Summary
Di seguito sono presentati metodi che forniscono istruzioni dettagliate per la dissezione, la dissociazione, la coltura e la registrazione di patch-clamp dai neuroni gangliari vestibolari e gangliari a spirale dell'orecchio interno.
Abstract
La morfologia compatta dei neuroni gangliari dell'orecchio interno isolati e in coltura consente una caratterizzazione dettagliata dei canali ionici e dei recettori dei neurotrasmettitori che contribuiscono alla diversità cellulare in questa popolazione. Questo protocollo delinea i passaggi necessari per il successo della dissezione, della dissociazione e della coltura a breve termine dei somata dei neuroni bipolari dell'orecchio interno ai fini delle registrazioni patch-clamp. Vengono fornite istruzioni dettagliate per la preparazione dei neuroni gangliari vestibolari con le modifiche necessarie per la placcatura dei neuroni gangliari a spirale. Il protocollo include le istruzioni per l'esecuzione di registrazioni patch-clamp a cellula intera nella configurazione a patch perforato. I risultati di esempio che caratterizzano le registrazioni voltage-clamp di correnti mediate da HCN (Cyclic Nucleotide-Gated) attivate dall'iperpolarizzazione evidenziano la stabilità della configurazione di registrazione a patch perforata rispetto alla configurazione a patch di rottura più standard. La combinazione di questi metodi, somata isolati più registrazioni perforate-patch-clamp, può essere utilizzata per studiare i processi cellulari che richiedono registrazioni lunghe e stabili e la conservazione dell'ambiente intracellulare, come la segnalazione attraverso i recettori accoppiati alla proteina G.
Introduction
I neuroni bipolari del nervo vestibolococleare collegano le cellule ciliate sensoriali dell'orecchio interno al tronco encefalico. Sono i principali vettori di informazioni sul suono e sui movimenti della testa; Il danno a queste importanti cellule porta a sordità e disturbi dell'equilibrio. Le porzioni vestibolari e uditive del nervo sono costituite ciascuna da tipi di cellule distinte che sono morfologicamente e funzionalmente diverse 1,2. Nel sistema vestibolare, due sottopopolazioni afferenti si attivano spontaneamente a intervalli regolari o irregolari2. Si ritiene che la temporizzazione dello spike afferente rifletta una diversità sottostante nella composizione dei canali ionici 3,4. Nel sistema uditivo, ci sono due sottopopolazioni principali di neuroni gangliari spirali (SGN); mentre gli SGN di tipo I contattano le singole cellule ciliate interne5, gli SGN di tipo II contattano più cellule ciliate esterne5. Registrazioni in vitro da colture semi-intatte e organotipiche suggeriscono differenze nelle proprietà di membrana degli SGN di tipo I e di tipo II 6,7.
Molti canali ionici e recettori dei neurotrasmettitori che si trovano ai terminali di questi neuroni si trovano anche nei loro corpi cellulari. Pertanto, le colture del vestibolare isolato e del ganglio a spirale somata possono essere studiate in vitro per capire come i canali ionici e i recettori dei neurotrasmettitori contribuiscono alla risposta di questi neuroni. La morfologia compatta dei corpi cellulari isolati consente registrazioni elettriche di alta qualità, adatte per la caratterizzazione dettagliata di canali ionici voltaggio-dipendenti e recettori dei neurotrasmettitori. Il facile accesso a una varietà rappresentativa di sottotipi di neuroni consente un'analisi ad alto rendimento della diversità cellulare.
Questo articolo presenta un metodo per isolare e coltivare corpi cellulari gangliari dissociati dalla porzione superiore del ganglio vestibolare nei ratti al giorno postnatale da (P)9 a P20. Vengono inoltre forniti suggerimenti per estendere questi metodi al ganglio a spirale, oltre ai passaggi necessari per estrarre, dissociare e placcare con successo le cellule ganglionari. Questi metodi sono un'evoluzione di quelli ideati nelle pubblicazioni di vari laboratori 8,9,10. In questo documento è inclusa anche una guida per la selezione di cellule sane per le registrazioni patch-clamp.
Infine, il protocollo delinea la procedura per la registrazione patch-clamp utilizzando la configurazione perforated-patch11. Sebbene la configurazione del cerotto perforato sia più dispendiosa in termini di tempo e tecnicamente più impegnativa rispetto alla più comune configurazione del cerotto rotto, è migliore per mantenere l'ambiente citoplasmatico che consente sessioni di registrazione lunghe e stabili. I vantaggi di questa configurazione di registrazione sono illustrati qui attraverso la migliore stabilità delle correnti cationiche attivate dall'iperpolarizzazione nelle registrazioni di patch perforate rispetto alle registrazioni di patch rotte.
Questo protocollo è organizzato in cinque sezioni. Le sezioni 1-3 descrivono le soluzioni e gli strumenti che possono essere preparati e conservati in anticipo. La sezione 4 descrive le fasi per la dissezione e la placcatura delle vestibolari e degli SGN. La sezione 5 descrive le fasi per la registrazione dai neuroni dopo un periodo di coltura. Nelle nostre mani, la sezione 4 e la sezione 5 vengono eseguite per un periodo di 2 giorni consecutivi.
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Protocol
Tutti gli usi degli animali qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso la University of Southern California. Gli animali inclusi in questo protocollo sono ratti Long Evans di età compresa tra P3 e P25 di entrambi i sessi ottenuti dai Charles River Laboratories, ma questi metodi possono essere applicati ad altri ceppi di roditori. Durante tutte le procedure è necessario indossare un camice da laboratorio e guanti, nonché occhiali protettivi dagli schizzi durante la preparazione delle soluzioni.
1. Preparativi
NOTA: Le soluzioni e gli strumenti descritti in questa sezione possono essere realizzati con largo anticipo per essere utilizzati il giorno della dissezione e della registrazione.
- Preparare il terreno di Liebovitz integrato con 10 mM di HEPES (soluzione di L-15). I seguenti passaggi descrivono la preparazione di 1 L di soluzione L-15.
- Versare 990 mL di H2O deionizzato in un becher. Misurare e aggiungere 2,386 g (10 mM) di HEPES. Aggiungere un flacone da 1 L di soluzione L-15 in polvere.
NOTA: L-15 in polvere ha una durata di conservazione più lunga e occupa meno spazio di conservazione. In alternativa, acquistare la soluzione L-15 e integrare con HEPES. Quest'ultima opzione ha anche la possibilità di utilizzare una soluzione priva di fenolo, utile per l'imaging a fluorescenza. - Mescolare la soluzione su un piatto per mescolare. Utilizzando un pHmetro, aggiungere lentamente 1 N di idrossido di sodio (NaOH) per ottenere un pH compreso tra 7,34 e 7,36.
- Aggiungere H2O deionizzato fino a quando la soluzione raggiunge un volume di 1.000 mL. Filtrare la soluzione utilizzando una membrana di dimensioni dei pori di 0,22 μm.
NOTA: La soluzione L-15 può essere conservata a 4 °C per circa 1-2 settimane. Se si utilizza L-15 a base di rosso fenolo, la soluzione diventerà rosa se troppo basica (pH > 7,4) o arancione se troppo acida (pH < 7,34).
- Versare 990 mL di H2O deionizzato in un becher. Misurare e aggiungere 2,386 g (10 mM) di HEPES. Aggiungere un flacone da 1 L di soluzione L-15 in polvere.
- Preparare il terreno di coltura per i neuroni gangliari vestibolari (VGN) (con modifica per gli SGN). Segui i passaggi seguenti per preparare 50 ml di terreno di coltura:
- Aggiungere 47,5 mL di terreno minimo essenziale GluMAX-I in un becher di vetro pulito.
- Misurare e aggiungere 0,1194 g (10 mM) di HEPES. Questo tampone aggiuntivo resiste alle variazioni di pH mentre le cellule si depositano, prima di essere spostate nell'incubatrice.
- Aggiungere 2,5 ml di siero fetale bovino (FBS). Questo fa il 5% in volume di FBS in un volume totale di 50 mL di terreno. Per le preparazioni SGN, 2,5 mL di FBS vengono sostituiti con 0,5 mL di soluzioni di N2 e 1 mL di B27.
- Mescolare la soluzione su un piatto per mescolare. Utilizzando un pHmetro, aggiungere lentamente 1 N NaOH per ottenere un pH compreso tra 7,38 e 7,4.
- Aggiungere 0,5 mL di penicillina-streptomicina. Filtrare la soluzione attraverso un filtro sterile da 0,22 μm. Conservare la soluzione a 4 °C.
- Almeno 30 minuti prima dell'uso, trasferire il terreno di coltura in un pallone per colture tissutali con tappo ventilato. Collocare il matraccio con il terreno di coltura in un incubatore con una concentrazione di CO2 del 5% a 37 °C.
- Preparare la soluzione interna del cerotto perforato
NOTA: In questo caso, vengono utilizzati 100 mL di soluzione interna di cerotto perforato per la registrazione dell'intera cellula (la ricetta è riassunta nella Tabella 1). Queste soluzioni possono essere preparate con largo anticipo e conservate a -20 °C. Le aliquote possono essere conservate a tempo indeterminato a -20 °C se non sono sottoposte a un ciclo ripetuto di congelamento e scongelamento.- Fino a 6 mesi prima, preparare e conservare le soluzioni madre di quanto segue: 1 M KCl, 0,5 M Mg2Cl (esaidrato) e 0,5 M CaCl2. Conservare in bottiglie ermetiche fino a 6 mesi a 4 °C.
NOTA: È una buona idea controllare l'osmolalità delle soluzioni madre (2.000 mOsm per la soluzione madre 1 M KCl; 1.500 mOsm per le soluzioni Mg2Cl e CaCl2 ) per assicurarsi che la concentrazione target sia raggiunta. Non utilizzare se la soluzione diventa torbida o forma precipitati. Questo può essere un possibile punto di pausa.
- Fino a 6 mesi prima, preparare e conservare le soluzioni madre di quanto segue: 1 M KCl, 0,5 M Mg2Cl (esaidrato) e 0,5 M CaCl2. Conservare in bottiglie ermetiche fino a 6 mesi a 4 °C.
- Il giorno della creazione della soluzione interna, seguire i passaggi seguenti utilizzando le soluzioni stock del passaggio 1.3.
- Misurare 100 mL di milli-Q (MQ)H2O. Prelevare 40 mL dai 100 mL e mettere da parte in un becher pulito.
- Aggiungere i restanti 60 mL di H2O in un becher da 100 mL pulito e sterile. Aggiungere 2,5 mL di 1 M KCl, 1 mL di 0,5 M mg2Cl-esaidrato e 0,02 mL di CaCl0,5 M 2.
- Aggiungere una barra per mescolare e posizionare il becher su un piatto per mescolare. Mescolare fino a completo scioglimento. Aggiungere 1,307 g di dir2SO4. Mescolare fino a quando il K2SO4 si scioglie.
- Pesare 0,1192 g di HEPES (target 5 mM in un volume finale di 100 ml) e aggiungerlo alla soluzione. Mescolare fino a quando non si sarà sciolto.
NOTA: Assicurarsi che tutti i componenti siano completamente dissolti, poiché a volte ci vuole tempo prima che il K2SO4 si dissolva. - Pesare 0,1902 g di glicole etilenico-bis(β-amminoetere etilico)-N,N,N′,N′-acido tetraacetico (EGTA) (obiettivo 5 mM in un volume finale di 100 mL) e aggiungere alla soluzione. Poiché l'EGTA non si dissolve completamente in una soluzione acida, posizionare il becher su una piastra di agitazione e inserire la sonda di pH.
- Agitando, titolare lentamente 1 M KOH fino a quando l'EGTA non si dissolve completamente. Aspettatevi che questo avvenga quando il pH è compreso tra 6 e 7. Continuare ad aggiungere lentamente KOH fino a quando il pH finale è 7,35 (circa 1,2-1,3 mL di KOH in totale).
- Aggiungere MQH2O per portare la soluzione a un volume finale di 100 mL e mescolare. Controllare l'osmolalità della soluzione (target 270 mOsm/kg per la soluzione di cerotto perforato) con un osmometro.
- Filtrare la soluzione interna del cerotto perforato utilizzando un filtro sterile da 0,22 μm. Conservare in aliquote da 5 mL a -20 °C. Utilizzare una nuova aliquota per ogni nuova sessione di registrazione.
NOTA: Questo può essere un possibile punto di pausa.
2. Fabbricazione di pipette di triturazione
NOTA: Le pipette di triturazione possono essere riutilizzate per più esperimenti. Sciacquare le pipette con etanolo, acqua e soluzione di L-15 prima di ogni utilizzo e pulirle con acqua ed etanolo dopo ogni utilizzo. Conservare con cura tra un utilizzo e l'altro.
- Per preparare le pipette di triturazione per la dissociazione cellulare, tenere una pipetta Pasteur di vetro alla fiamma di un bruciatore Bunsen. Una volta che la punta del vetro inizia a sciogliersi, allungare il vetro fino al diametro desiderato. Allontanare un'estremità della pipetta dalla fiamma per creare una piccola curva.
- Avvicinare la pipetta piegata a un microscopio. Usando una piastrella di incisione, incidete e rompete il vetro al diametro desiderato.
- Passare la punta della pipetta sopra la fiamma del bruciatore Bunsen. Questo luciderà rapidamente i bordi ruvidi vicino alla punta. Verificare che la punta non sia sigillata dalla fiamma.
- Ripetere il processo fino a quando non sono state preparate quattro o cinque pipette di dimensioni variabili.
3. Fabbricazione di pipette patch
NOTA: Preparare un set di pipette patch prima della sessione di registrazione, ma dopo la dissezione e la coltura dei ganglioni. Sebbene gli elettrodi realizzati uno alla volta durante la sessione di registrazione siano ottimali in termini di prestazioni, è stato ottenuto un discreto successo quando questi vengono realizzati in batch la sera prima. Conservare le pipette in un contenitore di vetro coperto per proteggere i puntali dalla polvere.
- Utilizzare un estrattore verticale di elettrodi e pipette in vetro borosilicato filamentato con diametro esterno di 1,5 mm/diametro interno di 1,17 mm. Assicurarsi che il vetro sia sempre privo di polvere e impronte digitali.
- Prelevare 8-10 pipette di registrazione utilizzando un programma in due fasi, come raccomandato dal produttore per le pipette a cerotto.
- Ispezionare e lucidare a caldo ogni puntale di pipetta di registrazione con una microforgia; La lucidatura a caldo favorisce una migliore tenuta. La resistenza target della pipetta è compresa tra 4 e 8 MΩ.
- Conservare le pipette lucidate in un contenitore coperto. Questo può essere considerato come un punto di pausa nell'esperimento.
NOTA: L'ottimizzazione del diametro della pipetta per raggiungere l'intervallo di resistenza target richiede alcuni tentativi ed errori con i passaggi 3.2 e 3.3. La maggior parte dei sistemi patch-clamp commerciali è dotata di una funzione di test a membrana incorporata per misurare la resistenza dell'elettrodo nella soluzione del bagno. La resistenza viene calcolata come rapporto tra la corrente di uscita in regime stazionario in risposta a uno stimolo a gradini di 5 mV applicato. Le impostazioni di estrazione al punto 3.1 e la lucidatura al punto 3.2 devono essere regolate in primo luogo utilizzando pipette di prova, fino a quando la resistenza delle pipette di prova non rientra nell'intervallo da 4 a 8 MΩ. - Il giorno della registrazione, rivestire i puntali delle pipette per ridurre la capacità della pipetta e il rumore di registrazione. Per fare ciò, avvolgere una piccola striscia di pellicola di paraffina sullo stelo della pipetta. Non è necessario avvolgere fino alla punta.
NOTA: Una strategia alternativa consiste nel rivestire e fissare a caldo un elastomero siliconico sullo stelo della pipetta12.
4. Estrazione del ganglio vestibolare e placcatura dei neuroni vestibolari
- Preparazione per la dissezione
- Preparare una miscela enzimatica di soluzione di L-15 con lo 0,05% di collagenasi e lo 0,25% di tripsina. Ad esempio, aggiungere 0,001 g di collagenasi e 0,005 g di tripsina a 2 ml di soluzione di L-15 in un becher, aggiungere un piccolo agitatore magnetico e mescolare fino a completo miscelamento. Mettere da parte a temperatura ambiente.
- Preparare una ghigliottina ottenuta commercialmente posizionando tovaglioli di carta ai lati e sotto la ghigliottina per ridurre al minimo l'esposizione del piano di lavoro e di altre superfici al sangue e ad altri materiali biologici.
- Disponi grandi forbici in acciaio inossidabile, grandi pinze e grandi forbici a molla. Tieni a portata di mano un grande flacone spray con etanolo al 70% per la pulizia della testina.
- Riempire un becher da 100 ml con soluzione di L-15 e metterlo su ghiaccio. Ossigenare la soluzione di L-15.
- Disporre le forbici a molla, le forbici chirurgiche, le pinze, il bisturi e la pipetta di trasferimento (vedere la tabella dei materiali).
- Preparare una capsula di Petri da 60 mm (per la dissezione macroscopica) e due piastre di Petri da 35 mm (per la pulizia/dissezione fine dei gangli). Riempire la capsula da 60 mm con una soluzione ossigenata di L-15 utilizzando una siringa da 30 mL con una punta filtrante da 0,22 μm.
- Eutanasia, pulizia della testa ed emisezione
- Pesare i cuccioli per calcolare il dosaggio appropriato di diluizione fatal-plus da somministrare per via intraperitoneale (~0,01 mL per 10 g).
- Una volta raggiunto un piano profondo di anestesia, come valutato da una mancanza di risposta al pizzicotto del dito del piede, decapitare usando la ghigliottina.
- Sciacquare accuratamente la testa con etanolo al 70% e poi accuratamente con soluzione di L-15.
- Rimuovere completamente la pelle dal cranio. Dividi in due la testa usando grandi forbici a molla partendo dal punto di ingresso del midollo spinale al cervello e praticando due tagli, il primo attraverso la parte superiore del cranio e il secondo attraverso la parte inferiore della mascella. Finisci di dividere in due la testa usando le forbici chirurgiche.
- Posizionare entrambe le metà della testa con il lato encefalico rivolto verso il basso in una capsula di Petri da 60 mm riempita con soluzione di L-15. Posizionare il tessuto fresco non attualmente sezionato sul ghiaccio.
- Estrazione del ganglio vestibolare superiore
- Estrai il cervello usando le forbici chirurgiche chiuse. Recidere e rimuovere il nervo cranico per staccare completamente il cervello dal cranio.
NOTA: A questo punto, la capsula otica (a forma di numero 8) dovrebbe essere visibile nella parte posteriore della testa. - Usando una pinza e partendo dalla parte posteriore della testa, estrarre il materiale membranoso trasparente.
- Taglia la parte superiore del cranio usando le forbici chirurgiche. Rimuovere il tessuto in eccesso dalla parte posteriore della testa e del collo per rendere l'area di dissezione e la capsula otica più pulite e di più facile accesso.
NOTA: Evitare di rendere il piatto troppo torbido scartando il tessuto in eccesso durante la procedura. - Trasferire il tessuto in una seconda capsula di Petri con una soluzione fresca di L-15. Localizzare la capsula otica e i nervi uditivi, vestibolari superiori e vestibolari inferiori. Taglia via il nervo uditivo e separa i gangli superiori e inferiori usando piccole forbici a molla.
NOTA: Sebbene i somata del nervo vestibolare si trovino sia nei gangli inferiori (più sottili) che in quelli superiori (più spessi), le cellule estratte dal ganglio superiore hanno una migliore sopravvivenza. - Usando un bisturi, radere delicatamente la cresta ossea per indebolire l'area ossea, sotto la quale il nervo si tuffa nella capsula ossea. Rimuovere con cautela i detriti con una pinza fine, esponendo l'intera parte gonfia del ganglio.
- Usa le forbici a molla fine per tagliare e separare il ganglio dal ramo nervoso periferico che si sta tuffando verso l'utricolo.
- Rimuovere il ganglio superiore utilizzando una pinza fine, facendo attenzione a non pizzicare troppo vicino al tessuto gangliare. Trasferire in una capsula di Petri da 35 mm con una soluzione fresca di L-15.
- Prima di procedere, preriscaldare la soluzione enzimatica: versare la miscela enzimatica in una capsula di Petri da 35 mm e porre in un incubatore a 37 °C per 10-15 min.
- Pulisci il ganglio usando una pinza fine e piccole forbici a molla rimuovendo l'osso (che appare bianco e cristallizzato nella struttura), il tessuto in eccesso, le fibre nervose e qualsiasi altra struttura superflua. Fare attenzione a ridurre al minimo la rimozione di qualsiasi tessuto gangliare.
- Estrai il cervello usando le forbici chirurgiche chiuse. Recidere e rimuovere il nervo cranico per staccare completamente il cervello dal cranio.
- Dissociazione e placcatura dei tessuti
- Trasferire i gangli puliti nella soluzione enzimatica preriscaldata e rimetterli nell'incubatrice per 10-40 minuti. Il trattamento enzimatico è completo quando il tessuto inizia a rompersi ma rimane in un unico pezzo. Il trattamento eccessivo del tessuto con enzimi si tradurrà nella completa dissoluzione dei gangli prima della triturazione.
NOTA: La durata del trattamento enzimatico del tessuto dipende dall'età dell'animale. Ad esempio, i gangli dei ratti P9 vengono trattati con l'enzima per 25 minuti e i gangli dei ratti P15 vengono trattati con l'enzima per 35 minuti. - Trasferire i gangli nella capsula di Petri da 35 mm con una soluzione fresca di L-15 e incubare per 2-3 minuti.
- Trasferire i gangli in un'altra capsula di Petri da 35 mm riempita con terreno di coltura filtrato.
- Utilizzando una micropipetta da 200 μL, pipettare una goccia di ~150 μL di terreno di coltura filtrato su una piastra con fondo in vetro rivestito. Non aggiungere troppa soluzione, poiché è importante mantenere la tensione superficiale per formare una bolla di soluzione che rimane sopra il vetrino coprioggetto.
- Trasferire il numero desiderato di gangli (da uno a quattro) sul vetrino coprioggetti.
- Prelevare una piccola quantità di terreno di coltura dalla piastra di coltura per sciacquare la pipetta di triturazione con il terreno per evitare che il tessuto si attacchi ai lati della pipetta di vetro. Triturare facendo passare delicatamente e ripetutamente il tessuto attraverso la pipetta fino a quando i gangli non sono sufficientemente dissociati.
NOTA: Non sovraccaricare il tessuto per tentare sospensioni unicellulari o lasciare che le cellule si schiantino sul fondo del piatto utilizzando una pressione positiva eccessiva. Inoltre, evitare la formazione di bolle d'aria, in quanto ciò ridurrà la sopravvivenza delle cellule. La triturazione delicata è la chiave per ottenere una sopravvivenza cellulare di successo. - Lasciare riposare le cellule per 5 min. Controllare al microscopio se le cellule si sono depositate sul vetrino coprioggetto.
- Mettere con cautela una capsula di coltura in un'incubatrice a 37 °C per 12-24 ore. Anche in questo caso, assicurati di mantenere intatta la bolla di soluzione.
NOTA: In caso di coltura per più di 24 ore, aggiornare quotidianamente i terreni di coltura. Questo può essere un possibile punto di pausa.
- Trasferire i gangli puliti nella soluzione enzimatica preriscaldata e rimetterli nell'incubatrice per 10-40 minuti. Il trattamento enzimatico è completo quando il tessuto inizia a rompersi ma rimane in un unico pezzo. Il trattamento eccessivo del tessuto con enzimi si tradurrà nella completa dissoluzione dei gangli prima della triturazione.
- Placcatura SGN
- Seguire i passaggi da 4.2.1 a 4.2.5 delle istruzioni del ganglio vestibolare per dividere in due la testa.
- Individua la capsula otica (a forma di numero 8) ed estrai dal cranio scheggiando i bordi usando una pinza smussata.
- Cambiare la soluzione L-15. La porzione a spirale della capsula otica ospita la coclea con l'organo di Corti. Sgretolare l'osso sovrastante i giri cocleari senza danneggiare il tessuto sottostante, con una pinza fine parallela alla curva dell'osso.
- Una volta che è stato rimosso abbastanza osso per rivelare l'intera estensione dei giri cocleari, utilizzare piccole forbici a molla per recidere il modiolo (tessuto fibroso denso, bianco contenente assoni centrali di SGN) alla base della coclea per liberarlo dal resto della capsula otica.
- Rimuovere la stria vascolare pizzicando la stria alla base con una pinza fine. Srotolare intorno alla spirale e fino all'apice per staccarla dall'organo di Corti.
- Tagliate l'organo di Corti in due o tre giri usando delle piccole forbici a molla in modo che sia piatto.
- Asportare il modiolo da ogni giro con piccole forbici a molla.
- Rimuovere il ganglio a spirale tagliando il bordo del punto in cui i tratti di fibra SGN si proiettano verso le cellule ciliate.
- Pulisci il ganglio usando una pinza fine rimuovendo l'osso (che appare bianco e cristallizzato nella struttura), il modiolo (che appare bianco e fibroso) e qualsiasi altra struttura superflua. Fare attenzione a ridurre al minimo la rimozione di qualsiasi tessuto gangliare.
- Seguire la stessa procedura utilizzata per il trattamento enzimatico del ganglio spirale utilizzata per il ganglio vestibolare nel paragrafo 4.4. I tempi enzimatici sono in genere più brevi nel ganglio spirale, che è più allungato del ganglio vestibolare. Utilizzare pipette di triturazione di diametro inferiore per il ganglio a spirale rispetto al ganglio vestibolare.
- Triturare il ganglio spirale in terreno di coltura integrato con N2 e B27, indicato nella ricetta dei terreni di coltura.
- Porre la capsula di coltura contenente i gangli dissociati in un'incubatrice a 37 °C, 5% di CO2 per 12-24 ore.
NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
5. Registrazione
NOTA: In questa procedura, le registrazioni patch-clamp dal ganglio isolato vengono in genere eseguite 12-24 ore dopo la placcatura. Altri laboratori hanno riportato risultati dai neuroni dopo periodi molto più lunghi in coltura10.
- Preparare la camera di registrazione
- Utilizzare la camera di registrazione a scambio rapido (o equivalente) che consente registrazioni patch-clamp direttamente nel piatto di coltura. Posizionare la camera sul microscopio invertito.
- Inserire le piastre di coltura con fondo di vetro nella camera.
- Alimentare la soluzione L-15 attraverso un sistema di tubi di perfusione nella camera di registrazione. Stabilizzare la perfusione in entrata e in uscita nella camera a una velocità di 0,5-1 mL al minuto.
- Preparare la soluzione interna per il caricamento degli elettrodi
- Scongelare un'aliquota della soluzione interna della toppa perforata. Allocare 2,5 mL della soluzione su una piastra di coltura da 35 mm. Riposizionare il coperchio sulla piastra di coltura e l'etichetta come "Tip Dip". Mettere da parte in una zona priva di polvere, poiché è molto importante mantenere questa soluzione il più pulita possibile.
- Pesare 1 mg di amfotericina-B e aggiungere 20 μL di dimetilsolfossido (DMSO). Vorticare e far girare la soluzione fino a quando tutta l'amfotericina-B è nella soluzione. Aggiungere 10 μL della soluzione DMSO/amfotericina-B ai restanti 2 mL della soluzione interna del cerotto perforato scongelato. Prelevare e sciogliere la soluzione con una pipetta due o tre volte per assicurarsi che il DMSO/amfotericina-B si sia miscelato uniformemente nella soluzione interna. La soluzione avrà una lieve sfumatura giallastra.
- Prelevare la soluzione interna del cerotto perforato amfotericina-B in una siringa da 3 ml. Aggiungere un puntale da 34 G alla siringa. Avvolgere la siringa in un foglio di alluminio e tenere la siringa sul ghiaccio.
NOTA: Questa soluzione deve essere rifatta ogni 2 ore per garantire l'efficacia dell'amfotericina-B nel perforare la membrana cellulare. L'amfotericina-B è sensibile alla luce e deve essere schermata dalla luce utilizzando un foglio di alluminio o altri metodi.
- Registrazioni patch-clamp
- Visualizza i neuroni usando un obiettivo 10x o 20x. Regola l'illuminazione e ottimizza l'ottica per vedere i confini e le ombre intorno alla cella.
- Controllare la qualità dei neuroni isolati. Tenta solo neuroni con superfici lisce e uniformi che non sono troppo contrastate e hanno solo piccoli crateri dispersi. Inoltre, assicurati di evitare coppie di neuroni, neuroni circondati da detriti o altre cellule.
- Con un ingrandimento di 100x, identifica un neurone o un campo di neuroni da rattoppare e allineali al centro del campo visivo.
- Riempire il puntale della pipetta con una soluzione pulita che non contenga amfotericina immergendo il puntale (per ~20 s) nella soluzione pulita che è stata posta in un piatto di coltura. L'azione capillare attirerà una piccola quantità di soluzione nella punta.
NOTA: Eseguire questo passaggio con un microscopio a dissezione stereoscopica, che consente di determinare la capacità del puntale di trattenere la soluzione Tip Dip. Se la soluzione non regge per ~10-20 s, la forma dell'elettrodo non è ideale. In questo caso, riconfigurare il programma di estrazione dell'elettrodo per produrre una punta più lunga. - Successivamente, riempire il retro della pipetta con la soluzione interna contenente amfotericina. Il filamento all'interno della pipetta attirerà la soluzione verso il basso per incontrare la soluzione pulita nel puntale. Lascia che il filamento tiri dolcemente verso il basso la soluzione e non tentare di eliminare le bolle, poiché ciò forzerà l'amfotericina verso la punta troppo velocemente.
- Utilizzare una siringa per estrarre la soluzione che potrebbe trovarsi nella parte posteriore dell'elettrodo.
NOTA: È molto importante lavorare velocemente da questo punto per atterrare e formare una tenuta ad alta resistenza sulla cella desiderata. - Inserire la pipetta nell'apposito supporto. Verificare che la pipetta sia ben aderente al supporto per evitare che la pipetta vada alla deriva. Se la pipetta non è stabile, sostituire gli O-ring di tenuta nella parte anteriore e posteriore del portapipetta per ridurre al minimo la deriva e mantenere una forte aspirazione. Sostituire la pipetta con una appena riempita.
- Abbassare la pipetta nel bagno della camera di registrazione.
- Posizionare il puntale della pipetta al centro del campo visivo. Assicurarsi che la punta sia priva di bolle d'aria o altri detriti.
- Applicare un passo di tensione (5 mV) nel test della membrana per monitorare la resistenza della pipetta. Continuare a monitorare la resistenza di ingresso durante l'intero processo di formazione di una tenuta sulla cella.
- Annullare il potenziale di offset della pipetta, in modo che la corrente della pipetta sia pari a zero nella modalità di test della membrana di pClamp.
- Correggere la capacità della pipetta utilizzando la funzione di compensazione rapida della capacità sull'amplificatore patch-clamp (selezioni rapide Cp nel pannello morbido Multiclamp Commander).
- Spostare la pipetta verso il basso nella cella.
- Una volta che la pipetta è abbastanza vicina al neurone, passare all'obiettivo con ingrandimento più alto e inviare l'immagine attraverso una telecamera a un monitor (utilizzare un obiettivo 40x, ingrandimento totale 400x). Regolare la pipetta e ricentrare il neurone.
- Avvicinare l'elettrodo di registrazione al soma. Individuare il centro del neurone sul monitor e posizionare l'elettrodo di registrazione sopra il neurone.
- Avvicinati al neurone dall'alto, in modo che l'elettrodo atterri al centro della cella sferica. Regolare l'offset della pipetta per azzerare i potenziali CC costanti nel sistema.
- Posizionare la pipetta vicino alla membrana. Atterra saldamente al centro della cella.
NOTA: Durante l'atterraggio, si verificherà una piccola fossetta sulla superficie del neurone e un raddoppio/triplicazione della resistenza di ingresso. - Applicare una pressione negativa (aspirazione) utilizzando una siringa o una pipetta orale. Attivare il potenziale di mantenimento di -60 mV. La resistenza di tenuta dovrebbe aumentare fino a superare un giga-ohm.
NOTA: Lavorare velocemente per ridurre il tempo che intercorre tra il riempimento di un elettrodo e l'atterraggio su una cella. C'è un tempo limitato prima che l'amfotericina aggiunta alla soluzione interna del cerotto perforato nella fase 5.3.5 raggiunga la punta dell'elettrodo. Una volta che la punta è contaminata da amfotericina, è difficile formare guarnizioni ad alta resistenza e la resistenza spesso si stabilizza a ~200 megaohm. - Una volta formata una guarnizione giga-ohm, rilasciare la pressione negativa. Non appena si forma il sigillo, applicare la compensazione rapida della capacità per ridurre il più possibile l'ampiezza dei transitori di capacità della pipetta in modalità di test a membrana.
- Quando l'amfotericina inizia a funzionare, osservare come la resistenza di ingresso diminuisce lentamente e la corrente che scorre in risposta al passo di tensione di 5 mV aumenta progressivamente man mano che l'amfotericina entra nella membrana. Un'improvvisa diminuzione della resistenza in serie invece di una graduale stabilizzazione suggerisce che si è verificata una rottura spontanea.
- Stimare la capacità dell'intera cella e la resistenza in serie utilizzando la funzione di annullamento dei transitori capacitivi dell'amplificatore. Documentare e monitorare la resistenza in serie all'inizio e regolarmente durante l'esperimento.
NOTA: La resistenza in serie può richiedere da 5 a 20 minuti per stabilizzarsi, a seconda delle dimensioni dell'elettrodo e della quantità di soluzione pulita aspirata nella pipetta. Le modalità voltage-clamp e current-clamp possono essere utilizzate una volta che la resistenza in serie si è stabilizzata al di sotto di 30 megaohm. A volte si osserva un rigonfiamento o un restringimento dei neuroni durante la registrazione, ma raramente quando l'osmolarità e il pH delle soluzioni sono regolati correttamente.
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Representative Results
L'esecuzione di protocolli di voltage-clamp mediante l'applicazione di famiglie di gradini di tensione rivela l'attivazione dipendente dalla tensione di una varietà di diverse famiglie di correnti. Esempi rappresentativi di correnti intere evocate da un VGN e adattate da registrazioni pubblicate13 sono mostrati nella Figura 1A,B. L'applicazione di tensioni depolarizzanti (Figura 1B) attiva una corrente verso l'interno (negativa per convenzione) che si attiva e si inattiva molto rapidamente (Figura 1A). Questo è stereotipato per le proprietà voltaggio-dipendenti dei canali del sodio14,15, che guidano principalmente la corsa verso l'alto dei potenziali d'azione16,17. La depolarizzazione attiva anche una corrente verso l'esterno di lunga durata e ad attivazione relativamente lenta che guida la corsa discendente di un potenziale d'azione. La farmacologia ha rivelato che queste correnti sono in gran parte trasportate da una varietà di canali del potassio nei VGN 3,18,19,20,21.
Le tensioni iperpolarizzanti profonde e di lunga durata evocano una corrente verso l'interno ad attivazione lenta trasportata dai canali nucleotidici ciclici (HCN) attivati dall'iperpolarizzazione22 (Figura 1C). L'attivazione di queste correnti può essere studiata utilizzando il protocollo della corrente di coda mostrato nella Figura 1D. In questo caso, la percentuale di attivazione della corrente viene sondata tracciando la corrente che scorre durante il passo di coda (Itail) in funzione della tensione di condizionamento. La curva di attivazione corrente-tensione ha una forma sigmoidale (Figura 1E). Sebbene questo canale sia controllato da secondi messaggeri solubili come l'AMP ciclico (cAMP), le curve di attivazione misurate utilizzando la configurazione a patch perforata sono stabili per tutta la durata di una lunga registrazione. Al contrario, le dimensioni e l'intervallo di attivazione della tensione del canale sono alterati (presumibilmente a causa del washout dei componenti citosolici) quando la registrazione viene effettuata nella configurazione a patch rotta.
La diversità neuronale è illustrata dalla gamma di modelli di attivazione suscitati quando le correnti vengono iniettate in diversi VGN e SGN (Figura 2; in alto e in basso, rispettivamente). Alcuni neuroni si attivano solo all'inizio dell'iniezione di corrente, mentre altri si attivano più volte. Questa eterogeneità riflette una diversità fondamentale nella composizione dei canali sottostanti del sodio e del potassio sia nei VGN che negli SGN 23,24,25.
Figura 1: Esempi di protocolli di voltage-clamp per la misurazione di diversi gruppi di correnti ioniche. (A,B) Esempio di correnti a cella intera (A) indotte da una famiglia di gradini di tensione (B). Le correnti nette di sodio verso l'interno (correnti negative) sono qui identificate dalla loro attivazione e inattivazione transitoria (freccia etichettata, Na+). Le correnti nette verso l'esterno (freccia etichettata, K+, correnti positive di lunga durata) sono trasportate in gran parte da ioni potassio e hanno cinetiche di attivazione e inattivazione molto più lente rispetto alle correnti di sodio. (C,D) Le correnti HCN sono attivate da una famiglia di tensioni iperpolarizzanti di lunga durata. (E,F) Stabilità della caratterizzazione dei canali ionici nella patch perforata in diversi punti temporali durante la registrazione. Le curve di attivazione dipendenti dalla tensione delle correnti HCN sono state misurate in una configurazione a patch perforata I. Curve di attivazione delle correnti HCN durante una configurazione a patch rotta (F). Le immagini C-F sono state modificate da13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Diversi modelli di sparo sono evocati dall'iniezione di fasi di correnti. (A) Schemi di sparo in cinque gangli vestibolari somata. (B) Schemi di sparo in cinque SGN. (C) Passi correnti corrispondenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I metodi qui presentati sono specifici per le registrazioni da neuroni isolati; Studi precedenti si sono concentrati sulle registrazioni dei terminali assonali in una preparazione semi-intatta. Rispetto alle tecniche di registrazione terminale esistenti, le registrazioni isolate offrono un comportamento superiore di space-clamp e isopotenziale. Inoltre, questo protocollo fornisce l'accesso a un campione più ampio di neuroni, poiché solo le sottopopolazioni portatrici di calici sono accessibili nelle registrazioni semi-intatte degli epiteli vestibolari. Infine, le registrazioni isolate consentono l'uso della tecnica del cerotto perforato, che previene la rottura dell'ambiente intracellulare che è spesso interrotto dalla dialisi tra la soluzione intracellulare e il citosol nelle registrazioni del cerotto rotto.
Le registrazioni di successo si basano in primo luogo sulla qualità del somata isolato e coltivato. Un passaggio critico nella sopravvivenza cellulare è la forza richiesta durante la triturazione per produrre i neuroni isolati. Una mano gentile è vitale per la sopravvivenza delle cellule. Le pipette di triturazione devono essere posizionate in alto nella bolla della soluzione di L-15 per evitare l'espulsione forzata dei neuroni sul fondo del piatto. In caso di problemi di sopravvivenza cellulare, è necessario prestare particolare attenzione anche per evitare la formazione di bolle d'aria o la rottura della bolla di soluzione, che impedisce alle cellule dissociate di depositarsi sul vetrino coprioggetti. È anche meglio avere pipette di triturazione lucidate a caldo disponibili in una varietà di dimensioni, in modo che gli sperimentatori abbiano la flessibilità di sceglierne una con un diametro tale che il ganglio subisca una lieve resistenza mentre passa attraverso la pipetta. La lucidatura a caldo delle pipette riduce i danni causati dal passaggio del ganglio sui bordi ruvidi del vetro. Lasciare un bordo ruvido può inizialmente sembrare più efficace nel rompere i gangli, ma questo approccio danneggia i somata e riduce la sopravvivenza dopo il periodo in coltura. Un ultimo consiglio è quello di custodire gelosamente una pipetta di triturazione di successo.
Un altro fattore critico per la sopravvivenza cellulare è la durata del trattamento con enzimi digestivi. Quando si determina il tempo dell'enzima, i ricercatori devono regolare attentamente il tempo per garantire che il tessuto si rompa bene, ma non così tanto da influire sulla sopravvivenza cellulare. Troviamo che l'impatto del trattamento enzimatico sulla sopravvivenza cellulare e sulle proprietà dei canali ionici è minimo, poiché i dati raccolti dalle cellule trattate con enzimi sembrano essere coerenti con altri metodi che non si basano su questo approccio19,26. Sebbene il trattamento enzimatico riduca al minimo la forza necessaria per la triturazione, presenta il limite che la digestione enzimatica (in particolare basata sulla sola tripsina o papaina) è nota per causare danni ai canali ionici27. Pertanto, anche se raccomandiamo alcune linee guida per la tempistica enzimatica a seconda dell'età dell'animale, è meglio essere preparati a regolare il tempo in base ai risultati. Infine, incoraggiamo un approccio "less is more" alla triturazione. Ciò significa resistere all'impulso di formare una sospensione unicellulare e interrompere la triturazione dopo tre o quattro passaggi, anche se rimangono diversi grandi pezzi di tessuto.
Un vantaggio della coltura è che sembra pulire la membrana cellulare somatica e promuove lo spargimento delle cellule gliali che formano la mielina, il che consente quindi un patch-clamping più efficace dai neuroni. Pertanto, la preparazione del ganglio isolato e coltivato è particolarmente utile per estendere le registrazioni del patch-clamp oltre la 1a settimana postnatale, dopo di che i corpi cellulari si ricoprono progressivamente di mielina, impedendo l'elettrodo del patch-clamp. L'attività dei canali ionici osservata nelle registrazioni patch-clamp da VGN isolati e coltivati a breve termine (<24 ore) oltre la 2a settimana postnatale è coerente con i cambiamenti zonali e maturativi nell'espressione dei canali ionici osservati dall'immunoistochimica e dalle registrazioni dirette dai terminali del calice negli epiteli vestibolari28,29. Tuttavia, va notato che la coltura prolungata aiutata da fattori neurotrofici e antibiotici può anche influenzare i canali ionici 30,31,32,33,34. Qualsiasi applicazione di queste tecniche deve considerare attentamente l'impatto di questi fattori sulla biofisica sottostante dei neuroni e dei loro canali ionici 30,31,32,33,34.
Nel complesso, le registrazioni patch-clamp di somata isolati e in coltura sono adatte per studiare la diversità nelle proprietà dei canali ionici dei neuroni dell'orecchio interno. La stabilità a lungo termine della configurazione a patch perforato è particolarmente adatta per lo studio di canali ionici come l'HCN, le cui proprietà di attivazione sono soggette a modulazione tramite secondi messaggeri citosolici.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non sussistono conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo le dottoresse Jing Bing Xue e Ruth Anne Eatock per i loro primi contributi a questi metodi. Questo lavoro è stato supportato da NIH NIDCD R03 DC012652 e NIH NIDCD DC012653S, e R01 DC0155512 a RK e T32 DC009975 a DB, NN e KR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | For perforated patch recordings. |
| ATP di-sodium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additive to internal solution |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | additive to culture medium, for SGN |
| Beakers (1000, 100, 10) milliliter | |||
| bench-top centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
| Bunsen burner | |||
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Additive to internal solution |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22x40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
| DMSO | Biotium | 90082 | |
| Dnase I,from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 11284932001 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Dumont #3 Forceps (Blunt) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont #55 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additive to internal solution |
| Electrode Puller | Narashige | PC-10 | |
| Epi-illumination light source | Zeiss | CL 1500 ECO | |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | for cleaning head and around dissection bench |
| Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
| Fine-edged dissection blade | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Glass Pasteur Pipettes | VWR | 14673-010 | to pull trituration pipettes |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | additive to culture medium |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | for pH buffering all solutions in protocol |
| Hot plate / magnetic stirrers | VWR | 76549-914 | |
| Insulated bucket filled with ice | to keep all samples and solutions cool | ||
| K2SO4, Potassium Sulfate | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additive to internal solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additive to internal solution |
| KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | To bring internal solution to desired pH. |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 14133-13 | |
| Leibovitz medium | Sigma Aldrich | L4386 | dissection and bath solutions |
| Low-profile-bath recording chamber for culture dishes | Warner Instruments | 64-0236 | |
| luer-lok syringes, 30 ml | BD | 302832 | for drawing L-15/HEPES/HEPES solution. |
| MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | base of the culture medium |
| MgCl2-Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M1028 | Additive to internal solution |
| microFil needle for filling micropipettes - 34 gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
| Microforge | Narashige | MF-90 | For electrode polishing. |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | additiive to culture medium, for SGN |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additive to internal solution |
| NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | for titration pH |
| Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
| Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing | USC Material Management | MEDOX200 (Identifier: 00015) | for dissolving into dissection and bath solutions |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| Pasteur pipette bulb (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | bulb for trituration pipettes |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | additive to prevent contamination of culture medium |
| Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) | MWI Animal Health | 15199 | for euthanasia |
| PES membrane filters , 0.2 micrometer | Nalgene | 566-0020 | for filtering solutions |
| PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | for filtering solutions drawn into syringes |
| Petri dishes, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration |
| Petri Dishes, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | for gross dissection |
| pH Meter | Mettler Toledo | Model S20 | |
| Pipettors (1000, 200, 10) microliter | USA Scientific | ||
| Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish | Mattek | P35GC-0-10-C | to plate neurons for culture |
| Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes | Warner Instruments | 64-0375 | |
| Reference Cell | World Precision Instruments | RC1T | |
| Scalpel blade | Miltex | 4-315 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| Serological Pipettes (10, 25) milliliter | Fisher Scientific | ||
| Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) | Warner Instruments | 64-0378 | |
| Small Animal Guillotine | Kent Scientific | DCAP | |
| Small animal guillotine | Kent Scientific | DCAP | for decapitation if dissecting rats older than P15. |
| Stereo Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Straight surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Syringe (3, 10, 30) milliliter | |||
| Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Tuberculin syringe | Covidien | 8881500105 | for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection |
| Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Volumetric flask, 1000 milliliter | |||
| Vortex | VWR | 945300 | |
| Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |
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