Her presenterer vi en optimalisert in vitro-metode for å avdekke, kvantifisere og validere proteininteraktorer av spesifikke RNA-sekvenser, ved bruk av totalt proteinekstrakt fra humane celler, streptapavidinperler belagt med biotinylert RNA og massespektrometrianalyse.
Protein-RNA-interaksjoner regulerer genuttrykk og cellulære funksjoner på transkripsjons- og posttranskripsjonsnivåer. Av denne grunn er det fortsatt av stor betydning å identifisere bindingspartnerne til et RNA av interesse for å avdekke mekanismene bak mange cellulære prosesser. Imidlertid kan RNA-molekyler interagere forbigående og dynamisk med noen RNA-bindende proteiner (RBP), spesielt med ikke-kanoniske. Derfor er det stort behov for forbedrede metoder for å isolere og identifisere slike RBP-er.
For å identifisere proteinpartnerne til en kjent RNA-sekvens effektivt og kvantitativt, utviklet vi en metode basert på nedtrekk og karakterisering av alle samvirkende proteiner, med utgangspunkt i cellulært totalproteinekstrakt. Vi optimaliserte proteintrekkingen ved hjelp av biotinylert RNA forhåndslastet på streptapavidinbelagte perler. Som et bevis på konseptet benyttet vi en kort RNA-sekvens kjent for å binde det nevrodegenerasjonsassosierte proteinet TDP-43 og en negativ kontroll av en annen nukleotidsammensetning, men samme lengde. Etter å ha blokkert kulene med gjær-tRNA, lastet vi de biotinylerte RNA-sekvensene på streptavidin-kulene og inkuberte dem med det totale proteinekstraktet fra HEK 293T-celler. Etter inkubering og flere vasketrinn for å fjerne uspesifikke bindemidler, eluerte vi de vekselvirkende proteinene med en saltoppløsning, kompatibel med de mest brukte proteinkvantifiseringsreagensene og med prøvepreparering for massespektrometri. Vi kvantifiserte anrikningen av TDP-43 i nedtrekket utført med det kjente RNA-bindemiddelet sammenlignet med den negative kontrollen ved massespektrometri. Vi brukte samme teknikk for å verifisere selektive interaksjoner av andre proteiner beregningsmessig spådd å være unike bindemidler av vårt RNA av interesse eller kontroll. Til slutt validerte vi protokollen ved western blot via påvisning av TDP-43 med et passende antistoff.
Denne protokollen vil tillate studier av proteinpartnerne til et RNA av interesse for nær-fysiologiske forhold, og bidra til å avdekke unike og uforutsette protein-RNA-interaksjoner.
RNA-bindende proteiner (RBP) har dukket opp som viktige aktører i transkripsjonell og posttranskripsjonell genregulering, siden de er involvert i prosesser som mRNA-skjøting, RNA-cellulær lokalisering, oversettelse, modifikasjon og nedbrytning 1,2,3. Slike interaksjoner mellom de to makromolekylene er svært koordinerte, nøyaktig balanserte og essensielle for dannelsen av funksjonelle og prosesseringsnav. Variasjoner eller dysreguleringer innenfor disse knutepunktene har potensial til å forstyrre de finregulerte protein-RNA-nettverkene og er i økende grad forbundet med en rekke menneskelige sykdommer, inkludert kreft 4,5 og nevrodegenerative lidelser 6,7,8. Samspillet mellom RNA-molekyler og deres proteinbindende partnere kan enten være stabile og enkle å validere eksperimentelt, eller svært dynamisk, forbigående og vanskeligere å karakterisere.
De siste årene har det blitt gjort et intensivt arbeid for å forstå disse interaksjonene. Blant de mest etablerte metodene er proteinnedtrekksanalyser (PD) sannsynligvis de mest verdsatte og brukte tilnærmingene for å avdekke hovedaktørene som utgjør ribonukleoprotein (RNP) komplekser og andre protein-RNA-interaksjonsnettverk 3,9,10. PD inkluderer en bred paraply av informative teknikker, for eksempel immunutfelling av enten RNA (RIP) 11,12 eller proteinet (CLIP) 13,14 av interesse. Noen av disse RNA-PD-protokollene bruker et kjent RNA som agn for proteiner15, oftest ved å dra nytte av høye affinitetsmerker som biotin. I dette tilfellet kan interaksjonspartnerne til et biotinylert RNA detekteres ved å forankre RNA på streptapavidinbelagte perler, noe som muliggjør effektiv isolering av RNP-ene. Hovedbegrensningene i disse tilnærmingene er vanligvis utformingen av de biotinylerte probene og testingen av deres evne til å binde målproteiner. For dette formålet kan det være nyttig å stole på publiserte CLIP-data av proteinet av interesse, hvis tilgjengelig, siden de med høy presisjon avslører de korte RNA-regionene som tilsvarer topper av interaksjoner med målproteinet13,16. De samme regionene kan brukes til å utvikle sonder for PD. En alternativ metode for å designe slike RNA-agn kan være den systematiske utviklingen av ligander ved eksponentiell berikelse (SELEX)17, som muliggjør design av aptamere gjennom in vitro-seleksjon, med utgangspunkt i et omfattende randomisert bibliotek og via en serie PCR-drevne optimaliseringssykluser. SELEX er imidlertid kompleks og tidkrevende, og de endelige resultatene er svært avhengige av det opprinnelige biblioteket. For å velge RNA-agnet som skulle brukes i protokollen som presenteres her, ble enda en tilnærming utnyttet, bestående av å bruke et RNA-agn designet de novo ved hjelp av beregningskraften til algoritmen catRAPID, som forutsier den foretrukne bindingen av et gitt protein mot visse RNA-sekvenser18,19,20.
Protokollen introdusert her er en versjon av en RNA-PD optimalisert for å eluere spesifikke proteinpartnere i nær fysiologiske forhold, uten bruk av vaskemiddel, denatureringsmidler eller høye temperaturer. Den er avhengig av nano-superparamagnetiske perler kovalent belagt med høyt renset streptavidin og bruk av et spesifikt silico-designet biotinylert RNA som agn. Denne protokollen gir en rask og effektiv metode for å isolere bindingspartnerne til biotinylerte RNA-molekyler under opprinnelige forhold, og gir potensialet for et bredt spekter av nedstrøms applikasjoner. For å teste denne protokollen ble en 10-nukleotid enkeltstrenget RNA-aptamersekvens, tidligere designet for å binde proteinet TAR DNA-bindende protein 43 (TDP-43) med høy affinitet og spesifisitet, brukt20. Med utgangspunkt i HEK 293T-cellelysater ble interaktorene til den biotinylerte RNA-aptameren identifisert ved hjelp av massespektrometrianalyse utført på prøver løsrevet fra RNA-agn ved hjelp av en hypertonisk buffer. Denne analysen bekreftet vellykket identifisering og kvantifisering av TDP-43 som foretrukket bindemiddel.
Denne protokollen muliggjør vellykket identifisering av proteininteraktorer ved bruk av bare et kort, in vitro-syntetisert RNA-oligonukleotid. Videre garanterer bruken av in silico designet RNA aptamers som PD-sonder21,22 spesifisitet for målene til betydelig reduserte kostnader.
Dette arbeidet rapporterer optimalisering av en PD-protokoll utført med biotinylerte RNA-oligonukleotider for å fange deres proteininteraktorer. Protokollen beskrevet her er enkel å utføre, krever lite materiale og gir svært pålitelige resultater. Det er viktig at de mest nye aspektene ved denne protokollen består av bruk av et RNA-agn designet fullt ut i silico og spesifikt for proteinmålet, og eluering av alle proteiner bundet til RNA-agn ved direkte å forstyrre deres interaksjoner med en saltoppløsning, i stedet for ved å dissosiere streptatidin fra biotinet med vaskemiddel og høytemperaturbehandling.
Denne protokollen utnytter styrken av bindingen mellom biotin og streptavidin29,30. I henhold til de valgte streptapavidinperlene må lasting av det biotinylerte RNA testes og kvantifiseres før fortsette. RNA-tredimensjonal folding kan også påvirke lasteeffektiviteten på perlene, siden det kan begrense biotinets eksponering for streptapavidin. Blokkering av perlene med ikke-biotinylert tRNA forbedrer rensligheten av resultatene ved å begrense uspesifikke interaksjoner med perlene. Lastebufferen og elueringsbufferen må velges avhengig av nedstrømsapplikasjonene. Her ble det foreslått svært milde forhold, egnet for de fleste applikasjonene og utviklet for å bevare potensielle proteinkomplekser. Denne metoden er imidlertid svært tilpasningsdyktig; brukeren kan velge hvilken som helst cellelinje og hvilken som helst RNA-størrelse, og kan bestemme seg for å gjenta protokollen etter folding / utfolding av RNA for å bestemme effekten av strukturen på bindingsegenskapene.
Et annet originalt aspekt ved denne protokollen er bruken av in silico prediksjonsverktøy for å sikre korrektheten av resultatene20. Å vite på forhånd hvilke proteiner som skal identifiseres som interaktorer av RNA av interesse, gir den enestående fordelen av å validere de tekniske aspektene ved protokollen. For eksempel, ved hjelp av en enkel WB-analyse, er det mulig å verifisere tilstedeværelsen av et kjent proteinmål i prøvene avledet fra de forskjellige trinnene i protokollen før du fortsetter med MS-analysen, noe som krever spesialisert instrumentering og er dyrere. I tillegg ble det nylig rapportert om en metode for å bruke catRAPID20, en intern protein-RNA-prediksjonsalgoritme, for å designe de novo RNA spesifikt for et målprotein. Inntil nylig var den eneste tilgjengelige rørledningen for å designe DNA / RNA-aptamere for et målprotein SELEX (systematisk evolusjon av ligander ved eksponentiell anrikning) tilnærming31. In silico-metoden muliggjør en mye raskere og kostnadseffektiv design av RNA-aptamere.
Hovedbegrensningene i denne metoden er knyttet til behovet for å arbeide i nukleasefrie buffere og verktøy. Videre, hvis det anses nødvendig å bekrefte in vitro bindingen mellom et de novo-designet RNA og et målprotein før PD, må proteinet produseres og renses og bindingen bestemmes med biofysiske tilnærminger. Dette er en begrensning som deles med produksjonen av monoklonale antistoffer.
Til tross for disse mindre problemene, kan pålitelige metoder for å kartlegge RNA-proteininteraksjoner, som den som presenteres her, bringe forskere nærmere for å avdekke makromolekylære nettverk og komplekse hovedaktører i mange fysiologiske og patologiske mekanismer, som de som er involvert i kreft, kardiomyopatier, diabetes, mikrobielle infeksjoner og genetiske og neurodegenerative lidelser.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Prof. Tartaglia og Dr. Cuomos forskningsgruppe for støtten som tilbys. EZ mottok finansiering fra MINDED-fellesskapet i EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under Marie Sklodowska-Curie-tilskuddsavtalen nr. 754490.
6-well tissue culture plates | VWR | 10861-554 | CELLS |
Cell scrapers | BIOSIGMA | 10153 | CELLS |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientfic | 11995065 | CELLS |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil | Thermo Fisher Scientfic | 10500064 | CELLS |
Phosphate Buffer Saline (PBS, Waltham, MA) | Thermo Fisher Scientfic | 14190169 | CELLS |
Trypsin (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientfic | 15050065 | CELLS |
Anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HRP) | Cellsignal | 7070 | PD |
Biotinylated RNA | Eurofins | Custom RNA oligonucleotides | PD |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | PD |
Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Biorad | 1705061 | PD |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Merck – Sigma Aldrich | 5056489001 | PD |
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well | Invitrogen | NP0321BOX | PD |
Recombinant anti-TDP43 antibody | Abcam | ab109535 | PD |
Ribonucleic acid, transfer from baker's yeast (S. cerevisiae) | Merck – Sigma Aldrich | R5636-1ML | PD |
Streptavidin Mag Sepharose | Merck – Sigma Aldrich | GE28-9857-99 | PD |
Trans-Blot Turbo RTA Mini 0.2 µm PVDF Transfer Kit | Biorad | 1704272 | PD |
Acetone | Thermo Fisher Scientfic | 022928.K2 | MS |
C18 cartridge | Thermo Fisher Scientfic | 13-110-018 | MS |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientfic | 20290 | MS |
EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | ES902 | MS |
iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich S.r.l. | I6125 | MS |
Lys-C/Trypsin | Promega | V5073 | MS |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo Fisher Scientfic | 28904 | MS |
Urea | Thermo Fisher Scientfic | J75826.A7 | MS |
Equipment | |||
ChemiDoc imaging system | Bio-Rad | CELLS | |
Dyna Mag -2 , Magnetic rack | Invitrogen | CELLS | |
Forma Series 3 water jacketed C02 incubator | Thermo Scientific | PD | |
PROTEAN II xi cell , power supply for PAGE applications | Bio-Rad | PD | |
Rotating wheel, rotator SB3 | Stuart | PD | |
Water bath set at 37 °C | VWR | PD | |
XCell SureLock Mini-Cell electrophoresis system | ThermoFisher Scientific | MS | |
Easy-nLC 1200 UHPLC | Thermo Scientific | MS | |
Q exactive Mass Spectrometer | Thermo Scientific | MS | |
Software | Version | ||
MaxQuant | 2.0.3.0 | MS | |
Perseus | 1.6.14.0 | MS |