Summary
在这里，我们提出了一种优化的 体外 方法，使用来自人类细胞的总蛋白质提取物、涂有生物素化RNA的链霉亲和素珠和质谱分析来发现，定量和验证特定RNA序列的蛋白质相互作用物。
Abstract
蛋白质-RNA相互作用在转录和转录后水平上调节基因表达和细胞功能。出于这个原因，鉴定感兴趣的RNA的结合伴侣对于揭示许多细胞过程背后的机制仍然非常重要。然而，RNA分子可能与一些RNA结合蛋白（RBP）瞬时和动态地相互作用，尤其是与非规范蛋白。因此，非常需要改进方法来分离和鉴定此类RBP。
为了有效和定量地鉴定已知RNA序列的蛋白质伴侣，我们开发了一种基于所有相互作用蛋白质的下拉和表征的方法，从细胞总蛋白质提取物开始。我们使用预加载在链霉亲和素包被磁珠上的生物素化RNA优化了蛋白质下拉。作为概念验证，我们采用了已知结合神经变性相关蛋白TDP-43的短RNA序列和不同核苷酸组成但长度相同的阴性对照。用酵母tRNA封闭磁珠后，我们将生物素化的RNA序列加载到链霉亲和素珠上，并将它们与HEK 293T细胞的总蛋白质提取物一起孵育。在孵育和几个洗涤步骤以去除非特异性结合剂后，我们用高盐溶液洗脱相互作用的蛋白质，与最常用的蛋白质定量试剂和质谱样品制备兼容。与质谱阴性对照相比，我们量化了使用已知RNA结合剂进行的下拉中TDP-43的富集。我们使用相同的技术来验证计算预测为我们感兴趣的RNA或对照的独特结合剂的其他蛋白质的选择性相互作用。最后，我们通过 蛋白质印迹 法验证了该方案，通过检测具有适当抗体的TDP-43。
该协议将允许在接近生理条件下研究感兴趣的RNA的蛋白质伴侣，帮助发现独特和不可预测的蛋白质 - RNA相互作用。
Introduction
RNA 结合蛋白 （RBP） 已成为转录和转录后基因调控的关键参与者，因为它们参与 mRNA 剪接、RNA 细胞定位、翻译、修饰和降解等过程1，2，3。两个大分子之间的这种相互作用是高度协调的，精确平衡的，对于功能和加工中心的形成至关重要。这些中心内的变异或失调有可能破坏精细调控的蛋白质-RNA网络，并且越来越多地与各种人类疾病相关，包括癌症4，5和神经退行性疾病6，7，8。RNA分子与其蛋白质结合伙伴之间的相互作用可以是稳定的，易于实验验证，也可以是高度动态的，瞬态的，更难表征的。
近年来，为了解这些相互作用作出了大量努力。在最成熟的方法中，蛋白质下拉测定（PDs）可能是最受赞赏和最常用的方法，以解开构成核糖核蛋白（RNP）复合物和其他蛋白质 - RNA相互作用网络的主要参与者3，9，10。PD包括广泛的信息技术，例如RNA（RIP）11，12或感兴趣的蛋白质（CLIP）13，14的免疫沉淀。其中一些RNA-PD方案使用已知的RNA作为蛋白质15的诱饵，最常见的是利用生物素等高亲和力标签。在这种情况下，可以通过将RNA锚定在链霉亲和素包被的磁珠上来检测生物素化RNA的相互作用伙伴，从而实现RNP的有效分离。这些方法的主要局限性通常是生物素化探针的设计以及它们结合靶蛋白的能力的测试。为此，依靠目标蛋白质的已发表CLIP数据（如果有）可能是有用的，因为它们可以高精度地揭示与目标蛋白质13，16相互作用的峰值相对应的短RNA区域。这些相同的区域可用于开发PD的探针。设计这种RNA诱饵的另一种方法可能是通过指数富集（SELEX）17对配体进行系统进化，这使得通过体外选择设计适配体，从全面的随机文库开始，通过一系列PCR驱动的优化周期。然而，SELEX 既复杂又耗时，最终结果高度依赖于初始库。为了选择此处介绍的方案中使用的RNA诱饵，利用了另一种方法，包括使用通过算法cat RAPID的计算能力从头设计的RNA诱饵，该算法预测给定蛋白质与某些RNA序列的优先结合18，19，20。
这里介绍的方案是RNA-PD的一个版本，经过优化，可在接近生理的条件下洗脱特定的蛋白质伴侣，而无需使用洗涤剂，变性剂或高温。它依赖于共价包被高度纯化的链霉亲和素的纳米超顺磁性珠， 并使用特定的计算机 设计生物素化RNA作为诱饵。该协议提供了一种快速有效的方法来分离天然条件下生物素化RNA分子的结合伴侣，为广泛的下游应用提供了潜力。为了测试该协议，使用了10核苷酸单链RNA适配体序列，该序列先前设计用于以高亲和力和特异性结合蛋白TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）20。从HEK 293T细胞裂解物开始，通过使用高渗缓冲液对从RNA诱饵分离的样品进行质谱分析来鉴定生物素化RNA适配体的相互作用体。该分析证实了TDP-43作为首选粘合剂的成功鉴定和定量。
该协议能够仅使用短的体外合成RNA寡核苷酸成功鉴定蛋白质相互作用器。此外，使用计算机设计的RNA适配体作为PD探针21，22保证了靶标的特异性，并大大降低了成本。
Protocol
1. 一般方法和材料
- 为所选的哺乳动物细胞培养物准备适当的培养基，并在使用前将其在37°C下预热20分钟。
- 按照材料表中所述提前准备所需 材料。高压灭菌玻璃器皿、塑料器皿和缓冲库存。
- 如 表1所述准备缓冲液。在将组分稀释至最终体积之前，使用浓HCl或NaOH调节储备溶液的pH值。
2. 哺乳动物细胞系制备
- 在 Dulbecco 的改良鹰培养基 （DMEM） 中培养 HEK 293T 细胞，并补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 100 μg/mL 青霉素/链霉素溶液。将它们在37°C下在提供5%CO2的加湿培养箱中孵育。常规分裂细胞。
- 在分离之前，用足够的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液冲洗细胞以覆盖生长表面。
- 取出PBS并加入超薄的胰蛋白酶-EDTA溶液。
- 将细胞在37°C下在提供5%CO2 的加湿培养箱中孵育5分钟，或直到细胞分离（它们在显微镜观察下应看起来分散）。
- 通过添加完整的DMEM将其稀释十倍以使其失活并计数细胞。
- 在 6 孔板中板 1.5 x 105 个细胞/mL，考虑两个孔/条件进行测试。
- 将细胞在37°C下在含有5%CO2的加湿培养箱中孵育48小时。
注意：查看制造商说明，了解适合细胞系的培养基和补充剂类型。此外，胰蛋白酶-EDTA的量和孵育时间取决于细胞系。一些细胞类型的生长速度比本协议中报告的更快/更慢;因此，应事先测试播种浓度。
3. 总蛋白质收获
- 从细胞生长的孔中取出培养基。
- 用 1 mL PBS 洗涤 6 孔板的每个孔。
- 丢弃 PBS。
- 将板在冰上移动，然后继续步骤3.5或在-80°C下冷冻干燥板以促进裂解。
- 向每个孔中加入 200 μL 裂解缓冲液。
- 使用细胞刮刀分离和破坏细胞。
- 将来自两个孔的细胞提取物转移到同一个 1.5 mL 管中。
- 将含有蛋白质提取物的试管放在冰上30分钟。
- 在4°C下以17，000× g 离心细胞裂解物15分钟。
- 将每个上清液转移到预冷管中。
注意：对于每个PD条件，建议总共106-10 7 个细胞。细胞裂解和蛋白质收获应使用冰冷缓冲液进行。应将蛋白酶抑制剂添加到裂解缓冲液中，以防止蛋白质降解。
4. 蛋白质浓度测定
- 按照生产者的指示，通过在dH2O中稀释五倍来制备Bradford试剂。
- 将 1 mL 试剂分布在 1 cm 比色皿中，加入 1 μL 样品，倒置混合。
- 在室温下在黑暗中孵育5-10分钟。
- 读取595nm处的吸光度。
- 计算对应于 1.5 mg 蛋白质的蛋白质提取物体积，并使用裂解缓冲液将所有样品的最终体积降至 600 μL。
- 将样品放在冰上直至使用。
注意：可以使用任何其他蛋白质浓度测定方法，遵循缓冲液兼容性建议。在任何情况下，裂解缓冲液都应用作空白。许多试剂与二硫苏糖醇（DTT）不相容。建议仅在蛋白质定量后添加DTT或其他还原剂（DTT至终浓度为1mM）。
5. 珠子制备
- 通过轻弹试管将珠子混合在其存储缓冲液中。
- 计算 100 μL 浆液培养基/样品，并将体积放入磁性架中。
- 珠子清洗
- 取出储存溶液，通过加入 1 mL 裂解缓冲液/管洗涤珠子并手动倒置。
- 使用磁性架取出缓冲液。
- 重复洗涤步骤。
- 加入相当于浆液介质初始体积的裂解缓冲液体积，轻弹试管进行混合，并将培养基均匀分配到与样品数量一样多的 1.5 mL 管中。
- 磁珠阻塞
- 使用磁性架取出缓冲液，加入 600 μL 在裂解缓冲液中制备的 0.25 mg/mL 酵母 tRNA 溶液。
- 在室温下在旋转轮上孵育1小时。
- 使用磁性架去除tRNA溶液。
- 加入 600 μL 裂解缓冲液，手动混合洗涤。
- 重复洗涤步骤并丢弃缓冲液。
6. 装珠
- 在 600 μL 裂解缓冲液中为含有初始 100 μL 浆液培养基（现在封闭的磁珠）的每个试管制备 200 μg RNA 寡核苷酸。
- 将寡核苷酸加入珠子中，在室温下旋转孵育1小时。
- 取出溶液，加入 600 μL 裂解缓冲液，并在室温下旋转试管 5 分钟，洗涤珠子两次。
- 丢弃缓冲区。
注意：切勿涡旋珠子，而是轻弹。除非必要，否则限制移液步骤的数量。如果可能，请使用切好的 1 mL 吸头。磁珠浆液培养基/样品的量取决于磁珠的结合能力和总蛋白的起始量。如果预测RNA寡核苷酸具有大量的二级结构，我们建议首先在80°C下使其变性10分钟，然后在室温下缓慢冷却或通过在30°C下孵育1小时来重新冷却。建议在磁珠上样后回收RNA寡核苷酸并确定剩余浓度，以优化上样所需的量并评估重复使用RNA的可能性。
7. 蛋白与珠子的结合
注意：从现在开始，如果可能，请在4°C下执行这些步骤。
- 从 600 μL 蛋白质溶液中取出 5% 的体积，并将其保留为 INPUT （IN） 以供进一步分析（将 1.5 mg 蛋白质溶解在 600 μL 中，因此 5% 对应于 30 μL 和 75 μg 蛋白质）。
- 将剩余的蛋白质混合物添加到每管装载的珠子中，并在4°C下缓慢旋转过夜。
8. 非特异性粘合剂的洗涤
- 使用磁性架取出未绑定的部分。保存 5% 的体积并将其标记为 FLOWTHROUGH （FT）（未结合的体积约为 600 μL，因此再次保留 30 μL 以供进一步分析）。
- 向珠子中加入1mL洗涤缓冲液1，并在4°C下旋转5分钟。
- 丢弃缓冲区。
- 重复步骤 8.2 和 8.3。
- 向珠子中加入1mL洗涤缓冲液2，并在4°C下旋转5分钟。
- 弃去上清液。
9. 特定粘合剂的洗脱
- 向磁珠中加入 100 μL 洗脱缓冲液 1 或洗脱缓冲液 2。
- 通过轻弹手动混合并在室温下孵育5分钟。
- 将试管放入热混合器中，在95°C下剧烈摇动5分钟。
- 将试管放入磁性架中，并将洗脱的馏分收集到干净的管中。
- 使用台式离心机快速旋转珠子，以最大限度地提高洗脱液的回收率。
- 保存洗脱液（EL）总体积的5%用于进一步分析（总体积为100 μL，因此将5 μL分离到另一个管中）。
- 如果需要，可以使用洗脱缓冲液作为空白液来确定蛋白质浓度，如第4节所示。
注意：在确定蛋白质浓度之前，建议不要向洗脱缓冲液中添加DTT。如果不需要蛋白质定量，或者如果有还原剂兼容的蛋白质定量试剂盒，则可以从一开始就向洗脱缓冲液中添加1 mM DTT。在该协议中，测试洗脱缓冲液1（含有1M NaCl）和洗脱缓冲液2（含2M NaCl）。随着离子强度的增加，目标蛋白的洗脱效率没有差异，但建议在建立最合适的缓冲液之前测试这两种条件。如果洗脱缓冲液中盐含量高是进一步分析的限制，则洗脱缓冲液中极少量的去垢剂允许缓冲液更换。作为替代方案，洗脱液可以稀释以达到所需的盐浓度。
10. 质谱鉴定蛋白质结合剂
- 丙酮沉淀
- 通过在冷（-20°C）丙酮中稀释四倍来浓缩洗脱的蛋白质。
- 涡旋并将管在-20°C孵育过夜。
- 在4°C下以17，000× g 旋转30分钟。
- 轻轻除去上清液，让丙酮蒸发，直到沉淀完全干燥。
- 溶液内蛋白质消化
- 通过加入 50 μL 变性缓冲液溶解蛋白质沉淀。
- 加入DTT至终浓度为5mM，允许蛋白质在55°C下还原30分钟。
- 在室温下冷却样品并进行蛋白质烷基化反应，加入浓度为10mM的碘乙酰胺（IAA）15分钟。
- 使用合适的酶（胰蛋白酶，LysC）消化蛋白质，并将样品在37°C孵育过夜。
- 通过添加 1 μL 10% 三氟乙酸 （TFA） 停止消化。
- 纯化肽并将其浓缩在定制的反相C18微柱上，如前所述19。
- 用缓冲液B从C18吸头洗脱肽。
- 使用真空离心机去除有机成分，并将肽重悬于5 μL 0.1%甲酸中以进行进一步分析。
注意：或者，蛋白质消化可以在洗涤非特异性粘合剂后立即“在珠子上”进行（步骤8.1-8.6），从而使方案更快。然而，建议测试在溶液消化中与标准蛋白相比，在磁珠上起作用的酶的效率，以保证最佳的实验蛋白序列覆盖率。
- 液相色谱-串联质谱 （LC-MS/MS）
- 插入分析柱（C18固定相）并在运行期间将其保持在45°C。
- 在单柱配置中，通过毛细管指紧接头（20 μm x 550 mm）将色谱柱连接到液相色谱泵六通旋转阀的出口。
- 按如下方式调整 LC 设置：
- 在缓冲液A中以受控压力（980 bar）加载肽。
- 在59分钟内以300 nL / min的速度施加5%-20%缓冲液B梯度，然后在15分钟内施加20%-30%缓冲液B梯度，在5分钟内施加30%-65%缓冲液B梯度。
- 通过在5分钟内将缓冲液B的浓度增加至95%加上在95%缓冲液B下等度5分钟的步骤来添加洗涤步骤。
- 在数据依赖性采集 （DDA） 模式下操作质谱仪，在 MS 和 MSMS 事件之间自动切换。
- 对于MS和MSMS事件，使用自动增益控制（AGC）目标值分别为3 x 106 和1 x 105 定义等于15的环路计数。
- 对于分辨率为 60 K 的 MS，将允许的最大离子积累时间设置为 20 ms，对于分辨率为 15 K 的 MSMS，将允许的最大离子积累时间设置为 100 ms。
- 使用28%的归一化碰撞能量进行高碰撞解离（HCD）碎裂实验，动态排除时间为20 s。
- 源参数操作如下：
喷雾电压：1.7 kV
毛细管电压：275°C
既不使用护套，也不使用辅助气体
注意：在本协议中，超高效液相色谱（UHPLC）质谱（MS）分析专门使用LC单柱设置与混合三重四极杆轨道仪器（材料表）耦合。可以使用其他LCMS系统，但建议调整参数。
- 数据分析
- 使用 “加载 ”按钮导入原始文件。
- 通过单击“设置实验”按钮定义 实验 名称。
- 进入组特定参数部分，指定与标识相关的所有参数：
用于消化的酶：胰蛋白酶/P
漏诊：最多三个
固定修饰：氨基甲酰甲基化
可变修饰：N-乙酰基（蛋白质），氧化（M） - 上传更新的 FASTA 文件，该文件可从公共数据库（如 UniprotKB）获得。
- 根据所选数据库的源指定正确的解析规则。
- 为蛋白质和肽定义亲子假发现率 （FDR） 值 = 1。
- 在“无标签量化”选项卡中添加无标签定量 （LFQ） 选项。
- 将最小 LFQ 比率计数保持在 2。
注意：在这里，我们描述了使用MaxQuant24 和Perseus软件25 分别进行蛋白质定量和后续统计分析的数据分析。但是，数据分析可以使用任何其他市售或免费的生物信息学进行。使用基于目标诱饵数据库的方法估计FDR26.肽和蛋白质FDR等于0.01意味着鉴定的肽和蛋白质预计含有1%的假阳性。
- 统计分析
- 加载蛋白质组.txt文件以在蛋白质水平上执行统计分析。
- 将 LFQ 值定义为主列。
- 通过基于分类列过滤行来删除“反向”和“污染物”。
- 使用分类注释行对不同的实验条件进行分组。
- 减少数据矩阵，选择先前定义的每个组中有效值的数量。
- 选择更适合实验条件的统计检验（即 t检验、多样本检验方差分析）。
- 使用基于 FDR 的计算确定重要提示的截止值。通常，0.01 和 0.05 都被接受为调整后的 p 值的阈值。
- 使用火山图表示可视化基于 t 检验统计量的差分分析结果。
- 以.txt格式导出最终矩阵，以便进一步编辑最终结果表。
注意：配置文件夹包含一个 FASTA 文件，其中包含角蛋白等蛋白质，这些蛋白质被认为是全球蛋白质组学实验中的常见污染物，在输出表中用 + 标记。在本研究中，具有两个样本条件，使用 t检验进行统计分析。
11. 蛋白质印迹结果验证
- 样品制备
- 将适当体积的 4x 上样缓冲液添加到 IN、FT 和 EL 的每个等分试样中。
- 将样品在95°C下煮沸5分钟。
- 快速旋转以从试管顶部回收蒸发的样品。
- SDS-PAGE和凝胶转印
- 将样品上样于4%-12%变性聚丙烯酰胺凝胶上。
- 用MES SDS电泳缓冲液在120 V下运行凝胶1.5小时。
- 按照制造商的说明，用半干转印盒在硝酸纤维素膜上转移凝胶。我们建议在 15 V 下传输 10 分钟。
- 免疫检测
- 在室温下用10%牛血清白蛋白（BSA）封闭膜1小时，同时轻轻搅拌。
- 根据制造商的说明，在TBST中加入在5%BSA中制备的一抗。在4°C下放置过夜或在室温下轻轻搅拌1小时。
- 用TBST洗涤膜三次，每次5分钟。
- 在室温搅拌下加入在TBST中制备的二抗1小时。
- 用TBST洗涤膜三次，每次5分钟。
- 使用印迹成像仪可视化结果。
注意：为了检测TDP-43（我们RNA的已知结合剂），使用重组兔单克隆抗体，并在4°C下将膜留置过夜。 作为二抗，使用抗兔IgG辣根过氧化物酶（HRP），但荧光二抗也可以起作用。为了可视化膜上的抗体，将膜与Clarity Western ECL底物孵育1分钟，然后使用ChemiDoc成像系统成像。
Representative Results
为了验证所提出的方案的有效性，这里介绍的PD实验使用 计算机设计的 生物素化RNA适配体进行，以特异性结合TDP-4320。该RNA以高结合亲和力（Kd = 90 nM）结合其蛋白质靶标20。在这里，序列5'-CGGUGUUGCU-3'的RNA被称为“+ RNA”。作为阴性对照，使用了+RNA的反向互补序列，这里称为“-RNA”。它的序列是5'-AGCAACACCG-3'。-RNA对TDP-43的结合亲和力显着降低（Kd = 1.5μM）19。出于此处描述的方案的目的，这些RNA寡核苷酸已与生物素分子偶联购买，以允许与链霉亲和素珠结合。+RNA在其3'端购买了生物素-TEG，其中包括生物素和核酸磷酸基团之间的15原子三乙二醇间隔物;相反，RNA在其5'末端有一个生物素，通过氨基C6接头 与 核酸偶联。然而，如果RNA诱饵的设计是稳健的，并且只要接头和RNA之间没有结构或化学干扰，则可以采用生物素偶联和其他接头长度的其他位置。
知道PD后与+RNA探针结合的主要蛋白质的身份，可以通过使用质谱（MS）和蛋白质印迹（WB）鉴定洗脱液中的TDP-43来验证方案（图1）。
使用+RNA或-RNA对四个PD重复进行MS分析（图2）。+RNA和-RNA相互作用组的鉴定超出了该协议的范围，但是报告了一些验证该协议准确性的结果。值得注意的是，在火山图中绘制显着富集的蛋白质显示，总蛋白质含量和从+RNA洗脱的富集蛋白质明显高于从-RNA中回收的蛋白质（图2）。这意味着，尽管具有相同的长度和结构含量（线性），但+RNA可以建立更多数量的特异性相互作用，这些相互作用在高盐洗脱步骤之前保留。相反，-RNA可能会建立更多数量的非特异性接触，这些接触在洗涤步骤中被破坏。正如预期的那样，TDP-43被鉴定为+RNA20的独特相互作用子;使用+RNA进行的四个PD重复的平均无标记定量（LFQ）为31.96±0.56，而蛋白质未在-RNA的相互作用体中鉴定。此外，在+RNA的所有独特相互作用者中，TDP-43被发现是最丰富的蛋白质。
为了进一步验证该方案，使用内部算法catRAPID 18，19来计算预测哪些其他蛋白质会特异性结合+RNA或-RNA。特别是，+RNA和-RNA与组成人类蛋白质组的蛋白质的相互作用评分是使用catRAPID“相互作用倾向”特征计算的，如我们之前的工作27所定义的那样。在获得高置信度的蛋白质中，预测HNRNPH3选择性结合+RNA（+RNA相互作用得分= 1.01;-RNA相互作用评分= 0.21）和PCBP2与-RNA特异性相互作用（+RNA相互作用评分= -0.5;-RNA相互作用评分= 0.31）（图3A）。此外，预测蛋白RBM41对于两种RNA寡核苷酸（+RNA相互作用评分= 0.4;-RNA相互作用评分= 0.39）都是混杂的（图3A）。MS分析确实证实了HNRNPH3和PCBP2分别存在于+RNA和-RNA的PD中，而RBM41被发现与两者相互作用（图3B）。
WB用于检测TDP-43的存在，以进一步确认结果和方案优化（图4）。在这里描述的程序中，在不同的阶段收集不同的样品。输入样品（IN）由在裂解缓冲液中稀释的总蛋白质组成。流出（FT）是在总蛋白质与预涂有生物素化RNA的链霉亲和素珠孵育过夜后获得的，该珠子代表未结合RNA的蛋白质部分。最后，洗脱液（EL）包含所有特异性识别所研究RNA的蛋白质，因为在FT和EL步骤之间，用150mM盐和0.1%triton-X的三个洗涤步骤应该已经去除了最弱的相互作用。
对于每个重复，在SDS-PAGE上平行运行相同量（5%v / v）的IN，FT和EL，并用抗TDP-43抗体染色（图4）。在+RNA的情况下，在IN和EL中观察到TDP-43的条带，表明从一开始就存在于总蛋白质提取物中的蛋白质在洗涤步骤中被+RNA保留，并且仅在结束时用高盐缓冲液洗脱。TDP-43也存在于-RNA的IN中，但是与蛋白质相对应的条带在FT中也可见，表明该RNA不结合TDP-43。EL中没有TDP-43频段证实了这一结果。
在方案优化期间，使用含有 1 M NaCl （EB1） 的洗脱缓冲液和含有 2 M NaCl （EB2） 的洗脱缓冲液探测与 RNA 序列特异性结合的蛋白质的洗脱（图 4）。在SDS-PAGE上比较使用任一EB获得的洗脱液，并用抗TDP-43抗体印迹。然后用ImageJ28 分析获得的图像，以量化用两种缓冲液洗脱的TDP-43量的任何差异。总体而言，没有观察到显着差异，我们得出结论，在这些测定中，1 M盐足以破坏最强的蛋白质 - RNA相互作用。
总体而言，此处报告的MS和WB结果表明，该方案可以以特定方式有效地捕获给定RNA的蛋白质相互作用体，并且可以在与下游分析兼容的缓冲液中进行洗脱。
图 1：拟议协议中使用的实验管道草图。 （A）生物素化的RNA寡核苷酸在适当浓度的裂解缓冲液中制备。（B）洗涤磁性链霉亲和素珠，用酵母tRNA封闭，并加载生物素化的RNA。（C）将来自培养的哺乳动物细胞系的总蛋白质提取物添加到珠子-RNA混合物中。（D）进行多次洗涤以去除非特异性相互作用。（E）用高渗溶液将特定的蛋白质相互作用物与RNA分离。（F）通过质谱法揭示相互作用物的身份，并通过蛋白质印迹法验证特定病例。请点击此处查看此图的大图。
图 2：基于无标记 MS 的蛋白质定量的分析策略 。 （A）洗脱的蛋白质在冷丙酮中沉淀过夜。然后将蛋白质变性，并进行溶液内消化。蛋白水解肽被浓缩和脱盐。（B）使用“霰弹枪法”通过LC-MS/MS 分析 肽。（C）原始数据处理和分析分别使用MaxQuant和Perseus软件进行。（D）在火山图中显示具有统计学意义的富集蛋白质。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：预测的相互作用倾向与实验确定的 +RNA 和 -RNA 相互作用之间的相关性。 （A） 猫快速相互作用得分相对于HNRNPH3，PCBP2和RBM41，表明HNRNPH3优先结合+RNA，PCBP2优先结合-RNA，而RBM41被预测不加选择地结合两个RNA序列。（B） 通过质谱分析确定的无标记定量平均值，该分析来自使用 +RNA 和 -RNA 进行的下拉。分析证实，HNRNPH3仅结合+RNA，PCBP2仅结合-RNA，RBM41平等结合两者。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：所选 RNA 序列相互作用体中是否存在 TDP-43 的蛋白质印迹验证。 WB膜已用抗TDP-43抗体处理。IN = 输入;FT = 流通;EL （EB1） = 洗脱缓冲液 1 洗脱;EL （EB2） = 用洗脱缓冲液 2 洗脱;符号“+”表示从+RNA下拉中获得的样品;符号“-”表示从-RNA下拉中获得的样品;泳道 1 包含一个蛋白质阶梯。TDP-43 由箭头指示。WB表明TDP-43存在于+RNA相互作用者中，但不存在于-RNA相互作用者中。 请点击此处查看此图的大图。
| 缓冲区名称 | 组成 | |||||
| 10x 传输缓冲液 | 250 mM tris，1.92 M 甘氨酸，1% SDS，20% 甲醇。使用前稀释 10 倍 | 帕金森 | ||||
| 20X MES SDS 运行缓冲液 | 1 M MES， 1 M tris， 2% SDS ， 20 mM EDTA.将pH值调节至7.3。使用前稀释 20 倍 | |||||
| 4x 样品上样缓冲液 | 0.25 M Tris碱， 0.28 M SDS， 40% 甘油， 20% 2-巯基乙醇， 4 mg/ml 溴酚蓝 | |||||
| 洗脱缓冲液 1 | 20 mM 磷酸盐 pH 7.5、1 M 氯化钠、0.5 mM EDTA、0.1 % Triton X-100、1 mM DTT（定量后添加） | |||||
| 洗脱缓冲液 2 | 20 mM 磷酸盐 pH 7.5、2 M 氯化钠、0.5 mM EDTA、0.1 % Triton X-100、1 mM DTT（定量后添加） | |||||
| 裂解缓冲液 | 10 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM 氯化钠、0.5 mM EDTA、0.1 % Triton X-100、1 mM DTT 和蛋白酶抑制剂 | |||||
| 带吐温-20的三缓冲盐水 | 1 M 三盐酸 pH 7.4， 3 M 氯化钠， 2.0% 吐温-20 | |||||
| 洗涤缓冲液 1 | 10 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM 氯化钠、0.5 mM EDTA、0.1 % Triton TM X-100、1 mM DTT 和蛋白酶抑制剂 | |||||
| 洗涤缓冲液 2 | 25 mM Hepes pH 8、150 mM 氯化钠、0.5 mM EDTA、0.1 % Triton X-100、1 mM DTT 和蛋白酶抑制剂 | |||||
| 缓冲液 A | 0.1%甲酸 | 女士 | ||||
| 缓冲液 B | 60%乙腈，0.1%甲酸 | |||||
| 变性缓冲液 | 8M 尿素，50 mM 三盐酸 | |||||
表 1：PD 和 MS 缓冲液。 用于下拉实验（PD）或质谱分析（MS）的缓冲液的名称和组成。
Discussion
这项工作报告了使用生物素化RNA寡核苷酸捕获其蛋白质相互作用物的PD方案的优化。这里描述的方案易于执行，需要的材料很少，并且可以产生高度可靠的结果。重要的是，该协议最新颖的方面包括使用完全 在计算机中 设计的RNA诱饵，并且针对蛋白质靶标具有特异性，以及通过直接破坏它们与高盐溶液的相互作用来洗脱与RNA诱饵结合的所有蛋白质，而不是通过将链霉亲和素与生物素解离与洗涤剂和高温处理。
该协议利用了生物素和链霉亲和素29，30之间键的强度。根据所选的链霉亲和素微球，在继续之前必须测试和定量生物素化RNA的上样量。此外，RNA三维折叠可能会影响磁珠的上样效率，因为它可能会限制生物素对链霉亲和素的暴露。用非生物素化的tRNA封闭磁珠通过限制与磁珠的非特异性相互作用来提高结果的清洁度。上样缓冲液和洗脱缓冲液必须根据下游应用进行选择。在这里，提出了非常温和的条件，适用于大多数应用并开发以保留潜在的蛋白质复合物。然而，这种方法具有很强的适应性;用户可以选择任何细胞系和任何RNA大小，并且可以决定在RNA折叠/展开后重复该方案，以确定结构对结合特性的影响。
该协议的另一个原始方面是使用 计算机 预测工具来确保结果的正确性20。事先知道哪些蛋白质应该被鉴定为目标RNA的相互作用者，为验证协议的技术方面提供了前所未有的优势。例如，使用简单的WB分析，可以在进行MS分析之前验证来自方案不同步骤的样品中是否存在已知蛋白质靶标，这需要专门的仪器并且成本更高。此外，最近还报道了一种使用 catRAPID20（一种内部蛋白质-RNA预测算法）来设计目标蛋白质特异性的从 头 RNA的方法。直到最近，为目标蛋白设计DNA/RNA适配体的唯一可用管道是SELEX（通过指数富集实现配体的系统进化）方法31。 计算机分析 方法可以更快、更经济地设计RNA适配体。
该方法的主要局限性与需要在无核酸酶缓冲液和工具中工作有关。此外，如果认为有必要 在体外 确认从 头设计的RNA与PD靶蛋白之间的结合，则需要生产和纯化蛋白质，并使用生物物理方法确定结合。这是与单克隆抗体生产共有的限制。
尽管存在这些小问题，但绘制RNA-蛋白质相互作用的可靠方法，例如这里介绍的方法，可以使科学家更接近于揭示大分子网络和许多生理和病理机制的复杂主要参与者，例如涉及癌症，心肌病，糖尿病，微生物感染以及遗传和神经退行性疾病。
Disclosures
作者没有相互竞争的经济利益或其他利益冲突。
Acknowledgments
作者要感谢Tartaglia教授和Cuomo博士的研究小组提供的支持。E.Z.根据玛丽·斯克洛多夫斯卡-居里赠款协议第754490号获得了欧盟地平线2020研究和创新计划的MINDED奖学金的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well tissue culture plates | VWR | 10861-554 | CELLS |
| Cell scrapers | BIOSIGMA | 10153 | CELLS |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientfic | 11995065 | CELLS |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil | Thermo Fisher Scientfic | 10500064 | CELLS |
| Phosphate Buffer Saline (PBS, Waltham, MA) | Thermo Fisher Scientfic | 14190169 | CELLS |
| Trypsin (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientfic | 15050065 | CELLS |
| Anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HRP) | Cellsignal | 7070 | PD |
| Biotinylated RNA | Eurofins | Custom RNA oligonucleotides | PD |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | PD |
| Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Biorad | 1705061 | PD |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Merck - Sigma Aldrich | 5056489001 | PD |
| NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well | Invitrogen | NP0321BOX | PD |
| Recombinant anti-TDP43 antibody | Abcam | ab109535 | PD |
| Ribonucleic acid, transfer from baker's yeast (S. cerevisiae) | Merck - Sigma Aldrich | R5636-1ML | PD |
| Streptavidin Mag Sepharose | Merck - Sigma Aldrich | GE28-9857-99 | PD |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini 0.2 µm PVDF Transfer Kit | Biorad | 1704272 | PD |
| Acetone | Thermo Fisher Scientfic | 022928.K2 | MS |
| C18 cartridge | Thermo Fisher Scientfic | 13-110-018 | MS |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientfic | 20290 | MS |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | ES902 | MS |
| iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich S.r.l. | I6125 | MS |
| Lys-C/Trypsin | Promega | V5073 | MS |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo Fisher Scientfic | 28904 | MS |
| Urea | Thermo Fisher Scientfic | J75826.A7 | MS |
| Equipment | |||
| ChemiDoc imaging system | Bio-Rad | CELLS | |
| Dyna Mag -2 , Magnetic rack | Invitrogen | CELLS | |
| Forma Series 3 water jacketed C02 incubator | Thermo Scientific | PD | |
| PROTEAN II xi cell , power supply for PAGE applications | Bio-Rad | PD | |
| Rotating wheel, rotator SB3 | Stuart | PD | |
| Water bath set at 37 °C | VWR | PD | |
| XCell SureLock Mini-Cell electrophoresis system | ThermoFisher Scientific | MS | |
| Easy-nLC 1200 UHPLC | Thermo Scientific | MS | |
| Q exactive Mass Spectrometer | Thermo Scientific | MS | |
| Software | Version | ||
| MaxQuant | 2.0.3.0 | MS | |
| Perseus | 1.6.14.0 | MS |
References
- Gebauer, F., Schwarzl, T., Valcárcel, J., Hentze, M. W. RNA-binding proteins in human genetic disease. Nature Reviews Genetics. 22 (3), 185-198 (2021).
- Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Cooper, T. A., Wan, L., Dreyfuss, G. RNA and disease. Cell. 136 (4), 777-793 (2009).
- Qin, H., et al. RNA-binding proteins in tumor progression. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 90 (2020).
- Nussbacher, J. K., Tabet, R., Yeo, G. W., Lagier-Tourenne, C. Disruption of RNA metabolism in neurological diseases and emerging therapeutic interventions. Neuron. 102 (2), 294-320 (2019).
- Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. Journal of Genetics and Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
- Maziuk, B., Ballance, H. I., Wolozin, B. Dysregulation of RNA binding protein aggregation in neurodegenerative disorders. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 89 (2017).
- Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (5), 1557-1562 (2006).
- Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118 (2021).
- Weidmann, C. A., Mustoe, A. M., Jariwala, P. B., Calabrese, J. M., Weeks, K. M. Analysis of RNA-protein networks with RNP-MaP defines functional hubs on RNA. Nature Biotechnology. 39 (3), 347-356 (2021).
- Graindorge, A., et al. In-cell identification and measurement of RNA-protein interactions. Nature Communications. 10 (1), 5317 (2019).
- Ule, J., Hwang, H. W., Darnell, R. B. The future of cross-linking and immunoprecipitation (CLIP). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (8), 032243 (2018).
- Ascano, M., Hafner, M., Cekan, P., Gerstberger, S., Tuschl, T. Identification of RNA-protein interaction networks using PAR-CLIP. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (2), 159-177 (2012).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biology. 15 (1), 203 (2014).
- Sugimoto, Y., et al. Analysis of CLIP and iCLIP methods for nucleotide-resolution studies of protein-RNA interactions. Genome Biology. 13 (8), (2012).
- Bayat, P., et al. SELEX methods on the road to protein targeting with nucleic acid aptamers. Biochimie. 154, 132-155 (2018).
- Armaos, A., Colantoni, A., Proietti, G., Rupert, J., Tartaglia, G. G. CatRAPID omics v2.0: Going deeper and wider in the prediction of protein-RNA interactions. Nucleic Acids Research. 49, 72-79 (2021).
- Agostini, F., et al. CatRAPID omics: A web server for large-scale prediction of protein-RNA interactions. Bioinformatics. 29 (22), 2928-2930 (2013).
- Zacco, E., et al. Probing TDP-43 condensation using an in silico designed aptamer. Nature Communications. 13 (1), 3306 (2022).
- Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Research. 42 (2), 13 (2014).
- Zhang, Y., Lai, B. S., Juhas, M. Recent advances in aptamer discovery and applications. Molecules. 24 (5), 941 (2019).
- UniProt Consortium. UniProt: the Universal Protein Knowledgebase in 2023. Nucleic Acids Research. 51, 523-531 (2023).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Bellucci, M., Agostini, F., Masin, M., Tartaglia, G. G. Predicting protein associations with long noncoding RNAs. Nature Methods. 8 (6), 444-445 (2011).
- Gallo-Oller, G., Ordoñez, R., Dotor, J. A new background subtraction method for Western blot densitometry band quantification through image analysis software. Journal of Immunological Methods. 457, 1-5 (2018).
- Weissinger, R., Heinold, L., Akram, S., Jansen, R. P., Hermesh, O. RNA proximity labeling: A new detection tool for RNA-protein interactions. Molecules. 26 (8), 2270 (2021).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).
