बैच के रूप में बनाया जाता है। धूल से सुझावों की रक्षा के लिए एक कवर ग्लास कंटेनर में पिपेट स्टोर करें।

  1. एक ऊर्ध्वाधर इलेक्ट्रोड पुलर और 1.5 मिमी बाहरी व्यास/1.17 मिमी आंतरिक व्यास फिलामेंटेड बोरोसिलिकेट ग्लास पिपेट का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि कांच हमेशा धूल और उंगलियों के निशान से मुक्त रखा जाता है।
  2. निर्माता द्वारा पैच-पिपेट के लिए अनुशंसित दो-चरणीय कार्यक्रम का उपयोग करके 8-10 रिकॉर्डिंग पिपेट खींचो।
  3. निरीक्षण और गर्मी पॉलिश एक microforge के साथ हर रिकॉर्डिंग विंदुक टिप; हीट-पॉलिशिंग बेहतर सीलिंग को बढ़ावा देती है। लक्ष्य विंदुक प्रतिरोध 4 और 8 MΩ के बीच है।
  4. पॉलिश किए गए पिपेट को एक ढके हुए कंटेनर में स्टोर करें। इसे प्रयोग में एक ठहराव बिंदु के रूप में माना जा सकता है।
    नोट: लक्ष्य प्रतिरोध सीमा तक पहुंचने के लिए पिपेट व्यास का अनुकूलन करने के लिए 3.2 और 3.3 चरणों के साथ कुछ परीक्षण और त्रुटि की आवश्यकता होती है। अधिकांश वाणिज्यिक पैच-क्लैंप सिस्टम में स्नान समाधान में इलेक्ट्रोड प्रतिरोध को मापने के लिए एक अंतर्निहित झिल्ली परीक्षण सुविधा होती है। प्रतिरोध की गणना एक लागू 5 एमवी चरण उत्तेजना के जवाब में स्थिर-राज्य आउटपुट वर्तमान के अनुपात के रूप में की जाती है। चरण 3.1 में पुल सेटिंग्स और चरण 3.2 में पॉलिशिंग को पहले परीक्षण पिपेट का उपयोग करके समायोजित किया जाना चाहिए, जब तक कि परीक्षण पिपेट का प्रतिरोध 4 से 8 MΩ रेंज के भीतर न आ जाए।
  5. रिकॉर्डिंग के दिन, विंदुक समाई और रिकॉर्डिंग शोर को कम करने के लिए विंदुक सुझावों कोट. ऐसा करने के लिए, विंदुक के शाफ्ट पर पैराफिन फिल्म की एक छोटी पट्टी लपेटें. टिप के लिए सभी तरह से लपेटना आवश्यक नहीं है।
    नोट: एक वैकल्पिक रणनीति कोट और गर्मी विंदुक12 के शाफ्ट पर एक सिलिकॉन इलास्टोमेर सेट करना है।

4. वेस्टिबुलर नाड़ीग्रन्थि का निष्कर्षण और वेस्टिबुलर न्यूरॉन्स की चढ़ाना

  1. विच्छेदन के लिए तैयारी
    1. 0.05% कोलेजनेज और 0.25% ट्रिप्सिन के साथ एल -15 समाधान का एक एंजाइम मिश्रण तैयार करें। उदाहरण के लिए, एक बीकर में एल -15 समाधान के 2 एमएल में 0.001 ग्राम कोलेजनेज और 0.005 ग्राम ट्रिप्सिन जोड़ें, एक छोटा चुंबकीय उत्तेजक जोड़ें, और पूरी तरह मिश्रित होने तक हलचल करें। कमरे के तापमान पर अलग रख दें।
    2. रक्त और अन्य जैविक सामग्रियों के लिए बेंचटॉप और अन्य सतहों के जोखिम को कम करने के लिए कागज तौलिये को किनारे पर और गिलोटिन के नीचे रखकर व्यावसायिक रूप से प्राप्त गिलोटिन तैयार करें।
    3. बड़े स्टेनलेस स्टील कैंची, बड़े संदंश, और बड़े वसंत कैंची बाहर रखना. सिर की सफाई के लिए 70% इथेनॉल के साथ एक बड़ी स्प्रे बोतल रखें।
    4. एल -15 समाधान और बर्फ पर जगह के साथ एक 100 एमएल बीकर भरें. एल -15 समाधान ऑक्सीजन।
    5. वसंत कैंची, सर्जिकल कैंची, संदंश, स्केलपेल, और हस्तांतरण विंदुक ( सामग्री की तालिकादेखें) बाहर रखना.
    6. एक 60 मिमी पेट्री डिश (सकल विच्छेदन के लिए) और दो 35 मिमी पेट्री व्यंजन (गैन्ग्लिया की सफाई/ठीक विच्छेदन के लिए) तैयार करें। 0.22 माइक्रोन फिल्टर टिप के साथ 30 एमएल सिरिंज का उपयोग करके ऑक्सीजन युक्त एल -15 समाधान के साथ 60 मिमी पकवान भरें।
  2. इच्छामृत्यु, सिर की सफाई, और गोलार्ध
    1. इंट्रापेरिटोनली (~ 0.01 एमएल प्रति 10 ग्राम) को प्रशासित करने के लिए घातक-प्लस कमजोर पड़ने की उचित खुराक की गणना करने के लिए पिल्ले का वजन करें।
    2. एक बार संज्ञाहरण का एक गहरा विमान पहुंच जाता है, जैसा कि पैर की अंगुली चुटकी की प्रतिक्रिया की कमी से मूल्यांकन किया जाता है, गिलोटिन का उपयोग करके सिर काट दें।
    3. 70% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से सिर कुल्ला, और फिर एल -15 समाधान के साथ अच्छी तरह से।
    4. खोपड़ी से त्वचा को पूरी तरह से हटा दें। रीढ़ की हड्डी के प्रवेश बिंदु से मस्तिष्क तक शुरू करके और दो कटौती करके बड़े वसंत कैंची का उपयोग करके सिर को विभाजित करें, पहला खोपड़ी के शीर्ष के माध्यम से और दूसरा जबड़े के नीचे के माध्यम से। सर्जिकल कैंची का उपयोग कर सिर bisecting समाप्त.
    5. एल -15 समाधान से भरा एक 60 मिमी पेट्री डिश में नीचे सिर मस्तिष्क पक्ष के दोनों हिस्सों रखें. ताजा ऊतक वर्तमान में बर्फ पर विच्छेदित नहीं किया जा रहा रखें.
  3. बेहतर वेस्टिबुलर नाड़ीग्रन्थि निकालना
    1. बंद सर्जिकल कैंची का उपयोग कर मस्तिष्क बाहर स्कूप. अलग और पूरी तरह से खोपड़ी से मस्तिष्क को अलग करने के लिए कपाल तंत्रिका को हटा दें.
      नोट: इस बिंदु पर, ओटिक कैप्सूल (संख्या 8 के आकार का) सिर के पीछे दिखाई देना चाहिए।
    2. संदंश का उपयोग करना और सिर के पीछे से शुरू, स्पष्ट झिल्लीदार सामग्री बंद खींच.
    3. सर्जिकल कैंची का उपयोग करके खोपड़ी के शीर्ष को काटें। विच्छेदन क्षेत्र और ओटिक कैप्सूल क्लीनर और उपयोग करने में आसान बनाने के लिए सिर और गर्दन के पीछे से अतिरिक्त ऊतक निकालें।
      नोट: प्रक्रिया के दौरान अतिरिक्त ऊतक को त्यागकर डिश को बहुत बादल बनाने से बचें।
    4. ताजा एल -15 समाधान के साथ एक दूसरे पेट्री डिश के लिए ऊतक स्थानांतरण. ओटिक कैप्सूल और श्रवण, बेहतर वेस्टिबुलर और अवर वेस्टिबुलर नसों का पता लगाएँ। श्रवण तंत्रिका को काट लें और छोटे वसंत कैंची का उपयोग करके बेहतर और अवर गैन्ग्लिया को अलग करें।
      नोट: हालांकि वेस्टिबुलर तंत्रिका का सोमाता अवर (पतला) और बेहतर (मोटा) गैन्ग्लिया दोनों में पाया जाता है, बेहतर नाड़ीग्रन्थि से निकाली गई कोशिकाओं का बेहतर अस्तित्व होता है।
    5. एक स्केलपेल का उपयोग करके, बोनी क्षेत्र को कमजोर करने के लिए बोनी रिज को धीरे से दाढ़ी दें, जिसके तहत तंत्रिका बोनी कैप्सूल में गोता लगाती है। ध्यान से ठीक संदंश के साथ मलबे को हटा दें, नाड़ीग्रन्थि के पूरे सूजन हिस्से को उजागर.
    6. परिधीय तंत्रिका शाखा से नाड़ीग्रन्थि को काटने और अलग करने के लिए ठीक वसंत कैंची का उपयोग करें जो यूट्रिकल की ओर गोता लगा रहा है।
    7. ठीक संदंश का उपयोग बेहतर नाड़ीग्रन्थि निकालें, सुनिश्चित करें कि नाड़ीग्रन्थि ऊतक के करीब चुटकी नहीं कर रही है. ताजा एल -15 समाधान के साथ एक 35 मिमी पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण.
    8. आगे बढ़ने से पहले, एंजाइम समाधान पूर्व गर्मी: एक 35 मिमी पेट्री डिश और 10-15 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह में एंजाइम मिश्रण डालना.
    9. हड्डी (जो संरचना में सफेद और क्रिस्टलीकृत दिखाई देता है), अतिरिक्त ऊतक, तंत्रिका फाइबर, और किसी भी अन्य अनावश्यक संरचनाओं को हटाकर ठीक संदंश और छोटे वसंत कैंची का उपयोग करके नाड़ीग्रन्थि को साफ करें। किसी भी नाड़ीग्रन्थि ऊतक को हटाने को कम करने के लिए ध्यान रखें।
  4. ऊतक पृथक्करण और चढ़ाना
    1. साफ गैन्ग्लिया को पूर्व-गर्म एंजाइम समाधान में स्थानांतरित करें और इसे 10 से 40 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें। एंजाइम उपचार पूरा हो जाता है जब ऊतक अलग होना शुरू हो जाता है लेकिन एक टुकड़े में रहता है। एंजाइमों के साथ ऊतक को ओवरट्रीट करने से विचूर्णन से पहले गैन्ग्लिया का पूर्ण विघटन होगा।
      नोट: ऊतक के लिए एंजाइमी उपचार से गुजरने वाले समय की मात्रा जानवर की उम्र पर निर्भर करती है। उदाहरण के लिए, पी 9 चूहों से गैन्ग्लिया 25 मिनट के लिए एंजाइम के साथ इलाज कर रहे हैं, और पी 15 चूहों से गैन्ग्लिया 35 मिनट के लिए एंजाइम के साथ इलाज कर रहे हैं.
    2. ताजा एल -15 समाधान के साथ 35 मिमी पेट्री डिश के लिए गैन्ग्लिया स्थानांतरण और 2-3 मिनट के लिए सेते हैं.
    3. गैन्ग्लिया को फ़िल्टर्ड संस्कृति मीडिया से भरे एक और 35 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
    4. एक 200 माइक्रोन माइक्रोपिपेट का उपयोग करना, एक लेपित ग्लास-नीचे पकवान पर फ़िल्टर्ड संस्कृति मीडिया की ~ 150 माइक्रोन ड्रॉप विंदुक। बहुत अधिक समाधान न जोड़ें, क्योंकि कांच के कवरस्लिप पर बने रहने वाले समाधान का एक बुलबुला बनाने के लिए सतह तनाव को बनाए रखना महत्वपूर्ण है।
    5. गैन्ग्लिया की वांछित संख्या (एक से चार) को कवरस्लिप में स्थानांतरित करें।
    6. ग्लास विंदुक के किनारों से चिपके से ऊतक को रोकने के लिए माध्यम के साथ विचूर्णन विंदुक कुल्ला करने के लिए संस्कृति पकवान से संस्कृति माध्यम की एक छोटी राशि ड्रा. धीरे से और बार-बार विंदुक के माध्यम से ऊतक पारित द्वारा triturate जब तक गैन्ग्लिया पर्याप्त रूप से अलग कर रहे हैं.
      नोट: एकल-कोशिका निलंबन का प्रयास करने के लिए ऊतक को ओवरवर्क न करें या कोशिकाओं को अत्यधिक सकारात्मक दबाव का उपयोग करके डिश के नीचे दुर्घटनाग्रस्त होने दें। इसके अलावा, हवा के बुलबुले बनाने से बचें, क्योंकि इससे सेल अस्तित्व कम हो जाएगा। कोमल विचूर्णन सफल सेल अस्तित्व को प्राप्त करने की कुंजी है।
    7. कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए आराम करते हैं. कोशिकाओं coverslip पर बस गए हैं देखने के लिए अगर एक प्रकाश खुर्दबीन के तहत की जाँच करें.
    8. ध्यान से 12-24 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक संस्कृति पकवान जगह है. फिर से, समाधान के बुलबुले को बरकरार रखना सुनिश्चित करें।
      नोट: जब 24 घंटे से अधिक समय तक संवर्धन करते हैं, तो संस्कृति मीडिया को दैनिक रूप से ताज़ा करें। यह एक संभावित ठहराव बिंदु हो सकता है।
  5. चढ़ाना एसजीएन
    1. सिर को द्विभाजित करने के लिए वेस्टिबुलर गैंग्लियन निर्देशों के चरण 4.2.1 से 4.2.5 का पालन करें।
    2. ओटिक कैप्सूल (संख्या 8 की तरह आकार) का पता लगाएँ, और कुंद संदंश का उपयोग किनारों पर दूर chipping द्वारा खोपड़ी से निकालें.
    3. L-15 समाधान बदलें। ओटिक कैप्सूल के सर्पिल भाग में कोर्टी के अंग के साथ कोक्लीअ होता है। हड्डी के वक्र के समानांतर ठीक संदंश के साथ, अंतर्निहित ऊतक को नुकसान पहुंचाए बिना कर्णावत मोड़ पर दूर चिप।
    4. एक बार जब कर्णावत मोड़ की पूरी सीमा को प्रकट करने के लिए पर्याप्त हड्डी हटा दी जाती है, तो कोक्लीअ के आधार पर मोडिओलस (मोटी, सफेद, रेशेदार ऊतक जिसमें एसजीएन के केंद्रीय अक्षतंतु होते हैं) को अलग करने के लिए छोटे वसंत कैंची का उपयोग करें ताकि इसे बाकी ओटिक कैप्सूल से मुक्त किया जा सके।
    5. ठीक संदंश के साथ आधार पर स्ट्रिया चुटकी द्वारा स्ट्रिया vascularis निकालें. सर्पिल के चारों ओर और शीर्ष तक इसे कोर्टी के अंग से मुक्त करने के लिए आराम करें।
    6. छोटे वसंत कैंची का उपयोग करके कोर्टी के अंग को दो या तीन मोड़ों में काटें ताकि यह सपाट हो जाए।
    7. छोटे वसंत कैंची के साथ प्रत्येक मोड़ से मोडिओलस का उत्पादन करें।
    8. जहां एसजीएन फाइबर ट्रैक्ट बालों की कोशिकाओं की ओर प्रोजेक्ट करते हैं, के किनारे पर काटकर सर्पिल नाड़ीग्रन्थि को हटा दें।
    9. हड्डी (जो सफेद और संरचना में क्रिस्टलीकृत दिखाई देता है), modiolus (जो सफेद और रेशेदार दिखाई देता है), और किसी भी अन्य अनावश्यक संरचनाओं को हटाने के द्वारा ठीक संदंश का उपयोग नाड़ीग्रन्थि को साफ करें. किसी भी नाड़ीग्रन्थि ऊतक को हटाने को कम करने के लिए ध्यान रखें।
    10. सर्पिल नाड़ीग्रन्थि के लिए एंजाइमेटिक रूप से इलाज के लिए उसी प्रक्रिया का पालन करें जैसा कि धारा 4.4 में वेस्टिबुलर नाड़ीग्रन्थि के लिए उपयोग किया जाता है। एंजाइमेटिक समय आमतौर पर सर्पिल नाड़ीग्रन्थि में कम होता है, जो वेस्टिबुलर नाड़ीग्रन्थि की तुलना में अधिक लम्बा होता है। वेस्टिबुलर नाड़ीग्रन्थि की तुलना में सर्पिल नाड़ीग्रन्थि के लिए छोटे व्यास विचूर्णन पिपेट का उपयोग करें।
    11. संस्कृति माध्यम में सर्पिल नाड़ीग्रन्थि को N2 और B27 के साथ पूरक करें, संस्कृति मीडिया के लिए नुस्खा में संकेत दिया गया है।
    12. एक 37 डिग्री सेल्सियस में अलग गैन्ग्लिया युक्त संस्कृति पकवान रखें, 12-24 घंटे के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर.
      नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है।

5. रिकॉर्डिंग

नोट: इस प्रक्रिया में, पृथक नाड़ीग्रन्थि से पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग आमतौर पर चढ़ाना के बाद 12-24 घंटे की जाती है। अन्य प्रयोगशालाओं संस्कृति10 में बहुत लंबी अवधि के बाद न्यूरॉन्स से परिणाम की सूचना दी है.

  1. रिकॉर्डिंग कक्ष तैयार करें
    1. त्वरित विनिमय रिकॉर्डिंग कक्ष (या समकक्ष) का उपयोग करें जो सीधे संस्कृति डिश में पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है। उल्टे खुर्दबीन पर कक्ष की स्थापना करें.
    2. कक्ष में कांच के नीचे संस्कृति व्यंजन डालें.
    3. रिकॉर्डिंग कक्ष के लिए एक छिड़काव ट्यूबिंग प्रणाली के माध्यम से एल -15 समाधान फ़ीड. प्रति मिनट 0.5-1 एमएल की दर से कक्ष में छिड़काव में प्रवाह और बाहर प्रवाह को स्थिर करें।
  2. इलेक्ट्रोड लोड करने के लिए आंतरिक समाधान तैयार करें
    1. छिद्रित-पैच आंतरिक समाधान का एक विभाज्य पिघलना। एक 35 मिमी संस्कृति पकवान पर समाधान के 2.5 एमएल आवंटित. संस्कृति पकवान पर ढक्कन बदलें और "टिप डुबकी" के रूप में लेबल. धूल रहित क्षेत्र में अलग रख दें, क्योंकि इस घोल को यथासंभव साफ रखना बहुत महत्वपूर्ण है।
    2. 1 मिलीग्राम एम्फोटेरिसिन-बी का वजन करें और 20 माइक्रोन डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) जोड़ें। भंवर और समाधान नीचे स्पिन जब तक सभी amphotericin-बी समाधान में है. डीफ़्रॉस्टेड छिद्रित-पैच आंतरिक समाधान के शेष 2 एमएल में डीएमएसओ/एम्फोटेरिसिन-बी समाधान के 10 माइक्रोन जोड़ें। वापस लें और एक विंदुक के साथ समाधान को दो या तीन बार दूर करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि डीएमएसओ/एम्फोटेरिसिन-बी समान रूप से आंतरिक समाधान में मिश्रित हो गया है। समाधान में हल्का-पीला रंग होगा।
    3. एम्फोटेरिसिन-बी छिद्रित-पैच आंतरिक समाधान को 3 एमएल सिरिंज में ड्रा करें। सिरिंज के लिए एक 34 जी टिप जोड़ें. एल्यूमीनियम पन्नी में सिरिंज लपेटें और बर्फ पर सिरिंज रखें.
      नोट: कोशिका झिल्ली को छिद्रित करने में एम्फोटेरिसिन-बी की प्रभावशीलता सुनिश्चित करने के लिए इस समाधान को हर 2 घंटे में रीमेक किया जाना चाहिए। एम्फोटेरिसिन-बी प्रकाश संवेदनशील है, और इसे एल्यूमीनियम पन्नी या अन्य तरीकों का उपयोग करके प्रकाश से परिरक्षित किया जाना चाहिए।
  3. पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग
    1. एक 10x या 20x उद्देश्य का उपयोग कर न्यूरॉन्स कल्पना. रोशनी को समायोजित करें और सेल के चारों ओर सीमाओं और छाया को देखने के लिए प्रकाशिकी का अनुकूलन करें।
    2. पृथक न्यूरॉन्स की गुणवत्ता की जाँच करें। केवल चिकनी और यहां तक कि सतहों के साथ न्यूरॉन्स का प्रयास करें जो बहुत दृढ़ता से विपरीत नहीं हैं और केवल छोटे, छितरी हुई क्रेटर हैं। इसके अलावा, न्यूरॉन्स के जोड़े, मलबे से घिरे न्यूरॉन्स या अन्य कोशिकाओं से बचने के लिए सुनिश्चित करें।
    3. 100x आवर्धन के तहत, पैच करने के लिए न्यूरॉन्स के एक न्यूरॉन या क्षेत्र की पहचान करें और उन्हें देखने के क्षेत्र के केंद्र में पंक्तिबद्ध करें।
    4. एक साफ समाधान है कि एक संस्कृति पकवान में रखा गया था कि साफ समाधान में (~ 20 एस के लिए) डुबकी द्वारा amphotericin शामिल नहीं है कि एक साफ समाधान के साथ विंदुक की नोक भरें. केशिका क्रिया टिप में समाधान की एक छोटी राशि आकर्षित करेगी।
      नोट: टिप टिप समाधान रखती है कितनी अच्छी तरह से यह निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है जो एक स्टीरियो विच्छेदन खुर्दबी, के तहत इस कदम को निष्पादित करें। यदि समाधान ~ 10-20 एस के लिए पकड़ में नहीं आता है, तो इलेक्ट्रोड का आकार आदर्श नहीं है। इस मामले में, एक लंबी टिप का उत्पादन करने के लिए इलेक्ट्रोड-पुलिंग प्रोग्राम को पुन: कॉन्फ़िगर करें।
    5. अगला, एम्फोटेरिसिन युक्त आंतरिक समाधान के साथ विंदुक के पीछे भरें। विंदुक के भीतर फिलामेंट टिप में साफ समाधान को पूरा करने के लिए समाधान को नीचे खींच देगा। फिलामेंट को आसानी से समाधान को नीचे खींचने की अनुमति दें, और बुलबुले को टैप करने का प्रयास न करें, क्योंकि यह एम्फोटेरिसिन को टिप पर बहुत तेजी से मजबूर करेगा।
    6. समाधान निकालने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें जो इलेक्ट्रोड के बहुत पीछे हो सकता है।
      नोट: इस बिंदु से जमीन पर तेजी से काम करना और वांछित सेल पर एक उच्च-प्रतिरोध सील बनाना बहुत महत्वपूर्ण है।
    7. विंदुक धारक में विंदुक डालें. जांचें कि पिपेट धारक में पिपेट बहाव को रोकने के लिए सुखद है। यदि विंदुक स्थिर नहीं है, तो बहाव को कम करने और मजबूत चूषण बनाए रखने के लिए विंदुक धारक के सामने और पीछे सीलिंग ओ-रिंग्स को स्विच करें। एक है कि ताजा भरा है के साथ विंदुक बदलें.
    8. रिकॉर्डिंग कक्ष के स्नान में विंदुक कम.
    9. देखने के क्षेत्र के बीच में विंदुक टिप का पता लगाएँ. सुनिश्चित करें कि टिप हवाई बुलबुले या अन्य मलबे से मुक्त है।
    10. विंदुक प्रतिरोध की निगरानी के लिए झिल्ली परीक्षण में एक वोल्टेज कदम (5 एमवी) लागू करें। सेल पर सील बनाने की पूरी प्रक्रिया के माध्यम से इनपुट प्रतिरोध की निगरानी जारी रखें।
    11. पिपेट ऑफसेट क्षमता को रद्द करें, जैसे कि पिपेट करंट pClamp के झिल्ली परीक्षण मोड में शून्य पढ़ता है।
    12. पैच-क्लैंप एम्पलीफायर पर तेजी से समाई मुआवजा समारोह का उपयोग कर विंदुक समाई के लिए सही (मल्टीक्लैंप कमांडर नरम पैनल में सीपी तेजी से डायल)।
    13. सेल के लिए नीचे विंदुक ले जाएँ.
    14. एक बार विंदुक न्यूरॉन के लिए काफी करीब है, उच्च बढ़ाई उद्देश्य के लिए स्विच और एक मॉनिटर के लिए एक कैमरे के माध्यम से छवि भेजने (एक 40x उद्देश्य, कुल 400x बढ़ाई का उपयोग करें). विंदुक समायोजित करें और न्यूरॉन को फिर से केंद्र दें।
    15. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को सोमा के करीब ले जाएं। मॉनिटर पर न्यूरॉन के केंद्र का पता लगाएँ और न्यूरॉन के ऊपर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की स्थिति।
    16. ऊपर से न्यूरॉन दृष्टिकोण, इस तरह है कि इलेक्ट्रोड गोलाकार सेल के केंद्र में भूमि जाएगा. सिस्टम में निरंतर डीसी क्षमता शून्य करने के लिए विंदुक ऑफसेट समायोजित करें.
    17. विंदुक झिल्ली के करीब स्थिति. सेल के केंद्र पर मजबूती से भूमि।
      नोट: लैंडिंग करते समय, न्यूरॉन की सतह पर एक छोटा सा डिंपल और इनपुट प्रतिरोध का दोहरीकरण/ट्रिपलिंग होगा।
    18. एक सिरिंज या मुंह विंदुक का उपयोग कर नकारात्मक दबाव (चूषण) लागू करें. -60 एमवी की होल्डिंग क्षमता चालू करें। सील प्रतिरोध तब तक बढ़ना चाहिए जब तक कि यह एक गीगा-ओम से न गुजर जाए।
      नोट: एक इलेक्ट्रोड भरने और एक सेल पर लैंडिंग के बीच समय को कम करने के लिए तेजी से काम करते हैं। चरण 5.3.5 में छिद्रित-पैच आंतरिक समाधान में जोड़े गए एम्फोटेरिसिन इलेक्ट्रोड टिप तक पहुंचने से पहले एक सीमित समय है। एक बार जब टिप एम्फोटेरिसिन से दूषित हो जाती है, तो उच्च-प्रतिरोध सील बनाना मुश्किल होता है, और प्रतिरोध अक्सर ~ 200 मेगाओम तक पठार होता है।
    19. एक बार एक गीगा-ओम सील बनने के बाद, नकारात्मक दबाव छोड़ दें। जैसे ही सील रूपों, झिल्ली परीक्षण मोड में विंदुक समाई यात्रियों के आयाम को कम करने के लिए जितना संभव हो सके तेजी से समाई मुआवजा लागू होते हैं।
    20. जैसे ही एम्फोटेरिसिन काम करना शुरू करता है, देखें कि इनपुट प्रतिरोध धीरे-धीरे कम हो जाता है और 5 एमवी वोल्टेज चरण के जवाब में बहने वाली धारा उत्तरोत्तर बढ़ती है क्योंकि एम्फोटेरिसिन झिल्ली में प्रवेश करता है। क्रमिक स्थिरीकरण के बजाय श्रृंखला प्रतिरोध में अचानक कमी से पता चलता है कि सहज टूटना हुआ है।
    21. पूरे सेल समाई और एम्पलीफायर के कैपेसिटिव क्षणिक nulling समारोह का उपयोग कर श्रृंखला प्रतिरोध का अनुमान लगाएं. दस्तावेज़ और प्रयोग की शुरुआत में श्रृंखला प्रतिरोध की निगरानी, और नियमित रूप से, प्रयोग के दौरान.
      नोट: श्रृंखला प्रतिरोध इलेक्ट्रोड के आकार के आधार पर स्थिर करने के लिए 5-20 मिनट से कहीं भी ले जा सकता है और विंदुक में कितना साफ समाधान खींचा जाता है। वोल्टेज-क्लैंप और वर्तमान-क्लैंप मोड का उपयोग तब किया जा सकता है जब श्रृंखला प्रतिरोध 30 मेगाओम से नीचे स्थिर हो जाए। रिकॉर्डिंग के दौरान न्यूरॉन्स की सूजन या सिकुड़ना कभी-कभी मनाया जाता है, लेकिन शायद ही कभी जब समाधान के परासरण और पीएच को सही ढंग से समायोजित किया जाता है।

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Representative Results

वोल्टेज चरणों के परिवारों को लागू करके वोल्टेज-क्लैंप प्रोटोकॉल चलाने से धाराओं के विभिन्न परिवारों के वोल्टेज-निर्भर सक्रियण का पता चलता है। पूरे सेल धाराओं के प्रतिनिधि उदाहरण एक वीजीएन से विकसित और प्रकाशित रिकॉर्डिंग13 से अनुकूलित चित्रा 1 ए, बी में दिखाए गए हैं। विध्रुवण वोल्टेज (चित्रा 1 बी) लागू करने से एक आवक वर्तमान (सम्मेलन द्वारा नकारात्मक) सक्रिय हो जाता है जो बहुत तेजी से सक्रिय और निष्क्रिय करता है (चित्र 1ए)। यह सोडियम चैनल14,15, जो मुख्य रूप से कार्रवाई क्षमता16,17 के अपस्ट्रोक ड्राइव के वोल्टेज गेटेड गुणों के लिए रूढ़िवादी है. विध्रुवण एक लंबे समय तक चलने वाले और अपेक्षाकृत धीमी गति से सक्रिय बाहरी धारा को भी सक्रिय करता है जो एक ऐक्शन पोटेंशिअल के डाउनस्ट्रोक को संचालित करता है। फार्माकोलॉजी से पता चला है कि इन धाराओं को बड़े पैमाने पर वीजीएन 3,18,19,20,21 में विभिन्न प्रकार के पोटेशियम चैनलों द्वारा ले जाया जाता है।

गहरी, लंबे समय तक चलने वाले हाइपरपोलराइजिंग वोल्टेज हाइपरपोलराइजेशन-सक्रिय चक्रीय न्यूक्लियोटाइड-गेटेड (एचसीएन) चैनलों22 (चित्रा 1सी)द्वारा किए गए धीमी-सक्रिय आवक प्रवाह को उद्घाटित करते हैं। इन धाराओं की सक्रियता चित्रा 1 डी में दिखाया पूंछ वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है. यहां, वर्तमान के सक्रियण प्रतिशत की जांच कंडीशनिंग वोल्टेज के एक समारोह के रूप में पूंछ चरण (Itail) के दौरान बहने वाली धारा की साजिश रचकर की जाती है। वर्तमान-वोल्टेज सक्रियण वक्र में एक सिग्माइडल आकार (चित्रा 1ई) है। यद्यपि यह चैनल चक्रीय एएमपी (सीएमपी) जैसे घुलनशील दूसरे दूतों द्वारा गेटेड है, छिद्रित-पैच कॉन्फ़िगरेशन का उपयोग करके मापा गया सक्रियण घटता एक लंबी रिकॉर्डिंग के दौरान स्थिर है। इसके विपरीत, चैनल के आकार और वोल्टेज-सक्रियण रेंज को बदल दिया जाता है (संभवतः साइटोसोलिक घटकों के वॉशआउट के कारण) जब रिकॉर्डिंग टूट-पैच कॉन्फ़िगरेशन में की जाती है।

न्यूरोनल विविधता को फायरिंग पैटर्न की सीमा से चित्रित किया जाता है जब धाराओं को अलग-अलग वीजीएन और एसजीएन(चित्रा 2; ऊपर और नीचे, क्रमशः) में इंजेक्ट किया जाता है। कुछ न्यूरॉन्स केवल वर्तमान इंजेक्शन की शुरुआत में आग लगाते हैं, जबकि अन्य कई बार आग लगाते हैं। यह विषमता वीजीएन और एसजीएन23,24,25दोनों में अंतर्निहित सोडियम और पोटेशियम चैनलों की संरचना में एक मौलिक विविधता को दर्शाती है।

Figure 1
चित्रा 1: आयनिक धाराओं के विविध समूहों को मापने के लिए वोल्टेज-क्लैंप प्रोटोकॉल के उदाहरण। (ए, बी) उदाहरण पूरे सेल धाराओं (ए) वोल्टेज चरणों (बी) के एक परिवार द्वारा प्रेरित। शुद्ध आवक सोडियम धाराओं (नकारात्मक धाराओं) को यहां उनके क्षणिक सक्रियण और निष्क्रियता (लेबल तीर, Na+) द्वारा पहचाना जाता है। शुद्ध जावक धाराएं (लेबल तीर, के +, लंबे समय तक चलने वाली सकारात्मक धाराएं) बड़े पैमाने पर पोटेशियम आयनों द्वारा ले जाई जाती हैं और सोडियम धाराओं की तुलना में बहुत धीमी सक्रियण और निष्क्रियता कैनेटीक्स होती हैं। (सी, डी) एचसीएन धाराएं लंबी अवधि के हाइपरपोलराइजिंग वोल्टेज के परिवार द्वारा सक्रिय होती हैं। (ई, एफ) रिकॉर्डिंग के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं पर छिद्रित-पैच में आयन चैनल लक्षण वर्णन की स्थिरता। एचसीएन धाराओं के वोल्टेज-निर्भर सक्रियण घटता को एक छिद्रित-पैच कॉन्फ़िगरेशन में मापा गया था I. एक टूट-पैच कॉन्फ़िगरेशन (एफ) के दौरान एचसीएन धाराओं के सक्रियण घटता। छवियाँ C-F को 13 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: धाराओं के चरणों को इंजेक्ट करके विविध फायरिंग पैटर्न विकसित किए जाते हैं। (ए) पांच वेस्टिबुलर नाड़ीग्रन्थि सोमाता में फायरिंग पैटर्न। (बी) पांच एसजीएन में फायरिंग पैटर्न। (सी) इसी वर्तमान कदम। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां प्रस्तुत विधियां पृथक न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग के लिए विशिष्ट हैं; पिछले अध्ययनों ने अर्ध-बरकरार तैयारी में एक्सॉन टर्मिनलों से रिकॉर्डिंग पर ध्यान केंद्रित किया है। जब मौजूदा टर्मिनल रिकॉर्डिंग तकनीकों की तुलना में, पृथक रिकॉर्डिंग बेहतर अंतरिक्ष-क्लैंप और आइसो-संभावित व्यवहार प्रदान करती है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल न्यूरॉन्स के व्यापक नमूने तक पहुंच प्रदान करता है, क्योंकि केवल कैलीक्स-असर उप-जनसंख्या वेस्टिबुलर एपिथेलिया की अर्ध-बरकरार रिकॉर्डिंग में सुलभ हैं। अंत में, पृथक रिकॉर्डिंग छिद्रित-पैच तकनीक के उपयोग की अनुमति देती है, जो इंट्रासेल्युलर मिलियू के विघटन को रोकती है जो अक्सर टूटी-पैच रिकॉर्डिंग में इंट्रासेल्युलर समाधान और साइटोसोल के बीच डायलिसिस द्वारा बाधित होती है।

सफल रिकॉर्डिंग पहले पृथक और सुसंस्कृत सोमता की गुणवत्ता पर निर्भर करती है। सेल अस्तित्व में एक महत्वपूर्ण कदम पृथक न्यूरॉन्स का उत्पादन करने के लिए विचूर्णन के दौरान आवश्यक बल है। सेल अस्तित्व के लिए एक कोमल हाथ महत्वपूर्ण है। विचूर्णन पिपेट एल -15 समाधान के बुलबुले में उच्च रखा जाना चाहिए बलपूर्वक पकवान के तल पर न्यूरॉन्स निष्कासित को रोकने के लिए. सेल अस्तित्व के मुद्दों उत्पन्न होते हैं, अतिरिक्त देखभाल भी हवा बुलबुले के गठन को रोकने के लिए या समाधान के बुलबुले को तोड़ने में लिया जाना चाहिए, जो coverslip पर बसने से dissociated कोशिकाओं को रोकता है. विभिन्न आकारों में गर्मी-पॉलिश किए गए विचूर्णन पिपेट उपलब्ध होना भी सबसे अच्छा है, ताकि जांचकर्ताओं के पास व्यास के साथ एक को चुनने का लचीलापन हो जैसे कि नाड़ीग्रन्थि हल्के प्रतिरोध का अनुभव करता है क्योंकि यह विंदुक से गुजरता है। पिपेट को गर्मी-चमकाने से कांच के खुरदरे किनारों पर नाड़ीग्रन्थि गुजरने से होने वाली क्षति कम हो जाती है। एक खुरदरी धार छोड़ना शुरू में गैन्ग्लिया को तोड़ने में अधिक प्रभावी प्रतीत हो सकता है, लेकिन यह दृष्टिकोण सोमता को नुकसान पहुंचाता है और संस्कृति में अवधि के बाद अस्तित्व को कम करता है। सलाह का एक अंतिम टुकड़ा ईर्ष्या एक सफल विचूर्णन विंदुक की रक्षा करना है।

एक अन्य कारक जो कोशिका के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है, वह है पाचन एंजाइमों के साथ उपचार की अवधि। एंजाइम समय का निर्धारण करते समय, जांचकर्ताओं को यह सुनिश्चित करने के लिए समय को सावधानीपूर्वक समायोजित करने की आवश्यकता होती है कि ऊतक अच्छी तरह से टूट जाए, लेकिन सेल अस्तित्व को प्रभावित करने के लिए इतना नहीं। हम पाते हैं कि सेल अस्तित्व और आयन चैनल गुणों पर एंजाइमी उपचार का प्रभाव कम से कम है, क्योंकि एंजाइम-उपचारित कोशिकाओं से एकत्र किए गए डेटा अन्य तरीकों के अनुरूप दिखाई देते हैं जो इस दृष्टिकोण 19,26 पर भरोसा नहीं करते हैं। हालांकि एंजाइमी उपचार ट्राइट्यूरेट करने के लिए आवश्यक बल को कम करता है, यह इस सीमा के साथ आता है कि एंजाइमैटिक पाचन (विशेष रूप से अकेले ट्रिप्सिन या पपैन पर आधारित) आयन चैनलों को नुकसान पहुंचाने के लिए जाना जाता है27. इस प्रकार, हालांकि हम जानवर की उम्र पर निर्भर एंजाइम समय के लिए कुछ दिशानिर्देश सुझाते हैं, परिणामों के आधार पर समय को समायोजित करने के लिए तैयार रहना सबसे अच्छा है। अंत में, हम विचूर्णन के लिए 'कम अधिक है' दृष्टिकोण को प्रोत्साहित करते हैं। इसका मतलब है कि एकल-कोशिका निलंबन बनाने के आग्रह का विरोध करना और तीन या चार पास के बाद विचूर्णन को रोकना, भले ही ऊतक के कई बड़े हिस्से शेष हों।

संवर्धन का एक फायदा यह है कि यह दैहिक कोशिका झिल्ली को साफ करने के लिए प्रकट होता है और माइलिन बनाने वाली ग्लियाल कोशिकाओं के बहा को बढ़ावा देता है, जो तब न्यूरॉन्स से अधिक सफल पैच-क्लैम्पिंग की अनुमति देता है। इस प्रकार, पृथक और सुसंस्कृत नाड़ीग्रन्थि तैयारी 1 प्रसवोत्तर सप्ताह से पहले पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग का विस्तार करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, जिसके बाद सेल निकायों उत्तरोत्तर माइलिन के साथ कवर हो जाते हैं, पैच दबाना इलेक्ट्रोड बाधा. आयन चैनल गतिविधि पृथक प्लस अल्पकालिक सुसंस्कृत (<24 ज) वीजीएन से पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग में मनाया 2 प्रसवोत्तर सप्ताह से परे इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और वेस्टिबुलर उपकला28,29 में कैलीक्स टर्मिनलों से प्रत्यक्ष रिकॉर्डिंग द्वारा देखा आयन चैनल अभिव्यक्ति में आंचलिक और परिपक्वता परिवर्तन के अनुरूप हैं। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि न्यूरोट्रॉफिक कारकों और एंटीबायोटिक दवाओं द्वारा सहायता प्राप्त लंबे समय तक संवर्धन आयन चैनलों30,31,32,33,34को भी प्रभावित कर सकता है। इन तकनीकों के किसी भी आवेदन ध्यान से न्यूरॉन्स और उनके आयन चैनलों30,31,32,33,34 के अंतर्निहित बायोफिज़िक्स पर इन कारकों के प्रभाव पर विचार करना चाहिए.

कुल मिलाकर, पृथक और सुसंस्कृत सोमाता से पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग आंतरिक कान न्यूरॉन्स के आयन चैनल गुणों में विविधता का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हैं। छिद्रित-पैच कॉन्फ़िगरेशन की दीर्घकालिक स्थिरता विशेष रूप से एचसीएन जैसे आयन चैनलों का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है, जिनके सक्रियण गुण साइटोसोलिक दूसरे दूतों के माध्यम से मॉड्यूलेशन के अधीन हैं।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम इन विधियों में उनके शुरुआती योगदान के लिए डॉ. जिंग बिंग जू और रूथ ऐनी ईटॉक को स्वीकार करते हैं। इस काम को NIH NIDCD R03 DC012652 और NIH NIDCD DC012653S, और R01 DC0155512 से RK और T32 DC009975 से DB, NN और KR द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin Sigma-Aldrich A4888-100MG For perforated patch recordings.
ATP di-sodium Sigma-Aldrich A7699 Additive to internal solution
B27 Supplement (50x), serum free Thermo Fisher Scientific 17504044 additive to culture medium, for SGN
Beakers (1000, 100, 10) milliliter
bench-top centrifuge USA Scientific 2641-0016
Bunsen burner
CaCl2 J.T. Baker 1311-01 Additive to internal solution
Collagenase Sigma-Aldrich C5318 one out of three enzyme to digest tissue
Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40  Warner Instruments 64-0707
DMSO Biotium 90082
Dnase I,from bovine pancreas Sigma-Aldrich 11284932001 one out of three enzyme to digest tissue
Dumont #3 Forceps (Blunt) Fine Science Tools 11231-30
Dumont #5 Forceps (Fine) Fine Science Tools 11251-10
Dumont #55 Forceps (Fine) Fine Science Tools 11255-20
EGTA Sigma-Aldrich E0396 Additive to internal solution
Electrode Puller Narashige PC-10
Epi-illumination light source  Zeiss  CL 1500 ECO
Ethanol Decon Labs 2716 for cleaning head and around dissection bench
Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes Sutter Instruments BF140-117-10
Fine-edged dissection blade Fine Science Tools 10010-00
Glass Pasteur Pipettes VWR 14673-010 to pull trituration pipettes
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16140063 additive to culture medium
HEPES Sigma-Aldrich H3375-100G for pH buffering all solutions in protocol
Hot plate / magnetic stirrers  VWR 76549-914
Insulated bucket filled with ice to keep all samples and solutions cool
K2SO4, Potassium Sulfate Sigma Aldrich P9458-250G Additive to internal solution
KCl Sigma-Aldrich P93333 Additive to internal solution
KOH (1 M) Honeywell 319376-500ML To bring internal solution to desired pH.
Large Spring Scissors Fine Science Tools 14133-13
Leibovitz medium  Sigma Aldrich L4386 dissection and bath solutions 
Low-profile-bath recording chamber for culture dishes Warner Instruments 64-0236
luer-lok syringes, 30 ml BD 302832 for drawing L-15/HEPES/HEPES solution.
MEM + Glutamax Supplement Fisher Scientific 41-090-101 base of the culture medium
MgCl2-Hexahydrate Sigma-Aldrich M1028 Additive to internal solution
microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge  World Precision Instruments MF34G
Microforge Narashige MF-90 For electrode polishing.
N2 Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 17502-048 additiive to culture medium, for SGN
NaCl Sigma-Aldrich S7653 Additive to internal solution
NaOH (1 M) Thomas Scientific 319511-500ML for titration pH
Osmometer Advanced Instruments Inc. 3320
Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing USC Material Management MEDOX200 (Identifier: 00015) for dissolving into dissection and bath solutions
Parafilm Bemis PM992
Pasteur pipette bulb (3 ml) Fisher Scientific 03-448-25 bulb for trituration pipettes
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 additive to prevent contamination of culture medium
Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing)  MWI Animal Health 15199 for euthanasia
PES membrane filters ,  0.2 micrometer  Nalgene 566-0020 for filtering solutions
PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm  CELLTREAT 229747 for filtering solutions drawn into syringes
Petri dishes, 35 x 10 mm Genessee Scientific 32-103 for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration
Petri Dishes, 60 x 15 mm Midland Scientific P7455 for gross dissection
pH Meter Mettler Toledo Model S20
Pipettors (1000, 200, 10) microliter USA Scientific
Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish Mattek P35GC-0-10-C to plate neurons for culture
Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes Warner Instruments 64-0375
Reference Cell World Precision Instruments RC1T
Scalpel blade Miltex 4-315
Scalpel Handle Fine Science Tools 10003-12
Scientific Scale Mettler Toledo XS64
Serological Pipettes (10, 25) milliliter Fisher Scientific
Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) Warner Instruments 64-0378
Small Animal Guillotine Kent Scientific DCAP
Small animal guillotine Kent Scientific DCAP for decapitation if dissecting rats older than P15.
Stereo Dissection Microscope  Zeiss Stemi 2000
Straight surgical scissors Fine Science Tools 14060-09
Syringe (3, 10, 30) milliliter
Trypsin Sigma Aldrich T1426 one out of three enzyme to digest tissue
Tuberculin syringe  Covidien 8881500105 for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection
Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15000-08
Volumetric flask, 1000 milliliter
Vortex VWR 945300
Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) Millipore-Sigma CDUFBI001

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References

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