Summary
Her presenterer vi en optimalisert in vitro-metode for å avdekke, kvantifisere og validere proteininteraktorer av spesifikke RNA-sekvenser, ved bruk av totalt proteinekstrakt fra humane celler, streptapavidinperler belagt med biotinylert RNA og massespektrometrianalyse.
Abstract
Protein-RNA-interaksjoner regulerer genuttrykk og cellulære funksjoner på transkripsjons- og posttranskripsjonsnivåer. Av denne grunn er det fortsatt av stor betydning å identifisere bindingspartnerne til et RNA av interesse for å avdekke mekanismene bak mange cellulære prosesser. Imidlertid kan RNA-molekyler interagere forbigående og dynamisk med noen RNA-bindende proteiner (RBP), spesielt med ikke-kanoniske. Derfor er det stort behov for forbedrede metoder for å isolere og identifisere slike RBP-er.
For å identifisere proteinpartnerne til en kjent RNA-sekvens effektivt og kvantitativt, utviklet vi en metode basert på nedtrekk og karakterisering av alle samvirkende proteiner, med utgangspunkt i cellulært totalproteinekstrakt. Vi optimaliserte proteintrekkingen ved hjelp av biotinylert RNA forhåndslastet på streptapavidinbelagte perler. Som et bevis på konseptet benyttet vi en kort RNA-sekvens kjent for å binde det nevrodegenerasjonsassosierte proteinet TDP-43 og en negativ kontroll av en annen nukleotidsammensetning, men samme lengde. Etter å ha blokkert kulene med gjær-tRNA, lastet vi de biotinylerte RNA-sekvensene på streptavidin-kulene og inkuberte dem med det totale proteinekstraktet fra HEK 293T-celler. Etter inkubering og flere vasketrinn for å fjerne uspesifikke bindemidler, eluerte vi de vekselvirkende proteinene med en saltoppløsning, kompatibel med de mest brukte proteinkvantifiseringsreagensene og med prøvepreparering for massespektrometri. Vi kvantifiserte anrikningen av TDP-43 i nedtrekket utført med det kjente RNA-bindemiddelet sammenlignet med den negative kontrollen ved massespektrometri. Vi brukte samme teknikk for å verifisere selektive interaksjoner av andre proteiner beregningsmessig spådd å være unike bindemidler av vårt RNA av interesse eller kontroll. Til slutt validerte vi protokollen ved western blot via påvisning av TDP-43 med et passende antistoff.
Denne protokollen vil tillate studier av proteinpartnerne til et RNA av interesse for nær-fysiologiske forhold, og bidra til å avdekke unike og uforutsette protein-RNA-interaksjoner.
Introduction
RNA-bindende proteiner (RBP) har dukket opp som viktige aktører i transkripsjonell og posttranskripsjonell genregulering, siden de er involvert i prosesser som mRNA-skjøting, RNA-cellulær lokalisering, oversettelse, modifikasjon og nedbrytning 1,2,3. Slike interaksjoner mellom de to makromolekylene er svært koordinerte, nøyaktig balanserte og essensielle for dannelsen av funksjonelle og prosesseringsnav. Variasjoner eller dysreguleringer innenfor disse knutepunktene har potensial til å forstyrre de finregulerte protein-RNA-nettverkene og er i økende grad forbundet med en rekke menneskelige sykdommer, inkludert kreft 4,5 og nevrodegenerative lidelser 6,7,8. Samspillet mellom RNA-molekyler og deres proteinbindende partnere kan enten være stabile og enkle å validere eksperimentelt, eller svært dynamisk, forbigående og vanskeligere å karakterisere.
De siste årene har det blitt gjort et intensivt arbeid for å forstå disse interaksjonene. Blant de mest etablerte metodene er proteinnedtrekksanalyser (PD) sannsynligvis de mest verdsatte og brukte tilnærmingene for å avdekke hovedaktørene som utgjør ribonukleoprotein (RNP) komplekser og andre protein-RNA-interaksjonsnettverk 3,9,10. PD inkluderer en bred paraply av informative teknikker, for eksempel immunutfelling av enten RNA (RIP) 11,12 eller proteinet (CLIP) 13,14 av interesse. Noen av disse RNA-PD-protokollene bruker et kjent RNA som agn for proteiner15, oftest ved å dra nytte av høye affinitetsmerker som biotin. I dette tilfellet kan interaksjonspartnerne til et biotinylert RNA detekteres ved å forankre RNA på streptapavidinbelagte perler, noe som muliggjør effektiv isolering av RNP-ene. Hovedbegrensningene i disse tilnærmingene er vanligvis utformingen av de biotinylerte probene og testingen av deres evne til å binde målproteiner. For dette formålet kan det være nyttig å stole på publiserte CLIP-data av proteinet av interesse, hvis tilgjengelig, siden de med høy presisjon avslører de korte RNA-regionene som tilsvarer topper av interaksjoner med målproteinet13,16. De samme regionene kan brukes til å utvikle sonder for PD. En alternativ metode for å designe slike RNA-agn kan være den systematiske utviklingen av ligander ved eksponentiell berikelse (SELEX)17, som muliggjør design av aptamere gjennom in vitro-seleksjon, med utgangspunkt i et omfattende randomisert bibliotek og via en serie PCR-drevne optimaliseringssykluser. SELEX er imidlertid kompleks og tidkrevende, og de endelige resultatene er svært avhengige av det opprinnelige biblioteket. For å velge RNA-agnet som skulle brukes i protokollen som presenteres her, ble enda en tilnærming utnyttet, bestående av å bruke et RNA-agn designet de novo ved hjelp av beregningskraften til algoritmen catRAPID, som forutsier den foretrukne bindingen av et gitt protein mot visse RNA-sekvenser18,19,20.
Protokollen introdusert her er en versjon av en RNA-PD optimalisert for å eluere spesifikke proteinpartnere i nær fysiologiske forhold, uten bruk av vaskemiddel, denatureringsmidler eller høye temperaturer. Den er avhengig av nano-superparamagnetiske perler kovalent belagt med høyt renset streptavidin og bruk av et spesifikt silico-designet biotinylert RNA som agn. Denne protokollen gir en rask og effektiv metode for å isolere bindingspartnerne til biotinylerte RNA-molekyler under opprinnelige forhold, og gir potensialet for et bredt spekter av nedstrøms applikasjoner. For å teste denne protokollen ble en 10-nukleotid enkeltstrenget RNA-aptamersekvens, tidligere designet for å binde proteinet TAR DNA-bindende protein 43 (TDP-43) med høy affinitet og spesifisitet, brukt20. Med utgangspunkt i HEK 293T-cellelysater ble interaktorene til den biotinylerte RNA-aptameren identifisert ved hjelp av massespektrometrianalyse utført på prøver løsrevet fra RNA-agn ved hjelp av en hypertonisk buffer. Denne analysen bekreftet vellykket identifisering og kvantifisering av TDP-43 som foretrukket bindemiddel.
Denne protokollen muliggjør vellykket identifisering av proteininteraktorer ved bruk av bare et kort, in vitro-syntetisert RNA-oligonukleotid. Videre garanterer bruken av in silico designet RNA aptamers som PD-sonder21,22 spesifisitet for målene til betydelig reduserte kostnader.
Protocol
1. Generelle metoder og materiale
- Klargjør riktig medium for den valgte cellekulturen av pattedyr og forvarm den ved 37 °C i 20 minutter før bruk.
- Forbered det nødvendige materialet på forhånd, som beskrevet i materialfortegnelsen. Autoklavglass, plastikk og bufferlagre.
- Klargjør bufferne som beskrevet i tabell 1. Juster pH-verdien i stamløsningene ved hjelp av konsentrert HCl eller NaOH før du fortynner komponentene til de endelige volumene.
2. Forberedelse av pattedyrcellelinje
- Dyrk HEK 293T-celler i Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) supplert med 10% føtal bovint serum (FBS) og 100 μg / ml penicillin / streptomycinløsning. Inkuber dem ved 37 °C i en fuktet inkubator forsynt med 5% CO2. Del cellene rutinemessig.
- Før du løsner, skyll cellene med nok fosfatbufret saltoppløsning (PBS) for å dekke vekstoverflaten.
- Fjern PBS og legg til et ultratynt lag med trypsin-EDTA-løsning.
- Inkuber cellene ved 37 °C i en fuktet inkubator forsynt med 5% CO2 i 5 minutter, eller til cellene er løsrevet (de skal se spredt ut under mikroskopisk observasjon).
- Fortynn trypsin-EDTA-løsningen ti ganger ved å legge til komplett DMEM for å inaktivere den og telle cellene.
- Plate 1,5 x 105 celler/ml i 6-brønnsplater, vurderer to brønner/tilstand som skal testes.
- Inkuber cellene ved 37 °C i 48 timer i en fuktet inkubator med 5 % CO2.
MERK: Sjekk produsentens instruksjoner for typen medium og supplement apt for cellelinjen. Også mengden og inkubasjonstiden for trypsin-EDTA avhenger av cellelinjen. Noen celletyper vokser raskere/langsommere enn det som ble rapportert i denne protokollen; Dermed bør såkonsentrasjonen testes på forhånd.
3. Total proteinhøst
- Fjern medium fra brønnene der cellene vokser.
- Vask hver brønn på 6-brønnsplatene med 1 ml PBS.
- Kast PBS.
- Flytt platene på is og fortsett enten med trinn 3.5 eller frys de tørre platene ved -80 °C for å lette lyseringen.
- Legg til 200 μL lysisbuffer til hver brønn.
- Bruk en celleskraper til å løsne og bryte cellene.
- Overfør celleekstraktet fra to brønner til samme 1,5 ml rør.
- Legg tuben med proteinekstraktet på is i 30 minutter.
- Sentrifuger cellelysatene ved 17 000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
- Overfør hver supernatant til et forkjølt rør.
MERK: Totalt 10 6-10 7 celler for hver PD-tilstand anbefales. Cellelyse og proteinhøsting bør utføres med iskalde buffere. Proteasehemmere bør legges til lysisbufferen for å forhindre proteinnedbrytning.
4. Bestemmelse av proteinkonsentrasjon
- Forbered Bradford-reagens, som angitt av produsenten, ved å fortynne den fem ganger i dH2O.
- Fordel 1 ml reagens i en 1 cm kuvette, tilsett 1 μL av prøven og bland ved inversjon.
- Inkuber i mørket ved romtemperatur i 5-10 min.
- Les av absorbansen ved 595 nm.
- Beregn volumet av proteinekstrakt tilsvarende 1,5 mg proteiner og bring alle prøvene til et endelig volum på 600 μL ved hjelp av lysisbuffer.
- Oppbevar prøvene på is til bruk.
MERK: Enhver annen metode for bestemmelse av proteinkonsentrasjon kan brukes, i henhold til anbefalinger for bufferkompatibilitet. I alle fall bør lysisbufferen brukes som et tomt. Mange reagenser er ikke kompatible med dithiothreitol (DTT). Det anbefales å legge til DTT eller andre reduksjonsmidler først etter proteinkvantifisering (DTT til en endelig konsentrasjon på 1 mM).
5. Perle forberedelse
- Bland perlene i lagringsbufferen ved å bla i røret.
- Beregn 100 μL slammedium / prøve og plasser volumet i et magnetstativ.
- Perle vask
- Fjern lagringsoppløsningen og vask perlene ved å tilsette 1 ml lysisbuffer/-rør og snu den manuelt.
- Fjern bufferen ved hjelp av magnetstativet.
- Gjenta vasketrinnet.
- Legg til et volum lysisbuffer som tilsvarer det opprinnelige volumet av slurrymedium, bland ved å flikke røret, og dispenser mediet jevnt i så mange 1,5 ml rør som det er prøver.
- Perle blokkering
- Fjern bufferen ved hjelp av magnetstativet og tilsett 600 μL av en 0,25 mg / ml løsning av gjær-tRNA fremstilt i lysisbuffer.
- Inkuber i 1 time ved romtemperatur på et roterende hjul.
- Fjern tRNA-løsningen ved hjelp av magnetstativet.
- Tilsett 600 μL lysisbuffer og vask ved å blande manuelt.
- Gjenta vasketrinnet og kast bufferen.
6. Perle lasting
- Forbered 200 μg RNA-oligonukleotid i 600 μL lysisbuffer for hvert rør som inneholder det første 100 μL oppslemmingsmediet (nå blokkerte perler).
- Tilsett oligo i perlene og inkuber i 1 time ved romtemperatur mens du roterer.
- Fjern løsningen, tilsett 600 μL lysisbuffer, og vask perlene to ganger ved å rotere rørene i 5 minutter ved romtemperatur.
- Kast bufferen.
MERK: Virv aldri perlene, men flikk i stedet. Begrens antall pipetteringstrinn, med mindre det er nødvendig. Når det er mulig, bruk kutte, 1 ml tips. Mengden dråpeslammedium/prøve avhenger av bindingsevnen til kulene og startmengden av de totale proteinene. Hvis RNA oligo antas å ha en betydelig mengde sekundær struktur, anbefaler vi først å denaturere den ved 80 °C i 10 minutter og deretter avkjøle den sakte ved romtemperatur eller remodifisere den ved 30 °C i 1 time. Det foreslås å gjenopprette RNA-oligo etter perlebelastning og bestemme konsentrasjonen som er igjen, for å optimalisere mengden som kreves for lasting og for å evaluere muligheten for gjenbruk av RNA.
7. Proteinbinding på perler
MERK: Fra nå av, når det er mulig, utfør trinnene ved 4 °C.
- Ta et 5% volum fra 600 μL proteinoppløsningen og hold det som INPUT (IN) for videre analyse (1,5 mg proteiner oppløses i 600 μL, så 5% tilsvarer 30 μL og 75 μg proteiner).
- Tilsett den gjenværende proteinblandingen til hver tube med lastede perler og la den rotere sakte over natten ved 4 °C.
8. Vask av uspesifikke bindemidler
- Fjern den ubundne fraksjonen ved hjelp av magnetstativet. Spar 5 % av volumet og merk det som FLOWTHROUGH (FT) (det ubundne volumet er ca. 600 μL, så behold igjen 30 μL for videre analyse).
- Tilsett 1 ml vaskebuffer 1 i kulene og la den rotere i 5 minutter ved 4 °C.
- Kast bufferen.
- Gjenta trinn 8.2 og 8.3.
- Tilsett 1 ml vaskebuffer 2 i kulene og la den rotere i 5 minutter ved 4 °C.
- Kast supernatanten.
9. Eluering av spesifikke bindemidler
- Tilsett 100 μL elueringsbuffer 1 eller elueringsbuffer 2 til perlene.
- Bland manuelt ved å bla og ruge i 5 min ved romtemperatur.
- Legg tubene i en thermomixer og rist kraftig i 5 minutter ved 95 °C.
- Plasser røret i magnetstativet og samle den eluerte fraksjonen i et rent rør.
- Spinn perlene raskt med en benksentrifuge for å maksimere utvinningen av eluatet.
- Spar 5 % av det totale ELUAT-volumet (EL) til videre analyser (totalvolumet er 100 μL, så separer 5 μL i et annet rør).
- Ved behov kan proteinkonsentrasjonen bestemmes som i avsnitt 4 ved å bruke elueringsbuffer som blank.
MERK: Det anbefales å avstå fra å tilsette DTT til elueringsbufferen før proteinkonsentrasjonen er bestemt. Hvis proteinkvantifisering ikke er nødvendig, eller hvis reduksjonsmiddelkompatible proteinkvantifiseringssett er tilgjengelige, kan 1 mM DTT legges til elueringsbufferen fra starten. I denne protokollen ble både elueringsbuffer 1 (inneholdende 1 M NaCl) og elueringsbuffer 2 (med 2 M NaCl) testet. Ingen forskjell i elueringseffektiviteten til målproteinet ble observert med økt ionstyrke, men det anbefales å teste begge forholdene før den mest hensiktsmessige bufferen etableres. Hvis en høy tilstedeværelse av salt i elueringsbufferen representerer en begrensning for videre analyse, tillater den svært lave mengden vaskemidler i elueringsbufferen bufferutveksling. Som et alternativ kan eluatet fortynnes for å nå ønsket saltkonsentrasjon.
10. Identifisering av proteinbindemidler ved massespektrometri
- Aceton nedbør
- Konsentrer de eluerte proteinene ved å fortynne det fire ganger i kald (-20 ° C) aceton.
- Virvel og inkuber røret ved -20 °C over natten.
- Spinn ved 17 000 x g i 30 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten forsiktig og la acetonen fordampe til pelleten har tørket helt.
- Proteinfordøyelse i løsningen
- Løs opp proteinpelleten ved å tilsette 50 μL denatureringsbuffer.
- Tilsett DTT til en endelig konsentrasjon på 5 mM, noe som tillater proteinreduksjon i 30 minutter ved 55 °C.
- Avkjøl prøvene ved romtemperatur og fortsett med proteinalkyleringsreaksjonen, tilsett iodoacetamid (IAA) i en konsentrasjon på 10 mM i 15 minutter.
- Fordøy proteinene med et egnet enzym (trypsin, LysC) og inkuber prøvene over natten ved 37 °C.
- Stopp fordøyelsen ved å tilsette 1 μL 10% trifluoreddiksyre (TFA).
- Rydd opp og konsentrer peptidene på en tilpasset omvendt fase C18 mikrokolonne, som tidligere beskrevet19.
- Elute peptider fra C18-spissen med buffer B.
- Fjern den organiske komponenten ved hjelp av en vakuumsentrifuge og resuspender peptidene i 5 μL 0,1% maursyre for videre analyse.
MERK: Alternativt kan proteinfordøyelse utføres "på perler" umiddelbart etter vask av uspesifikke bindemidler (trinn 8.1-8.6), og dermed gjøre protokollen raskere. Det anbefales imidlertid å teste effektiviteten til enzymet som arbeider "på perler" immobiliserte proteiner sammenlignet med standard i løsningsfordøyelse, for å garantere optimal eksperimentell proteinsekvensdekning.
- Væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS)
- Plugg inn den analytiske kolonnen (C18-stasjonær fase) og hold den ved 45 °C i løpet av løpetiden.
- Koble kolonnen til utløpet til en seks-port rotasjonsventil på LC-pumpen gjennom en kapillærfingertett montering (20 μm x 550 mm) i en enkeltkolonnekonfigurasjon.
- Juster LC-innstillingene som følger:
- Legg peptidene under kontrollert trykk (980 bar) i buffer A.
- Bruk en buffergradient på 5 %-20 % B-gradient ved 300 nL/min over 59 min, etterfulgt av en buffergradient på 20–30 % over 15 minutter og en 30–65 % buffergradient over 5 min.
- Legg til et vasketrinn ved å øke konsentrasjonen av buffer B opp til 95 % over 5 minutter pluss et 5 minutters isokratisk trinn ved 95 % buffer B.
- Bruk massespektrometeret i dataavhengig innsamlingsmodus (DDA) for å bytte automatisk mellom MS- og MSMS-hendelser.
- Definer et løkkeantall lik 15 ved hjelp av en AGC-målverdi (Automatic Gain Control) på 3 x 106 og 1 x 105 for henholdsvis MS- og MSMS-hendelsene.
- Sett maksimal tillatt ionakkumuleringstid til 20 ms for MS med en oppløsning på 60 K, og 100 ms for MSMS med en oppløsning på 15 K.
- Utfør et fragmenteringseksperiment med høy kollisjonsdissosiasjon (HCD) ved bruk av en normalisert kollisjonsenergi på 28%, med en dynamisk ekskluderingstid på 20 s.
- Bruk kildeparametrene som følger:
Sprøytespenning: 1,7 kV
Kapillærspenning: 275 °C
Verken kappe eller hjelpegass brukt
MERK: I denne protokollen har ultra-high performance fluid chromatography (UHPLC) massespektrometrisk (MS) analyse blitt spesifikt utført ved hjelp av et LC enkeltkolonneoppsett, koblet til et hybrid trippel quadrupole orbitrap-instrument (Table of Materials). Andre LCMS-systemer kan brukes, men en tilpasning av parametere anbefales.
- Analyse av data
- Bruk Last inn-knappen til å importere råfilene.
- Definer eksperimentnavnene ved å klikke på Angi eksperiment-knappen .
- Skriv inn delen gruppespesifikke parametere for å spesifisere alle parametere relatert til identifikasjon:
Enzym som brukes til fordøyelsen: Trypsin / P
Tapte klyvinger: opptil tre
Fast modifikasjon: Karbamidometylering
Variabel modifikasjon: N-acetyl (protein), oksidasjon (M) - Last opp en oppdatert FASTA-fil, tilgjengelig fra offentlige databaser som UniprotKB.
- Angi de riktige analysereglene i henhold til kilden til den valgte databasen.
- Definer en parentage false discovery rate (FDR) verdi = 1 for både proteiner og peptider.
- Legg til alternativet for etikettfri kvantifisering (LFQ) i fanen Etikettfri kvantifisering.
- Hold minimum LFQ-forhold på to.
MERK: Her beskriver vi dataanalyse ved hjelp av MaxQuant24 og Perseus programvare25 for å utføre henholdsvis proteinkvantifisering og påfølgende statistisk analyse. Dataanalyse kan imidlertid utføres med hvilken som helst annen kommersielt tilgjengelig eller gratis bioinformatikk. FDR er estimert ved hjelp av en mål-lokkefugl databasebasert tilnærming26. Peptid og protein FDR lik 0,01 betyr at peptider og proteiner identifisert forventes å inneholde 1% av falske positive.
- Statistisk analyse
- Last inn proteingruppene.txt filen for å utføre statistisk analyse på proteinnivå.
- Definer LFQ-verdiene som hovedkolonner.
- Fjern "omvendt" og "forurensninger" ved å filtrere rader basert på den kategoriske kolonnen.
- Bruk de kategoriske merknadsradene til å gruppere de forskjellige eksperimentelle forholdene.
- Reduser datamatrisen ved å velge antall gyldige verdier i hver av de tidligere definerte gruppene.
- Velg den statistiske testen som passer best til de eksperimentelle forholdene (dvs. t-test, multippel prøvetest ANOVA).
- Bestem en tidsgrense for viktige tips med en FDR-basert beregning. Vanligvis godtas både 0,01 og 0,05 som terskler for den justerte p-verdien .
- Visualisere resultatene av differensialanalyser basert på t-teststatistikk ved hjelp av en vulkanplottrepresentasjon.
- Eksporter den endelige matrisen i .txt format for videre redigering av den endelige resultattabellen.
MERK: Konfigurasjonsmappen inneholder en FASTA-fil med proteiner som keratiner som anses som vanlige forurensninger i globale proteomiske eksperimenter, som er flagget med en + i utdatatabellen. I denne studien, som har to utvalgsbetingelser, brukes en t-test til den statistiske analysen.
11. Resultater validering av Western Blot
- Prøve forberedelse
- Legg til riktig volum på 4x prøvelastingsbuffer til hver alikot av IN, FT og EL.
- Kok prøvene i 5 min ved 95 °C.
- Hurtigspinn for å gjenopprette fordampet prøve fra toppen av rørene.
- SDS-PAGE og geloverføring
- Legg prøver på en 4% -12% denaturerende polyakrylamidgel.
- Kjør gelen med MES SDS løpebuffer i 1,5 timer ved 120 V.
- Overfør gelen på en nitrocellulosemembran med en halvtørr overføringskassett i henhold til produsentens instruksjoner. Vi anbefaler en 10 min overføring på 15 V.
- Immunodeteksjon
- Blokker membranen med 10% bovint serumalbumin (BSA) i 1 time ved romtemperatur mens du rører forsiktig.
- Tilsett det primære antistoffet tilberedt i 5% BSA i TBST, i henhold til produsentens instruksjoner. La stå over natten ved 4 °C eller i 1 time ved romtemperatur under forsiktig omrøring.
- Vask membranen tre ganger med TBST, hver gang i 5 minutter.
- Tilsett det sekundære antistoffet tilberedt i TBST i 1 time ved romtemperatur under omrøring.
- Vask membranen tre ganger med TBST, hver gang i 5 minutter.
- Visualiser resultatene ved hjelp av en blot imager.
MERK: For å påvise TDP-43, et kjent bindemiddel i vårt RNA, ble rekombinant kaninmonoklonalt antistoff brukt og etterlatt med membranen over natten ved 4 ° C. Som et sekundært antistoff ble antikanin IgG pepperrotperoksidase (HRP) brukt, men et fluorescerende sekundært antistoff ville også fungere. For å visualisere antistoffene på membranen ble membranen inkubert med Clarity Western ECL-substratet i 1 min, før avbildning med ChemiDoc-avbildningssystemet.
Representative Results
For å verifisere gyldigheten av den foreslåtte protokollen ble PD-eksperimentene presentert her utført med en biotinylert RNA-aptamer designet i silico for å spesifikt binde TDP-4320. Dette RNA binder proteinmålet med høy bindingsaffinitet (Kd = 90 nM)20. Her er dette RNA, av sekvens 5'-CGGUGUUGCU-3', referert til med navnet "+RNA". Som en negativ kontroll ble den omvendte komplementære sekvensen av +RNA, som her kalles "-RNA", brukt. Sekvensen er 5'-AGCAACACCG-3'. -RNA viser en signifikant lavere bindingsaffinitet mot TDP-43 (Kd = 1,5 μM)19. For formålet med protokollen beskrevet her, har disse RNA-oligonukleotidene blitt kjøpt konjugert til et biotinmolekyl for å tillate binding til streptapavidinkulene. +RNA ble kjøpt med en biotin-TEG i sin 3'-ende, som inkluderer en 15-atom trietylenglykolavstandsstykke mellom biotinet og fosfatgruppen av nukleinsyren; -RNA hadde i stedet et biotin i sin 5' ende, konjugert til nukleinsyren via en amino-C6-linker. Imidlertid, hvis utformingen av RNA-agnet er robust, og så lenge det ikke er noen strukturell eller kjemisk forstyrrelse mellom linkeren og RNA, kan andre posisjoner for biotinkonjugeringen og andre linkerlengder brukes.
Å vite identiteten til hovedproteinet som ble funnet bundet til +RNA-sonden etter PD, muliggjorde validering av protokollen ved identifisering av TDP-43 i eluatet, ved bruk av både massespektrometri (MS) og western blot (WB) (figur 1).
MS-analyse ble utført på fire PD-replikater utført med enten +RNA eller -RNA (figur 2). Identifikasjonen av interaktomene til +RNA og -RNA er utenfor omfanget av denne protokollen, men noen resultater som validerer nøyaktigheten av protokollen rapporteres. Merk at plotting av de betydelig anrikede proteinene i et vulkanplott viste at det totale proteininnholdet og de anrikede proteinene eluert fra +RNA var betydelig høyere enn det som ble gjenvunnet fra -RNA (figur 2). Dette betyr at til tross for at det har samme lengde og strukturelle innhold (lineært), kan +RNA etablere et høyere antall spesifikke interaksjoner, som beholdes opp til elueringstrinnet med høyt salt. Det er sannsynlig at -RNA i stedet etablerer et høyere antall uspesifikke kontakter som blir forstyrret under vasketrinnene. Som forventet ble TDP-43 identifisert som en unik interaktor av +RNA20; den gjennomsnittlige etikettfrie kvantifiseringen (LFQ) for de fire PD-replikatene utført med +RNA er 31,96 ± 0,56, mens proteinet ikke er identifisert blant interaktorene til -RNA. I tillegg, blant alle unike interaktorer av +RNA, ble TDP-43 funnet å være det mest rikelig berikede proteinet.
For å validere protokollen ytterligere, ble den interne algoritmen catRAPID 18,19 brukt til å beregningsmessig forutsi hvilke andre proteiner som spesifikt ville binde enten +RNA eller -RNA. Spesielt ble interaksjonspoeng for +RNA og -RNA med proteinene som komponerer det humane proteomet beregnet ved hjelp av catRAPID 'interaksjonstilbøyelighet' -funksjonen, som definert i vårt tidligere arbeid27. Blant proteinene som ble skåret med høy sikkerhet, ble HNRNPH3 spådd å binde selektivt +RNA (+RNA-interaksjonsscore = 1,01; -RNA-interaksjonsscore = 0,21) og PCBP2 for å interagere spesifikt med -RNA (+RNA-interaksjonsscore = -0,5; -RNA-interaksjonsscore = 0,31) (figur 3A). I tillegg ble proteinet RBM41 spådd å være promiskuøst for begge RNA-oligonukleotider (+RNA-interaksjonsscore = 0,4; -RNA-interaksjonsscore = 0,39) (figur 3A). MS-analysen bekreftet faktisk tilstedeværelsen av HNRNPH3 og PCBP2 i PD på henholdsvis +RNA og -RNA, mens RBM41 ble funnet å interagere med begge (figur 3B).
WB ble brukt til å oppdage tilstedeværelsen av TDP-43 for ytterligere å bekrefte resultatene og under protokolloptimalisering (figur 4). I prosedyren beskrevet her ble det samlet inn ulike prøver på ulike stadier. Inngangsprøven (IN) besto av totalproteinene fortynnet i lysisbuffer. Gjennomstrømningen (FT) ble oppnådd etter en inkubasjon over natten av de totale proteinene med streptapavidinperlene forhåndsbelagt med det biotinylerte RNA, som representerte fraksjonen av proteiner som ikke bandt RNA. Til slutt inneholdt eluatet (EL) alle proteinene som gjenkjente spesifikt RNA som ble undersøkt, siden mellom FT- og EL-trinnene tre vasketrinn med 150 mM salt og 0,1% triton-X burde ha fjernet de svakeste interaksjonene.
For hver replikat ble samme mengde (5 % v/v) av IN, FT og EL kjørt parallelt på en SDS-PAGE og farget med et anti-TDP-43-antistoff (figur 4). I tilfelle av +RNA ble båndet av TDP-43 observert i IN og i EL, noe som indikerer at proteinet, tilstede fra starten i det totale proteinekstraktet, beholdes av +RNA under vasketrinnene og bare elueres på slutten med en høy saltbuffer. TDP-43 var også tilstede i IN for -RNA, men båndet som tilsvarer proteinet er også synlig i FT, noe som indikerer at dette RNA ikke binder TDP-43. Fraværet av TDP-43-båndet i EL bekrefter dette resultatet.
Under optimaliseringen av protokollen ble elueringen av proteinene spesifikt bundet til RNA-sekvensene undersøkt både med en elueringsbuffer inneholdende 1 M NaCl (EB1) og med en elueringsbuffer komplett med 2 M NaCl (EB2) (figur 4). Eluater oppnådd med enten EB ble sammenlignet på en SDS-PAGE og blottet med anti-TDP-43 antistoff. De oppnådde bildene ble deretter analysert med ImageJ28 for å kvantifisere enhver forskjell i TDP-43-mengde eluert med de to bufferne. Samlet sett ble det ikke observert noen signifikant forskjell, og vi konkluderte med at innenfor disse analysene er 1 M salt tilstrekkelig til å forstyrre selv de sterkeste protein-RNA-interaksjonene.
Samlet sett viser resultatene rapportert her for MS og WB at denne protokollen er effektiv i å fange proteininteraktorene til et gitt RNA på en bestemt måte, og at den muliggjør eluering i buffere som er kompatible med nedstrømsanalyse.
Figur 1: Skisse av den eksperimentelle rørledningen som brukes i den foreslåtte protokollen . (A) Det biotinylerte RNA-oligonukleotidet fremstilles i lysisbuffer ved passende konsentrasjon. (B) Magnetiske streptavidinperler vaskes, blokkeres med gjær-tRNA og lastes med det biotinylerte RNA. (C) Totalt proteinekstrakt avledet fra dyrkede pattedyrcellelinjer blir tilsatt til perle-RNA-blandingen. (D) Flere vasker utføres for å fjerne uspesifikke interaksjoner. (E) De spesifikke proteininteraktorene løsnes fra RNA med en hypertonisk løsning. (F) Interaktorenes identitet avsløres ved massespektrometri, og spesifikke tilfeller valideres av western blot. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Analytisk strategi for etikettfri MS-basert proteinkvantifisering . (A) Eluterte proteiner utfelles i kald aceton over natten. Proteiner denatureres deretter, og en fordøyelse i løsningen utføres. Proteolytiske peptider konsentreres og avsaltes. (B) Peptider analyseres via LC-MS / MS ved hjelp av en "hagle tilnærming". (C) Rådatabehandling og analyse utføres ved hjelp av henholdsvis MaxQuant og Perseus-programvare. (D) Statistisk signifikante berikede proteiner vises i et vulkanplott. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Korrelasjon mellom predikerte interaksjonstilbøyeligheter og eksperimentelt bestemte interaksjoner av +RNA og -RNA. (A) catRAPID interaksjonsscore i forhold til HNRNPH3, PCBP2 og RBM41, noe som indikerer fortrinnsbinding av HNRNPH3 for +RNA og PCBP2 for -RNA, mens RBM41 forventes å ukritisk binde begge RNA-sekvensene. (B) Etikettfrie kvantifiseringsgjennomsnitt bestemt ved massespektrometrianalyse fra nedtrekkene utført med +RNA og -RNA. Analysen bekrefter at HNRNPH3 kun binder +RNA, PCBP2 binder kun -RNA, og RBM41 binder begge likt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Western blot validering av tilstedeværelse / fravær av TDP-43 blant interaktorene av utvalgte RNA-sekvenser. WB-membranen har blitt behandlet med anti-TDP-43 antistoff. IN = inngang; FT = gjennomstrømning; EL (EB1) = eluering med elueringsbuffer 1; EL (EB2) = eluering med elueringsbuffer 2; tegnet "+" indikerer prøver avledet fra rullegardinmenyen utført med +RNA; tegnet "-" indikerer prøver avledet fra rullegardinmenyen utført med -RNA; Bane 1 inneholder en proteinstige. TDP-43 er indikert med en pil. WB indikerer at TDP-43 finnes blant +RNA-interaktorer, men ikke blant -RNA-interaktorer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Navn på buffer | Komposisjon | |||||
| 10x Tranfer buffer | 250 mM tris, 1,92 M glycin, 1% SDS, 20% metanol. Fortynn 10 ganger før bruk | PD | ||||
| 20X MES SDS løpende buffer | 1 M MES, 1 M tris, 2% SDS, 20 mM EDTA. Juster pH til 7,3. Fortynn 20 ganger før bruk | |||||
| 4x Buffer for prøvelasting | 0,25 M Tris base, 0,28 M SDS, 40% glyserol, 20% 2-merkapto-etanol, 4 mg / ml bromphenol blå | |||||
| Elueringsbuffer 1 | 20 mM fosfat pH 7,5, 1 M NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT (tilsettes etter kvantifisering) | |||||
| Elueringsbuffer 2 | 20 mM fosfat pH 7,5, 2 M NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT (tilsettes etter kvantifisering) | |||||
| Lysis buffer | 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT og proteasehemmere | |||||
| Tris-bufret saltvann med Tween-20 | 1 m Tris-HCl pH 7,4, 3 m NaCl, 2,0% mellom-20 | |||||
| Vask buffer 1 | 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton TM X-100, 1 mM DTT og proteasehemmere | |||||
| Vask buffer 2 | 25 mM Hepes pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT og proteasehemmere | |||||
| Buffer A | 0,1% maursyre | MS | ||||
| Buffer B | 60% acetonitril, 0,1% maursyre | |||||
| Denaturering buffer | 8M urea, 50 mM Tris-HCl | |||||
Tabell 1: PD- og MS-buffere. Navn på og sammensetning av bufferne som brukes enten for nedtrekksforsøkene (PD) eller for massespektrometrianalysen (MS).
Discussion
Dette arbeidet rapporterer optimalisering av en PD-protokoll utført med biotinylerte RNA-oligonukleotider for å fange deres proteininteraktorer. Protokollen beskrevet her er enkel å utføre, krever lite materiale og gir svært pålitelige resultater. Det er viktig at de mest nye aspektene ved denne protokollen består av bruk av et RNA-agn designet fullt ut i silico og spesifikt for proteinmålet, og eluering av alle proteiner bundet til RNA-agn ved direkte å forstyrre deres interaksjoner med en saltoppløsning, i stedet for ved å dissosiere streptatidin fra biotinet med vaskemiddel og høytemperaturbehandling.
Denne protokollen utnytter styrken av bindingen mellom biotin og streptavidin29,30. I henhold til de valgte streptapavidinperlene må lasting av det biotinylerte RNA testes og kvantifiseres før fortsette. RNA-tredimensjonal folding kan også påvirke lasteeffektiviteten på perlene, siden det kan begrense biotinets eksponering for streptapavidin. Blokkering av perlene med ikke-biotinylert tRNA forbedrer rensligheten av resultatene ved å begrense uspesifikke interaksjoner med perlene. Lastebufferen og elueringsbufferen må velges avhengig av nedstrømsapplikasjonene. Her ble det foreslått svært milde forhold, egnet for de fleste applikasjonene og utviklet for å bevare potensielle proteinkomplekser. Denne metoden er imidlertid svært tilpasningsdyktig; brukeren kan velge hvilken som helst cellelinje og hvilken som helst RNA-størrelse, og kan bestemme seg for å gjenta protokollen etter folding / utfolding av RNA for å bestemme effekten av strukturen på bindingsegenskapene.
Et annet originalt aspekt ved denne protokollen er bruken av in silico prediksjonsverktøy for å sikre korrektheten av resultatene20. Å vite på forhånd hvilke proteiner som skal identifiseres som interaktorer av RNA av interesse, gir den enestående fordelen av å validere de tekniske aspektene ved protokollen. For eksempel, ved hjelp av en enkel WB-analyse, er det mulig å verifisere tilstedeværelsen av et kjent proteinmål i prøvene avledet fra de forskjellige trinnene i protokollen før du fortsetter med MS-analysen, noe som krever spesialisert instrumentering og er dyrere. I tillegg ble det nylig rapportert om en metode for å bruke catRAPID20, en intern protein-RNA-prediksjonsalgoritme, for å designe de novo RNA spesifikt for et målprotein. Inntil nylig var den eneste tilgjengelige rørledningen for å designe DNA / RNA-aptamere for et målprotein SELEX (systematisk evolusjon av ligander ved eksponentiell anrikning) tilnærming31. In silico-metoden muliggjør en mye raskere og kostnadseffektiv design av RNA-aptamere.
Hovedbegrensningene i denne metoden er knyttet til behovet for å arbeide i nukleasefrie buffere og verktøy. Videre, hvis det anses nødvendig å bekrefte in vitro bindingen mellom et de novo-designet RNA og et målprotein før PD, må proteinet produseres og renses og bindingen bestemmes med biofysiske tilnærminger. Dette er en begrensning som deles med produksjonen av monoklonale antistoffer.
Til tross for disse mindre problemene, kan pålitelige metoder for å kartlegge RNA-proteininteraksjoner, som den som presenteres her, bringe forskere nærmere for å avdekke makromolekylære nettverk og komplekse hovedaktører i mange fysiologiske og patologiske mekanismer, som de som er involvert i kreft, kardiomyopatier, diabetes, mikrobielle infeksjoner og genetiske og neurodegenerative lidelser.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Prof. Tartaglia og Dr. Cuomos forskningsgruppe for støtten som tilbys. EZ mottok finansiering fra MINDED-fellesskapet i EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under Marie Sklodowska-Curie-tilskuddsavtalen nr. 754490.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well tissue culture plates | VWR | 10861-554 | CELLS |
| Cell scrapers | BIOSIGMA | 10153 | CELLS |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientfic | 11995065 | CELLS |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil | Thermo Fisher Scientfic | 10500064 | CELLS |
| Phosphate Buffer Saline (PBS, Waltham, MA) | Thermo Fisher Scientfic | 14190169 | CELLS |
| Trypsin (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientfic | 15050065 | CELLS |
| Anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HRP) | Cellsignal | 7070 | PD |
| Biotinylated RNA | Eurofins | Custom RNA oligonucleotides | PD |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | PD |
| Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Biorad | 1705061 | PD |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Merck - Sigma Aldrich | 5056489001 | PD |
| NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well | Invitrogen | NP0321BOX | PD |
| Recombinant anti-TDP43 antibody | Abcam | ab109535 | PD |
| Ribonucleic acid, transfer from baker's yeast (S. cerevisiae) | Merck - Sigma Aldrich | R5636-1ML | PD |
| Streptavidin Mag Sepharose | Merck - Sigma Aldrich | GE28-9857-99 | PD |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini 0.2 µm PVDF Transfer Kit | Biorad | 1704272 | PD |
| Acetone | Thermo Fisher Scientfic | 022928.K2 | MS |
| C18 cartridge | Thermo Fisher Scientfic | 13-110-018 | MS |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientfic | 20290 | MS |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | ES902 | MS |
| iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich S.r.l. | I6125 | MS |
| Lys-C/Trypsin | Promega | V5073 | MS |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo Fisher Scientfic | 28904 | MS |
| Urea | Thermo Fisher Scientfic | J75826.A7 | MS |
| Equipment | |||
| ChemiDoc imaging system | Bio-Rad | CELLS | |
| Dyna Mag -2 , Magnetic rack | Invitrogen | CELLS | |
| Forma Series 3 water jacketed C02 incubator | Thermo Scientific | PD | |
| PROTEAN II xi cell , power supply for PAGE applications | Bio-Rad | PD | |
| Rotating wheel, rotator SB3 | Stuart | PD | |
| Water bath set at 37 °C | VWR | PD | |
| XCell SureLock Mini-Cell electrophoresis system | ThermoFisher Scientific | MS | |
| Easy-nLC 1200 UHPLC | Thermo Scientific | MS | |
| Q exactive Mass Spectrometer | Thermo Scientific | MS | |
| Software | Version | ||
| MaxQuant | 2.0.3.0 | MS | |
| Perseus | 1.6.14.0 | MS |
References
- Gebauer, F., Schwarzl, T., Valcárcel, J., Hentze, M. W. RNA-binding proteins in human genetic disease. Nature Reviews Genetics. 22 (3), 185-198 (2021).
- Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Cooper, T. A., Wan, L., Dreyfuss, G. RNA and disease. Cell. 136 (4), 777-793 (2009).
- Qin, H., et al. RNA-binding proteins in tumor progression. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 90 (2020).
- Nussbacher, J. K., Tabet, R., Yeo, G. W., Lagier-Tourenne, C. Disruption of RNA metabolism in neurological diseases and emerging therapeutic interventions. Neuron. 102 (2), 294-320 (2019).
- Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. Journal of Genetics and Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
- Maziuk, B., Ballance, H. I., Wolozin, B. Dysregulation of RNA binding protein aggregation in neurodegenerative disorders. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 89 (2017).
- Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (5), 1557-1562 (2006).
- Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118 (2021).
- Weidmann, C. A., Mustoe, A. M., Jariwala, P. B., Calabrese, J. M., Weeks, K. M. Analysis of RNA-protein networks with RNP-MaP defines functional hubs on RNA. Nature Biotechnology. 39 (3), 347-356 (2021).
- Graindorge, A., et al. In-cell identification and measurement of RNA-protein interactions. Nature Communications. 10 (1), 5317 (2019).
- Ule, J., Hwang, H. W., Darnell, R. B. The future of cross-linking and immunoprecipitation (CLIP). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (8), 032243 (2018).
- Ascano, M., Hafner, M., Cekan, P., Gerstberger, S., Tuschl, T. Identification of RNA-protein interaction networks using PAR-CLIP. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (2), 159-177 (2012).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biology. 15 (1), 203 (2014).
- Sugimoto, Y., et al. Analysis of CLIP and iCLIP methods for nucleotide-resolution studies of protein-RNA interactions. Genome Biology. 13 (8), (2012).
- Bayat, P., et al. SELEX methods on the road to protein targeting with nucleic acid aptamers. Biochimie. 154, 132-155 (2018).
- Armaos, A., Colantoni, A., Proietti, G., Rupert, J., Tartaglia, G. G. CatRAPID omics v2.0: Going deeper and wider in the prediction of protein-RNA interactions. Nucleic Acids Research. 49, 72-79 (2021).
- Agostini, F., et al. CatRAPID omics: A web server for large-scale prediction of protein-RNA interactions. Bioinformatics. 29 (22), 2928-2930 (2013).
- Zacco, E., et al. Probing TDP-43 condensation using an in silico designed aptamer. Nature Communications. 13 (1), 3306 (2022).
- Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Research. 42 (2), 13 (2014).
- Zhang, Y., Lai, B. S., Juhas, M. Recent advances in aptamer discovery and applications. Molecules. 24 (5), 941 (2019).
- UniProt Consortium. UniProt: the Universal Protein Knowledgebase in 2023. Nucleic Acids Research. 51, 523-531 (2023).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Bellucci, M., Agostini, F., Masin, M., Tartaglia, G. G. Predicting protein associations with long noncoding RNAs. Nature Methods. 8 (6), 444-445 (2011).
- Gallo-Oller, G., Ordoñez, R., Dotor, J. A new background subtraction method for Western blot densitometry band quantification through image analysis software. Journal of Immunological Methods. 457, 1-5 (2018).
- Weissinger, R., Heinold, L., Akram, S., Jansen, R. P., Hermesh, O. RNA proximity labeling: A new detection tool for RNA-protein interactions. Molecules. 26 (8), 2270 (2021).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).
