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Biochemistry

लघु बायोटिनीलेटेड आरएनए का उपयोग करके आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन का एक अनुकूलित मात्रात्मक पुल-डाउन विश्लेषण

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/64923
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3, 1
1Center for Human Technology, Italian Institute of Technology (IIT), 2Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology (IEO), 3Department of Biology and Biotechnologies ‘Charles Darwin’, Sapienza University of Rome

Summary

यहां, हम मानव कोशिकाओं से कुल प्रोटीन अर्क, बायोटिनीलेटेड आरएनए के साथ लेपित स्ट्रेप्टाविडिन मोती, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण का उपयोग करके विशिष्ट आरएनए अनुक्रमों के प्रोटीन इंटरएक्टर्स को उजागर करने, मात्रा निर्धारित करने और मान्य करने के लिए एक अनुकूलित इन विट्रो विधि प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन ट्रांसक्रिप्शनल और पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल स्तरों पर जीन अभिव्यक्ति और सेलुलर कार्यों को नियंत्रित करते हैं। इस कारण से, कई सेलुलर प्रक्रियाओं के पीछे तंत्र का अनावरण करने के लिए रुचि के आरएनए के बाध्यकारी भागीदारों की पहचान करना उच्च महत्व का है। हालांकि, आरएनए अणु कुछ आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन (आरबीपी) के साथ क्षणिक और गतिशील रूप से बातचीत कर सकते हैं, खासकर गैर-कैननिकल लोगों के साथ। इसलिए, ऐसे आरबीपी को अलग करने और पहचानने के लिए बेहतर तरीकों की बहुत आवश्यकता है।

एक ज्ञात आरएनए अनुक्रम के प्रोटीन भागीदारों को कुशलतापूर्वक और मात्रात्मक रूप से पहचानने के लिए, हमने सेलुलर कुल प्रोटीन निकालने से शुरू होने वाले सभी अंतःक्रियात्मक प्रोटीनों के पुल-डाउन और लक्षण वर्णन के आधार पर एक विधि विकसित की। हमने स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित मोतियों पर प्री-लोडेड बायोटिनीलेटेड आरएनए का उपयोग करके प्रोटीन पुल-डाउन को अनुकूलित किया। अवधारणा के प्रमाण के रूप में, हमने एक छोटे आरएनए अनुक्रम को नियोजित किया जो न्यूरोडीजेनेरेशन से जुड़े प्रोटीन टीडीपी -43 और एक अलग न्यूक्लियोटाइड संरचना के नकारात्मक नियंत्रण को बांधने के लिए जाना जाता है लेकिन एक ही लंबाई। खमीर टीआरएनए के साथ मोतियों को अवरुद्ध करने के बाद, हमने स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों पर बायोटिनीलेटेड आरएनए अनुक्रमों को लोड किया और उन्हें एचईके 293 टी कोशिकाओं से कुल प्रोटीन अर्क के साथ इनक्यूबेट किया। निरर्थक बाइंडर्स को हटाने के लिए इनक्यूबेशन और कई धोने के चरणों के बाद, हमने एक उच्च-नमक समाधान के साथ बातचीत करने वाले प्रोटीन को शामिल किया, जो सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले प्रोटीन परिमाणीकरण अभिकर्मकों के साथ संगत है और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूना तैयार करता है। हमने मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में ज्ञात आरएनए बाइंडर के साथ किए गए पुल-डाउन में टीडीपी -43 के संवर्धन को निर्धारित किया। हमने अन्य प्रोटीनों की चयनात्मक बातचीत को सत्यापित करने के लिए एक ही तकनीक का उपयोग किया, जो कम्प्यूटेशनल रूप से हमारे आरएनए या नियंत्रण के अद्वितीय बाइंडर होने की भविष्यवाणी करते हैं। अंत में, हमने उचित एंटीबॉडी के साथ टीडीपी -43 का पता लगाने के माध्यम से वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा प्रोटोकॉल को मान्य किया।

यह प्रोटोकॉल निकट-से-शारीरिक स्थितियों में रुचि के आरएनए के प्रोटीन भागीदारों के अध्ययन की अनुमति देगा, जिससे अद्वितीय और अप्रत्याशित प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन को उजागर करने में मदद मिलेगी।

Introduction

आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन (आरबीपी) ट्रांसक्रिप्शनल और पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल जीन विनियमन में महत्वपूर्ण खिलाड़ियों के रूप में उभरे हैं, क्योंकि वे एमआरएनए स्प्लिसिंग, आरएनए सेलुलर स्थानीयकरण, अनुवाद, संशोधन और गिरावट 1,2,3 जैसी प्रक्रियाओं में शामिल हैं। दो मैक्रोमोलेक्यूल्स के बीच इस तरह की बातचीत अत्यधिक समन्वित, सटीक रूप से संतुलित और कार्यात्मक और प्रसंस्करण केंद्रों के गठन के लिए आवश्यक है। इन केंद्रों के भीतर भिन्नताओं या डिसरेगुलेशन में बारीक विनियमित प्रोटीन-आरएनए नेटवर्क को बाधित करने की क्षमता होती है और कैंसर 4,5 और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार 6,7,8 सहित विभिन्न प्रकार के मानव रोगों से तेजी से जुड़े होते हैं। आरएनए अणुओं और उनके प्रोटीन बाइंडिंग भागीदारों के बीच बातचीत या तो स्थिर और प्रयोगात्मक रूप से मान्य करने में आसान हो सकती है, या अत्यधिक गतिशील, क्षणिक और चिह्नित करने के लिए अधिक कठिन हो सकती है।

हाल के वर्षों में, इन इंटरैक्शन को समझने के लिए गहन प्रयास किए गए हैं। सबसे स्थापित तरीकों में, प्रोटीन पुल-डाउन परख (पीडी) संभवतः राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) कॉम्प्लेक्स और अन्य प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन नेटवर्क 3,9,10 का गठन करने वाले मुख्य खिलाड़ियों को उजागर करने के लिए सबसे अधिक सराहना और आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोण हैं। पीडी में सूचनात्मक तकनीकों की एक व्यापक छतरी शामिल है, जैसे कि आरएनए (आरआईपी) 11,12 या प्रोटीन (सीएलआईपी) 13,14 की प्रतिरक्षा। इनमें से कुछ आरएनए-पीडी प्रोटोकॉल प्रोटीन15 के लिए चारा के रूप में एक ज्ञात आरएनए को नियोजित करते हैं, अक्सर बायोटिन जैसे उच्च आत्मीयता टैग का लाभ उठाकर। इस उदाहरण में, स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित मोतियों पर आरएनए को लंगर डालकर बायोटिनीलेटेड आरएनए के इंटरैक्शन पार्टनर्स का पता लगाया जा सकता है, जिससे आरएनपी के कुशल अलगाव को सक्षम किया जा सकता है। इन दृष्टिकोणों की मुख्य सीमाएं आमतौर पर बायोटिनीलेटेड जांच का डिजाइन और लक्ष्य प्रोटीन को बांधने की उनकी क्षमता का परीक्षण हैं। इस उद्देश्य के लिए, यदि उपलब्ध हो, तो रुचि के प्रोटीन के प्रकाशित सीएलआईपी डेटा पर भरोसा करना उपयोगी हो सकता है, क्योंकि वे उच्च परिशुद्धता के साथ, छोटे आरएनए क्षेत्रों को प्रकट करते हैं जो लक्ष्य प्रोटीन13,16 के साथ बातचीत की चोटियों के अनुरूप हैं। इन क्षेत्रों का उपयोग पीडी के लिए जांच विकसित करने के लिए किया जा सकता है। इस तरह के आरएनए चारा को डिजाइन करने का एक वैकल्पिक तरीका घातीय संवर्धन (एसईएलईएक्स) 17 द्वारा लिगेंड का व्यवस्थित विकास हो सकता है, जो इन विट्रो चयन के माध्यम से एपटामर के डिजाइन को सक्षम करता है, जो एक व्यापक यादृच्छिक पुस्तकालय से शुरू होता है और पीसीआर-संचालित अनुकूलन चक्रों की एक श्रृंखला के माध्यम से होता है। हालांकि, एसईएलईएक्स जटिल और समय लेने वाला है, और अंतिम परिणाम प्रारंभिक पुस्तकालय पर अत्यधिक निर्भर हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में उपयोग करने के लिए आरएनए चारा का चयन करने के लिए, एक और दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था, जिसमें एल्गोरिदम कैटरैपिड की कम्प्यूटेशनल शक्ति के माध्यम से नए सिरे से डिजाइन किए गए आरएनए चारा का उपयोग करना शामिल था, जो कुछ आरएनए अनुक्रमों 18,19,20 के प्रति किसी दिए गए प्रोटीन के अधिमान्य बंधन की भविष्यवाणी करता है।

यहां पेश किया गया प्रोटोकॉल एक आरएनए-पीडी का एक संस्करण है जो डिटर्जेंट, विकृत एजेंटों या उच्च तापमान के उपयोग के बिना, निकट-से-शारीरिक स्थितियों में विशिष्ट प्रोटीन भागीदारों को अनुकूलित करने के लिए अनुकूलित है। यह अत्यधिक शुद्ध स्ट्रेप्टाविडिन के साथ सहसंयोजक रूप से लेपित नैनो-सुपरपैरामैग्नेटिक मोतियों पर निर्भर करता है और एक चारा के रूप में सिलिको डिज़ाइन किए गए बायोटिनीलेटेड आरएनए में एक विशिष्ट का उपयोग करता है। यह प्रोटोकॉल मूल परिस्थितियों में बायोटिनीलेटेड आरएनए अणुओं के बाध्यकारी भागीदारों को अलग करने के लिए एक तेज़ और कुशल विधि प्रदान करता है, जो डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला की क्षमता प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल का परीक्षण करने के लिए, एक 10-न्यूक्लियोटाइड एकल फंसे हुए आरएनए एपटामर अनुक्रम, जिसे पहले प्रोटीन टीएआर डीएनए-बाइंडिंग प्रोटीन 43 (टीडीपी -43) को उच्च आत्मीयता और विशिष्टता के साथ बांधने के लिए डिज़ाइन किया गया था,का उपयोग किया गया था। एचईके 293 टी सेल लाइसेट से शुरू होकर, बायोटिनीलेटेड आरएनए एपटामर के इंटरएक्टर्स की पहचान हाइपरटोनिक बफर का उपयोग करके आरएनए चारा से अलग किए गए नमूनों पर किए गए मास-स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के माध्यम से की गई थी। इस विश्लेषण ने पसंदीदा बाइंडर के रूप में टीडीपी -43 की सफल पहचान और परिमाणीकरण की पुष्टि की।

यह प्रोटोकॉल केवल एक छोटे, इन विट्रो संश्लेषित आरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड का उपयोग करके प्रोटीन इंटरएक्टर्स की सफल पहचान को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, पीडी जांच21,22 के रूप में सिलिको डिज़ाइन किए गए आरएनए एपटामर का उपयोग काफी कम लागत पर लक्ष्यों के लिए विशिष्टता की गारंटी देता है।

Protocol

1. सामान्य तरीके और सामग्री

  1. चुने हुए स्तनधारी सेल कल्चर के लिए उपयुक्त माध्यम तैयार करें और उपयोग से पहले 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इसे पूर्व-गर्म करें।
  2. सामग्री की तालिका में वर्णित के रूप में पहले से आवश्यक सामग्री तैयार करें। आटोक्लेव ग्लासवेयर, प्लास्टिक वेयर और बफर स्टॉक।
  3. तालिका 1 में वर्णित बफर तैयार करें। घटकों को उनके अंतिम वॉल्यूम में पतला करने से पहले केंद्रित एचसीएल या एनएओएच का उपयोग करके स्टॉक समाधान ों के पीएच को समायोजित करें।

2. स्तनधारी सेल लाइन तैयारी

  1. डलबेकको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) में एचईके 293 टी कोशिकाओं को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 100 μg / mL पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान के साथ पूरक करें। उन्हें 5% सीओ2 के साथ आपूर्ति किए गए ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। नियमित रूप से कोशिकाओं को विभाजित करें।
  2. अलग करने से पहले, बढ़ती सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन (पीबीएस) समाधान के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें।
  3. पीबीएस को हटा दें और ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान की एक अल्ट्रा-पतली परत जोड़ें।
  4. 5 मिनट के लिए 5% सीओ2 के साथ प्रदान किए गए एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, या जब तक कि कोशिकाएं अलग न हो जाएं (उन्हें सूक्ष्म अवलोकन के तहत फैलाया जाना चाहिए)।
  5. ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान को निष्क्रिय करने और कोशिकाओं की गणना करने के लिए पूर्ण डीएमईएम जोड़कर दस गुना पतला करें।
  6. प्लेट 1.5 x 105 कोशिकाओं / एमएल को 6-वेल प्लेटों में, परीक्षण करने के लिए दो कुओं / स्थिति पर विचार करते हुए।
  7. 5% सीओ2 के साथ एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: माध्यम के प्रकार के लिए निर्माता निर्देशों की जांच करें और सेल लाइन के लिए उपयुक्त पूरक करें। इसके अलावा, ट्रिप्सिन-ईडीटीए की मात्रा और इनक्यूबेशन समय सेल लाइन पर निर्भर करता है। कुछ सेल प्रकार इस प्रोटोकॉल में बताई गई तुलना में तेजी से / धीमी गति से बढ़ते हैं; इस प्रकार, सीडिंग एकाग्रता का परीक्षण पहले से किया जाना चाहिए।

3. कुल प्रोटीन फसल

  1. उन कुओं से माध्यम निकालें जहां कोशिकाएं बढ़ रही हैं।
  2. 6-वेल प्लेटों में से प्रत्येक को 1 एमएल पीबीएस के साथ अच्छी तरह से धो लें।
  3. पीबीएस को छोड़ दें।
  4. प्लेटों को बर्फ पर ले जाएं और या तो चरण 3.5 के साथ आगे बढ़ें या लाइसिस की सुविधा के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सूखी प्लेटों को फ्रीज करें।
  5. प्रत्येक कुएं में 200 μL लाइसिस बफर जोड़ें।
  6. कोशिकाओं को अलग करने और तोड़ने के लिए सेल स्क्रैपर का उपयोग करें।
  7. दो कुओं से प्राप्त सेल अर्क को एक ही 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  8. प्रोटीन अर्क युक्त ट्यूब को 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
  9. सेल लाइसेट को 17,000 x g पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  10. प्रत्येक सतह पर तैरनेवाला को प्री-कूल्ड ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: प्रत्येक पीडी स्थिति के लिए कुल 106-10 7 कोशिकाओं की सिफारिश की जाती है। सेल लाइसिस और प्रोटीन फसल बर्फ-ठंडे बफर के साथ किया जाना चाहिए। प्रोटीन क्षरण को रोकने के लिए प्रोटीज इनहिबिटर को लाइसिस बफर में जोड़ा जाना चाहिए।

4. प्रोटीन एकाग्रता निर्धारण

  1. ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक तैयार करें, जैसा कि निर्माता द्वारा इंगित किया गया है, इसे डीएच2ओ में पांच गुना पतला करके।
  2. 1 सेमी क्यूवेट में 1 एमएल अभिकर्मक वितरित करें, नमूना का 1 μL जोड़ें, और व्युत्क्रम द्वारा मिलाएं।
  3. 5-10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
  4. 595 एनएम पर अवशोषण पढ़ें।
  5. 1.5 मिलीग्राम प्रोटीन के अनुरूप प्रोटीन निकालने की मात्रा की गणना करें और सभी नमूनों को लाइसिस बफर का उपयोग करके 600 μL की अंतिम मात्रा में लाएं।
  6. उपयोग तक नमूने बर्फ पर रखें।
    नोट: बफर संगतता सिफारिशों के बाद किसी भी अन्य प्रोटीन एकाग्रता निर्धारण विधि का उपयोग किया जा सकता है। किसी भी मामले में, लाइसिस बफर को रिक्त स्थान के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। कई अभिकर्मक डिथियोथ्रेइटोल (डीटीटी) के साथ संगत नहीं हैं। प्रोटीन परिमाणीकरण (डीटीटी को 1 एमएम की अंतिम एकाग्रता तक) के बाद ही डीटीटी या अन्य कम करने वाले एजेंटों को जोड़ने की सिफारिश की जाती है।

5. मोती की तैयारी

  1. ट्यूब को फ्लिक करके उनके स्टोरेज बफर में मोतियों को मिलाएं।
  2. 100 μL घोल माध्यम / नमूने की गणना करें और मात्रा को चुंबकीय रैक में रखें।
  3. मोती धोना
    1. भंडारण समाधान निकालें और 1 एमएल लाइसिस बफर / ट्यूब जोड़कर मोतियों को धो लें और इसे मैन्युअल रूप से इनवर्ट करें।
    2. चुंबकीय रैक का उपयोग करके बफर को हटा दें।
    3. धोने के चरण को दोहराएं।
    4. घोल माध्यम की प्रारंभिक मात्रा के बराबर लाइसिस बफर की मात्रा जोड़ें, ट्यूब को फ्लिक करके मिलाएं, और माध्यम को समान रूप से 1.5 एमएल ट्यूबों में वितरित करें जितना नमूने हैं।
  4. मोती ब्लॉकिंग
    1. चुंबकीय रैक का उपयोग करके बफर को हटा दें और लाइसिस बफर में तैयार खमीर टीआरएनए के 0.25 मिलीग्राम / एमएल समाधान के 600 μL जोड़ें।
    2. एक घूर्णन पहिया पर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. चुंबकीय रैक का उपयोग करके टीआरएनए समाधान को हटा दें।
    4. 600 μL लाइसिस बफर जोड़ें और मैन्युअल रूप से मिश्रण करके धो लें।
    5. धोने के चरण को दोहराएं और बफर को छोड़ दें।

6. मोती लोडिंग

  1. प्रारंभिक 100 μL घोल माध्यम (अब अवरुद्ध मोती) युक्त प्रत्येक ट्यूब के लिए 600 μL लाइसिस बफर में आरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड के 200 μg तैयार करें।
  2. ओलिगो को मोतियों में जोड़ें और घुमाते समय कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. घोल निकालें, 600 μL लाइसिस बफर जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों को घुमाकर मोतियों को दो बार धोएं।
  4. बफर को छोड़ दें।
    नोट: मोतियों को कभी भंवर न करें, बल्कि इसके बजाय फ्लिक करें। जब तक आवश्यक न हो, पाइपिंग चरणों की संख्या सीमित करें। जब संभव हो, कट, 1 एमएल युक्तियों का उपयोग करें। नमूना की मात्रा मोतियों की बाध्यकारी क्षमता और कुल प्रोटीन की शुरुआती मात्रा पर निर्भर करती है। यदि आरएनए ऑलिगो में द्वितीयक संरचना की एक महत्वपूर्ण मात्रा होने की भविष्यवाणी की जाती है, तो हम पहले इसे 10 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर डीनेचर करने की सलाह देते हैं और फिर इसे कमरे के तापमान पर धीरे-धीरे ठंडा करते हैं या इसे 1 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इंजेक्ट करके फिर से मोड़ते हैं। बीड लोडिंग के बाद आरएनए ऑलिगो को पुनर्प्राप्त करने और बची हुई एकाग्रता को निर्धारित करने का सुझाव दिया जाता है, ताकि लोडिंग के लिए आवश्यक राशि को अनुकूलित किया जा सके और आरएनए का पुन: उपयोग करने की संभावना का मूल्यांकन किया जा सके।

7. मोतियों पर प्रोटीन बाइंडिंग

नोट: अब से, जब संभव हो, 4 डिग्री सेल्सियस पर चरणों का पालन करें।

  1. 600 μL प्रोटीन समाधान से 5% मात्रा लें और इसे आगे के विश्लेषण के लिए इनपुट (IN) के रूप में रखें (1.5 मिलीग्राम प्रोटीन 600 μL में घुल जाते हैं, इसलिए 5% 30 μL और 75 μg प्रोटीन से मेल खाती है)।
  2. लोडेड मोतियों की प्रत्येक ट्यूब में शेष प्रोटीन मिश्रण जोड़ें और धीरे-धीरे 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर घूमने दें।

8. निरर्थक बाइंडर्स को धोना

  1. चुंबकीय रैक का उपयोग करके अनबाउंड अंश को हटा दें। वॉल्यूम का 5% सहेजें और इसे फ्लोथ्रू (एफटी) के रूप में लेबल करें (अनबाउंड वॉल्यूम सीए 600 μL है, इसलिए आगे के विश्लेषण के लिए फिर से 30 μL रखें)।
  2. मोतियों में 1 एमएल वॉश बफर 1 जोड़ें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए घूमने दें।
  3. बफर को छोड़ दें।
  4. चरण 8.2 और 8.3 दोहराएँ।
  5. मोतियों में 1 एमएल वॉश बफर 2 जोड़ें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए घूमने दें।
  6. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।

9. विशिष्ट बाइंडर्स का क्षालन

  1. मोतियों में 100 μL क्षालन बफर 1 या क्षालन बफर 2 जोड़ें।
  2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए फ्लिक करके मैन्युअल रूप से मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
  3. ट्यूबों को थर्मोमिक्सर में रखें और 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए जोर से हिलाएं।
  4. ट्यूब को चुंबकीय रैक में रखें और एक साफ ट्यूब में इल्यूटेड अंश एकत्र करें।
  5. एलुएट की वसूली को अधिकतम करने के लिए एक बेंच सेंट्रीफ्यूज के साथ मोतियों को जल्दी से स्पिन करें।
  6. आगे के विश्लेषण के लिए कुल ELUATE (EL) मात्रा का 5% सहेजें (कुल मात्रा 100 μL है, इसलिए 5 μL को दूसरी ट्यूब में अलग करें)।
  7. यदि आवश्यक हो, तो प्रोटीन एकाग्रता को खंड 4 के रूप में निर्धारित किया जा सकता है, क्षालन बफर को रिक्त स्थान के रूप में उपयोग करके।
    नोट: जब तक प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित नहीं की जाती है, तब तक क्षालन बफर में डीटीटी जोड़ने से बचने की सिफारिश की जाती है। यदि प्रोटीन परिमाणीकरण की आवश्यकता नहीं है, या यदि एजेंट-संगत प्रोटीन परिमाणीकरण किट को कम करना उपलब्ध है, तो 1 एमएम डीटीटी को शुरू से ही क्षालन बफर में जोड़ा जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, दोनों क्षालन बफर 1 (1 एम एनएसीएल युक्त) और क्षालन बफर 2 (2 एम एनएसीएल के साथ) का परीक्षण किया गया था। बढ़ी हुई आयनिक ताकत के साथ लक्ष्य प्रोटीन की क्षालन दक्षता में कोई अंतर नहीं देखा गया था, लेकिन सबसे उपयुक्त बफर स्थापित करने से पहले दोनों स्थितियों का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है। यदि क्षालन बफर में नमक की उच्च उपस्थिति आगे के विश्लेषण के लिए एक सीमा का प्रतिनिधित्व करती है, तो क्षालन बफर में डिटर्जेंट की बहुत कम मात्रा बफर-एक्सचेंज की अनुमति देती है। एक विकल्प के रूप में, वांछित नमक एकाग्रता तक पहुंचने के लिए एलुएट को पतला किया जा सकता है।

10. मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन बाइंडर्स की पहचान

  1. एसीटोन वर्षा
    1. ठंडे (-20 डिग्री सेल्सियस) एसीटोन में इसे चार गुना पतला करके प्रोटीन को केंद्रित करें।
    2. भंवर करें और रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 17,000 x g पर स्पिन करें।
    4. धीरे से सतह पर तैरने वाले को हटा दें और एसीटोन को वाष्पित होने दें जब तक कि गोली पूरी तरह से सूख न जाए।
  2. इन-सॉल्यूशन प्रोटीन पाचन।
    1. 50 μL विकृतीकरण बफर जोड़कर प्रोटीन गोली को घोलें।
    2. डीटीटी को 5 एमएम की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें, जिससे 55 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए प्रोटीन में कमी हो सके।
    3. कमरे के तापमान पर नमूनों को ठंडा करें और प्रोटीन अल्काइलेशन प्रतिक्रिया के साथ आगे बढ़ें, 15 मिनट के लिए 10 एमएम की एकाग्रता पर आयोडोसिटामाइड (आईएए) जोड़ें।
    4. एक उपयुक्त एंजाइम (ट्रिप्सिन, लाइससी) का उपयोग करके प्रोटीन को पचाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नमूने को इनक्यूबेट करें।
    5. 10% ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड (टीएफए) के 1 μL को जोड़कर पाचन को रोकें।
    6. पेप्टाइड्स को एक कस्टम उलट चरण सी 18 माइक्रो-कॉलम पर साफ करें और केंद्रित करें, जैसा कि पहले वर्णित19 है।
    7. बफर बी के साथ सी 18 टिप से इल्यूट पेप्टाइड्स।
    8. वैक्यूम सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके कार्बनिक घटक को हटा दें और आगे के विश्लेषण के लिए 0.1% फॉर्मिक एसिड के 5 μL में पेप्टाइड्स को फिर से निलंबित करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन पाचन को निरर्थक बाइंडर्स (चरण 8.1-8.6) को धोने के तुरंत बाद "ऑन-बीड्स" किया जा सकता है, इस प्रकार प्रोटोकॉल को तेज बनाया जा सकता है। हालांकि, इष्टतम प्रयोगात्मक प्रोटीन अनुक्रम कवरेज की गारंटी देने के लिए, समाधान पाचन में मानक की तुलना में "ऑन-बीड्स" स्थिर-प्रोटीन काम करने वाले एंजाइम की दक्षता का परीक्षण करना उचित है।
  3. तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस /
    1. विश्लेषणात्मक कॉलम (सी 18-स्थिर चरण) में प्लग करें और रन के समय इसे 45 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. कॉलम को एकल-स्तंभ कॉन्फ़िगरेशन में केशिका उंगली-तंग फिटिंग (20 μm x 550 mm) के माध्यम से एलसी पंप के छह-पोर्ट रोटरी वाल्व के आउटलेट से कनेक्ट करें।
    3. एलसी सेटिंग्स निम्नानुसार समायोजित करें:
      1. बफर ए में नियंत्रित दबाव (980 बार) के तहत पेप्टाइड्स लोड करें।
      2. 59 मिनट से अधिक 300 nL/min पर 5% -20% बफर बी ग्रेडिएंट लागू करें, इसके बाद 15 मिनट से अधिक 20% -30% बफर बी ग्रेडिएंट और 5 मिनट से अधिक 30% -65% बफर बी ग्रेडिएंट लागू करें।
      3. 5 मिनट में बफर बी की एकाग्रता को 95% तक बढ़ाकर और 95% बफर बी पर 5 मिनट का आइसोक्रेटिक कदम बढ़ाकर वॉश स्टेप जोड़ें।
    4. एमएस और एमएसएमएस घटनाओं के बीच स्वचालित रूप से स्विच करने के लिए डेटा-निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) मोड में मास स्पेक्ट्रोमीटर संचालित करें।
    5. एमएस और एमएसएमएस घटनाओं के लिए क्रमशः 3 x 106 और 1 x 105 के स्वचालित लाभ नियंत्रण (एजीसी) लक्ष्य मान का उपयोग करके 15 के बराबर लूप गणना परिभाषित करें।
    6. 60 K के रिज़ॉल्यूशन के साथ MS के लिए अधिकतम अनुमत आयन संचय समय 20 ms पर सेट करें, और 15K के रिज़ॉल्यूशन के साथ MSMS के लिए 100 ms।
    7. 20 सेकंड के गतिशील बहिष्करण समय के साथ 28% की सामान्यीकृत टकराव ऊर्जा का उपयोग करके एक उच्च टकराव पृथक्करण (एचसीडी) विखंडन प्रयोग करें।
    8. स्रोत पैरामीटर निम्नानुसार संचालित करें:
      स्प्रे वोल्टेज: 1.7 केवी
      केशिका वोल्टेज: 275 डिग्री सेल्सियस
      न तो एक म्यान और न ही सहायक गैस का उपयोग किया जाता है
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, अल्ट्रा-हाई परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (यूएचपीएलसी) मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक (एमएस) विश्लेषण विशेष रूप से एलसी सिंगल कॉलम सेटअप का उपयोग करके किया गया है, जो हाइब्रिड ट्रिपल क्वाड्रोपोल ऑर्बिटरैप उपकरण (सामग्री की तालिका) के साथ युग्मित है। अन्य एलसीएमएस सिस्टम का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन मापदंडों के अनुकूलन की सिफारिश की जाती है।
  4. डेटा विश्लेषण
    1. कच्ची फ़ाइलों को आयात करने के लिए लोड बटन का उपयोग करें।
    2. प्रयोग सेट करें बटन पर क्लिक करके प्रयोग नाम निर्धारित करें.
    3. पहचान से संबंधित सभी पैरामीटर निर्दिष्ट करने के लिए समूह-विशिष्ट पैरामीटर अनुभाग दर्ज करें:
      पाचन के लिए उपयोग किया जाने वाला एंजाइम: ट्रिप्सिन /
      मिस्ड क्लीवेज: तीन तक
      निश्चित संशोधन: कार्बामिडोमिथाइलेशन
      चर संशोधन: एन-एसिटाइल (प्रोटीन), ऑक्सीकरण (एम)
    4. एक अद्यतन FASTA फ़ाइल अपलोड करें, जो सार्वजनिक डेटाबेस जैसे UniprotKB से उपलब्ध है।
    5. चुने गए डेटाबेस के स्रोत के अनुसार सही पार्स नियम निर्दिष्ट करें.
    6. प्रोटीन और पेप्टाइड्स दोनों के लिए एक पेरेंटेज झूठी खोज दर (एफडीआर) मान = 1 को परिभाषित करें।
    7. लेबल मुक्त परिमाणीकरण टैब में लेबल मुक्त परिमाणीकरण (LFQ) विकल्प जोड़ें।
    8. न्यूनतम LFQ अनुपात गणना दो पर रखें।
      नोट: यहां, हम क्रमशः प्रोटीन परिमाणीकरण और बाद के सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए मैक्सक्वांट24 और पर्सियस सॉफ्टवेयर25 का उपयोग करके डेटा विश्लेषण का वर्णन करते हैं। हालांकि, डेटा विश्लेषण किसी भी अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध या मुक्त जैव सूचना विज्ञान के साथ किया जा सकता है। एफडीआर का अनुमान लक्ष्य-डिकॉय डेटाबेस-आधारित दृष्टिकोण26 का उपयोग करके लगाया जाता है। 0.01 के बराबर पेप्टाइड और प्रोटीन एफडीआर का मतलब है कि पहचाने गए पेप्टाइड्स और प्रोटीन में 1% झूठे पॉजिटिव होने की उम्मीद है।
  5. सांख्यिकीय विश्लेषण
    1. प्रोटीन स्तर पर सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए प्रोटीन समूह.txt फ़ाइल लोड करें।
    2. LFQ मानों को मुख्य स्तंभ के रूप में परिभाषित करें.
    3. श्रेणीबद्ध स्तंभ के आधार पर पंक्तियों को फ़िल्टर करके "रिवर्स" और "संदूषक" निकालें।
    4. विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों को समूहीकृत करने के लिए श्रेणीबद्ध एनोटेशन पंक्तियों का उपयोग करें।
    5. पहले से निर्धारित प्रत्येक समूह में मान्य मानों की संख्या का चयन करते हुए डेटा मैट्रिक्स को कम करें.
    6. सांख्यिकीय परीक्षण का चयन करें जो प्रयोगात्मक स्थितियों (यानी, टी-टेस्ट, मल्टीपल सैंपल टेस्ट एनोवा) के अनुरूप बेहतर है।
    7. एफडीआर-आधारित गणना के साथ महत्वपूर्ण संकेतों के लिए कट-ऑफ निर्धारित करें। आमतौर पर, 0.01 और 0.05 दोनों को समायोजित पी मान के लिए थ्रेसहोल्ड के रूप में स्वीकार किया जाता है।
    8. ज्वालामुखी प्लॉट प्रतिनिधित्व का उपयोग करके टी-टेस्ट आंकड़ों के आधार पर अंतर विश्लेषण के परिणामों की कल्पना करें।
    9. अंतिम परिणाम तालिका के आगे संपादन के लिए अंतिम मैट्रिक्स को .txt प्रारूप में निर्यात करें।
      नोट: कॉन्फ़िगरेशन फ़ोल्डर में केराटिन जैसे प्रोटीन के साथ एक एफएएसटीए फ़ाइल होती है जिसे वैश्विक प्रोटिओमिक प्रयोगों में सामान्य संदूषक माना जाता है, जिसे आउटपुट तालिका में ए + के साथ ध्वजांकित किया जाता है। वर्तमान अध्ययन में, दो नमूना स्थितियों के साथ, सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक टी-टेस्ट का उपयोग किया जाता है।

11. पश्चिमी धब्बा द्वारा परिणाम सत्यापन

  1. नमूना तैयार करना
    1. आईएन, एफटी और ईएल के प्रत्येक एलिकोट में 4x नमूना लोडिंग बफर की उपयुक्त मात्रा जोड़ें।
    2. 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए नमूने उबालें।
    3. ट्यूबों के शीर्ष से वाष्पित नमूने को पुनर्प्राप्त करने के लिए तेजी से स्पिन।
  2. SDS-PAGE और जेल स्थानांतरण
    1. 4% -12% विकृत पॉलीक्रिलामाइड जेल पर नमूने लोड करें।
    2. 120 वोल्ट पर 1.5 घंटे के लिए बफर चलाने वाले एमईएस एसडीएस के साथ जेल चलाएं।
    3. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, जेल को अर्ध-शुष्क स्थानांतरण कैसेट के साथ नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर स्थानांतरित करें। हम 15 वी पर 10 मिनट स्थानांतरण की सलाह देते हैं।
  3. इम्यूनोडिटेक्शन
    1. धीरे-धीरे आंदोलन करते हुए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 10% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के साथ झिल्ली को अवरुद्ध करें।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, टीबीएसटी में 5% बीएसए में तैयार प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें। कोमल आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर 4 डिग्री सेल्सियस या 1 घंटे के लिए रात भर छोड़ दें।
    3. टीबीएसटी के साथ झिल्ली को तीन बार धोएं, हर बार 5 मिनट के लिए।
    4. आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए टीबीएसटी में तैयार द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ें।
    5. टीबीएसटी के साथ झिल्ली को तीन बार धोएं, हर बार 5 मिनट के लिए।
    6. ब्लॉट इमेजर का उपयोग करके परिणामों की कल्पना करें।
      नोट: टीडीपी -43 का पता लगाने के लिए, हमारे आरएनए के एक ज्ञात बाइंडर, पुनः संयोजक खरगोश मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर झिल्ली के साथ छोड़ दिया गया था। एक द्वितीयक एंटीबॉडी के रूप में, एंटी-खरगोश आईजीजी हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) का उपयोग किया गया था, लेकिन एक फ्लोरोसेंट सेकेंडरी एंटीबॉडी भी काम करेगा। झिल्ली पर एंटीबॉडी की कल्पना करने के लिए, केमीडॉक इमेजिंग सिस्टम के साथ इमेजिंग से पहले, झिल्ली को 1 मिनट के लिए क्लैरिटी वेस्टर्न ईसीएल सब्सट्रेट के साथ इनक्यूबेट किया गया था।

Representative Results

प्रस्तावित प्रोटोकॉल की वैधता को सत्यापित करने के लिए, यहां प्रस्तुत पीडी प्रयोगों को विशेष रूप से टीडीपी -4320 को बांधने के लिए सिलिको में डिज़ाइन किए गए बायोटिनीलेटेड आरएनए एपटामर के साथ किया गया था। यह आरएनए अपने प्रोटीन लक्ष्य को उच्च बाध्यकारी आत्मीयता (केडी = 90 एनएम) 20 के साथ बांधता है। यहां, अनुक्रम 5 '-CGGUGUUGCU-3' के इस आरएनए को "+आरएनए" नाम से संदर्भित किया जाता है। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, +आरएनए के रिवर्स पूरक अनुक्रम, जिसे यहां "-आरएनए" कहा जाता है, का उपयोग किया गया था। इसका अनुक्रम 5'-AGCAACACCG-3' है। -आरएनए टीडीपी -43 (केडी = 1.5 μM)19 के प्रति काफी कम बाध्यकारी संबंध दिखाता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल के उद्देश्य के लिए, इन आरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को एक बायोटिन अणु में संयुग्मित खरीदा गया है, ताकि स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों को बांधने की अनुमति मिल सके। + आरएनए को इसके 3 'अंत में बायोटिन-टीईजी के साथ खरीदा गया था, जिसमें बायोटिन और न्यूक्लिक एसिड के फॉस्फेट समूह के बीच 15-परमाणु ट्राइथाइलीन ग्लाइकॉल स्पेसर शामिल है; -आरएनए के बजाय इसके 5 'अंत में एक बायोटिन था, जो एक एमिनो-सी 6 लिंकर के माध्यम से न्यूक्लिक एसिड से संयुग्मित था। हालांकि, अगर आरएनए चारा का डिज़ाइन मजबूत है, और जब तक लिंकर और आरएनए के बीच कोई संरचनात्मक या रासायनिक हस्तक्षेप नहीं होता है, तब तक बायोटिन संयुग्मन और अन्य लिंकर लंबाई के लिए अन्य पदों को नियोजित किया जा सकता है।

पीडी के बाद +आरएनए जांच से बंधे पाए जाने वाले मुख्य प्रोटीन की पहचान को जानने से मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) और वेस्टर्न ब्लॉट (डब्ल्यूबी) दोनों का उपयोग करके एलुएट में टीडीपी -43 की पहचान करके प्रोटोकॉल के सत्यापन को सक्षम किया गया (चित्रा 1)।

एमएस विश्लेषण या तो +आरएनए या -आरएनए (चित्रा 2) का उपयोग करके किए गए चार पीडी प्रतिकृतियों पर किया गया था। +आरएनए और -आरएनए के इंटरैक्शन की पहचान इस प्रोटोकॉल के दायरे से परे है, हालांकि प्रोटोकॉल की सटीकता को मान्य करने वाले कुछ परिणाम रिपोर्ट किए गए हैं। ध्यान दें, एक ज्वालामुखी भूखंड में महत्वपूर्ण रूप से समृद्ध प्रोटीन की योजना बनाने से पता चला कि कुल प्रोटीन सामग्री और +आरएनए से प्राप्त समृद्ध प्रोटीन -आरएनए (चित्रा 2) से बरामद किए गए प्रोटीन की तुलना में काफी अधिक था। इसका मतलब यह है कि, समान लंबाई और संरचनात्मक सामग्री (रैखिक) होने के बावजूद, + आरएनए विशिष्ट इंटरैक्शन की एक उच्च संख्या स्थापित कर सकता है, जो उच्च नमक के साथ क्षालन चरण तक बनाए रखा जाता है। यह संभावना है कि -आरएनए इसके बजाय गैर-विशिष्ट संपर्कों की एक उच्च संख्या स्थापित करता है जो धोने के चरणों के दौरान बाधित होते हैं। जैसा कि अपेक्षित था, टीडीपी -43 को +आरएनए20 के एक अद्वितीय इंटरैक्टर के रूप में पहचाना गया था; +आरएनए के साथ किए गए चार पीडी प्रतिकृतियों के लिए औसत लेबल-मुक्त परिमाणीकरण (एलएफक्यू) 31.96 ± 0.56 है, जबकि प्रोटीन को -आरएनए के इंटरएक्टर्स के बीच पहचाना नहीं जाता है। इसके अलावा, +आरएनए के सभी अद्वितीय इंटरएक्टर्स में, टीडीपी -43 को सबसे प्रचुर मात्रा में समृद्ध प्रोटीन पाया गया।

प्रोटोकॉल को और मान्य करने के लिए, इन-हाउस एल्गोरिदम कैटरैपिड18,19 का उपयोग कम्प्यूटेशनल रूप से भविष्यवाणी करने के लिए किया गया था कि कौन से अन्य प्रोटीन विशेष रूप से +आरएनए या -आरएनए को बांधेंगे। विशेष रूप से, मानव प्रोटिओम की रचना करने वाले प्रोटीन के साथ +आरएनए और -आरएनए के लिए इंटरैक्शन स्कोर की गणना कैटरैपिड 'इंटरैक्शन प्रवृत्ति' सुविधा का उपयोग करके की गई थी, जैसा कि हमारे पिछले काम27 में परिभाषित किया गया है। उच्च आत्मविश्वास के साथ स्कोर किए गए प्रोटीनों में, HNRNPH3 को चुनिंदा +RNA (+ RNA इंटरैक्शन स्कोर = 1.01; -RNA इंटरैक्शन स्कोर = 0.21) और PCBP2 को विशेष रूप से -RNA (+ आरएनए इंटरैक्शन स्कोर = -0.5; -RNA इंटरैक्शन स्कोर = 0.31) के साथ बातचीत करने के लिए बांधने की भविष्यवाणी की गई थी (चित्रा 3A)। इसके अलावा, प्रोटीन आरबीएम 41 को आरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (+ आरएनए इंटरैक्शन स्कोर = 0.4; -आरएनए इंटरैक्शन स्कोर = 0.39) (चित्रा 3 ए) दोनों के लिए नकली होने की भविष्यवाणी की गई थी। एमएस विश्लेषण ने वास्तव में क्रमशः +आरएनए और -आरएनए के पीडी में एचएनआरएनपीएच 3 और पीसीबीपी 2 की उपस्थिति की पुष्टि की, जबकि आरबीएम 41 को दोनों के साथ बातचीत करते हुए पाया गया (चित्रा 3 बी)।

डब्ल्यूबी का उपयोग परिणामों की पुष्टि करने और प्रोटोकॉल अनुकूलन (चित्रा 4) के दौरान टीडीपी -43 की उपस्थिति का पता लगाने के लिए किया गया था। यहां वर्णित प्रक्रिया में, विभिन्न चरणों में अलग-अलग नमूने एकत्र किए गए थे। इनपुट नमूना (आईएन) में लाइसिस बफर में पतला कुल प्रोटीन शामिल था। फ्लोथ्रू (एफटी) को बायोटिनीलेटेड आरएनए के साथ पूर्व-लेपित स्ट्रेप्टाविडिन बीड्स के साथ कुल प्रोटीन के रात भर के इनक्यूबेशन के बाद प्राप्त किया गया था, जो प्रोटीन के अंश का प्रतिनिधित्व करता है जो आरएनए को बांधता नहीं है। अंत में, एलुएट (ईएल) में सभी प्रोटीन शामिल थे जो विशेष रूप से जांच के तहत आरएनए को पहचानते थे, क्योंकि एफटी और ईएल चरणों के बीच 150 एमएम नमक और 0.1% ट्राइटन-एक्स के साथ तीन धोने के चरणों को सबसे कमजोर इंटरैक्शन को हटा देना चाहिए था।

प्रत्येक प्रतिकृति के लिए, आईएन, एफटी और ईएल की समान मात्रा (5% वी / वी) को एसडीएस-पेज पर समानांतर में चलाया गया था और एंटी-टीडीपी -43 एंटीबॉडी (चित्रा 4) के साथ दाग दिया गया था। +आरएनए के मामले में, टीडीपी -43 का बैंड आईएन और ईएल में देखा गया था, यह दर्शाता है कि कुल प्रोटीन अर्क में शुरुआत से मौजूद प्रोटीन को धोने के चरणों के दौरान + आरएनए द्वारा बनाए रखा जाता है और केवल उच्च नमक बफर के साथ अंत में रखा जाता है। टीडीपी -43 -आरएनए के लिए आईएन में भी मौजूद था, हालांकि प्रोटीन के अनुरूप बैंड एफटी में भी दिखाई देता है, यह दर्शाता है कि यह आरएनए टीडीपी -43 को बांधता नहीं है। ईएल में टीडीपी -43 बैंड की अनुपस्थिति इस परिणाम की पुष्टि करती है।

प्रोटोकॉल के अनुकूलन के दौरान, विशेष रूप से आरएनए अनुक्रमों से बंधे प्रोटीन के क्षालन की जांच 1 एम एनएसीएल (ईबी 1) युक्त एक क्षालन बफर के साथ और 2 एम एनएसीएल (ईबी 2) के साथ पूर्ण क्षालन बफर के साथ की गई थी (चित्रा 4)। ईबी के साथ प्राप्त इल्यूएट्स की तुलना एसडीएस-पेज पर की गई और एंटी-टीडीपी -43 एंटीबॉडी के साथ धब्बा लगाया गया। प्राप्त छवियों का विश्लेषण इमेजजे28 के साथ किया गया था ताकि दो बफर के साथ टीडीपी -43 राशि में किसी भी अंतर को निर्धारित किया जा सके। कुल मिलाकर, कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया था, और हमने निष्कर्ष निकाला कि, इन परखों के भीतर, 1 एम नमक सबसे मजबूत प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन को बाधित करने के लिए पर्याप्त है।

कुल मिलाकर, एमएस और डब्ल्यूबी के लिए यहां रिपोर्ट किए गए परिणाम दर्शाते हैं कि यह प्रोटोकॉल किसी दिए गए आरएनए के प्रोटीन इंटरएक्टर्स को एक विशिष्ट तरीके से पकड़ने में कुशल है, और यह डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के साथ संगत बफर में क्षालन को सक्षम बनाता है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रस्तावित प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली प्रयोगात्मक पाइपलाइन का स्केच । (ए) बायोटिनीलेटेड आरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड को उचित एकाग्रता पर लाइसिस बफर में तैयार किया जाता है। (बी) चुंबकीय स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों को धोया जाता है, खमीर टीआरएनए के साथ अवरुद्ध किया जाता है, और बायोटिनीलेटेड आरएनए के साथ लोड किया जाता है। (सी) सुसंस्कृत स्तनधारी सेल लाइनों से प्राप्त कुल प्रोटीन अर्क को मोती-आरएनए मिश्रण में जोड़ा जाता है। (डी) निरर्थक इंटरैक्शन को हटाने के लिए कई वॉश किए जाते हैं। (ई) विशिष्ट प्रोटीन इंटरएक्टर्स को हाइपरटोनिक समाधान के साथ आरएनए से अलग किया जाता है। (एफ) इंटरएक्टर्स की पहचान मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रकट की जाती है, और विशिष्ट मामलों को पश्चिमी धब्बा द्वारा मान्य किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: लेबल-मुक्त एमएस-आधारित प्रोटीन परिमाणीकरण के लिए विश्लेषणात्मक रणनीति । (ए) ल्यूटेड प्रोटीन को रात भर ठंडे एसीटोन में अवक्षेपित किया जाता है। प्रोटीन को तब विकृत किया जाता है, और एक इन-सॉल्यूशन पाचन किया जाता है। प्रोटियोलिटिक पेप्टाइड्स केंद्रित और अलवणीकृत होते हैं। (बी) पेप्टाइड्स का विश्लेषण "शॉटगन दृष्टिकोण" का उपयोग करके एलसी-एमएस / एमएस के माध्यम से किया जाता है। (सी) कच्चे डेटा प्रसंस्करण और विश्लेषण क्रमशः मैक्सक्वांट और पर्सियस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया जाता है। (डी) एक ज्वालामुखी भूखंड में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण समृद्ध प्रोटीन प्रदर्शित होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: अनुमानित इंटरैक्शन प्रेसिटीज और प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित इंटरैक्शन +आरएनए और -आरएनए के बीच सहसंबंध। (ए) एचएनआरएनपीएच 3, पीसीबीपी 2, और आरबीएम 41 के सापेक्ष कैटरैपिड इंटरैक्शन स्कोर, +आरएनए के लिए एचएनआरएनपीएच 3 और -आरएनए के लिए पीसीबीपी 2 के अधिमान्य बंधन को दर्शाता है, जबकि आरबीएम 41 को दोनों आरएनए अनुक्रमों को अंधाधुंध रूप से बांधने की भविष्यवाणी की गई है। (बी) लेबल-मुक्त परिमाणीकरण औसत +आरएनए और -आरएनए के साथ किए गए पुल-डाउन से मास-स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जाता है। विश्लेषण पुष्टि करता है कि HNRNPH3 केवल +RNA को बांधता है, PCBP2 केवल -RNA को बांधता है, और RBM41 दोनों को समान रूप से बांधता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: चुने हुए आरएनए अनुक्रमों के इंटरएक्टर्स के बीच टीडीपी -43 की उपस्थिति / अनुपस्थिति का पश्चिमी धब्बा सत्यापन। डब्ल्यूबी झिल्ली का इलाज एंटी-टीडीपी -43 एंटीबॉडी के साथ किया गया है। IN = इनपुट; एफटी = प्रवाह-थ्रू; ईएल (ईबी 1) = क्षालन बफर 1 के साथ क्षालन; ईएल (ईबी 2) = क्षालन बफर 2 के साथ क्षालन; संकेत "+" +आरएनए के साथ किए गए पुल-डाउन से प्राप्त नमूनों को इंगित करता है; संकेत "-" -आरएनए के साथ किए गए पुल-डाउन से प्राप्त नमूनों को इंगित करता है; लेन 1 में एक प्रोटीन सीढ़ी होती है। टीडीपी -43 को एक तीर द्वारा इंगित किया गया है। डब्ल्यूबी इंगित करता है कि टीडीपी -43 + आरएनए इंटरएक्टर्स के बीच पाया जाता है, लेकिन -आरएनए इंटरएक्टर्स के बीच नहीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

बफर का नाम संयोजन
10x Tranfer बफर बफर 250 एमएम ट्रिस, 1.92 एम ग्लाइसिन, 1% एसडीएस, 20% मेथनॉल। पूर्व उपयोग में 10 गुना पतला करें पीडी
20X MES SDS चल रहा बफर 1 एम एमईएस, 1 एम ट्रिस, 2% एसडीएस, 20 एमएम ईडीटीए। पीएच को 7.3 पर समायोजित करें। पूर्व उपयोग में 20 गुना पतला करें
4x नमूना लोडिंग बफर 0.25 एम ट्रिस बेस, 0.28 एम एसडीएस, 40% ग्लिसरॉल, 20% 2-मर्कैप्टो-इथेनॉल, 4 मिलीग्राम /
क्षालन बफर 1 20 mM फॉस्फेट pH 7.5, 1 M NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 1 mM DTT (परिमाणीकरण के बाद जोड़ा जाना है)
क्षालन बफर 2 20 mM फॉस्फेट pH 7.5, 2 M NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 1 mM DTT (परिमाणीकरण के बाद जोड़ा जाना है)
लाइसिस बफर। 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.1% ट्राइटन X-100, 1 mM DTT और प्रोटीज इनहिबिटर
ट्वीन-20 के साथ ट्राइस-बफर्ड खारा 1 M Tris-HCl pH 7.4, 3 M NaCl, 2.0% ट्वीन-20
वॉश बफर 1 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.1% ट्राइटन TM X-100, 1 mM DTT और प्रोटीज इनहिबिटर
बफर 2 धोएं 25 mM Hepes pH 8, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.1% ट्राइटन X-100, 1 mM DTT और प्रोटीज इनहिबिटर
बफर ए 0.1% फॉर्मिक एसिड सुश्री
बफर बी 60% एसिटोनिट्राइल, 0.1% फॉर्मिक एसिड
विकृतीकरण बफर 8 एम यूरिया, 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल

तालिका 1: पीडी और एमएस बफर। पुल-डाउन प्रयोगों (पीडी) या मास-स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण (एमएस) के लिए उपयोग किए जाने वाले बफर के नाम और संरचना।

Discussion

यह काम उनके प्रोटीन इंटरएक्टर्स को पकड़ने के लिए बायोटिनीलेटेड आरएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ किए गए पीडी प्रोटोकॉल के अनुकूलन की रिपोर्ट करता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए सरल है, कम सामग्री की आवश्यकता होती है, और अत्यधिक विश्वसनीय परिणाम उत्पन्न करता है। महत्वपूर्ण रूप से, इस प्रोटोकॉल के सबसे नवीन पहलुओं में सिलिको में पूरी तरह से डिज़ाइन किए गए और प्रोटीन लक्ष्य के लिए विशिष्ट आरएनए चारा का उपयोग शामिल है, और डिटर्जेंट और उच्च तापमान उपचार के साथ बायोटिन से स्ट्रेप्टाविडिन को अलग करने के बजाय, उच्च नमक समाधान के साथ उनकी बातचीत को सीधे बाधित करके आरएनए चारा से बंधे सभी प्रोटीनों का क्षालन शामिल है।

यह प्रोटोकॉल बायोटिन और स्ट्रेप्टाविडिन29,30 के बीच बंधन की ताकत का लाभ उठाता है। चुने हुए स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों के अनुसार, आगे बढ़ने से पहले बायोटिनीलेटेड आरएनए की लोडिंग का परीक्षण और मात्रा निर्धारित की जानी चाहिए। इसके अलावा, आरएनए त्रि-आयामी तह मोतियों पर लोडिंग दक्षता को प्रभावित कर सकती है, क्योंकि यह स्ट्रेप्टाविडिन के लिए बायोटिन के जोखिम को सीमित कर सकती है। गैर-बायोटिनीलेटेड टीआरएनए के साथ मोतियों को अवरुद्ध करने से मोतियों के साथ निरर्थक बातचीत को सीमित करके परिणामों की स्वच्छता में सुधार होता है। डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के आधार पर लोडिंग बफर और क्षालन बफर को चुना जाना चाहिए। यहां, बहुत हल्की स्थितियां, अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त और संभावित प्रोटीन परिसरों को संरक्षित करने के लिए विकसित, प्रस्तावित की गई थीं। हालांकि यह विधि अत्यधिक अनुकूलनीय है; उपयोगकर्ता किसी भी सेल लाइन और किसी भी आरएनए आकार का चयन कर सकता है, और बाध्यकारी गुणों पर संरचना के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए आरएनए के फोल्ड / प्रकट होने के बाद प्रोटोकॉल को दोहराने का निर्णय ले सकता है।

इस प्रोटोकॉल का एक अन्य मूलपहलू परिणामों की शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए सिलिको भविष्यवाणी उपकरणों में उपयोग है। पहले से जानना कि किन प्रोटीनों को रुचि के आरएनए के इंटरएक्टर्स के रूप में पहचाना जाना चाहिए, प्रोटोकॉल के तकनीकी पहलुओं को मान्य करने का अभूतपूर्व लाभ देता है। उदाहरण के लिए, एक साधारण डब्ल्यूबी विश्लेषण का उपयोग करके, एमएस विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने से पहले प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों से प्राप्त नमूनों में एक ज्ञात प्रोटीन लक्ष्य की उपस्थिति को सत्यापित करना संभव है, जिसके लिए विशेष उपकरण की आवश्यकता होती है और यह अधिक महंगा है। इसके अलावा, एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए विशिष्ट नए आरएनए को डिजाइन करने के लिए कैटरैपिड20, एक इन-हाउस प्रोटीन-आरएनए भविष्यवाणी एल्गोरिदम का उपयोग करने की एक विधि हाल ही में रिपोर्ट की गई थी। कुछ समय पहले तक, एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए डीएनए / आरएनए एपटामर डिजाइन करने के लिए एकमात्र उपलब्ध पाइपलाइन एसईएलईएक्स (घातीय संवर्धन द्वारा लिगेंड का व्यवस्थित विकास) दृष्टिकोण31 था। इन सिलिको विधि आरएनए एपटामर के बहुत तेज और लागत प्रभावी डिजाइन के लिए सक्षम बनाती है।

इस पद्धति की मुख्य सीमाएं न्यूक्लियस-मुक्त बफर और उपकरणों में काम करने की आवश्यकता से जुड़ी हैं। इसके अलावा, यदि इन विट्रो में एक डे नोवो-डिज़ाइन किए गए आरएनए और एक लक्ष्य प्रोटीन पूर्व पीडी के बीच बंधन की पुष्टि करना आवश्यक माना जाता है, तो प्रोटीन का उत्पादन और शुद्ध करने और बायोफिज़िकल दृष्टिकोण के साथ बंधन निर्धारित करने की आवश्यकता होती है। यह एक सीमा है जो मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के उत्पादन के साथ साझा की जाती है।

इन मामूली मुद्दों के बावजूद, आरएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन को मैप करने के विश्वसनीय तरीके, जैसे कि यहां प्रस्तुत किया गया है, वैज्ञानिकों को मैक्रोमोलेक्यूलर नेटवर्क और कई शारीरिक और रोग तंत्र के जटिल मुख्य अभिनेताओं का अनावरण करने के करीब ला सकता है, जैसे कि कैंसर, कार्डियोमायोपैथी, मधुमेह, माइक्रोबियल संक्रमण और आनुवंशिक और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों में शामिल।

Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या हितों का अन्य टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक प्रोफेसर टार्टाग्लिया और डॉ कुओमो के शोध समूह को समर्थन की पेशकश के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। ईजेड को मैरी स्क्लोडोव्स्का-क्यूरी अनुदान समझौते संख्या 754490 के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम के माइंडेड फैलोशिप से धन प्राप्त हुआ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well tissue culture plates  VWR 10861-554 CELLS
Cell scrapers BIOSIGMA  10153 CELLS
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium  (DMEM) Thermo Fisher Scientfic 11995065 CELLS
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil Thermo Fisher Scientfic 10500064 CELLS
Phosphate Buffer Saline (PBS, Waltham, MA) Thermo Fisher Scientfic 14190169 CELLS
Trypsin (0.25%), phenol red Thermo Fisher Scientfic 15050065 CELLS
Anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HRP) Cellsignal 7070 PD
Biotinylated RNA Eurofins Custom RNA oligonucleotides PD
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9418 PD
Clarity Western ECL Substrate, 500 ml Biorad 1705061 PD
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Merck - Sigma Aldrich 5056489001 PD
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well Invitrogen NP0321BOX PD
Recombinant anti-TDP43 antibody Abcam ab109535 PD
Ribonucleic acid, transfer from baker's yeast (S. cerevisiae) Merck - Sigma Aldrich R5636-1ML PD
Streptavidin Mag Sepharose Merck - Sigma Aldrich GE28-9857-99 PD
Trans-Blot Turbo RTA Mini 0.2 µm PVDF Transfer Kit Biorad 1704272 PD
Acetone Thermo Fisher Scientfic 022928.K2 MS
C18 cartridge Thermo Fisher Scientfic 13-110-018 MS
Dithiothreitol  (DTT) Thermo Fisher Scientfic 20290 MS
EASY-Spray HPLC Columns Thermo Scientific ES902 MS
iodoacetamide (IAA)  Sigma Aldrich S.r.l. I6125 MS
Lys-C/Trypsin Promega V5073 MS
Trifluoroacetic acid (TFA) Thermo Fisher Scientfic 28904 MS
Urea Thermo Fisher Scientfic J75826.A7 MS
Equipment
ChemiDoc imaging system Bio-Rad CELLS
Dyna Mag -2 , Magnetic rack Invitrogen CELLS
Forma Series 3 water jacketed C02 incubator Thermo Scientific PD
PROTEAN II xi cell , power supply for PAGE applications Bio-Rad PD
Rotating wheel, rotator SB3 Stuart PD
Water bath set at 37 °C VWR PD
XCell SureLock Mini-Cell electrophoresis system ThermoFisher Scientific MS
Easy-nLC 1200 UHPLC Thermo Scientific MS
Q exactive Mass Spectrometer Thermo Scientific MS
Software Version
MaxQuant 2.0.3.0 MS
Perseus 1.6.14.0 MS

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References

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इस महीने जोव अंक 192 में आरएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन प्रोटीन पुल-डाउन आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन (आरबीपी) बायोटिनीलेटेड आरएनए आरएनए एपटामर।
लघु बायोटिनीलेटेड आरएनए का उपयोग करके आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन का एक अनुकूलित मात्रात्मक पुल-डाउन विश्लेषण
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Crua Asensio, N., Rizzieri, S., Cuomo, A., Tartaglia, G. G., Zacco, E. An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA. J. Vis. Exp. (192), e64923, doi:10.3791/64923 (2023).

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