Summary
Здесь мы представляем оптимизированный метод in vitro для обнаружения, количественного определения и проверки белковых интеракторов определенных последовательностей РНК с использованием экстракта общего белка из клеток человека, шариков стрептавидина, покрытых биотинилированной РНК, и масс-спектрометрического анализа.
Abstract
Белок-РНК-взаимодействия регулируют экспрессию генов и клеточные функции на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях. По этой причине идентификация партнеров по связыванию интересующей РНК по-прежнему имеет большое значение для раскрытия механизмов, лежащих в основе многих клеточных процессов. Однако молекулы РНК могут временно и динамически взаимодействовать с некоторыми РНК-связывающими белками (RBP), особенно с неканоническими. Следовательно, крайне необходимы более совершенные методы изоляции и выявления таких ОДП.
Для эффективной и количественной идентификации белковых партнеров известной последовательности РНК мы разработали метод, основанный на вытягивании и характеристике всех взаимодействующих белков, начиная с экстракта клеточного общего белка. Мы оптимизировали вытягивание белка с помощью биотинилированной РНК, предварительно загруженной на шарики, покрытые стрептавидином. В качестве доказательства концепции мы использовали короткую последовательность РНК, которая, как известно, связывает связанный с нейродегенерацией белок TDP-43 и отрицательный контроль другого нуклеотидного состава, но той же длины. После блокировки шариков дрожжевой тРНК мы загрузили последовательности биотинилированной РНК на шарики стрептавидина и инкубировали их с общим белковым экстрактом из клеток HEK 293T. После инкубации и нескольких этапов промывки для удаления неспецифических связующих веществ мы элюировали взаимодействующие белки раствором с высоким содержанием соли, совместимым с наиболее часто используемыми реагентами для количественного определения белка и с подготовкой образцов для масс-спектрометрии. Мы количественно оценили обогащение TDP-43 в вытягивании, выполненном известным связывающим РНК, по сравнению с отрицательным контролем с помощью масс-спектрометрии. Мы использовали тот же метод для проверки селективных взаимодействий других белков, которые, как вычислительно предсказывали, являются уникальными связующими для интересующей нас РНК или контрольной РНК. Наконец, мы проверили протокол методом вестерн-блоттинга путем обнаружения TDP-43 с соответствующим антителом.
Этот протокол позволит изучать белковых партнеров интересующей РНК в условиях, близких к физиологическим, помогая выявить уникальные и непредсказуемые взаимодействия белок-РНК.
Introduction
РНК-связывающие белки (RBP) стали важнейшими игроками в регуляции транскрипционных и посттранскрипционных генов, поскольку они участвуют в таких процессах, как сплайсинг мРНК, клеточная локализация РНК, трансляция, модификация и деградация РНК 1,2,3. Такие взаимодействия между двумя макромолекулами хорошо скоординированы, точно сбалансированы и необходимы для формирования функциональных и процессинговых центров. Вариации или нарушения регуляции в этих центрах могут нарушать тонко регулируемые белок-РНК-сети и все чаще ассоциируются с различными заболеваниями человека, включая рак4,5 и нейродегенеративные расстройства 6,7,8. Взаимодействия между молекулами РНК и их партнерами по связыванию белков могут быть либо стабильными и легко проверяемыми экспериментально, либо высокодинамичными, переходными и более сложными для характеристики.
В последние годы были предприняты интенсивные усилия по пониманию этих взаимодействий. Среди наиболее известных методов анализы вытягивания белка (PD), вероятно, являются наиболее ценными и часто используемыми подходами для разгадки основных игроков, составляющих комплексы рибонуклеопротеинов (RNP) и другие сети взаимодействия белка и РНК 3,9,10. БП включают в себя широкий спектр информативных методов, таких как иммунопреципитация либо РНК (RIP)11,12, либо белка (CLIP)13,14, представляющих интерес. Некоторые из этих протоколов РНК-ФД используют известную РНК в качестве приманки для белков15, чаще всего используя высокоаффинные метки, такие как биотин. В этом случае партнеры по взаимодействию биотинилированной РНК могут быть обнаружены путем закрепления РНК на шариках, покрытых стрептавидином, что обеспечивает эффективную изоляцию РНП. Основными ограничениями этих подходов обычно являются конструкция биотинилированных зондов и тестирование их способности связывать целевые белки. Для этой цели было бы полезно полагаться на опубликованные данные CLIP интересующего белка, если таковые имеются, поскольку они с высокой точностью выявляют короткие участки РНК, которые соответствуют пикам взаимодействий с целевым белком13,16. Эти же области могут быть использованы для разработки зондов для PD. Альтернативным методом разработки таких приманок для РНК может быть систематическая эволюция лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX)17, которая позволяет создавать аптамеры посредством отбора in vitro, начиная с обширной рандомизированной библиотеки и с помощью серии циклов оптимизации, основанных на ПЦР. Однако SELEX сложен и требует много времени, и конечные результаты сильно зависят от исходной библиотеки. Для выбора РНК-приманки для использования в представленном здесь протоколе был использован еще один подход, заключающийся в использовании РНК-приманки, разработанной de novo с помощью вычислительной мощности алгоритма catRAPID, который предсказывает предпочтительное связывание данного белка с определенными последовательностями РНК18,19,20.
Представленный здесь протокол представляет собой версию РНК-ФД, оптимизированную для элюирования конкретных белковых партнеров в условиях, приближенных к физиологическим, без использования моющих средств, денатурирующих агентов или высоких температур. Он основан на нано-суперпарамагнитных шариках, ковалентно покрытых высокоочищенным стрептавидином, и использовании в качестве приманки специальной биотинилированной РНК, разработанной in silico . Этот протокол обеспечивает быстрый и эффективный метод выделения партнеров по связыванию биотинилированных молекул РНК в нативных условиях, предлагая потенциал для широкого спектра последующих применений. Для проверки этого протокола была использована 10-нуклеотидная одноцепочечная последовательность РНК-аптамера, ранее разработанная для связывания белка TAR DNA-связывающего белка 43 (TDP-43) с высоким сродством и специфичностью20. Начиная с лизатов клеток HEK 293T, интеракторы биотинилированного РНК-аптамера идентифицировали с помощью масс-спектрометрического анализа, проведенного на образцах, отделенных от приманки РНК с помощью гипертонического буфера. Этот анализ подтвердил успешную идентификацию и количественное определение TDP-43 в качестве предпочтительного связующего.
Этот протокол позволяет успешно идентифицировать белковые интеракторы, используя только короткий, синтезированный in vitro олигонуклеотид РНК. Более того, использование разработанных in silico РНК-аптамеров в качестве зондовPD 21,22 гарантирует специфичность для мишеней при значительно меньших затратах.
Protocol
1. Общие методы и материал
- Подготовьте подходящую среду для выбранной культуры клеток млекопитающих и предварительно прогрейте ее при 37 ° C в течение 20 минут перед использованием.
- Заранее подготовьте необходимый материал, как описано в Таблице материалов. Автоклавная стеклянная посуда, пластиковая посуда и буферные запасы.
- Подготовьте буферы, как описано в таблице 1. Отрегулируйте рН исходных растворов, используя концентрированные HCl или NaOH, прежде чем разбавлять компоненты до их конечных объемов.
2. Подготовка клеточной линии млекопитающих
- Выращивайте клетки HEK 293T в модифицированной среде Eagle Medium (DMEM) Дульбекко с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 100 мкг/мл раствора пенициллина/стрептомицина. Инкубируйте их при 37 °C в увлажненном инкубаторе, снабженном 5% CO2. Регулярно разделяйте клетки.
- Перед отделением промойте клетки достаточным количеством солевого раствора с фосфатным буфером (PBS), чтобы покрыть поверхность выращивания.
- Удалите PBS и добавьте ультратонкий слой раствора трипсина-ЭДТА.
- Инкубируют клетки при 37 ° C в увлажненном инкубаторе, снабженном 5% CO2 , в течение 5 мин или до тех пор, пока клетки не будут отделены (они должны выглядеть рассеянными при микроскопическом наблюдении).
- Разбавьте раствор трипсина-ЭДТА в десять раз, добавив полный DMEM, чтобы инактивировать его и подсчитать клетки.
- Планшет 1,5 x 105 клеток/мл в 6-луночных планшетах, учитывая две лунки/условия для тестирования.
- Инкубируйте клетки при 37 ° C в течение 48 ч в увлажненном инкубаторе с 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ознакомьтесь с инструкциями производителя по типу среды и добавке, подходящей для клеточной линии. Кроме того, количество и время инкубации трипсина-ЭДТА зависят от клеточной линии. Некоторые типы клеток растут быстрее/медленнее, чем сообщалось в этом протоколе; Таким образом, концентрация семян должна быть проверена заранее.
3. Общий сбор белка
- Удалите среду из лунок, где растут клетки.
- Промойте каждую лунку 6-луночных планшетов 1 мл PBS.
- Откажитесь от PBS.
- Переместите пластины на лед и либо перейдите к шагу 3.5, либо заморозьте сухие пластины при -80 ° C, чтобы облегчить лизис.
- Добавьте 200 мкл лизисного буфера в каждую лунку.
- Используйте скребок для ячеек, чтобы отделить и разбить ячейки.
- Перенесите клеточный экстракт, полученный из двух лунок, в одну и ту же пробирку объемом 1,5 мл.
- Поместите пробирку с белковым экстрактом на лед на 30 минут.
- Центрифугируют лизаты клеток при 17 000 x g в течение 15 мин при 4 °C.
- Перенесите каждую надосадочную жидкость в предварительно охлажденную трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всего рекомендуется 10 6-10 7 клеток для каждого состояния БП. Лизис клеток и сбор белка следует проводить с помощью ледяных буферов. Ингибиторы протеазы следует добавлять в буфер лизиса, чтобы предотвратить деградацию белка.
4. Определение концентрации белка
- Приготовьте реагент Брэдфорда, как указано производителем, разбавив его в пять раз в dH2O.
- Распределите 1 мл реагента в кювете диаметром 1 см, добавьте 1 мкл образца и перемешайте инверсией.
- Выдержать в темноте при комнатной температуре 5-10 мин.
- Считайте коэффициент поглощения на длине волны 595 нм.
- Рассчитайте объем белкового экстракта, соответствующий 1,5 мг белков, и доведите все образцы до конечного объема 600 мкл с помощью буфера лизиса.
- Держите образцы на льду до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать любой другой метод определения концентрации белка в соответствии с рекомендациями по совместимости буферов. В любом случае буфер лизиса следует использовать в качестве заготовки. Многие реагенты несовместимы с дитиотреитолом (DTT). Рекомендуется добавлять DTT или другие восстановители только после количественного определения белка (DTT до конечной концентрации 1 мМ).
5. Подготовка бусин
- Смешайте шарики в буфере для хранения, щелкнув тюбиком.
- Рассчитайте 100 мкл суспензионной среды/образца и поместите объем в магнитную стойку.
- Стирка бисера
- Удалите раствор для хранения и промойте шарики, добавив 1 мл лизисного буфера/пробирки, и переверните его вручную.
- Извлеките буфер с помощью магнитной стойки.
- Повторите этап стирки.
- Добавьте объем лизирующего буфера, равный исходному объему суспензионной среды, перемешайте, щелкнув пробирку, и равномерно распределите среду по 1,5 мл пробирок, сколько есть образцов.
- Блокировка борта
- Удалите буфер с помощью магнитной стойки и добавьте 600 мкл 0,25 мг/мл раствора дрожжевой тРНК, приготовленного в буфере для лизиса.
- Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре на вращающемся колесе.
- Удалите раствор тРНК с помощью магнитной стойки.
- Добавьте 600 мкл лизисного буфера и промойте, смешав вручную.
- Повторите этап стирки и выбросьте буфер.
6. Загрузка борта
- Приготовьте 200 мкг олигонуклеотида РНК в 600 мкл лизисного буфера для каждой пробирки, содержащей исходную среду суспензии объемом 100 мкл (теперь заблокированные шарики).
- Добавьте олиго в шарики и выдерживайте в течение 1 ч при комнатной температуре при вращении.
- Удалите раствор, добавьте 600 мкл лизисного буфера и дважды промойте шарики, вращая пробирки в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Откажитесь от буфера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не крутите бусины, а вместо этого щелкайте. Ограничьте количество шагов пипетирования, если в этом нет необходимости. По возможности используйте наконечники по 1 мл. Количество среды/образца суспензии шариков зависит от связывающей способности шариков и начального количества общего количества белков. Если прогнозируется, что олиго РНК имеет значительное количество вторичной структуры, мы рекомендуем сначала денатурировать его при 80 ° C в течение 10 мин, а затем медленно охладить при комнатной температуре или восстановить, инкубируя при 30 ° C в течение 1 часа. Предлагается восстановить олиго РНК после загрузки шарика и определить оставшуюся концентрацию, чтобы оптимизировать количество, необходимое для загрузки, и оценить возможность повторного использования РНК.
7. Связывание белка на бусинах
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента, по возможности, выполняйте действия при температуре 4 °C.
- Возьмите 5% объем из 600 мкл белкового раствора и держите его в качестве INPUT (IN) для дальнейшего анализа (1,5 мг белков растворяют в 600 мкл, поэтому 5% соответствует 30 мкл и 75 мкг белков).
- Добавьте оставшуюся белковую смесь в каждую пробирку загруженных шариков и оставьте медленно вращаться на ночь при температуре 4 ° C.
8. Промывка неспецифических связующих
- Удалите несвязанную фракцию с помощью магнитной стойки. Сохраните 5% объема и пометьте его как FLOWTHROUGH (FT) (несвязанный объем составляет ок. 600 мкл, поэтому снова оставьте 30 мкл для дальнейшего анализа).
- Добавьте 1 мл промывочного буфера 1 к шарикам и оставьте вращаться на 5 минут при 4 °C.
- Откажитесь от буфера.
- Повторите шаги 8.2 и 8.3.
- Добавьте 1 мл буфера для стирки 2 в шарики и оставьте вращаться на 5 минут при 4 °C.
- Откажитесь от надосадочной жидкости.
9. Элюирование специфических связующих веществ
- Добавьте 100 мкл элюирующего буфера 1 или элюирующего буфера 2 к шарикам.
- Смешайте вручную и выдерживайте 5 минут при комнатной температуре.
- Поместите трубки в термомиксер и энергично встряхивайте в течение 5 минут при 95 ° C.
- Поместите трубку в магнитную стойку и соберите элюированную фракцию в чистую трубку.
- Быстро раскрутите шарики с помощью настольной центрифуги, чтобы максимально восстановить элюат.
- Сохраните 5% от общего объема ELUATE (EL) для дальнейших анализов (общий объем составляет 100 мкл, поэтому разделите 5 мкл в другую пробирку).
- При необходимости концентрацию белка можно определить, как показано в разделе 4, используя элюирующий буфер в качестве заготовки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется воздерживаться от добавления DTT в буфер для элюирования до тех пор, пока не будет определена концентрация белка. Если количественное определение белка не требуется или если доступны наборы для количественного определения белка, совместимые с восстановительным агентом, 1 мМ DTT может быть добавлен в буфер элюирования с самого начала. В этом протоколе были протестированы как элюирующий буфер 1 (содержащий 1 М NaCl), так и элюирующий буфер 2 (с 2 М NaCl). Никакой разницы в эффективности элюирования целевого белка при повышенной ионной силе не наблюдалось, но рекомендуется протестировать оба условия перед установлением наиболее подходящего буфера. Если высокое содержание соли в элюирующем буфере представляет собой ограничение для дальнейшего анализа, то очень низкое количество моющих средств в элюирующем буфере позволяет осуществлять буферный обмен. В качестве альтернативы элюат можно разбавлять до достижения желаемой концентрации соли.
10. Идентификация белковых связывающих методом масс-спектрометрии
- Осаждение ацетона
- Сконцентрируйте элюированные белки, разбавив их в четыре раза в холодном (-20 ° C) ацетоне.
- Встряхните и инкубируйте трубку при -20 °C в течение ночи.
- Отжим при 17 000 x g в течение 30 мин при 4 °C.
- Аккуратно удалите надосадочную жидкость и дайте ацетону испариться, пока гранула полностью не высохнет.
- Переваривание белка в растворе
- Растворите белковую гранулу, добавив 50 мкл денатурационного буфера.
- Добавьте DTT до конечной концентрации 5 мМ, что позволит восстановить содержание белка в течение 30 минут при 55 ° C.
- Охладите образцы при комнатной температуре и продолжайте реакцию алкилирования белка, добавляя йодоацетамид (IAA) в концентрации 10 мМ в течение 15 мин.
- Переваривают белки с использованием подходящего фермента (трипсин, LysC) и инкубируют образцы в течение ночи при 37 ° C.
- Остановите пищеварение, добавив 1 мкл 10% трифторуксусной кислоты (TFA).
- Очистите и сконцентрируйте пептиды на специальной микроколонке C18 с обращенной фазой, как описано ранее19.
- Элюте пептиды из наконечника C18 буфером B.
- Удалите органический компонент с помощью вакуумной центрифуги и ресуспендируйте пептиды в 5 мкл 0,1% муравьиной кислоты для дальнейшего анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, расщепление белка может быть выполнено «на шариках» сразу после промывки неспецифических связующих (этапы 8.1-8.6), что ускоряет протокол. Тем не менее, целесообразно проверить эффективность фермента, работающего «на шариках» иммобилизованных белков, по сравнению со стандартом в растворе, чтобы гарантировать оптимальное экспериментальное покрытие белковой последовательности.
- Жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия (ЖХ-МС/МС)
- Подключите аналитическую колонку (C18 - неподвижная фаза) и поддерживайте ее при температуре 45 °C во время прогона.
- Подсоедините колонку к выходу шестиходового поворотного клапана насоса LC через капиллярный плотный фитинг (20 мкм x 550 мм) в конфигурации с одной колонкой.
- Отрегулируйте параметры LC следующим образом:
- Загрузите пептиды под контролируемым давлением (980 бар) в буфер А.
- Применяйте градиент буфера B 5-20% при 300 нл / мин в течение 59 минут, затем градиент буфера B 20-30% в течение 15 минут и градиент буфера B 30-65% в течение 5 минут.
- Добавьте стадию промывки, увеличив концентрацию буфера B до 95% в течение 5 минут, плюс 5-минутную изократическую стадию при 95% буфера B.
- Используйте масс-спектрометр в режиме сбора данных (DDA) для автоматического переключения между событиями MS и MSMS.
- Определите количество циклов, равное 15, используя целевое значение автоматической регулировки усиления (АРУ) 3 x 106 и 1 x 105 для событий MS и MSMS соответственно.
- Установите максимально допустимое время накопления ионов 20 мс для МС с разрешением 60 К и 100 мс для МСМС с разрешением 15 К.
- Проведите эксперимент по фрагментации с высокой диссоциацией столкновений (HCD) с использованием нормализованной энергии столкновения 28% с динамическим временем исключения 20 с.
- Управляйте параметрами источника следующим образом:
Напряжение распыления: 1,7 кВ
Капиллярное напряжение: 275 °C
Не используется ни оболочка, ни вспомогательный газ
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе масс-спектрометрический анализ (МС) сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) был специально выполнен с использованием одноколоночной установки LC, соединенной с гибридным прибором с тройным квадрупольным орбитрапом (таблица материалов). Можно использовать другие системы LCMS, но рекомендуется адаптировать параметры.
- Анализ данных
- Используйте кнопку «Загрузить », чтобы импортировать необработанные файлы.
- Определите имена экспериментов, нажав кнопку «Установить эксперимент ».
- Войдите в раздел параметров, специфичных для группы, чтобы указать все параметры, связанные с идентификацией:
Фермент, используемый для пищеварения: трипсин / P
Пропущенные декольте: до трех
Исправлена модификация: Карбамидометилирование
Переменная модификация: N-ацетил (белок), окисление (M) - Загрузите обновленный файл FASTA, доступный из общедоступных баз данных, таких как UniprotKB.
- Укажите корректные правила синтаксического анализа в соответствии с источником выбранной базы данных.
- Определите значение коэффициента ложного обнаружения происхождения (FDR) = 1 как для белков, так и для пептидов.
- Добавьте параметр количественного определения без меток (LFQ) на вкладке «Количественная оценка без меток».
- Держите минимальное количество коэффициентов LFQ равным двум.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы описываем анализ данных с использованием программного обеспечения MaxQuant24 и Perseus25 для количественного определения белка и последующего статистического анализа соответственно. Тем не менее, анализ данных может быть выполнен с помощью любого другого коммерчески доступного или бесплатного биоинформатического средства. FDR оценивается с использованием подхода, основанного на базе данных целевой приманки26. Пептид и белок FDR, равный 0,01, означает, что идентифицированные пептиды и белки, как ожидается, будут содержать 1% ложноположительных результатов.
- Статистический анализ
- Загрузите файл proteingroups.txt для выполнения статистического анализа на уровне белка.
- Определите значения LFQ в качестве основных столбцов.
- Удалите «обратные» и «загрязнения», отфильтровав строки на основе категориального столбца.
- Используйте строки категориальных аннотаций для группировки различных условий эксперимента.
- Уменьшите матрицу данных, выбрав количество допустимых значений в каждой из ранее определенных групп.
- Выберите статистический тест, который лучше подходит для условий эксперимента (например, t-критерий, многовыборочный тест ANOVA).
- Определите пороговое значение для важных подсказок с помощью расчета на основе FDR. Как правило, как 0,01, так и 0,05 принимаются в качестве пороговых значений для скорректированного значения p .
- Визуализируйте результаты дифференциального анализа, основанного на статистике t-критерия, используя представление графика вулкана.
- Экспортируйте итоговую матрицу в .txt формате для дальнейшего редактирования итоговой таблицы результатов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Папка конфигурации содержит файл FASTA с белками, такими как кератины, которые считаются распространенными загрязнителями в глобальных протеомных экспериментах, которые помечены знаком + в выходной таблице. В настоящем исследовании, имея два условия выборки, для статистического анализа используется t-критерий.
11. Валидация результатов методом вестерн-блоттинга
- Пробоподготовка
- Добавьте соответствующий объем 4-кратного буфера загрузки образцов к каждой аликвоте IN, FT и EL.
- Прокипятите образцы в течение 5 минут при температуре 95°C.
- Быстрый отжим для извлечения испарившегося образца из верхней части пробирок.
- SDS-PAGE и перенос геля
- Загрузите образцы на 4%-12% денатурирующий полиакриламидный гель.
- Запустите гель с буфером MES SDS в течение 1,5 ч при напряжении 120 В.
- Перенесите гель на нитроцеллюлозную мембрану с помощью полусухой трансферной кассеты, следуя инструкциям производителя. Мы рекомендуем 10-минутную передачу при напряжении 15 В.
- Иммунодетекция
- Заблокируйте мембрану 10% бычьим сывороточным альбумином (BSA) на 1 ч при комнатной температуре, осторожно перемешивая.
- Добавьте первичное антитело, приготовленное в 5% BSA, в TBST, согласно инструкции производителя. Оставить на ночь при температуре 4 °C или на 1 час при комнатной температуре при легком перемешивании.
- Промойте мембрану трижды TBST, каждый раз по 5 мин.
- Добавляют вторичное антитело, приготовленное в ТБСТ, в течение 1 ч при комнатной температуре при перемешивании.
- Промойте мембрану трижды TBST, каждый раз по 5 мин.
- Визуализируйте результаты с помощью сканера блоттинга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обнаружения TDP-43 использовали известное связывающее наше РНК рекомбинантное моноклональное антитело кролика и оставляли с мембраной на ночь при 4 ° C. В качестве вторичного антитела использовалась пероксидаза хрена (HRP) против кролика IgG, но также будет работать флуоресцентное вторичное антитело. Чтобы визуализировать антитела на мембране, мембрану инкубировали с субстратом Clarity Western ECL в течение 1 минуты перед визуализацией с помощью системы визуализации ChemiDoc.
Representative Results
Для проверки валидности предложенного протокола представленные здесь эксперименты с ПД были выполнены с использованием биотинилированного РНК-аптамера, разработанного in silico для специфического связывания TDP-4320. Эта РНК связывает свою белковую мишень с высокой аффинностью связывания (Kd = 90 нМ)20. Здесь эта РНК последовательности 5'-CGGUGUUGCU-3', обозначается именем «+РНК». В качестве отрицательного контроля использовалась обратная комплементарная последовательность +РНК, которая здесь называется «-РНК». Его последовательность составляет 5'-AGCAACACCG-3'. -РНК демонстрирует значительно более низкое сродство связывания к TDP-43 (Kd = 1,5 мкМ)19. Для целей протокола, описанного здесь, эти олигонуклеотиды РНК были приобретены конъюгированными с молекулой биотина, чтобы обеспечить связывание с шариками стрептавидина. + РНК была приобретена с биотином-ТЭГ на 3'-конце, который включает 15-атомный триэтиленгликолевый спейсер между биотином и фосфатной группой нуклеиновой кислоты; -РНК вместо этого имела биотин на своем 5'-конце, конъюгированный с нуклеиновой кислотой через линкер амино-С6. Однако, если конструкция приманки РНК надежна, и до тех пор, пока нет структурного или химического вмешательства между линкером и РНК, могут быть использованы другие позиции для конъюгации биотина и других длин линкера.
Знание идентичности основного белка, который должен быть обнаружен связанным с зондом + РНК после PD, позволило проверить протокол путем идентификации TDP-43 в элюате с использованием как масс-спектрометрии (MS), так и вестерн-блоттинга (WB) (рис. 1).
Анализ МС проводился на четырех репликациях ПД, выполненных с использованием либо +РНК, либо -РНК (рис. 2). Идентификация интерактомов +РНК и -РНК выходит за рамки этого протокола, однако сообщается о некоторых результатах, подтверждающих точность протокола. Следует отметить, что построение графика значительно обогащенных белков на графике вулкана показало, что общее содержание белка и обогащенные белки, элюированные из +РНК, были значительно выше, чем то, что было извлечено из -РНК (рис. 2). Это означает, что, несмотря на одинаковую длину и структурное содержание (линейное), +РНК может устанавливать большее количество специфических взаимодействий, которые сохраняются до стадии элюирования с высоким содержанием соли. Вполне вероятно, что -РНК вместо этого устанавливает большее количество неспецифических контактов, которые нарушаются на этапах промывки. Как и ожидалось, TDP-43 был идентифицирован как уникальный интерактор +РНК20; среднее количественное определение без меток (LFQ) для четырех реплик PD, выполненных с помощью +РНК, составляет 31,96 ± 0,56, в то время как белок не идентифицирован среди интеракторов -РНК. Кроме того, среди всех уникальных интеракторов +РНК TDP-43 оказался наиболее обильно обогащенным белком.
Для дальнейшей проверки протокола был использован собственный алгоритм RAPID18,19, чтобы вычислительно предсказать, какие другие белки будут специфически связываться либо с +РНК, либо с -РНК. В частности, оценки взаимодействия для +РНК и -РНК с белками, составляющими протеом человека, были рассчитаны с использованием функции «склонности к взаимодействию» catRAPID, как определено в нашей предыдущей работе27. Среди белков, набранных с высокой степенью достоверности, было предсказано, что HNRNPH3 селективно связывается с +РНК (+ оценка взаимодействия РНК = 1,01; оценка взаимодействия с РНК = 0,21) и PCBP2 специфически взаимодействует с -РНК (+ оценка взаимодействия РНК = -0,5; оценка взаимодействия с РНК = 0,31) (рис. 3A). Кроме того, было предсказано, что белок RBM41 будет беспорядочным для обоих олигонуклеотидов РНК (+ оценка взаимодействия РНК = 0,4; оценка взаимодействия РНК = 0,39) (рис. 3A). Анализ МС действительно подтвердил наличие HNRNPH3 и PCBP2 в PD +РНК и -РНК соответственно, в то время как RBM41 был обнаружен взаимодействующий с обоими (рис. 3B).
WB использовался для обнаружения присутствия TDP-43 для дальнейшего подтверждения результатов и во время оптимизации протокола (рис. 4). В процедуре, описанной здесь, разные образцы были собраны на разных этапах. Входная проба (IN) состояла из общего количества белков, разведенных в буфере лизиса. Проточный (FT) был получен после ночной инкубации общих белков с гранулами стрептавидина, предварительно покрытыми биотинилированной РНК, представляющей собой фракцию белков, которые не связывали РНК. Наконец, элюат (EL) содержал все белки, которые специфически распознавали исследуемую РНК, поскольку между стадиями FT и EL три стадии промывки солью 150 мМ и 0,1% тритона-X должны были удалить самые слабые взаимодействия.
Для каждой репликации одинаковое количество (5% v/v) IN, FT и EL запускали параллельно на SDS-PAGE и окрашивали антителом против TDP-43 (рис. 4). В случае +РНК полоса TDP-43 наблюдалась в IN и в EL, что указывает на то, что белок, присутствующий с самого начала в общем белковом экстракте, удерживается +РНК во время этапов промывки и элюируется только в конце буфером с высоким содержанием соли. TDP-43 также присутствовал в IN для -РНК, однако полоса, соответствующая белку, также видна в FT, что указывает на то, что эта РНК не связывает TDP-43. Отсутствие полосы ТДП-43 в ЭЛ подтверждает этот результат.
Во время оптимизации протокола элюирование белков, специфически связанных с последовательностями РНК, исследовали как элюирующим буфером, содержащим 1 M NaCl (EB1), так и элюирующим буфером в комплекте с 2 M NaCl (EB2) (рис. 4). Элюаты, полученные с любым БЭ, сравнивали на SDS-PAGE и блотировали антителом против TDP-43. Полученные изображения затем были проанализированы с помощью ImageJ28 для количественной оценки любой разницы в количестве TDP-43, элюированного двумя буферами. В целом, существенной разницы не наблюдалось, и мы пришли к выводу, что в этих анализах 1 М соли достаточно, чтобы нарушить даже самые сильные взаимодействия белка и РНК.
В целом, результаты, представленные здесь для MS и WB, демонстрируют, что этот протокол эффективен в захвате белковых интеракторов данной РНК определенным образом и что он обеспечивает элюирование в буферах, совместимых с последующим анализом.
Рисунок 1: Эскиз экспериментального трубопровода, используемого в предлагаемом протоколе . (А) Биотинилированный олигонуклеотид РНК получают в лизирующем буфере в соответствующей концентрации. (B) Магнитные шарики стрептавидина промываются, блокируются дрожжевой тРНК и загружаются биотинилированной РНК. (C) Общий белковый экстракт, полученный из культивируемых клеточных линий млекопитающих, добавляют к смеси шариков и РНК. (D) Многократные промывки выполняются для удаления неспецифических взаимодействий. (E) Специфические белковые интеракторы отделяются от РНК с помощью гипертонического раствора. (F) Идентичность взаимодействующих лиц выявляется с помощью масс-спектрометрии, а конкретные случаи подтверждаются вестерн-блоттингом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Аналитическая стратегия количественного определения белка на основе РС без меток . (A) Элюированные белки осаждаются в холодном ацетоне в течение ночи. Затем белки денатурируют и проводят расщепление в растворе. Протеолитические пептиды концентрируются и обессоливаются. (B) Пептиды анализируются с помощью ЖХ-МС/МС с использованием «дробовика». (C) Обработка и анализ необработанных данных выполняются с использованием программного обеспечения MaxQuant и Perseus, соответственно. (D) Статистически значимые обогащенные белки отображаются на вулканическом графике. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Корреляция между прогнозируемыми склонностями к взаимодействию и экспериментально определенными взаимодействиями +РНК и -РНК. (A) оценки взаимодействия RAPID catпо отношению к HNRNPH3, PCBP2 и RBM41, что указывает на преимущественное связывание HNRNPH3 для +РНК и PCBP2 для -РНК, в то время как RBM41, по прогнозам, будет без разбора связывать обе последовательности РНК. (B) Средние количественные значения без меток, определенные масс-спектрометрическим анализом по вытягиванию, выполненному с помощью +РНК и -РНК. Анализ подтверждает, что HNRNPH3 связывается только с +РНК, PCBP2 связывает только с -РНК, а RBM41 связывается с обеими в равной степени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Валидация вестерн-блоттингом наличия/отсутствия TDP-43 среди интеракторов выбранных последовательностей РНК. Мембрана WB была обработана антителом против TDP-43. IN = вход; FT = проточный; EL (EB1) = элюирование с элюирующим буфером 1; EL (EB2) = элюирование с элюирующим буфером 2; знак «+» указывает на образцы, полученные в результате вытягивания, выполненного с помощью +РНК; знак «-» указывает на образцы, полученные в результате вытягивания, выполненного с помощью -РНК; Полоса 1 содержит белковую лестницу. ТДП-43 обозначается стрелкой. WB указывает, что TDP-43 обнаружен среди +РНК-интеракторов, но не среди -РНК-интеракторов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Имя буфера | Состав | |||||
| 10-кратный буфер передачи | 250 мМ трис, 1,92 М глицина, 1% SDS, 20% метанола. Разбавьте в 10 раз перед использованием | ПД | ||||
| 20X MES SDS рабочий буфер | 1 М MES, 1 М трис, 2% SDS, 20 мМ ЭДТА. Отрегулируйте pH до 7,3. Разбавьте в 20 раз перед использованием | |||||
| 4x буфер загрузки образцов | 0,25 М трис-основания, 0,28 М SDS, 40% глицерина, 20% 2-меркаптоэтанола, 4 мг/мл бромфенолового синего | |||||
| Буфер элюирования 1 | 20 мМ фосфат рН 7,5, 1 М NaCl, 0,5 мМ ЭДТА, 0,1 % Triton X-100, 1 мМ DTT (добавляется после количественного определения) | |||||
| Буфер элюирования 2 | 20 мМ фосфата рН 7,5, 2 М NaCl, 0,5 мМ ЭДТА, 0,1 % Triton X-100, 1 мМ DTT (добавляется после количественного определения) | |||||
| Буфер лизиса | 10 мМ Tris-HCl pH 7,4, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ ЭДТА, 0,1 % Triton X-100, 1 мМ DTT и ингибиторы протеазы | |||||
| Трис-буферизованный физиологический раствор с Tween-20 | 1 М трис-HCl рН 7,4, 3 М NaCl, 2,0% твин-20 | |||||
| Буфер для стирки 1 | 10 мМ Tris-HCl pH 7,4, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ ЭДТА, 0,1 % Triton TM X-100, 1 мМ DTT и ингибиторы протеазы | |||||
| Буфер для стирки 2 | 25 мМ Hepes pH 8, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ ЭДТА, 0,1 % Triton X-100, 1 мМ DTT и ингибиторы протеазы | |||||
| Буфер А | 0,1% муравьиной кислоты | ГОСПОЖА | ||||
| Буфер B | 60% ацетонитрила, 0,1% муравьиной кислоты | |||||
| Буфер денатурации | 8М мочевина, 50 мМ трис-HCl | |||||
Таблица 1: Буферы PD и MS. Названия и состав буферов, используемых либо для экспериментов по вытягиванию (PD), либо для масс-спектрометрического анализа (MS).
Discussion
В этой работе сообщается об оптимизации протокола PD, выполненного с биотинилированными олигонуклеотидами РНК для захвата их белковых интеракторов. Описанный здесь протокол прост в исполнении, требует мало материала и дает очень надежные результаты. Важно отметить, что наиболее новые аспекты этого протокола заключаются в использовании приманки РНК, полностью разработанной in silico и специфичной для белковой мишени, и элюировании всех белков, связанных с приманкой РНК, путем непосредственного нарушения их взаимодействия с раствором с высоким содержанием соли, а не путем диссоциации стрептавидина от биотина с помощью моющего средства и высокотемпературной обработки.
Этот протокол использует силу связи между биотином и стрептавидином29,30. В соответствии с выбранными гранулами стрептавидина загрузка биотинилированной РНК должна быть проверена и количественно определена, прежде чем продолжить. Кроме того, трехмерное сворачивание РНК может повлиять на эффективность загрузки шариков, поскольку оно может ограничить воздействие биотина на стрептавидин. Блокирование шариков небиотинилированной тРНК улучшает чистоту результатов, ограничивая неспецифические взаимодействия с шариками. Загрузочный буфер и элюирующий буфер должны быть выбраны в зависимости от последующих применений. Здесь были предложены очень мягкие условия, подходящие для большинства применений и разработанные для сохранения потенциальных белковых комплексов. Однако этот метод легко адаптируется; пользователь может выбрать любую клеточную линию и любой размер РНК, а также может решить повторить протокол после сворачивания/разворачивания РНК, чтобы определить влияние структуры на свойства связывания.
Другим оригинальным аспектом этого протокола является использование инструментов прогнозирования in silico для обеспечения правильности результатов20. Заблаговременное знание того, какие белки должны быть идентифицированы как интеракторы интересующей РНК, дает беспрецедентное преимущество проверки технических аспектов протокола. Например, используя простой анализ WB, можно проверить наличие известной белковой мишени в образцах, полученных на различных этапах протокола, прежде чем приступать к анализу MS, который требует специализированных приборов и является более дорогостоящим. Кроме того, недавно сообщалось о методе использования собственного алгоритма прогнозирования белок-РНК catRAPID 20 для разработки de novo РНК, специфичной для белка-мишени. До недавнего времени единственным доступным конвейером для разработки ДНК/РНК-аптамеров для белка-мишени был подход SELEX (систематическая эволюция лигандов путем экспоненциального обогащения)31. Метод in silico позволяет гораздо быстрее и экономичнее создавать РНК-аптамеры.
Основные ограничения этого метода связаны с необходимостью работы в безнуклеазных буферах и инструментах. Кроме того, если считается необходимым подтвердить in vitro связывание между РНК, разработанной de novo, и белком-мишенью до БП, белок должен быть получен и очищен, а связывание определено с помощью биофизических подходов. Это ограничение, которое связано с выработкой моноклональных антител.
Несмотря на эти незначительные проблемы, надежные методы картирования РНК-белковых взаимодействий, такие как представленный здесь, могут приблизить ученых к раскрытию макромолекулярных сетей и сложных основных участников многих физиологических и патологических механизмов, таких как те, которые связаны с раком, кардиомиопатиями, диабетом, микробными инфекциями, а также генетическими и нейродегенеративными расстройствами.
Disclosures
У авторов нет конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить исследовательскую группу профессора Тарталья и доктора Куомо за оказанную поддержку. Э.З. получила финансирование от стипендии MINDED исследовательской и инновационной программы Европейского Союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения Марии Склодовской-Кюри No 754490.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well tissue culture plates | VWR | 10861-554 | CELLS |
| Cell scrapers | BIOSIGMA | 10153 | CELLS |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientfic | 11995065 | CELLS |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil | Thermo Fisher Scientfic | 10500064 | CELLS |
| Phosphate Buffer Saline (PBS, Waltham, MA) | Thermo Fisher Scientfic | 14190169 | CELLS |
| Trypsin (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientfic | 15050065 | CELLS |
| Anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HRP) | Cellsignal | 7070 | PD |
| Biotinylated RNA | Eurofins | Custom RNA oligonucleotides | PD |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | PD |
| Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Biorad | 1705061 | PD |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Merck - Sigma Aldrich | 5056489001 | PD |
| NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well | Invitrogen | NP0321BOX | PD |
| Recombinant anti-TDP43 antibody | Abcam | ab109535 | PD |
| Ribonucleic acid, transfer from baker's yeast (S. cerevisiae) | Merck - Sigma Aldrich | R5636-1ML | PD |
| Streptavidin Mag Sepharose | Merck - Sigma Aldrich | GE28-9857-99 | PD |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini 0.2 µm PVDF Transfer Kit | Biorad | 1704272 | PD |
| Acetone | Thermo Fisher Scientfic | 022928.K2 | MS |
| C18 cartridge | Thermo Fisher Scientfic | 13-110-018 | MS |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientfic | 20290 | MS |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | ES902 | MS |
| iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich S.r.l. | I6125 | MS |
| Lys-C/Trypsin | Promega | V5073 | MS |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo Fisher Scientfic | 28904 | MS |
| Urea | Thermo Fisher Scientfic | J75826.A7 | MS |
| Equipment | |||
| ChemiDoc imaging system | Bio-Rad | CELLS | |
| Dyna Mag -2 , Magnetic rack | Invitrogen | CELLS | |
| Forma Series 3 water jacketed C02 incubator | Thermo Scientific | PD | |
| PROTEAN II xi cell , power supply for PAGE applications | Bio-Rad | PD | |
| Rotating wheel, rotator SB3 | Stuart | PD | |
| Water bath set at 37 °C | VWR | PD | |
| XCell SureLock Mini-Cell electrophoresis system | ThermoFisher Scientific | MS | |
| Easy-nLC 1200 UHPLC | Thermo Scientific | MS | |
| Q exactive Mass Spectrometer | Thermo Scientific | MS | |
| Software | Version | ||
| MaxQuant | 2.0.3.0 | MS | |
| Perseus | 1.6.14.0 | MS |
References
- Gebauer, F., Schwarzl, T., Valcárcel, J., Hentze, M. W. RNA-binding proteins in human genetic disease. Nature Reviews Genetics. 22 (3), 185-198 (2021).
- Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Cooper, T. A., Wan, L., Dreyfuss, G. RNA and disease. Cell. 136 (4), 777-793 (2009).
- Qin, H., et al. RNA-binding proteins in tumor progression. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 90 (2020).
- Nussbacher, J. K., Tabet, R., Yeo, G. W., Lagier-Tourenne, C. Disruption of RNA metabolism in neurological diseases and emerging therapeutic interventions. Neuron. 102 (2), 294-320 (2019).
- Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. Journal of Genetics and Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
- Maziuk, B., Ballance, H. I., Wolozin, B. Dysregulation of RNA binding protein aggregation in neurodegenerative disorders. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 89 (2017).
- Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (5), 1557-1562 (2006).
- Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118 (2021).
- Weidmann, C. A., Mustoe, A. M., Jariwala, P. B., Calabrese, J. M., Weeks, K. M. Analysis of RNA-protein networks with RNP-MaP defines functional hubs on RNA. Nature Biotechnology. 39 (3), 347-356 (2021).
- Graindorge, A., et al. In-cell identification and measurement of RNA-protein interactions. Nature Communications. 10 (1), 5317 (2019).
- Ule, J., Hwang, H. W., Darnell, R. B. The future of cross-linking and immunoprecipitation (CLIP). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (8), 032243 (2018).
- Ascano, M., Hafner, M., Cekan, P., Gerstberger, S., Tuschl, T. Identification of RNA-protein interaction networks using PAR-CLIP. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (2), 159-177 (2012).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biology. 15 (1), 203 (2014).
- Sugimoto, Y., et al. Analysis of CLIP and iCLIP methods for nucleotide-resolution studies of protein-RNA interactions. Genome Biology. 13 (8), (2012).
- Bayat, P., et al. SELEX methods on the road to protein targeting with nucleic acid aptamers. Biochimie. 154, 132-155 (2018).
- Armaos, A., Colantoni, A., Proietti, G., Rupert, J., Tartaglia, G. G. CatRAPID omics v2.0: Going deeper and wider in the prediction of protein-RNA interactions. Nucleic Acids Research. 49, 72-79 (2021).
- Agostini, F., et al. CatRAPID omics: A web server for large-scale prediction of protein-RNA interactions. Bioinformatics. 29 (22), 2928-2930 (2013).
- Zacco, E., et al. Probing TDP-43 condensation using an in silico designed aptamer. Nature Communications. 13 (1), 3306 (2022).
- Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Research. 42 (2), 13 (2014).
- Zhang, Y., Lai, B. S., Juhas, M. Recent advances in aptamer discovery and applications. Molecules. 24 (5), 941 (2019).
- UniProt Consortium. UniProt: the Universal Protein Knowledgebase in 2023. Nucleic Acids Research. 51, 523-531 (2023).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Bellucci, M., Agostini, F., Masin, M., Tartaglia, G. G. Predicting protein associations with long noncoding RNAs. Nature Methods. 8 (6), 444-445 (2011).
- Gallo-Oller, G., Ordoñez, R., Dotor, J. A new background subtraction method for Western blot densitometry band quantification through image analysis software. Journal of Immunological Methods. 457, 1-5 (2018).
- Weissinger, R., Heinold, L., Akram, S., Jansen, R. P., Hermesh, O. RNA proximity labeling: A new detection tool for RNA-protein interactions. Molecules. 26 (8), 2270 (2021).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).
