Summary
Här presenterar vi en optimerad in vitro-metod för att avslöja, kvantifiera och validera proteininteraktorer av specifika RNA-sekvenser , med hjälp av totalt proteinextrakt från humana celler, streptavidinpärlor belagda med biotinylerat RNA och masspektrometrianalys.
Abstract
Protein-RNA-interaktioner reglerar genuttryck och cellulära funktioner på transkriptionell och posttranskriptionell nivå. Av denna anledning är identifiering av bindningspartnerna för ett RNA av intresse fortfarande av stor betydelse för att avslöja mekanismerna bakom många cellulära processer. RNA-molekyler kan dock interagera tillfälligt och dynamiskt med vissa RNA-bindande proteiner (RBP), särskilt med icke-kanoniska. Därför finns det ett stort behov av förbättrade metoder för att isolera och identifiera sådana RBP.
För att identifiera proteinpartnerna i en känd RNA-sekvens effektivt och kvantitativt utvecklade vi en metod baserad på pull-down och karakterisering av alla interagerande proteiner, med utgångspunkt från cellulärt totalt proteinextrakt. Vi optimerade proteinneddragningen med hjälp av biotinylerat RNA förladdat på streptavidinbelagda pärlor. Som ett bevis på konceptet använde vi en kort RNA-sekvens som är känd för att binda det neurodegenerationsassocierade proteinet TDP-43 och en negativ kontroll av en annan nukleotidkomposition men samma längd. Efter att ha blockerat pärlorna med jäst-tRNA laddade vi de biotinylerade RNA-sekvenserna på streptavidinpärlorna och inkuberade dem med det totala proteinextraktet från HEK 293T-celler. Efter inkubation och flera tvättsteg för att avlägsna ospecifika bindemedel eluerade vi de interagerande proteinerna med en högsaltlösning, kompatibel med de vanligaste proteinkvantifieringsreagenserna och med provberedning för masspektrometri. Vi kvantifierade anrikningen av TDP-43 i neddragningen utförd med det kända RNA-bindemedlet jämfört med den negativa kontrollen med masspektrometri. Vi använde samma teknik för att verifiera de selektiva interaktionerna mellan andra proteiner som beräkningsmässigt förutspåddes vara unika bindemedel för vårt RNA av intresse eller för kontrollen. Slutligen validerade vi protokollet med western blot via detektion av TDP-43 med en lämplig antikropp.
Detta protokoll kommer att möjliggöra studier av proteinpartnerna i ett RNA av intresse för nära fysiologiska förhållanden, vilket hjälper till att avslöja unika och oförutsägbara protein-RNA-interaktioner.
Introduction
RNA-bindande proteiner (RBP) har framträtt som avgörande aktörer i transkriptionell och posttranskriptionell genreglering, eftersom de är involverade i processer som mRNA-splitsning, RNA-cellulär lokalisering, translation, modifiering och nedbrytning 1,2,3. Sådana interaktioner mellan de två makromolekylerna är mycket samordnade, exakt balanserade och väsentliga för bildandet av funktionella och bearbetningsnav. Variationer eller dysreglementen inom dessa nav har potential att störa de finreglerade protein-RNA-nätverken och är alltmer associerade med en mängd olika mänskliga sjukdomar, inklusive cancer 4,5 och neurodegenerativa störningar 6,7,8. Interaktionerna mellan RNA-molekyler och deras proteinbindande partners kan vara antingen stabila och lätta att validera experimentellt, eller mycket dynamiska, övergående och svårare att karakterisera.
Under de senaste åren har intensiva ansträngningar gjorts för att förstå dessa interaktioner. Bland de mest etablerade metoderna är proteinpull-down-analyser (PD) förmodligen de mest uppskattade och vanliga metoderna för att avslöja de viktigaste aktörerna som utgör ribonukleoproteinkomplex (RNP) och andra protein-RNA-interaktionsnätverk 3,9,10. PD inkluderar ett brett paraply av informativa tekniker, såsom immunoprecipitation av antingen RNA (RIP)11,12 eller proteinet (CLIP)13,14 av intresse. Några av dessa RNA-PD-protokoll använder ett känt RNA som bete för proteiner15, oftast genom att dra nytta av taggar med hög affinitet som biotin. I detta fall kan interaktionspartnerna för ett biotinylerat RNA detekteras genom att förankra RNA på streptavidinbelagda pärlor, vilket möjliggör effektiv isolering av RNP: erna. De viktigaste begränsningarna med dessa tillvägagångssätt är vanligtvis utformningen av de biotinylerade sonderna och testningen av deras förmåga att binda målproteiner. För detta ändamål kan det vara användbart att förlita sig på publicerade CLIP-data för proteinet av intresse, om sådana finns, eftersom de med hög precision avslöjar de korta RNA-regioner som motsvarar toppar av interaktioner med målproteinet13,16. Samma regioner kan användas för att utveckla sonder för PD. En alternativ metod för att designa sådana RNA-beten kan vara systematisk utveckling av ligander genom exponentiell anrikning (SELEX)17, vilket möjliggör design av aptamerer genom in vitro-urval, med utgångspunkt från ett omfattande randomiserat bibliotek och via en serie PCR-drivna optimeringscykler. SELEX är dock komplext och tidskrävande, och de slutliga resultaten är mycket beroende av det ursprungliga biblioteket. För att välja RNA-betet att använda i protokollet som presenteras här utnyttjades ännu ett tillvägagångssätt, bestående av att använda ett RNA-bete designat de novo med hjälp av beräkningskraften hos algoritmkatten RAPID, som förutsäger preferensbindningen av ett givet protein mot vissa RNA-sekvenser18,19,20.
Protokollet som introduceras här är en version av en RNA-PD optimerad för att eluera specifika proteinpartners under nära fysiologiska förhållanden, utan användning av tvättmedel, denatureringsmedel eller höga temperaturer. Det bygger på nano-superparamagnetiska pärlor kovalent belagda med högrenad streptavidin och användningen av ett specifikt in silico-designat biotinylerat RNA som bete. Detta protokoll ger en snabb och effektiv metod för att isolera bindningspartnerna för biotinylerade RNA-molekyler under naturliga förhållanden, vilket ger potential för ett brett spektrum av nedströmsapplikationer. För att testa detta protokoll användes en 10-nukleotid enkelsträngad RNA-aptamersekvens, tidigare utformad för att binda proteinet TAR DNA-bindande protein 43 (TDP-43) med hög affinitet och specificitet,20. Med utgångspunkt från HEK 293T-celllysater identifierades interaktorerna för den biotinylerade RNA-aptameren med hjälp av masspektrometrianalys utförd på prover som lossnat från RNA-betet med hjälp av en hypertonisk buffert. Denna analys bekräftade den framgångsrika identifieringen och kvantifieringen av TDP-43 som föredraget bindemedel.
Detta protokoll möjliggör framgångsrik identifiering av proteininteraktorer med endast en kort, in vitro syntetiserad RNA-oligonukleotid. Dessutom garanterar användningen av in silico-designade RNA-aptamerer som PD-sonder21,22 specificitet för målen till avsevärt reducerade kostnader.
Protocol
1. Allmänna metoder och material
- Bered lämpligt medium för den valda cellkulturen hos däggdjur och förvärm den vid 37 °C i 20 minuter före användningen.
- Förbered det nödvändiga materialet i förväg, enligt beskrivningen i materialförteckningen. Autoklavglas, plastvaror och buffertlager.
- Förbered buffertarna enligt beskrivningen i tabell 1. Justera stamlösningarnas pH med koncentrerad HCl eller NaOH innan komponenterna späds ut till sina slutliga volymer.
2. Förberedelse av däggdjurscellinjen
- Odla HEK 293T-celler i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 100 μg / ml penicillin / streptomycinlösning. Inkubera dem vid 37 °C i en fuktad inkubator med 5 % CO2. Dela cellerna rutinmässigt.
- Innan du lossnar, skölj cellerna med tillräckligt med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att täcka odlingsytan.
- Ta bort PBS och tillsätt ett ultratunt lager trypsin-EDTA-lösning.
- Inkubera cellerna vid 37 °C i en fuktad inkubator försedd med 5 %CO2 i 5 minuter, eller tills cellerna är avskilda (de ska se spridda ut under mikroskopisk observation).
- Späd trypsin-EDTA-lösningen tiofaldigt genom att tillsätta fullständig DMEM för att inaktivera den och räkna cellerna.
- Platta 1,5 x 105 celler / ml i 6-brunnsplattor, med tanke på två brunnar / tillstånd att testa.
- Inkubera cellerna vid 37 °C i 48 timmar i en fuktad inkubator med 5 %CO2.
OBS: Kontrollera tillverkarens instruktioner för vilken typ av medium och tillägg apt för cellinjen. Mängden och inkubationstiden för trypsin-EDTA beror också på cellinjen. Vissa celltyper växer snabbare / långsammare än vad som rapporterades i detta protokoll; Således bör såddkoncentrationen testas i förväg.
3. Total proteinskörd
- Ta bort medium från brunnarna där cellerna växer.
- Tvätta varje brunn på 6-brunnsplattorna med 1 ml PBS.
- Kassera PBS.
- Flytta plattorna på is och fortsätt antingen med steg 3.5 eller frys de torra plattorna vid -80 °C för att underlätta lysen.
- Tillsätt 200 μL lysbuffert till varje brunn.
- Använd en cellskrapa för att lossa och bryta cellerna.
- Överför cellextraktet från två brunnar till samma 1,5 ml rör.
- Lägg tuben med proteinextraktet på is i 30 min.
- Centrifugera celllysaten vid 17 000 x g i 15 min vid 4 °C.
- Överför varje supernatant till ett förkylt rör.
OBS: Totalt 10 6-10 7 celler för varje PD-tillstånd rekommenderas. Celllys och proteinskörd bör utföras med iskalla buffertar. Proteashämmare bör tillsättas till lysbufferten för att förhindra proteinnedbrytning.
4. Bestämning av proteinkoncentration
- Förbered Bradford-reagens, enligt tillverkarens anvisningar, genom att späda det femfaldigt idH2O.
- Fördela 1 ml reagens i en 1 cm kyvett, tillsätt 1 μl av provet och blanda genom inversion.
- Inkubera i mörker vid rumstemperatur i 5-10 min.
- Avläs absorbansen vid 595 nm.
- Beräkna volymen proteinextrakt motsvarande 1,5 mg proteiner och bringa alla prover till en slutlig volym på 600 μl med hjälp av lysbuffert.
- Förvara proverna på is tills de används.
OBS: Alla andra metoder för bestämning av proteinkoncentration kan användas enligt rekommendationer om buffertkompatibilitet. I vilket fall som helst bör lysbufferten användas som ett ämne. Många reagenser är inte kompatibla med ditiotreitol (DTT). Det rekommenderas att tillsätta DTT eller andra reduktionsmedel först efter proteinkvantifiering (DTT till en slutlig koncentration på 1 mM).
5. Förberedelse av pärlor
- Blanda pärlorna i deras lagringsbuffert genom att knäppa röret.
- Beräkna 100 μl flytgödselmedium/prov och placera volymen i ett magnetställ.
- Pärla tvätt
- Ta bort förvaringslösningen och tvätta pärlorna genom att tillsätta 1 ml lysbuffert/rör och vänd upp och ned manuellt.
- Ta bort bufferten med magnetstället.
- Upprepa tvättsteget.
- Tillsätt en volym lysbuffert som är lika med den ursprungliga volymen flytgödselmedium, blanda genom att knäppa röret och fördela mediet jämnt i så många 1,5 ml rör som det finns prover.
- Blockering av pärlor
- Ta bort bufferten med magnetstället och tillsätt 600 μL av en 0,25 mg/ml lösning av jäst-tRNA beredd i lysbuffert.
- Inkubera i 1 h vid rumstemperatur på ett roterande hjul.
- Ta bort tRNA-lösningen med magnetstället.
- Tillsätt 600 μl lysbuffert och tvätta genom att blanda manuellt.
- Upprepa tvättsteget och kassera bufferten.
6. Pärlladdning
- Bered 200 μg RNA-oligonukleotid i 600 μl lysbuffert för varje rör som innehåller det ursprungliga 100 μl uppslamningsmediet (nu blockerade pärlor).
- Tillsätt oligo till pärlorna och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur medan du roterar.
- Ta bort lösningen, tillsätt 600 μL lysbuffert och tvätta pärlorna två gånger genom att rotera rören i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Kassera bufferten.
OBS: Virvla aldrig pärlorna, utan snärta istället. Begränsa antalet pipetteringssteg, om det inte är nödvändigt. När det är möjligt, använd skär, 1 ml spetsar. Mängden uppslamningsmedium/prov för strängar beror på kulans bindningsförmåga och utgångsmängden för de totala proteinerna. Om RNA-oligo förutspås ha en betydande mängd sekundär struktur, rekommenderar vi att den först denatureras vid 80 ° C i 10 minuter och sedan kyls ner långsamt vid rumstemperatur eller reflateras genom att inkubera den vid 30 ° C i 1 timme. Det föreslås att återvinna RNA-oligo efter pärlladdning och bestämma koncentrationen kvar för att optimera den mängd som krävs för laddning och för att utvärdera möjligheten att återanvända RNA.
7. Proteinbindning på pärlor
OBS: Från och med nu, när det är möjligt, utför stegen vid 4 ° C.
- Ta en 5% volym från 600 μL proteinlösningen och behåll den som INPUT (IN) för vidare analys (1,5 mg proteiner löses i 600 μL, så 5% motsvarar 30 μL och 75 μg proteiner).
- Tillsätt den återstående proteinblandningen till varje tub med laddade pärlor och låt den långsamt rotera över natten vid 4 °C.
8. Tvättning av ospecifika bindemedel
- Ta bort den obundna fraktionen med magnetstället. Spara 5% av volymen och märk den som FLOWTHROUGH (FT) (den obundna volymen är ca. 600 μL, så behåll igen 30 μL för vidare analys).
- Tillsätt 1 ml tvättbuffert 1 till pärlorna och låt den rotera i 5 minuter vid 4 °C.
- Kassera bufferten.
- Upprepa steg 8.2 och 8.3.
- Tillsätt 1 ml tvättbuffert 2 till pärlorna och låt den rotera i 5 minuter vid 4 °C.
- Kassera supernatanten.
9. Eluering av specifika bindemedel
- Tillsätt 100 μL elueringsbuffert 1 eller elueringsbuffert 2 till pärlorna.
- Blanda manuellt genom att snärta och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Placera rören i en termomixer och skaka kraftigt i 5 min vid 95 °C.
- Placera röret i magnetstället och samla den eluerade fraktionen i ett rent rör.
- Snurra snabbt pärlorna med en bänkcentrifug för att maximera eluatets återhämtning.
- Spara 5% av den totala ELUATE-volymen (EL) för ytterligare analyser (total volym är 100 μL, så separera 5 μL i ett annat rör).
- Vid behov kan proteinkoncentrationen bestämmas enligt avsnitt 4 genom att använda elueringsbuffert som blindprov.
OBS: Det rekommenderas att man avstår från att tillsätta DTT till elueringsbufferten tills proteinkoncentrationen har bestämts. Om proteinkvantifiering inte krävs, eller om reduktionsmedelkompatibla proteinkvantifieringssatser finns tillgängliga, kan 1 mM DTT tillsättas till elueringsbufferten från början. I detta protokoll testades både elueringsbuffert 1 (innehållande 1 M NaCl) och elueringsbuffert 2 (med 2 M NaCl). Ingen skillnad i målproteinets elueringseffektivitet observerades med ökad jonstyrka, men det rekommenderas att testa båda förhållandena innan den lämpligaste bufferten fastställs. Om en hög förekomst av salt i elueringsbufferten utgör en begränsning för vidare analys, möjliggör den mycket låga mängden tvätt- och rengöringsmedel i elueringsbufferten buffertbyte. Som ett alternativ kan eluatet spädas för att nå önskad saltkoncentration.
10. Identifiering av proteinbindemedel med masspektrometri
- Aceton nederbörd
- Koncentrera de eluerade proteinerna genom att späda det fyrfaldigt i kall aceton (-20 °C).
- Virvla och inkubera röret vid -20 °C över natten.
- Snurra vid 17 000 x g i 30 min vid 4 °C.
- Ta försiktigt bort supernatanten och låt acetonen avdunsta tills pelleten har torkat helt.
- Proteinuppslutning i lösning
- Lös upp proteinpelleten genom att tillsätta 50 μl denatureringsbuffert.
- Tillsätt DTT till en slutlig koncentration på 5 mM, vilket möjliggör proteinreduktion i 30 minuter vid 55 °C.
- Kyl ner proverna vid rumstemperatur och fortsätt med proteinalkyleringsreaktionen, tillsätt jodacetamid (IAA) i en koncentration av 10 mM i 15 minuter.
- Smält proteinerna med ett lämpligt enzym (trypsin, LysC) och inkubera proverna över natten vid 37 °C.
- Avbryt matsmältningen genom att tillsätta 1 μL 10% trifluorättiksyra (TFA).
- Rengör och koncentrera peptiderna på en anpassad omvänd fas C18-mikrokolonn, som tidigare beskrivits19.
- Eluera peptider från C18-spetsen med buffert B.
- Avlägsna den organiska komponenten med hjälp av en vakuumcentrifug och återsuspendera peptiderna i 5 μL 0,1% myrsyra för vidare analys.
OBS: Alternativt kan proteinnedbrytning utföras "på pärlor" omedelbart efter tvättning av ospecifika bindemedel (steg 8.1-8.6), vilket gör protokollet snabbare. Det är emellertid lämpligt att testa effektiviteten hos enzymet som arbetar "on-beads" immobiliserade proteiner jämfört med standard i lösningsuppslutning för att garantera optimal experimentell proteinsekvenstäckning.
- Masspektrometri med vätskekromatografi-tandem (LC-MS/MS)
- Anslut analyskolonnen (C18-stationär fas) och håll den vid 45 °C under körningen.
- Anslut kolonnen till utloppet på en rotationsventil med sex portar på LC-pumpen genom en kapillär fingertät koppling (20 μm x 550 mm) i en konfiguration med en kolonn.
- Justera LC-inställningarna enligt följande:
- Ladda peptiderna under kontrollerat tryck (980 bar) i buffert A.
- Applicera en 5%-20% buffert B-gradient vid 300 nL/min över 59 min, följt av en 20%-30% buffert B-gradient över 15 min och en 30%-65% buffert B-gradient över 5 min.
- Lägg till ett tvättsteg genom att öka koncentrationen av buffert B upp till 95 % under 5 minuter plus ett isokratiskt steg på 5 minuter vid 95 % buffert B.
- Använd masspektrometern i DDA-läge (databeroende insamling) för att automatiskt växla mellan MS- och MSMS-händelser.
- Definiera ett slingantal som är lika med 15 med hjälp av ett AGC-målvärde (Automatic Gain Control) på 3 x 106 och 1 x 105 för MS- respektive MSMS-händelserna.
- Ställ in den högsta tillåtna jonackumuleringstiden till 20 ms för MS med en upplösning på 60 K och 100 ms för MSMS med en upplösning på 15 K.
- Utför ett fragmenteringsexperiment med hög kollisionsdissociation (HCD) med en normaliserad kollisionsenergi på 28%, med en dynamisk uteslutningstid på 20 s.
- Använd källparametrarna enligt följande:
Sprayspänning: 1,7 kV
Kapillärspänning: 275 °C
Varken mantel eller hjälpgas används
OBS: I detta protokoll har ultrahög prestanda vätskekromatografi (UHPLC) masspektrometrisk (MS) analys utförts specifikt med hjälp av en LC-enkolonninställning, kopplad till ett hybrid trippel kvadrupol orbitrap-instrument (Table of Materials). Andra LCMS-system kan användas, men en anpassning av parametrar rekommenderas.
- Analys av data
- Använd knappen Läs in för att importera råfilerna.
- Definiera experimentnamnen genom att klicka på knappen Ange experiment .
- Ange avsnittet gruppspecifika parametrar för att ange alla parametrar relaterade till identifiering:
Enzym som används för matsmältningen: Trypsin / P
Missade klyvningar: upp till tre
Fast modifiering: Karbamidometylering
Variabel modifiering: N-acetyl (protein), oxidation (M) - Ladda upp en uppdaterad FASTA-fil, tillgänglig från offentliga databaser som UniprotKB.
- Ange rätt parsningsregler enligt källan till den valda databasen.
- Definiera ett FDR-värde (parentage false discovery rate) = 1 för både proteiner och peptider.
- Lägg till alternativet Etikettfri kvantifiering (LFQ) på fliken Etikettfri kvantifiering.
- Håll det minsta antalet LFQ-kvoter på två.
OBS: Här beskriver vi dataanalys med MaxQuant24 och Perseus programvara25 för att utföra proteinkvantifiering respektive efterföljande statistisk analys. Dataanalys kan dock utföras med någon annan kommersiellt tillgänglig eller fri bioinformatisk. FDR beräknas med hjälp av en databasbaserad metod som bygger på mållockbete26. Peptid och protein FDR lika med 0,01 innebär att peptider och proteiner som identifieras förväntas innehålla 1% falska positiva.
- Statistisk analys
- Ladda proteingroups.txt -filen för att utföra statistisk analys på proteinnivå.
- Definiera LFQ-värdena som huvudkolumner.
- Ta bort "omvända" och "föroreningar" genom att filtrera rader baserat på den kategoriska kolumnen.
- Använd de kategoriska anteckningsraderna för att gruppera de olika experimentella förhållandena.
- Minska datamatrisen genom att välja antalet giltiga värden i var och en av de tidigare definierade grupperna.
- Välj det statistiska test som bättre passar experimentella förhållanden ( dvs. t-test, multipelprovtest ANOVA).
- Bestäm en gräns för betydande tips med en FDR-baserad beräkning. Vanligtvis accepteras både 0,01 och 0,05 som tröskelvärden för det justerade p-värdet .
- Visualisera resultaten av differentialanalyser baserade på t-teststatistik med hjälp av en vulkanplotrepresentation.
- Exportera den slutliga matrisen i .txt format för vidare redigering av den slutliga resultattabellen.
Konfigurationsmappen innehåller en FASTA-fil med proteiner som keratiner som anses vara vanliga föroreningar i globala proteomiska experiment, som flaggas med ett + i utdatatabellen. I den aktuella studien, med två provförhållanden, används ett t-test för den statistiska analysen.
11. Validering av resultat genom western blot
- Provberedning
- Tillsätt lämplig volym 4x provladdningsbuffert till varje alikvot av IN, FT och EL.
- Koka proverna i 5 min vid 95°C.
- Snurra snabbt för att återvinna avdunstat prov från toppen av rören.
- SDS-PAGE och gelöverföring
- Ladda prover på en 4% -12% denaturerande polyakrylamidgel.
- Kör gelen med MES SDS löpande buffert i 1,5 h vid 120 V.
- Överför gelén på ett nitrocellulosamembran med en halvtorr överföringskassett enligt tillverkarens instruktioner. Vi rekommenderar en 10 min överföring vid 15 V.
- Immundetektion
- Blockera membranet med 10% bovint serumalbumin (BSA) i 1 timme vid rumstemperatur medan du försiktigt skakar.
- Tillsätt den primära antikroppen beredd i 5% BSA i TBST, enligt tillverkarens instruktioner. Låt stå över natten vid 4 °C eller i 1 timme i rumstemperatur under försiktig omrörning.
- Tvätta membranet tre gånger med TBST, varje gång i 5 min.
- Tillsätt den sekundära antikroppen som beretts i TBST i 1 timme vid rumstemperatur under omrörning.
- Tvätta membranet tre gånger med TBST, varje gång i 5 min.
- Visualisera resultaten med hjälp av en fläckkamera.
OBS: För detektering av TDP-43 användes ett känt bindemedel av vår RNA, rekombinant kaninmonoklonal antikropp och lämnades med membranet över natten vid 4 ° C. Som en sekundär antikropp användes anti-kanin IgG pepparrotsperoxidas (HRP), men en fluorescerande sekundär antikropp skulle också fungera. För att visualisera antikropparna på membranet inkuberades membranet med Clarity Western ECL-substratet i 1 minut innan det avbildades med ChemiDoc-bildsystemet.
Representative Results
För att verifiera giltigheten av det föreslagna protokollet utfördes PD-experimenten som presenteras här med en biotinylerad RNA-aptamer designad i silico för att specifikt binda TDP-4320. Detta RNA binder sitt proteinmål med hög bindningsaffinitet (Kd = 90 nM)20. Här hänvisas detta RNA, av sekvens 5'-CGGUGUUGCU-3', till med namnet "+RNA". Som en negativ kontroll användes den omvända komplementära sekvensen av +RNA, som här kallas "-RNA". Dess sekvens är 5'-AGCAACACCG-3'. -RNA visar en signifikant lägre bindningsaffinitet mot TDP-43 (Kd = 1,5 μM)19. För det protokoll som beskrivs här har dessa RNA-oligonukleotider köpts konjugerade till en biotinmolekyl för att möjliggöra bindning till streptavidinpärlorna. + RNA köptes med en biotin-TEG vid dess 3'-ände, som inkluderar en 15-atoms trietylenglykoldistans mellan biotinet och fosfatgruppen i nukleinsyran; -RNA hade istället ett biotin vid sin 5'-ände, konjugerat till nukleinsyran via en amino-C6-länkare. Men om utformningen av RNA-betet är robust, och så länge det inte finns någon strukturell eller kemisk interferens mellan länkaren och RNA, kan andra positioner för biotinkonjugeringen och andra länklängder användas.
Att känna till identiteten hos huvudproteinet som finns bundet till +RNA-sonden efter PD möjliggjorde validering av protokollet genom identifiering av TDP-43 i eluatet, med användning av både masspektrometri (MS) och western blot (WB) (figur 1).
MS-analys utfördes på fyra PD-replikat utförda med antingen +RNA eller -RNA (figur 2). Identifieringen av interaktomerna av +RNA och -RNA ligger utanför ramen för detta protokoll, men vissa resultat som validerar protokollets noggrannhet rapporteras. Observera att plottning av de signifikant anrikade proteinerna i ett vulkandiagram avslöjade att det totala proteininnehållet och de anrikade proteinerna som eluerades från + RNA var signifikant högre än vad som återvanns från -RNA (figur 2). Detta innebär att +RNA, trots att det har samma längd och strukturella innehåll (linjärt), kan etablera ett högre antal specifika interaktioner, som behålls upp till elueringssteget med högt salt. Det är troligt att -RNA istället etablerar ett högre antal ospecifika kontakter som störs under tvättstegen. Som förväntat identifierades TDP-43 som en unik interactor av +RNA20; den genomsnittliga etikettfria kvantifieringen (LFQ) för de fyra PD-replikaten utförda med +RNA är 31,96 ± 0,56, medan proteinet inte identifieras bland interaktorerna av -RNA. Dessutom, bland alla unika interactors av + RNA, visade sig TDP-43 vara det mest rikligt anrikade proteinet.
För att ytterligare validera protokollet användes den interna algoritmen catRAPID18,19 för att beräkningsmässigt förutsäga vilka andra proteiner som specifikt skulle binda antingen +RNA eller -RNA. I synnerhet beräknades interaktionspoäng för +RNA och -RNA med proteinerna som komponerar det humana proteomet med hjälp av catRAPID 'interaktionsbenägenhet' -funktionen, som definierats i vårt tidigare arbete27. Bland proteinerna som poängsattes med hög konfidens förutspåddes HNRNPH3 binda selektivt +RNA (+RNA-interaktionspoäng = 1,01; -RNA-interaktionspoäng = 0,21) och PCBP2 för att interagera specifikt med -RNA (+RNA-interaktionspoäng = -0,5; -RNA-interaktionspoäng = 0,31) (figur 3A). Dessutom förutspåddes proteinet RBM41 vara promiskuöst för båda RNA-oligonukleotiderna (+ RNA-interaktionspoäng = 0,4; -RNA-interaktionspoäng = 0,39) (figur 3A). MS-analysen bekräftade verkligen närvaron av HNRNPH3 och PCBP2 i PD av + RNA respektive -RNA, medan RBM41 befanns interagera med båda (figur 3B).
WB användes för att detektera närvaron av TDP-43 för att ytterligare bekräfta resultaten och under protokolloptimering (figur 4). I det förfarande som beskrivs här samlades olika prover i olika steg. Ingångsprovet (IN) bestod av de totala proteinerna utspädda i lysbuffert. Genomströmningen (FT) erhölls efter en inkubation över natten av de totala proteinerna med streptavidinpärlorna förbelagda med det biotinylerade RNA, vilket representerar fraktionen av proteiner som inte binder RNA. Slutligen innehöll eluatet (EL) alla proteiner som kände igen specifikt RNA som undersöktes, eftersom mellan FT- och EL-stegen tre tvättsteg med 150 mM salt och 0,1% triton-X borde ha tagit bort de svagaste interaktionerna.
För varje replikat kördes samma mängd (5 % v/v) IN, FT och EL parallellt på en SDS-PAGE och färgades med en anti-TDP-43-antikropp (figur 4). I fallet med + RNA observerades bandet av TDP-43 i IN och i EL, vilket indikerar att proteinet, närvarande från början i det totala proteinextraktet, hålls kvar av + RNA under tvättstegen och endast elueras i slutet med en hög saltbuffert. TDP-43 var också närvarande i IN för -RNA, men bandet som motsvarar proteinet är också synligt i FT, vilket indikerar att detta RNA inte binder TDP-43. Frånvaron av TDP-43-bandet i EL bekräftar detta resultat.
Under optimeringen av protokollet undersöktes elueringen av proteinerna specifikt bundna till RNA-sekvenserna både med en elueringsbuffert innehållande 1 M NaCl (EB1) och med en elueringsbuffert komplett med 2 M NaCl (EB2) (figur 4). Eluater erhållna med endera EB jämfördes på en SDS-PAGE och blottades med anti-TDP-43-antikroppen. De erhållna bilderna analyserades sedan med ImageJ28 för att kvantifiera eventuell skillnad i TDP-43-mängd eluerad med de två buffertarna. Sammantaget observerades ingen signifikant skillnad, och vi drog slutsatsen att inom dessa analyser är 1 M salt tillräckligt för att störa även de starkaste protein-RNA-interaktionerna.
Sammantaget visar resultaten som rapporteras här för MS och WB att detta protokoll är effektivt för att fånga proteininteraktorerna för ett givet RNA på ett specifikt sätt och att det möjliggör eluering i buffertar som är kompatibla med nedströmsanalys.
Figur 1: Skiss av den experimentella rörledning som används i det föreslagna protokollet . (A) Den biotinylerade RNA-oligonukleotiden bereds i lysbuffert vid lämplig koncentration. (B) Magnetiska streptavidinpärlor tvättas, blockeras med jäst-tRNA och laddas med biotinylerat RNA. (C) Totalt proteinextrakt från odlade cellinjer från däggdjur tillsätts till blandningen av pärlor och RNA. (D) Flera tvättar utförs för att avlägsna ospecifika interaktioner. (E) De specifika proteininteraktorerna lossnar från RNA med en hypertonisk lösning. (F) Interaktorernas identitet avslöjas genom masspektrometri, och specifika fall valideras av Western Blot. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Analysstrategi för etikettfri MS-baserad proteinkvantifiering . (A) Eluerade proteiner fälls ut i kall aceton över natten. Proteiner denatureras sedan och en uppslutning i lösning utförs. Proteolytiska peptider koncentreras och avsaltas. (B) Peptider analyseras via LC-MS/MS med hjälp av en "hagelgevärsmetod". (C) Bearbetning och analys av rådata utförs med hjälp av MaxQuant respektive Perseus programvara. (D) Statistiskt signifikanta anrikade proteiner visas i ett vulkandiagram. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Korrelation mellan förutsagda interaktionsbenägenheter och experimentellt bestämda interaktioner mellan +RNA och -RNA. (A) catRAPID-interaktionspoäng i förhållande till HNRNPH3, PCBP2 och RBM41, vilket indikerar preferensbindning av HNRNPH3 för +RNA och av PCBP2 för -RNA, medan RBM41 förutses att urskillningslöst binda båda RNA-sekvenserna. (B) Etikettfria kvantifieringsmedelvärden bestämda genom masspektrometrianalys från neddragningar utförda med +RNA och -RNA. Analysen bekräftar att HNRNPH3 enbart binder +RNA, PCBP2 enbart binder -RNA och RBM41 binder båda lika. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Western blot-validering av närvaro/frånvaro av TDP-43 bland interaktorerna för valda RNA-sekvenser. WB-membranet har behandlats med anti-TDP-43-antikropp. IN = ingång; FT = genomströmning, EL (EB1) = eluering med elueringsbuffert 1, EL (EB2) = eluering med elueringsbuffert 2, tecknet "+" indikerar prover härledda från neddragningen utförd med + RNA; tecknet "-" indikerar prover härledda från neddragningen utförd med -RNA; Lane 1 innehåller en proteinstege. TDP-43 indikeras med en pil. WB indikerar att TDP-43 finns bland +RNA-interaktorer men inte bland -RNA-interaktorer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Buffertens namn | Sammansättning | |||||
| 10x Tranfer buffert | 250 mM tris, 1,92 M glycin, 1% SDS, 20% metanol. Späd 10 gånger före användning | PD | ||||
| 20x MES SDS kör buffert | 1 M MES, 1 M tris, 2% SDS , 20 mM EDTA. Justera pH till 7,3. Späd 20 gånger före användning | |||||
| 4x Provladdningsbuffert | 0,25 M Tris bas, 0,28 M SDS, 40% glycerol, 20% 2-merkaptoetanol, 4 mg/ml bromfenolblått | |||||
| Elueringsbuffert 1 | 20 mM fosfat pH 7,5, 1 M NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT (tillsätts efter kvantifiering) | |||||
| Elueringsbuffert 2 | 20 mM fosfat pH 7,5, 2 M NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT (tillsätts efter kvantifiering) | |||||
| Lysis buffert | 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT och proteashämmare | |||||
| Trisbuffrad saltlösning med Tween-20 | 1 M Tris-HCl pH 7,4, 3 M NaCl, 2,0% Tween-20 | |||||
| Tvättbuffert 1 | 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton TM X-100, 1 mM DTT och proteashämmare | |||||
| Tvätt buffert 2 | 25 mM Hepes pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT och proteashämmare | |||||
| Buffert A | 0,1% myrsyra | MS | ||||
| Buffert B | 60% acetonitril, 0,1% myrsyra | |||||
| Denatureringsbuffert | 8M urea, 50 mM Tris-HCl | |||||
Tabell 1: PD- och MS-buffertar. Namn på och sammansättning av de buffertar som används antingen för neddragningsexperimenten (PD) eller för masspektrometrianalysen.
Discussion
Detta arbete rapporterar optimering av ett PD-protokoll utfört med biotinylerade RNA-oligonukleotider för att fånga deras proteininteraktorer. Protokollet som beskrivs här är enkelt att utföra, kräver lite material och ger mycket tillförlitliga resultat. Viktigt är att de mest nya aspekterna av detta protokoll består av användningen av ett RNA-bete utformat helt i silico och specifikt för proteinmålet och elueringen av alla proteiner bundna till RNA-betet genom att direkt störa deras interaktioner med en högsaltlösning, snarare än genom att dissociera streptavidin från biotinet med tvättmedel och högtemperaturbehandling.
Detta protokoll utnyttjar styrkan i bindningen mellan biotin och streptavidin29,30. Enligt de valda streptavidinpärlorna måste laddningen av det biotinylerade RNA testas och kvantifieras innan man fortsätter. RNA-tredimensionell vikning kan också påverka laddningseffektiviteten på pärlorna, eftersom det kan begränsa exponeringen av biotinet för streptavidin. Blockering av pärlorna med icke-biotinylerat tRNA förbättrar resultatens renhet genom att begränsa ospecifika interaktioner med pärlorna. Belastningsbufferten och elueringsbufferten måste väljas beroende på tillämpningar nedströms. Här föreslogs mycket milda förhållanden, lämpliga för de flesta applikationerna och utvecklade för att bevara potentiella proteinkomplex. Denna metod är dock mycket anpassningsbar; användaren kan välja vilken cellinje som helst och vilken RNA-storlek som helst och kan bestämma sig för att upprepa protokollet efter vikning / utveckling av RNA för att bestämma strukturens effekt på bindningsegenskaperna.
En annan ursprunglig aspekt av detta protokoll är användningen av in silico-prediktionsverktyg för att säkerställa att resultaten är korrekta20. Att veta i förväg vilka proteiner som ska identifieras som interaktorer av RNA av intresse ger den oöverträffade fördelen att validera de tekniska aspekterna av protokollet. Med hjälp av en enkel WB-analys är det till exempel möjligt att verifiera närvaron av ett känt proteinmål i proverna härledda från de olika stegen i protokollet innan man fortsätter med MS-analysen, vilket kräver specialiserad instrumentering och är dyrare. Dessutom rapporterades nyligen en metod för att använda catRAPID20, en intern protein-RNA-prediktionsalgoritm, för att designa de novo RNA specifikt för ett målprotein. Fram till nyligen var den enda tillgängliga pipelinen för att designa DNA/RNA-aptamerer för ett målprotein SELEX-metoden (systematisk utveckling av ligander genom exponentiell anrikning)31. In silico-metoden möjliggör en mycket snabbare och kostnadseffektiv design av RNA-aptamerer.
De viktigaste begränsningarna för denna metod är förknippade med behovet av att arbeta i nukleasfria buffertar och verktyg. Om det anses nödvändigt att in vitro bekräfta bindningen mellan ett de novo-designat RNA och ett målprotein före PD, måste proteinet produceras och renas och bindningen bestämmas med biofysikaliska metoder. Detta är en begränsning som delas med produktionen av monoklonala antikroppar.
Trots dessa mindre problem kan tillförlitliga metoder för att kartlägga RNA-proteininteraktioner, som den som presenteras här, föra forskare närmare att avslöja makromolekylära nätverk och komplexa huvudaktörer för många fysiologiska och patologiska mekanismer, såsom de som är involverade i cancer, kardiomyopatier, diabetes, mikrobiella infektioner och genetiska och neurodegenerativa störningar.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Prof. Tartaglias och Dr. Cuomos forskargrupp för det stöd som erbjudits. E.Z. fick finansiering från MINDED-stipendiet i Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 enligt Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtalet nr 754490.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well tissue culture plates | VWR | 10861-554 | CELLS |
| Cell scrapers | BIOSIGMA | 10153 | CELLS |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientfic | 11995065 | CELLS |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil | Thermo Fisher Scientfic | 10500064 | CELLS |
| Phosphate Buffer Saline (PBS, Waltham, MA) | Thermo Fisher Scientfic | 14190169 | CELLS |
| Trypsin (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientfic | 15050065 | CELLS |
| Anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HRP) | Cellsignal | 7070 | PD |
| Biotinylated RNA | Eurofins | Custom RNA oligonucleotides | PD |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | PD |
| Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Biorad | 1705061 | PD |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Merck - Sigma Aldrich | 5056489001 | PD |
| NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well | Invitrogen | NP0321BOX | PD |
| Recombinant anti-TDP43 antibody | Abcam | ab109535 | PD |
| Ribonucleic acid, transfer from baker's yeast (S. cerevisiae) | Merck - Sigma Aldrich | R5636-1ML | PD |
| Streptavidin Mag Sepharose | Merck - Sigma Aldrich | GE28-9857-99 | PD |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini 0.2 µm PVDF Transfer Kit | Biorad | 1704272 | PD |
| Acetone | Thermo Fisher Scientfic | 022928.K2 | MS |
| C18 cartridge | Thermo Fisher Scientfic | 13-110-018 | MS |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientfic | 20290 | MS |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | ES902 | MS |
| iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich S.r.l. | I6125 | MS |
| Lys-C/Trypsin | Promega | V5073 | MS |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo Fisher Scientfic | 28904 | MS |
| Urea | Thermo Fisher Scientfic | J75826.A7 | MS |
| Equipment | |||
| ChemiDoc imaging system | Bio-Rad | CELLS | |
| Dyna Mag -2 , Magnetic rack | Invitrogen | CELLS | |
| Forma Series 3 water jacketed C02 incubator | Thermo Scientific | PD | |
| PROTEAN II xi cell , power supply for PAGE applications | Bio-Rad | PD | |
| Rotating wheel, rotator SB3 | Stuart | PD | |
| Water bath set at 37 °C | VWR | PD | |
| XCell SureLock Mini-Cell electrophoresis system | ThermoFisher Scientific | MS | |
| Easy-nLC 1200 UHPLC | Thermo Scientific | MS | |
| Q exactive Mass Spectrometer | Thermo Scientific | MS | |
| Software | Version | ||
| MaxQuant | 2.0.3.0 | MS | |
| Perseus | 1.6.14.0 | MS |
References
- Gebauer, F., Schwarzl, T., Valcárcel, J., Hentze, M. W. RNA-binding proteins in human genetic disease. Nature Reviews Genetics. 22 (3), 185-198 (2021).
- Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Cooper, T. A., Wan, L., Dreyfuss, G. RNA and disease. Cell. 136 (4), 777-793 (2009).
- Qin, H., et al. RNA-binding proteins in tumor progression. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 90 (2020).
- Nussbacher, J. K., Tabet, R., Yeo, G. W., Lagier-Tourenne, C. Disruption of RNA metabolism in neurological diseases and emerging therapeutic interventions. Neuron. 102 (2), 294-320 (2019).
- Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. Journal of Genetics and Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
- Maziuk, B., Ballance, H. I., Wolozin, B. Dysregulation of RNA binding protein aggregation in neurodegenerative disorders. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 89 (2017).
- Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (5), 1557-1562 (2006).
- Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118 (2021).
- Weidmann, C. A., Mustoe, A. M., Jariwala, P. B., Calabrese, J. M., Weeks, K. M. Analysis of RNA-protein networks with RNP-MaP defines functional hubs on RNA. Nature Biotechnology. 39 (3), 347-356 (2021).
- Graindorge, A., et al. In-cell identification and measurement of RNA-protein interactions. Nature Communications. 10 (1), 5317 (2019).
- Ule, J., Hwang, H. W., Darnell, R. B. The future of cross-linking and immunoprecipitation (CLIP). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (8), 032243 (2018).
- Ascano, M., Hafner, M., Cekan, P., Gerstberger, S., Tuschl, T. Identification of RNA-protein interaction networks using PAR-CLIP. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (2), 159-177 (2012).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biology. 15 (1), 203 (2014).
- Sugimoto, Y., et al. Analysis of CLIP and iCLIP methods for nucleotide-resolution studies of protein-RNA interactions. Genome Biology. 13 (8), (2012).
- Bayat, P., et al. SELEX methods on the road to protein targeting with nucleic acid aptamers. Biochimie. 154, 132-155 (2018).
- Armaos, A., Colantoni, A., Proietti, G., Rupert, J., Tartaglia, G. G. CatRAPID omics v2.0: Going deeper and wider in the prediction of protein-RNA interactions. Nucleic Acids Research. 49, 72-79 (2021).
- Agostini, F., et al. CatRAPID omics: A web server for large-scale prediction of protein-RNA interactions. Bioinformatics. 29 (22), 2928-2930 (2013).
- Zacco, E., et al. Probing TDP-43 condensation using an in silico designed aptamer. Nature Communications. 13 (1), 3306 (2022).
- Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Research. 42 (2), 13 (2014).
- Zhang, Y., Lai, B. S., Juhas, M. Recent advances in aptamer discovery and applications. Molecules. 24 (5), 941 (2019).
- UniProt Consortium. UniProt: the Universal Protein Knowledgebase in 2023. Nucleic Acids Research. 51, 523-531 (2023).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Bellucci, M., Agostini, F., Masin, M., Tartaglia, G. G. Predicting protein associations with long noncoding RNAs. Nature Methods. 8 (6), 444-445 (2011).
- Gallo-Oller, G., Ordoñez, R., Dotor, J. A new background subtraction method for Western blot densitometry band quantification through image analysis software. Journal of Immunological Methods. 457, 1-5 (2018).
- Weissinger, R., Heinold, L., Akram, S., Jansen, R. P., Hermesh, O. RNA proximity labeling: A new detection tool for RNA-protein interactions. Molecules. 26 (8), 2270 (2021).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).
