Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En optimeret kvantitativ pull-down analyse af RNA-bindende proteiner ved hjælp af kort biotinyleret RNA

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/64923
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3, 1
1Center for Human Technology, Italian Institute of Technology (IIT), 2Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology (IEO), 3Department of Biology and Biotechnologies ‘Charles Darwin’, Sapienza University of Rome

Summary

Her præsenterer vi en optimeret in vitro-metode til at afdække, kvantificere og validere proteininteraktorer af specifikke RNA-sekvenser ved hjælp af total proteinekstrakt fra humane celler, streptavidinperler belagt med biotinyleret RNA og massespektrometrianalyse.

Abstract

Protein-RNA-interaktioner regulerer genekspression og cellulære funktioner på transkriptionelle og posttranskriptionelle niveauer. Af denne grund er identifikation af bindingspartnerne for et RNA af interesse fortsat af stor betydning for at afsløre mekanismerne bag mange cellulære processer. RNA-molekyler kan dog interagere forbigående og dynamisk med nogle RNA-bindende proteiner (RBP'er), især med ikke-kanoniske. Der er derfor et stort behov for forbedrede metoder til at isolere og identificere sådanne vandområdeprogrammer.

For at identificere proteinpartnerne i en kendt RNA-sekvens effektivt og kvantitativt udviklede vi en metode baseret på pull-down og karakterisering af alle interagerende proteiner, startende fra cellulært totalt proteinekstrakt. Vi optimerede proteinnedtrækningen ved hjælp af biotinyleret RNA, der var forudindlæst på streptavidin-coatede perler. Som et proof of concept anvendte vi en kort RNA-sekvens, der vides at binde det neurodegenerationsassocierede protein TDP-43 og en negativ kontrol af en anden nukleotidsammensætning, men af samme længde. Efter at have blokeret perlerne med gær-tRNA indlæste vi de biotinylerede RNA-sekvenser på streptavidinperlerne og inkuberede dem med det samlede proteinekstrakt fra HEK 293T-celler. Efter inkubation og flere vasketrin for at fjerne uspecifikke bindemidler eluerede vi de interagerende proteiner med en opløsning med højt saltindhold, kompatibel med de mest almindeligt anvendte proteinkvantificeringsreagenser og med prøveforberedelse til massespektrometri. Vi kvantificerede berigelsen af TDP-43 i pull-down udført med det kendte RNA-bindemiddel sammenlignet med den negative kontrol ved massespektrometri. Vi brugte den samme teknik til at verificere de selektive interaktioner mellem andre proteiner, der beregningsmæssigt forudsiges at være unikke bindemidler af vores RNA af interesse eller af kontrollen. Endelig validerede vi protokollen ved western blot via påvisning af TDP-43 med et passende antistof.

Denne protokol vil gøre det muligt at studere proteinpartnerne i et RNA af interesse i nær-til-fysiologiske tilstande, hvilket hjælper med at afdække unikke og uforudsigelige protein-RNA-interaktioner.

Introduction

RNA-bindende proteiner (RBP'er) har vist sig som afgørende aktører i transkriptionel og posttranskriptionel genregulering, da de er involveret i processer som mRNA-splejsning, RNA-cellulær lokalisering, translation, modifikation og nedbrydning 1,2,3. Sådanne interaktioner mellem de to makromolekyler er stærkt koordinerede, præcist afbalancerede og afgørende for dannelsen af funktionelle og behandlingshubs. Variationer eller dysreguleringer inden for disse knudepunkter har potentialet til at forstyrre de fint regulerede protein-RNA-netværk og er i stigende grad forbundet med en række menneskelige sygdomme, herunder kræft 4,5 og neurodegenerative lidelser 6,7,8. Interaktionerne mellem RNA-molekyler og deres proteinbindende partnere kan enten være stabile og lette at validere eksperimentelt eller meget dynamiske, forbigående og vanskeligere at karakterisere.

I de senere år er der gjort en intensiv indsats for at forstå disse interaktioner. Blandt de mest etablerede metoder er protein pull-down assays (PD'er) sandsynligvis de mest værdsatte og almindeligt anvendte tilgange til at optrævle de vigtigste aktører, der udgør ribonukleoprotein (RNP) komplekser og andre protein-RNA interaktionsnetværk 3,9,10. PD'er omfatter en bred paraply af informative teknikker, såsom immunudfældning af enten RNA (RIP)11,12 eller proteinet (CLIP)13,14 af interesse. Nogle af disse RNA-PD-protokoller anvender et kendt RNA som lokkemad til proteiner15, oftest ved at drage fordel af mærker med høj affinitet, såsom biotin. I dette tilfælde kan interaktionspartnerne i et biotinyleret RNA detekteres ved at forankre RNA'et på streptavidinbelagte perler, hvilket muliggør effektiv isolering af RNP'erne. De vigtigste begrænsninger ved disse tilgange er normalt designet af de biotinylerede sonder og testningen af deres evne til at binde målproteiner. Til dette formål kan det være nyttigt at stole på offentliggjorte CLIP-data for proteinet af interesse, hvis de er tilgængelige, da de med høj præcision afslører de korte RNA-regioner, der svarer til toppe af interaktioner med målproteinet13,16. De samme regioner kunne bruges til at udvikle sonder til PD'er. En alternativ metode til at designe sådanne RNA-lokkemad kan være den systematiske udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX)17, som muliggør design af aptamerer gennem in vitro-selektion, startende fra et omfattende randomiseret bibliotek og via en række PCR-drevne optimeringscyklusser. SELEX er imidlertid kompleks og tidskrævende, og de endelige resultater er meget afhængige af det oprindelige bibliotek. For at vælge RNA-agn til brug i protokollen, der præsenteres her, blev endnu en tilgang udnyttet, der bestod i at bruge en RNA-agn designet de novo ved hjælp af beregningskraften i algoritmen catRAPID, som forudsiger præferencebindingen af et givet protein mod visse RNA-sekvenser18,19,20.

Protokollen, der introduceres her, er en version af en RNA-PD, der er optimeret til at eluere specifikke proteinpartnere under næsten fysiologiske forhold uden brug af vaskemiddel, denatureringsmidler eller høje temperaturer. Det er afhængig af nano-superparamagnetiske perler kovalent belagt med højt oprenset streptavidin og brugen af et specifikt in silico designet biotinyleret RNA som lokkemad. Denne protokol giver en hurtig og effektiv metode til at isolere bindingspartnerne af biotinylerede RNA-molekyler under native forhold, hvilket giver mulighed for en bred vifte af downstream-applikationer. For at teste denne protokol blev en 10-nukleotid enkeltstrenget RNA aptamersekvens, tidligere designet til at binde proteinet TAR DNA-bindende protein 43 (TDP-43) med høj affinitet og specificitet, anvendt20. Med udgangspunkt i HEK 293T-cellelysater blev interaktorerne af den biotinylerede RNA-aptamer identificeret ved hjælp af massespektrometrianalyse udført på prøver løsrevet fra RNA-agn under anvendelse af en hypertonisk buffer. Denne analyse bekræftede den vellykkede identifikation og kvantificering af TDP-43 som foretrukket bindemiddel.

Denne protokol muliggør en vellykket identifikation af proteininteraktorer ved kun at anvende et kort, in vitro syntetiseret RNA-oligonukleotid. Desuden garanterer brugen af in silico-designede RNA-aptamerer som PD-sonder21,22 specificitet for målene til betydeligt reducerede omkostninger.

Protocol

1. Generelle metoder og materiale

  1. Forbered det passende medium til den valgte pattedyrcellekultur og forvarm det ved 37 °C i 20 minutter før brug.
  2. Forbered det krævede materiale på forhånd som beskrevet i materialetabellen. Autoklave glasvarer, plastvarer og bufferlagre.
  3. Bufferne fremstilles som beskrevet i tabel 1. Stamopløsningernes pH-værdi justeres ved hjælp af koncentreret HCl eller NaOH, før komponenterne fortyndes til deres endelige volumen.

2. Forberedelse af pattedyrcellelinjer

  1. Dyrk HEK 293T-celler i Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 μg / ml penicillin / streptomycinopløsning. De inkuberes ved 37 °C i en befugtet inkubator, der forsynes med 5% CO2. Opdel cellerne rutinemæssigt.
  2. Før afmontering skylles cellerne med tilstrækkelig fosfatbufret saltopløsning (PBS) til at dække vækstoverfladen.
  3. Fjern PBS og tilsæt et ultratyndt lag trypsin-EDTA-opløsning.
  4. Cellerne inkuberes ved 37 °C i en befugtet inkubator forsynet med 5% CO2 i 5 minutter, eller indtil cellerne løsnes (de skal se spredte ud under mikroskopisk observation).
  5. Fortynd trypsin-EDTA-opløsningen ti gange ved at tilføje komplet DMEM for at inaktivere den og tælle cellerne.
  6. Plade 1,5 x 105 celler/ml i 6-brøndsplader, idet to brønde/tilstand skal testes.
  7. Cellerne inkuberes ved 37 °C i 48 timer i en befugtet inkubator med 5% CO2.
    BEMÆRK: Kontroller producentens instruktioner for medietypen og supplement apt for cellelinjen. Mængden og inkubationstiden for trypsin-EDTA afhænger også af cellelinjen. Nogle celletyper vokser hurtigere / langsommere end hvad der blev rapporteret i denne protokol; Således bør såkoncentrationen testes på forhånd.

3. Samlet proteinhøst

  1. Fjern medium fra brøndene, hvor cellerne vokser.
  2. Hvert hul på pladerne med 6 brønde vaskes med 1 ml PBS.
  3. Kassér PBS.
  4. Pladerne flyttes på is, og trin 3.5 fortsættes, eller de tørre plader fryses ved -80 °C for at lette lyseringen.
  5. Der tilsættes 200 μL lysisbuffer til hvert hul.
  6. Brug en celleskraber til at løsne og bryde cellerne.
  7. Overfør celleekstraktet, der stammer fra to brønde, til det samme 1,5 ml rør.
  8. Anbring tuben med proteinekstraktet på is i 30 min.
  9. Centrifuger cellen lysater ved 17.000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
  10. Hver supernatant overføres til et forkølet glas.
    BEMÆRK: I alt 106-10 7 celler for hver PD-tilstand anbefales. Cellelyse og proteinhøst bør udføres med iskolde buffere. Proteasehæmmere bør tilsættes til lysisbufferen for at forhindre proteinnedbrydning.

4. Bestemmelse af proteinkoncentration

  1. Forbered Bradford-reagens, som angivet af producenten, ved at fortynde det fem gange idH2O.
  2. Der fordeles 1 ml reagens i en 1 cm kuvette, der tilsættes 1 μL af prøven, og der blandes på hovedet.
  3. Inkuber i mørke ved stuetemperatur i 5-10 min.
  4. Absorbansen aflæses ved 595 nm.
  5. Beregn mængden af proteinekstrakt svarende til 1,5 mg proteiner og bring alle prøverne til et endeligt volumen på 600 μL ved hjælp af lysisbuffer.
  6. Opbevar prøverne på is indtil brug.
    BEMÆRK: Enhver anden metode til bestemmelse af proteinkoncentration kan anvendes i henhold til bufferkompatibilitetsanbefalinger. Under alle omstændigheder skal lysisbufferen anvendes som et emne. Mange reagenser er ikke kompatible med dithiothreitol (DTT). Det anbefales kun at tilsætte DTT eller andre reduktionsmidler efter proteinkvantificering (DTT til en slutkoncentration på 1 mM).

5. Forberedelse af perler

  1. Bland perlerne i deres opbevaringsbuffer ved at knipse røret.
  2. Beregn 100 μL gyllemedium/prøve, og anbring volumenet i et magnetstativ.
  3. Perlevask
    1. Fjern opbevaringsopløsningen og vask perlerne ved at tilsætte 1 ml lysisbuffer/rør og invertere det manuelt.
    2. Fjern bufferen ved hjælp af magnetstativet.
    3. Gentag vasketrinnet.
    4. Tilsæt et volumen lysisbuffer svarende til det oprindelige volumen gyllemedium, bland ved at svirpe røret, og fordel mediet ensartet i så mange 1,5 ml rør, som der er prøver.
  4. Blokering af perler
    1. Fjern bufferen ved hjælp af magnetstativet og tilsæt 600 μL af en 0,25 mg / ml opløsning af gær-tRNA fremstillet i lysisbuffer.
    2. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur på et roterende hjul.
    3. Fjern tRNA-opløsningen ved hjælp af magnetstativet.
    4. Der tilsættes 600 μL lysisbuffer og vaskes ved manuel blanding.
    5. Gentag vasketrinnet, og kassér bufferen.

6. Indlæsning af perler

  1. Der fremstilles 200 μg RNA-oligonukleotid i 600 μL lysisbuffer for hvert rør, der indeholder det indledende 100 μL gyllemedium (nu blokerede perler).
  2. Tilsæt oligoen til perlerne og inkuber i 1 time ved stuetemperatur, mens du roterer.
  3. Fjern opløsningen, tilsæt 600 μL lysisbuffer, og vask perlerne to gange ved at dreje rørene i 5 minutter ved stuetemperatur.
  4. Kassér bufferen.
    BEMÆRK: Vortex aldrig perlerne, men svip i stedet. Begræns antallet af pipetteringstrin, medmindre det er nødvendigt. Når det er muligt, skal du bruge skære, 1 ml spidser. Mængden af perlegyllemedium/prøve afhænger af perlernes bindingsevne og startmængden af de samlede proteiner. Hvis RNA-oligoen forventes at have en betydelig mængde sekundær struktur, anbefaler vi først at denaturere den ved 80 °C i 10 minutter og derefter køle den langsomt ned ved stuetemperatur eller afvise den ved at inkubere den ved 30 °C i 1 time. Det foreslås at genvinde RNA-oligoen efter perlebelastning og bestemme den koncentration, der er tilbage, for at optimere den mængde, der kræves til indlæsning, og for at evaluere muligheden for at genbruge RNA'et.

7. Proteinbinding på perler

BEMÆRK: Fra nu af skal du udføre trinnene ved 4 °C, når det er muligt.

  1. Tag et volumen på 5% fra 600 μL proteinopløsningen og opbevar det som INPUT (IN) til yderligere analyse (1,5 mg proteiner opløses i 600 μL, så 5% svarer til 30 μL og 75 μg proteiner).
  2. Tilsæt den resterende proteinblanding til hvert rør med fyldte perler, og lad den rotere langsomt natten over ved 4 °C.

8. Vask af uspecifikke bindemidler

  1. Fjern den ubundne fraktion ved hjælp af magnetstativet. Spar 5% af volumenet og mærk det som FLOWTHROUGH (FT) (det ubundne volumen er ca. 600 μL, så hold igen 30 μL til yderligere analyse).
  2. Tilsæt 1 ml vaskebuffer 1 til perlerne og lad den rotere i 5 minutter ved 4 °C.
  3. Kassér bufferen.
  4. Gentag trin 8.2 og 8.3.
  5. Tilsæt 1 ml vaskebuffer 2 til perlerne og lad den rotere i 5 minutter ved 4 °C.
  6. Supernatanten kasseres.

9. Eluering af specifikke bindemidler

  1. Der tilsættes 100 μL elueringsbuffer 1 eller elueringsbuffer 2 til perlerne.
  2. Bland manuelt ved at svirpe og inkubere i 5 minutter ved stuetemperatur.
  3. Anbring glassene i en termomixer og ryst kraftigt i 5 minutter ved 95 °C.
  4. Anbring røret i magnetstativet og saml den eluerede fraktion i et rent rør.
  5. Drej hurtigt perlerne med en bænkcentrifuge for at maksimere genopretningen af eluatet.
  6. Spar 5% af det samlede ELUATE (ELUAT) volumen til yderligere analyser (samlet volumen er 100 μL, så adskil 5 μL i et andet rør).
  7. Om nødvendigt kan proteinkoncentrationen bestemmes som i afsnit 4 ved anvendelse af elueringsbuffer som blindprøve.
    BEMÆRK: Det anbefales at afstå fra at tilføje DTT til elueringsbufferen, indtil proteinkoncentrationen er bestemt. Hvis proteinkvantificering ikke er påkrævet, eller hvis reduktionsmiddelkompatible proteinkvantificeringssæt er tilgængelige, kan der tilsættes 1 mM DTT til elueringsbufferen fra starten. I denne protokol blev både elueringsbuffer 1 (indeholdende 1 M NaCl) og elueringsbuffer 2 (med 2 M NaCl) testet. Der blev ikke observeret nogen forskel i målproteinets elueringseffektivitet ved øget ionstyrke, men det anbefales at teste begge betingelser, før den mest hensigtsmæssige buffer bestemmes. Hvis en høj forekomst af salt i elueringsbufferen udgør en begrænsning for yderligere analyse, giver den meget lave mængde vaskemidler i elueringsbufferen mulighed for bufferudskiftning. Som et alternativ kan eluatet fortyndes for at nå den ønskede saltkoncentration.

10. Identifikation af proteinbindere ved massespektrometri

  1. Acetone nedbør
    1. Koncentrer de eluerede proteiner ved at fortynde det fire gange i kold (-20 °C) acetone.
    2. Hvirvel og inkuberes røret ved -20 °C natten over.
    3. Spin ved 17.000 x g i 30 minutter ved 4 °C.
    4. Supernatanten fjernes forsigtigt, og acetonen fordamper, indtil pelletten er helt tørret.
  2. Proteinfordøjelse i opløsning
    1. Opløs proteinpillen ved at tilsætte 50 μL denatureringsbuffer.
    2. Der tilsættes DTT til en slutkoncentration på 5 mM, hvilket muliggør proteinreduktion i 30 minutter ved 55 °C.
    3. Prøverne afkøles ved stuetemperatur, og proteinalkyleringsreaktionen fortsættes, idet iodoacetamid (IAS) tilsættes i en koncentration på 10 mM i 15 minutter.
    4. Proteinerne fordøjes med et egnet enzym (trypsin, LysC) og prøverne inkuberes natten over ved 37 °C.
    5. Stop fordøjelsen ved at tilsætte 1 μL 10% trifluoreddikesyre (TFA).
    6. Ryd op og koncentrer peptiderne på en brugerdefineret omvendt fase C18-mikrokolonne, som tidligere beskrevet19.
    7. Eluer peptider fra C18-spidsen med buffer B.
    8. Den organiske komponent fjernes ved hjælp af en vakuumcentrifuge og resuspenderes peptiderne i 5 μL 0,1% myresyre til yderligere analyse.
      BEMÆRK: Alternativt kan proteinfordøjelse udføres "on-beads" umiddelbart efter vask af uspecifikke bindemidler (trin 8.1-8.6), hvilket gør protokollen hurtigere. Det er imidlertid tilrådeligt at teste effektiviteten af enzymet, der arbejder "på-perler" immobiliserede proteiner sammenlignet med standard i opløsningsfordøjelse for at garantere den optimale eksperimentelle proteinsekvensdækning.
  3. Væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS)
    1. Tilslut analysekolonnen (C18-stationær fase), og opbevar den ved 45 °C under kørslen.
    2. Tilslut søjlen til udløbet af en seks-port roterende ventil på LC-pumpen gennem en kapillær fingertæt montering (20 μm x 550 mm) i en enkeltsøjlekonfiguration.
    3. Juster LC-indstillingerne på følgende måde:
      1. Fyld peptiderne under kontrolleret tryk (980 bar) i buffer A.
      2. Anvend en 5%-20% buffer B-gradient ved 300 nL/min over 59 min, efterfulgt af en 20%-30% buffer B-gradient over 15 min og en 30%-65% buffer B-gradient over 5 min.
      3. Tilføj et vasketrin ved at øge koncentrationen af buffer B op til 95% over 5 min plus et 5 min isokratisk trin ved 95% buffer B.
    4. Betjen massespektrometeret i dataafhængig erhvervelsestilstand (DDA) for automatisk at skifte mellem MS- og MSMS-hændelser.
    5. Definer et loopantal svarende til 15 ved hjælp af en automatisk forstærkningskontrolmålværdi (AGC) på 3 x 106 og 1 x 105 for henholdsvis MS- og MSMS-hændelserne.
    6. Indstil den maksimalt tilladte ionakkumuleringstid til 20 ms for MS med en opløsning på 60 K og 100 ms for MSMS med en opløsning på 15 K.
    7. Udfør et fragmenteringseksperiment med høj kollisionsdissociation (HCD) ved hjælp af en normaliseret kollisionsenergi på 28% med en dynamisk udelukkelsestid på 20 s.
    8. Betjen kildeparametrene på følgende måde:
      Sprøjtespænding: 1,7 kV
      Kapillær spænding: 275 °C
      Hverken en kappe eller hjælpegas anvendes
      BEMÆRK: I denne protokol er ultrahøjtydende væskekromatografi (UHPLC) massespektrometrisk (MS) analyse specifikt udført ved hjælp af en LC-enkeltkolonneopsætning koblet til et hybrid triple quadrupole orbitrap-instrument (materialetabel). Andre LCMS-systemer kan anvendes, men en tilpasning af parametre anbefales.
  4. Analyse af data
    1. Brug knappen Indlæs til at importere raw-filerne.
    2. Definer eksperimentnavnene ved at klikke på knappen Indstil eksperiment .
    3. Indtast sektionen gruppespecifikke parametre for at angive alle de parametre, der er relateret til identifikation:
      Enzym anvendt til fordøjelse: Trypsin/P
      Ubesvarede spaltninger: op til tre
      Fast modifikation: Carbamidomethylering
      Variabel modifikation: N-acetyl (protein), oxidation (M)
    4. Upload en opdateret FASTA-fil, der er tilgængelig fra offentlige databaser som UniprotKB.
    5. Angiv de korrekte parseregler i henhold til kilden til den valgte database.
    6. Definer en afstamningsfalsk opdagelsesrate (FDR) værdi = 1 for både proteiner og peptider.
    7. Tilføj indstillingen etiketfri kvantificering (LFQ) under fanen Etiketfri kvantificering.
    8. Hold det mindste antal LFQ-forhold på to.
      BEMÆRK: Her beskriver vi dataanalyse ved hjælp af MaxQuant24 og Perseus software25 til at udføre henholdsvis proteinkvantificering og efterfølgende statistisk analyse. Dataanalyse kan dog udføres med enhver anden kommercielt tilgængelig eller gratis bioinformatisk. FDR estimeres ved hjælp af en mål-lokkedatabasebaseret tilgang26. Peptid og protein FDR lig med 0,01 betyder, at identificerede peptider og proteiner forventes at indeholde 1% falske positive.
  5. Statistisk analyse
    1. Indlæs proteingrupperne.txt fil for at udføre statistisk analyse på proteinniveau.
    2. Definer LFQ-værdierne som hovedkolonner.
    3. Fjern "omvendt" og "forurenende stoffer" ved at filtrere rækker baseret på den kategoriske kolonne.
    4. Brug de kategoriske anmærkningsrækker til at gruppere de forskellige eksperimentelle betingelser.
    5. Reducer datamatrixen ved at vælge antallet af gyldige værdier i hver af de tidligere definerede grupper.
    6. Vælg den statistiske test, der passer bedst til de eksperimentelle betingelser (dvs. t-test, multiple sample test ANOVA).
    7. Bestem en afskæring for væsentlige tip med en FDR-baseret beregning. Typisk accepteres både 0,01 og 0,05 som tærskler for den justerede p-værdi .
    8. Visualiser resultaterne af differentialanalyser baseret på t-test-statistikker ved hjælp af en vulkanplotrepræsentation.
    9. Eksporter den endelige matrix i .txt format til yderligere redigering af den endelige resultattabel.
      BEMÆRK: Konfigurationsmappen indeholder en FASTA-fil med proteiner såsom keratiner, der betragtes som almindelige forurenende stoffer i globale proteomiske eksperimenter, som er markeret med et + i outputtabellen. I denne undersøgelse, der har to prøvebetingelser, anvendes en t-test til den statistiske analyse.

11. Validering af resultater ved western blot

  1. Forberedelse af prøver
    1. Der tilsættes en passende mængde 4x prøvepåfyldningsbuffer til hver prøve IN, FT og EL.
    2. Kog prøverne i 5 minutter ved 95 °C.
    3. Hurtig centrifugering for at genvinde fordampet prøve fra toppen af rørene.
  2. SDS-PAGE og gel overførsel
    1. Læg prøver på en 4% -12% denaturerende polyacrylamidgel.
    2. Kør gelen med MES SDS løbebuffer i 1,5 timer ved 120 V.
    3. Overfør gelen på en nitrocellulosemembran med en halvtør overførselskassette efter producentens anvisninger. Vi anbefaler en 10 minutters overførsel ved 15 V.
  3. Immundetektion
    1. Bloker membranen med 10% bovin serumalbumin (BSA) i 1 time ved stuetemperatur, mens du forsigtigt omrører.
    2. Tilsæt det primære antistof fremstillet i 5% BSA i TBST i henhold til producentens anvisninger. Lad det stå natten over ved 4 °C eller i 1 time ved stuetemperatur under forsigtig omrøring.
    3. Vask membranen tre gange med TBST, hver gang i 5 min.
    4. Der tilsættes det sekundære antistof fremstillet i TBST i 1 time ved stuetemperatur under omrøring.
    5. Vask membranen tre gange med TBST, hver gang i 5 min.
    6. Visualiser resultaterne ved hjælp af et blot imager.
      BEMÆRK: Til påvisning af TDP-43, et kendt bindemiddel af vores RNA, blev rekombinant kanin monoklonalt antistof anvendt og efterladt med membranen natten over ved 4 ° C. Som et sekundært antistof blev anti-kanin IgG peberrodsperoxidase (HRP) brugt, men et fluorescerende sekundært antistof ville også fungere. For at visualisere antistofferne på membranen blev membranen inkuberet med Clarity Western ECL-substratet i 1 min, før der blev taget billeder med ChemiDoc-billeddannelsessystemet.

Representative Results

For at verificere gyldigheden af den foreslåede protokol blev PD-eksperimenterne, der blev præsenteret her, udført med en biotinyleret RNA-aptamer designet i silico til specifikt at binde TDP-4320. Dette RNA binder sit proteinmål med høj bindingsaffinitet (Kd = 90 nM)20. Her omtales dette RNA med sekvens 5'-CGGUGUUGCU-3' med navnet "+RNA". Som en negativ kontrol blev den omvendte komplementære sekvens af +RNA, som her kaldes "-RNA", anvendt. Dens sekvens er 5'-AGCAACACCG-3'. -RNA viser en signifikant lavere bindingsaffinitet mod TDP-43 (Kd = 1,5 μM)19. Med henblik på protokollen beskrevet her er disse RNA-oligonukleotider købt konjugeret til et biotinmolekyle for at muliggøre binding til streptavidinperlerne. +RNA blev købt med en biotin-TEG i sin 3'-ende, som inkluderer en 15-atomtriethylenglycolafstandsstykke mellem biotinet og phosphatgruppen af nukleinsyren; -RNA havde i stedet en biotin i sin 5'-ende, konjugeret til nukleinsyren via en amino-C6-linker. Men hvis designet af RNA-agnet er robust, og så længe der ikke er nogen strukturel eller kemisk interferens mellem linkeren og RNA'et, kan andre positioner for biotinkonjugationen og andre linkerlængder anvendes.

Kendskab til identiteten af hovedproteinet, der skulle findes bundet til +RNA-sonden efter PD, muliggjorde validering af protokollen ved identifikation af TDP-43 i eluatet ved hjælp af både massespektrometri (MS) og western blot (WB) (figur 1).

MS-analyse blev udført på fire PD-replikater udført under anvendelse af enten +RNA eller -RNA (figur 2). Identifikationen af interaktomerne af +RNA og -RNA ligger uden for denne protokols anvendelsesområde, men nogle resultater, der validerer protokollens nøjagtighed, rapporteres. Det skal bemærkes, at plotning af de signifikant berigede proteiner i et vulkanplot afslørede, at det samlede proteinindhold og de berigede proteiner, der elueres fra +RNA, var signifikant højere end det, der blev genvundet fra -RNA (figur 2). Dette betyder, at på trods af at det har samme længde og strukturelle indhold (lineært), kan +RNA etablere et højere antal specifikke interaktioner, som bevares op til elueringstrinnet med højt salt. Det er sandsynligt, at -RNA i stedet etablerer et højere antal uspecifikke kontakter, der forstyrres under vasketrinnene. Som forventet blev TDP-43 identificeret som en unik interaktor af +RNA20; den gennemsnitlige etiketfri kvantificering (LFQ) for de fire PD-replikater udført med +RNA er 31,96 ± 0,56, mens proteinet ikke er identificeret blandt interaktorerne af -RNA. Derudover viste TDP-43 sig blandt alle unikke interaktorer af +RNA at være det mest rigeligt berigede protein.

For yderligere at validere protokollen blev den interne algoritme catRAPID18,19 brugt til beregningsmæssigt at forudsige, hvilke andre proteiner der specifikt ville binde enten +RNA eller -RNA. Især interaktionsscorer for +RNA og -RNA med de proteiner, der udgør det humane proteom, blev beregnet ved hjælp af catRAPID-funktionen 'interaktionstilbøjelighed', som defineret i vores tidligere arbejde27. Blandt proteinerne scoret med høj sikkerhed blev HNRNPH3 forudsagt at binde selektivt +RNA (+RNA interaktionsscore = 1,01; -RNA interaktionsscore = 0,21) og PCBP2 at interagere specifikt med -RNA (+RNA interaktionsscore = -0,5; -RNA interaktionsscore = 0,31) (figur 3A). Derudover blev proteinet RBM41 forudsagt at være promiskuøst for begge RNA-oligonukleotider (+RNA-interaktionsscore = 0,4; -RNA-interaktionsscore = 0,39) (figur 3A). MS-analysen bekræftede faktisk tilstedeværelsen af HNRNPH3 og PCBP2 i PD af henholdsvis +RNA og -RNA, mens RBM41 blev fundet interagere med begge (figur 3B).

WB blev brugt til at detektere tilstedeværelsen af TDP-43 for yderligere at bekræfte resultaterne og under protokoloptimering (figur 4). I den her beskrevne procedure blev forskellige prøver indsamlet på forskellige stadier. Inputprøven (IN) bestod af de samlede proteiner fortyndet i lysisbuffer. Gennemstrømningen (FT) blev opnået efter en inkubation natten over af de samlede proteiner med streptavidinperlerne forbelagt med det biotinylerede RNA, der repræsenterer den fraktion af proteiner, der ikke bandt RNA'et. Endelig indeholdt eluatet (EL) alle de proteiner, der specifikt anerkendte RNA'et under undersøgelse, da mellem FT og EL-trinene skulle tre vasketrin med 150 mM salt og 0,1% triton-X have fjernet de svageste interaktioner.

For hver replikat blev den samme mængde (5% v / v) IN, FT og EL kørt parallelt på en SDS-PAGE og farvet med et anti-TDP-43-antistof (figur 4). I tilfælde af +RNA blev båndet af TDP-43 observeret i IN og i EL, hvilket indikerer, at proteinet, der er til stede fra starten i det totale proteinekstrakt, tilbageholdes af +RNA under vasketrinnene og kun elueres i slutningen med en høj saltbuffer. TDP-43 var også til stede i IN for -RNA, men båndet svarende til proteinet er også synligt i FT, hvilket indikerer, at dette RNA ikke binder TDP-43. Fraværet af TDP-43-båndet i EL bekræfter dette resultat.

Under optimeringen af protokollen blev elueringen af proteinerne specifikt bundet til RNA-sekvenserne undersøgt både med en elueringsbuffer indeholdende 1 M NaCl (EB1) og med en elueringsbuffer komplet med 2 M NaCl (EB2) (figur 4). Eluater opnået med enten EB blev sammenlignet på en SDS-PAGE og blottet med anti-TDP-43-antistoffet. De opnåede billeder blev derefter analyseret med ImageJ28 for at kvantificere enhver forskel i TDP-43-mængden elueret med de to buffere. Samlet set blev der ikke observeret nogen signifikant forskel, og vi konkluderede, at inden for disse analyser er 1 M salt tilstrækkeligt til at forstyrre selv de stærkeste protein-RNA-interaktioner.

Samlet set viser de resultater, der rapporteres her for MS og WB'er, at denne protokol er effektiv til at fange proteininteraktorakterne for et givet RNA på en bestemt måde, og at den muliggør eluering i buffere, der er kompatible med downstream-analyse.

Figure 1
Figur 1: Skitse af den eksperimentelle rørledning, der anvendes i den foreslåede protokol . (A) Det biotinylerede RNA-oligonukleotid fremstilles i lysisbuffer ved den passende koncentration. (B) Magnetiske streptavidinperler vaskes, blokeres med gær-tRNA og fyldes med det biotinylerede RNA. (C) Samlet proteinekstrakt afledt af dyrkede pattedyrcellelinjer tilsættes til perle-RNA-blandingen. (D) Flere vaske udføres for at fjerne uspecifikke interaktioner. (E) De specifikke proteininteraktorer løsnes fra RNA'et med en hypertonisk opløsning. (F) Interacternes identitet afsløres ved massespektrometri, og specifikke tilfælde valideres af western blot. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Analytisk strategi for mærkningsfri MS-baseret proteinkvantificering . (A) Eluerede proteiner udfældes i kold acetone natten over. Proteiner denatureres derefter, og en fordøjelse i opløsning udføres. Proteolytiske peptider koncentreres og afsaltes. (B) Peptider analyseres via LC-MS/MS ved hjælp af en "haglgeværtilgang". (C) Rådatabehandling og analyse udføres ved hjælp af henholdsvis MaxQuant- og Perseus-software. (D) Statistisk signifikante berigede proteiner vises i et vulkanplot. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Korrelation mellem forudsagte interaktionstilbøjeligheder og eksperimentelt bestemte interaktioner mellem +RNA og -RNA. (A) catRAPID-interaktionsscorer i forhold til HNRNPH3, PCBP2 og RBM41, hvilket indikerer præferencebinding af HNRNPH3 for +RNA og af PCBP2 for -RNA, mens RBM41 forventes vilkårligt at binde begge RNA-sekvenser. (B) Etiketfri kvantificeringsgennemsnit bestemt ved massespektrometrianalyse fra pull-downs udført med +RNA og -RNA. Analysen bekræfter, at HNRNPH3 udelukkende binder +RNA, PCBP2 binder udelukkende -RNA, og RBM41 binder begge ligeligt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Western blot-validering af tilstedeværelsen/fraværet af TDP-43 blandt interaktorerne af udvalgte RNA-sekvenser. WB-membranen er blevet behandlet med anti-TDP-43-antistof. IN = indgang; FT = gennemstrømning; EL (EB1) = eluering med elueringsbuffer 1 EL (EB2) = eluering med elueringsbuffer 2 tegnet "+" angiver prøver afledt af pull-down udført med +RNA; tegnet "-" angiver prøver afledt af pull-down udført med -RNA; Bane 1 indeholder en proteinstige. TDP-43 er angivet med en pil. WB indikerer, at TDP-43 findes blandt +RNA-interaktorer, men ikke blandt -RNA-interaktorer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Bufferens navn Sammensætning
10x Tranfer buffer 250 mM tris, 1,92 M glycin, 1% SDS, 20% methanol. Fortynd 10 gange før brug PD
20X MES SDS kører buffer 1 M MES, 1 M tris, 2% SDS, 20 mM EDTA. Juster pH til 7,3. Fortynd 20 gange før brug
4x prøveindlæsningsbuffer 0,25 M Tris base, 0,28 M SDS, 40% glycerol, 20% 2-mercapto-ethanol, 4 mg/ml bromphenolblåt
Elueringsbuffer 1 20 mM phosphat pH 7,5, 1 M NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT (tilsættes efter kvantificering)
Elueringsbuffer 2 20 mM phosphat pH 7,5, 2 M NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT (tilsættes efter kvantificering)
Lysis buffer 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 1 mM DTT og proteasehæmmere
Tris-bufret saltvand med Tween-20 1 M Tris-HCl pH 7,4, 3 M NaCl, 2,0% Tween-20
Vaskebuffer 1 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton TM X-100, 1 mM DTT og proteasehæmmere
Vaskebuffer 2 25 mM Hepes pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 1 mM DTT og proteasehæmmere
Buffer A 0,1% myresyre MS
Buffer B 60% acetonitril, 0,1% myresyre
Denatureringsbuffer 8M urinstof, 50 mM Tris-HCI

Tabel 1: PD- og MS-buffere. Navne på og sammensætning af de buffere, der anvendes til enten pull-down-eksperimenterne (PD) eller massespektrometrianalysen (MS).

Discussion

Dette arbejde rapporterer optimering af en PD-protokol udført med biotinylerede RNA-oligonukleotider for at fange deres proteininteraktorer. Den her beskrevne protokol er enkel at udføre, kræver lidt materiale og giver meget pålidelige resultater. Det er vigtigt, at de mest nye aspekter af denne protokol består af brugen af en RNA-agn designet fuldt ud i silico og specifik for proteinmålet og eluering af alle proteiner bundet til RNA-agn ved direkte at forstyrre deres interaktioner med en højsaltopløsning snarere end ved at adskille streptavidin fra biotinet med vaskemiddel og behandling ved høj temperatur.

Denne protokol udnytter styrken af bindingen mellem biotin og streptavidin29,30. Ifølge de valgte streptavidinperler skal belastningen af det biotinylerede RNA testes og kvantificeres, før det fortsættes. RNA tridimensionel foldning kan også påvirke belastningseffektiviteten på perlerne, da det kan begrænse eksponeringen af biotinet for streptavidin. Blokering af perlerne med ikke-biotinyleret tRNA forbedrer renheden af resultaterne ved at begrænse uspecifikke interaktioner med perlerne. Belastningsbufferen og elueringsbufferen skal vælges afhængigt af downstream-anvendelserne. Her blev der foreslået meget milde forhold, der var egnede til de fleste applikationer og udviklet til at bevare potentielle proteinkomplekser. Denne metode er dog meget tilpasningsdygtig; brugeren kan vælge en hvilken som helst cellelinje og enhver RNA-størrelse og kan beslutte at gentage protokollen efter foldning / udfoldning af RNA'et for at bestemme strukturens virkning på bindingsegenskaberne.

Et andet originalt aspekt af denne protokol er brugen af in silico-forudsigelsesværktøjer for at sikre, at resultaterne er korrekte20. At vide på forhånd, hvilke proteiner der skal identificeres som interaktorer af RNA af interesse, giver den hidtil usete fordel ved at validere de tekniske aspekter af protokollen. For eksempel er det ved hjælp af en simpel WB-analyse muligt at verificere tilstedeværelsen af et kendt proteinmål i prøverne afledt af de forskellige trin i protokollen, inden man fortsætter med MS-analysen, hvilket kræver specialiseret instrumentering og er dyrere. Derudover blev der for nylig rapporteret om en metode til at bruge catRAPID20, en intern protein-RNA-forudsigelsesalgoritme, til at designe de novo RNA, der er specifik for et målprotein. Indtil for nylig var den eneste tilgængelige pipeline til design af DNA/RNA-aptamerer til et målprotein SELEX-metoden (systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse)31. In silico-metoden muliggør et meget hurtigere og omkostningseffektivt design af RNA-aptamerer.

De vigtigste begrænsninger ved denne metode er forbundet med behovet for at arbejde i nukleasefrie buffere og værktøjer. Hvis det desuden anses for nødvendigt in vitro at bekræfte bindingen mellem et de novo-designet RNA og et målprotein forud for PD, skal proteinet produceres og oprenses, og bindingen bestemmes med biofysiske tilgange. Dette er en begrænsning, der deles med produktionen af monoklonale antistoffer.

På trods af disse mindre problemer kan pålidelige metoder til kortlægning af RNA-proteininteraktioner, som den, der præsenteres her, bringe forskere tættere på at afsløre makromolekylære netværk og komplekse hovedaktører i mange fysiologiske og patologiske mekanismer, såsom dem, der er involveret i kræft, kardiomyopatier, diabetes, mikrobielle infektioner og genetiske og neurodegenerative lidelser.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke professor Tartaglias og Dr. Cuomos forskningsgruppe for den tilbudte støtte. E.Z. modtog finansiering fra MINDED-stipendiet fra EU's Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftale nr. 754490.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well tissue culture plates  VWR 10861-554 CELLS
Cell scrapers BIOSIGMA  10153 CELLS
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium  (DMEM) Thermo Fisher Scientfic 11995065 CELLS
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil Thermo Fisher Scientfic 10500064 CELLS
Phosphate Buffer Saline (PBS, Waltham, MA) Thermo Fisher Scientfic 14190169 CELLS
Trypsin (0.25%), phenol red Thermo Fisher Scientfic 15050065 CELLS
Anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HRP) Cellsignal 7070 PD
Biotinylated RNA Eurofins Custom RNA oligonucleotides PD
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9418 PD
Clarity Western ECL Substrate, 500 ml Biorad 1705061 PD
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Merck - Sigma Aldrich 5056489001 PD
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well Invitrogen NP0321BOX PD
Recombinant anti-TDP43 antibody Abcam ab109535 PD
Ribonucleic acid, transfer from baker's yeast (S. cerevisiae) Merck - Sigma Aldrich R5636-1ML PD
Streptavidin Mag Sepharose Merck - Sigma Aldrich GE28-9857-99 PD
Trans-Blot Turbo RTA Mini 0.2 µm PVDF Transfer Kit Biorad 1704272 PD
Acetone Thermo Fisher Scientfic 022928.K2 MS
C18 cartridge Thermo Fisher Scientfic 13-110-018 MS
Dithiothreitol  (DTT) Thermo Fisher Scientfic 20290 MS
EASY-Spray HPLC Columns Thermo Scientific ES902 MS
iodoacetamide (IAA)  Sigma Aldrich S.r.l. I6125 MS
Lys-C/Trypsin Promega V5073 MS
Trifluoroacetic acid (TFA) Thermo Fisher Scientfic 28904 MS
Urea Thermo Fisher Scientfic J75826.A7 MS
Equipment
ChemiDoc imaging system Bio-Rad CELLS
Dyna Mag -2 , Magnetic rack Invitrogen CELLS
Forma Series 3 water jacketed C02 incubator Thermo Scientific PD
PROTEAN II xi cell , power supply for PAGE applications Bio-Rad PD
Rotating wheel, rotator SB3 Stuart PD
Water bath set at 37 °C VWR PD
XCell SureLock Mini-Cell electrophoresis system ThermoFisher Scientific MS
Easy-nLC 1200 UHPLC Thermo Scientific MS
Q exactive Mass Spectrometer Thermo Scientific MS
Software Version
MaxQuant 2.0.3.0 MS
Perseus 1.6.14.0 MS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gebauer, F., Schwarzl, T., Valcárcel, J., Hentze, M. W. RNA-binding proteins in human genetic disease. Nature Reviews Genetics. 22 (3), 185-198 (2021).
  2. Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).
  3. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  4. Cooper, T. A., Wan, L., Dreyfuss, G. RNA and disease. Cell. 136 (4), 777-793 (2009).
  5. Qin, H., et al. RNA-binding proteins in tumor progression. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 90 (2020).
  6. Nussbacher, J. K., Tabet, R., Yeo, G. W., Lagier-Tourenne, C. Disruption of RNA metabolism in neurological diseases and emerging therapeutic interventions. Neuron. 102 (2), 294-320 (2019).
  7. Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. Journal of Genetics and Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
  8. Maziuk, B., Ballance, H. I., Wolozin, B. Dysregulation of RNA binding protein aggregation in neurodegenerative disorders. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 89 (2017).
  9. Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (5), 1557-1562 (2006).
  10. Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118 (2021).
  11. Weidmann, C. A., Mustoe, A. M., Jariwala, P. B., Calabrese, J. M., Weeks, K. M. Analysis of RNA-protein networks with RNP-MaP defines functional hubs on RNA. Nature Biotechnology. 39 (3), 347-356 (2021).
  12. Graindorge, A., et al. In-cell identification and measurement of RNA-protein interactions. Nature Communications. 10 (1), 5317 (2019).
  13. Ule, J., Hwang, H. W., Darnell, R. B. The future of cross-linking and immunoprecipitation (CLIP). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (8), 032243 (2018).
  14. Ascano, M., Hafner, M., Cekan, P., Gerstberger, S., Tuschl, T. Identification of RNA-protein interaction networks using PAR-CLIP. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (2), 159-177 (2012).
  15. McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biology. 15 (1), 203 (2014).
  16. Sugimoto, Y., et al. Analysis of CLIP and iCLIP methods for nucleotide-resolution studies of protein-RNA interactions. Genome Biology. 13 (8), (2012).
  17. Bayat, P., et al. SELEX methods on the road to protein targeting with nucleic acid aptamers. Biochimie. 154, 132-155 (2018).
  18. Armaos, A., Colantoni, A., Proietti, G., Rupert, J., Tartaglia, G. G. CatRAPID omics v2.0: Going deeper and wider in the prediction of protein-RNA interactions. Nucleic Acids Research. 49, 72-79 (2021).
  19. Agostini, F., et al. CatRAPID omics: A web server for large-scale prediction of protein-RNA interactions. Bioinformatics. 29 (22), 2928-2930 (2013).
  20. Zacco, E., et al. Probing TDP-43 condensation using an in silico designed aptamer. Nature Communications. 13 (1), 3306 (2022).
  21. Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Research. 42 (2), 13 (2014).
  22. Zhang, Y., Lai, B. S., Juhas, M. Recent advances in aptamer discovery and applications. Molecules. 24 (5), 941 (2019).
  23. UniProt Consortium. UniProt: the Universal Protein Knowledgebase in 2023. Nucleic Acids Research. 51, 523-531 (2023).
  24. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  25. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  26. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  27. Bellucci, M., Agostini, F., Masin, M., Tartaglia, G. G. Predicting protein associations with long noncoding RNAs. Nature Methods. 8 (6), 444-445 (2011).
  28. Gallo-Oller, G., Ordoñez, R., Dotor, J. A new background subtraction method for Western blot densitometry band quantification through image analysis software. Journal of Immunological Methods. 457, 1-5 (2018).
  29. Weissinger, R., Heinold, L., Akram, S., Jansen, R. P., Hermesh, O. RNA proximity labeling: A new detection tool for RNA-protein interactions. Molecules. 26 (8), 2270 (2021).
  30. Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
  31. Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 192 RNA-proteininteraktioner proteinpull-down RNA-bindende proteiner (RBP'er) biotinyleret RNA RNA-aptamerer
En optimeret kvantitativ pull-down analyse af RNA-bindende proteiner ved hjælp af kort biotinyleret RNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crua Asensio, N., Rizzieri, S.,… More

Crua Asensio, N., Rizzieri, S., Cuomo, A., Tartaglia, G. G., Zacco, E. An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA. J. Vis. Exp. (192), e64923, doi:10.3791/64923 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter