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Biology

ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स के माध्यम से उनके लाइसोजेन्स पर समशीतोष्ण बैक्टीरियोफेज के प्रभाव को समझना

Published: January 5, 2024 doi: 10.3791/64945
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1, 2, 1
1Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, Institute of Infection, Veterinary and Ecological Sciences (IVES), University of Liverpool, 2School of Science, Engineering, and Environment, University of Salford

Summary

यह प्रोटोकॉल उनके मेजबानों पर प्रोफेज के प्रभाव को प्रकट करने में सक्षम बनाता है। बैक्टीरियल संस्कृतियों को उन स्थितियों का उपयोग करके सिंक्रनाइज़ किया जाता है जो लाइसोजेनिक स्थिति का सबसे अच्छा समर्थन करते हैं, सहज प्रेरण को सीमित करते हैं। आरटी-क्यूपीसीआर स्पष्ट रूप से प्रोफेज-प्रतिबंधित जीन और फेज नियंत्रण से अयुग्मित जीन को उन लोगों से अलग करता है जो लिटिक प्रतिकृति चक्र के दौरान व्यक्त किए जाते हैं।

Abstract

समशीतोष्ण फेज बैक्टीरिया जीनोम के बहुमत में प्रोफेज के रूप में एकीकृत पाए जाते हैं। कुछ प्रोफेज बैक्टीरियल क्रोमोसोम में क्रिप्टिक और फिक्स्ड होते हैं, लेकिन अन्य सक्रिय होते हैं और उन्हें अनायास या उत्प्रेरण कारकों के संपर्क में आने से प्रतिकृति रूप में ट्रिगर किया जा सकता है। प्रोफेज आमतौर पर अपने मेजबान सेल पर विष उत्पादन या अन्य विषाणु से जुड़े लक्षणों को प्रदान करने की क्षमता से जुड़े होते हैं। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि वे अपने मेजबानों के शरीर विज्ञान को बदलने में बहुत बड़ी भूमिका निभा सकते हैं। यहां वर्णित तकनीक ने हमें यह जांचने में सक्षम बनाया है कि कैसे प्रोफेज अवसरवादी जीवाणु स्यूडोमोनास एरुगिनोसा में जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करते हैं।

इस काम में, जंगली-प्रकार पी एरुगिनोसा स्ट्रेन पीएओ 1 के विकास की तुलना लिवरपूल एपिडेमिक स्ट्रेन (एलईएस) एलईएसबी 58 से प्रोफेज के विभिन्न संयोजनों को ले जाने वाले इसोजेनिक लाइसोजेन्स के साथ की गई थी। एक लाइसोजेन संस्कृति में, जीवाणु कोशिकाओं का एक अनुपात लिटिक बैक्टीरियोफेज प्रतिकृति (सहज प्रेरण) का समर्थन करेगा, जिसमें देर से फेज जीन के प्रति कोशिका अभिव्यक्ति का उच्च स्तर होगा, जैसे कि फेज कणों की असेंबली से जुड़े, इस प्रकार लाइसोजेन-प्रतिबंधित जीन अभिव्यक्ति से जुड़े निम्न-स्तरीय जीन अभिव्यक्ति को छिपाना। सहज प्रेरण का प्रभाव इस प्रकार एक लाइसोजेन आबादी में प्रोफेज जीन अभिव्यक्ति को अस्पष्ट कर सकता है।

विकास प्रोफाइलिंग प्रयोगों का उपयोग सहज प्रेरण की पहचान करने के लिए किया गया था, जो प्रारंभिक घातीय विकास चरण के दौरान न्यूनतम था। यह अध्ययन बताता है कि प्रारंभिक घातीय विकास चरण के दौरान नमूना संस्कृतियों को कैसे तैयार किया जाए और कम सेल संख्या के बावजूद पर्याप्त नियंत्रण कैसे स्थापित किया जाए। ये प्रोटोकॉल विभिन्न परिस्थितियों में जंगली-प्रकार और लाइसोजेनिक बैक्टीरिया की विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तुलना सुनिश्चित करते हैं, इस प्रकार प्रोफेज जीनोम के ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग में सुधार करते हैं और पहले से पहचाने गए प्रोफेज कार्यों की पहचान में सहायता करते हैं।

Introduction

हाल ही में, रोगाणुरोधी प्रतिरोध1 और सीआरआईएसपीआर-सीएएस-आधारित जीन संपादन2 से निपटने के लिए फेज थेरेपी ने बैक्टीरियोफेज अनुसंधान में नए सिरे से रुचि पैदा की है। फिर, जैव प्रौद्योगिकी में प्रगति ने बैक्टीरिया और फेज3 के बीच बातचीत की गहरी जांच को सक्षम किया है। हालांकि, फेज ("फेज थेरेपी") का चिकित्सीय उपयोग फेज के बारे में चिंताओं से बाधित होता है जो मोबाइल आनुवंशिक तत्वों के रूप में कार्य करते हैं, जिसमें विषाणु और प्रतिरोध जीन कोक्षैतिज रूप से स्थानांतरित करने की क्षमता होती है। "डार्क मैटर" 5 (अज्ञात कार्यों वाले जीन) का विस्तार परेशान और मोहक दोनों है। डार्क मैटर को फेज जीव विज्ञान की हमारी समझ में एक अंतर माना जाता है और आणविक उपकरणों और संभावित नवीन चिकित्सीय 6 के लिए काफी हद तक अप्रयुक्त संसाधनहै। उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण तकनीकों का विकास, बेहतर जीन एनोटेशन 7,8,9 और नए पेप्टाइड-फोल्डिंग एल्गोरिदम10 के साथ, फेज जीन का पता लगाने, विवरण और कार्यात्मक भविष्यवाणी में सुधार कर रहा है। हालांकि, विज्ञान अभी भी संस्कृति या वास्तविक दुनिया में अधिकांश फेज के जीन कार्यों को मान्य करने से बहुत दूर है।

आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सेक) विश्व स्तर पर फेज संक्रमण के दौरान जीन अभिव्यक्ति को मैप कर सकता है और लिटिक और लाइसोजेनिक चक्र11,12 में शामिल फेज और जीवाणु तत्वों दोनों की समझ में काफी सुधार हुआ है। लाइसोजेनिक प्रक्रियाओं के दौरान, समशीतोष्ण फेज जीनोम को बैक्टीरिया डीएनए में एकीकृत किया जाता है ताकि प्रोफेज13 बन सकें। वैश्विक जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग प्रयोगों का उपयोग प्रोफेज-प्रतिबंधित जीन की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो समशीतोष्ण फेज जीनोम पर एन्कोड किए गए हैं लेकिन केवल लाइसोजेनिक अवस्था11 के दौरान व्यक्त किए गए हैं। ऐसे जीन फेज संरचनात्मक प्रोटीन को एन्कोड नहीं करते हैं और किसी भी फेज संक्रमण प्रक्रियाओं में शामिल नहीं होते हैं। आरएनए-सेक का उपयोग उन जीनों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो बैक्टीरिया के मेजबान के जीव विज्ञान को प्रभावित करने की अधिक संभावना रखते हैं, या तो कार्य के लाभ को प्रेरित करके या मौजूदा जीवाणु जीन को विनियमित करके, इस प्रकार अक्सर बैक्टीरिया को बदलते वातावरण के अनुकूल बनाने में सक्षम बनाते हैं। इसलिए, बैक्टीरिया के कार्यों की एक श्रृंखला को नियंत्रित करते हुए, माइक्रोबियल कठपुतली स्वामी के रूप में कार्य करने के लिए प्रोफेज की क्षमता का अध्ययन किया जा सकता है।

प्रोफेज-प्रतिबंधित जीन अभिव्यक्ति के प्रभावी विश्लेषण के लिए दो प्रमुख बाधाएं हैं। सबसे पहले, अतिसंवेदनशील मेजबानों की उपलब्धता एक महत्वपूर्ण मुद्दा है। परिभाषा के अनुसार, प्रोफेज पहले से ही अपने विशिष्ट मेजबान जीनोम में शामिल हैं, इसलिए प्रोफेज की उपस्थिति और अनुपस्थिति में वैश्विक जीन अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए अतिसंवेदनशील जंगली-प्रकार के मेजबान को ढूंढना चुनौतीपूर्ण है। यह या तो किसी अन्य अतिसंवेदनशील मेजबान के डे नोवो संक्रमण के माध्यम से या मूल जंगली-प्रकार के अलगाव से प्रोफेज के विलोपन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, बाकी मेजबान जीनोम को बाधित किए बिना। दूसरी बाधा लाइसोजेनिक आबादी की विषम प्रकृति में निहित है। कुछ प्रोफेज उत्परिवर्तन या पुनर्संयोजन के माध्यम से "क्रिप्टिक" बनने के लिए अवक्रमित होते हैं, जिसका अर्थ है कि वे बैक्टीरिया जीनोम के एक विशिष्ट स्थान पर तय होते हैं। हालांकि, अन्य प्रोफेज "सक्रिय" होते हैं और उन्हें अनायास या उत्प्रेरण कारकों के संपर्क में आने के बाद एक प्रतिकृति, लिटिक चक्र में प्रेरित किया जा सकता है। कई लाइसोजेनिक संस्कृतियों में, सहज प्रेरण की दर का मतलब है कि बैक्टीरिया कोशिकाओं का एक अनुपात हमेशा लिटिक फेज प्रतिकृति14,15,16 से गुजर रहा है। इन आबादी में देर से फेज जीन की अभिव्यक्ति का एक उच्च स्तर लाइसोजेन-प्रतिबंधित जीन अभिव्यक्ति11,17 से जुड़े निम्न-स्तरीय जीन अभिव्यक्ति को मुखौटा करता है। सहज प्रोफेज प्रेरण से गुजरने वाले लाइसोजेन्स का अनुपात विकास की स्थिति, विकास की स्थिति या अन्य ट्रिगर्स के साथ भिन्न हो सकता है। इसलिए, लाइसोजेन पर प्रोफेज के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए, लाइसोजेनिक स्थिति के पक्ष में विकास की स्थिति को अनुकूलित करके सहज प्रोफेज प्रेरण घटनाओं को यथासंभव कम किया जाना चाहिए।

यह अध्ययन स्यूडोमोनास एरुगिनोसा के लिवरपूल एपिडेमिक स्ट्रेन (एलईएस) से सहवास प्रोफेज के एक सेट के प्रभाव की जांच करने के लिए किए गए प्रारंभिक कार्य की रिपोर्ट करता है। सक्रिय प्रोफेज को एलईएस से प्रेरित और अलग किया गया था और मॉडल पी एरुगिनोसा होस्ट स्ट्रेन, पीएओ 116,18,19 को संक्रमित करने के लिए उपयोग किया गया था। एरुगिनोसा स्ट्रेन, पीएओ 1, और इसके लाइसोजेन, पीएओ 1 : 2 के पूरे जीनोम को अनुक्रमित किया गया था (30 x कवरेज की गहराई पर) ताकि जंगली प्रकार के तनाव की पहचान सुनिश्चित की जा सके और यह पुष्टि की जा सके कि लाइसोजेन इसोजेनिक था। एलईएस को सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों में रुग्णता और मृत्यु दर में वृद्धि के साथ जोड़ा गया है, और एलईएस फेज19 को सिस्टिक फाइब्रोसिस फेफड़ों के वातावरण 16,19,20 के अनुकूलन में सहायता करने का सुझाव दिया गया है। मजबूत सबूत के बावजूद कि ये प्रोफेज अपने मेजबान20,21 के जीव विज्ञान को प्रभावित करते हैं, उनके अधिकांश जीन कार्यों को अभी तक विशेषता नहीं दी गई है, और बातचीत के विशिष्ट तंत्र को खराब तरीके से समझा जाता है। एक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स दृष्टिकोण एक नियंत्रित मेजबान पृष्ठभूमि में प्रोफेज जीन कार्यों को अनुभवपूर्वक उजागर कर सकता है। चूंकि सहज प्रेरण अभिव्यक्ति प्रोफाइल को प्रभावित कर सकता है, इसलिए यह लेख बताता है कि लाइसोजेनिक स्थिति के पक्ष में विकास की स्थिति को कैसे अनुकूलित किया जाए। संस्कृतियों के इस तरह के सिंक्रनाइज़ेशन को वास्तविक समय पीसीआर द्वारा प्रमुख आनुवंशिक मार्करों के अभिव्यक्ति स्तर को निर्धारित करने के लिए मान्य किया जा सकता है जो पीएओ 1 में एलईएस फेज प्रतिकृति के महत्वपूर्ण चरणों से जुड़े हैं। इसी दृष्टिकोण का उपयोग पहले शिगा-टॉक्सोजेनिक फेज के प्रोफेज-प्रतिबंधित कार्यों की पहचान करने के लिए किया गया है जो एस्चेरिचिया कोलाई 11,17,21,22 में गतिशीलता, एसिड प्रतिरोध और रोगाणुरोधी प्रतिरोध को प्रभावित करते हैं।

Protocol

1. एक चयन योग्य संकेतक होस्ट बनाएँ (चित्रा 1)

नोट: फेज कल्चर लाइसेट में मूल जीवाणु मेजबान से दूषित कोशिकाएं हो सकती हैं। एंटीबायोटिक-प्रतिरोधी संकेतक तनाव होने से संकेतक तनाव और प्रोफेज के मूल जीवाणु मेजबान के बीच भेदभाव की अनुमति मिलती है। एक चयन योग्य संकेतक तनाव का उपयोग फेज प्रवर्धन चरणों के बाद लाइसोजेन कोशिकाओं से फेज को हटाने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन या निस्पंदन चरणों की आवश्यकता के बिना संक्रामक फेज कणों की सटीक गणना को सक्षम बनाता है। चयन योग्य संकेतक होस्ट स्ट्रेन फेज गणना के लिए चरणों के समय और संख्या को भी कम करता है ताकि एक साथ कई स्थितियों का परीक्षण किया जा सके।

  1. रुचि के समशीतोष्ण फेज द्वारा लिटिक और लाइसोजेनिक संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील एक उपयुक्त संकेतक मेजबान तनाव की पहचान करें। एरुगिनोसा लैब स्ट्रेन पीएओ 118,20 का उपयोग किया गया था और यह तीन एलईएस फेज (एलईएस 2, एलईएस 3, और एलईएस 4) के लिए अतिसंवेदनशील है।
  2. एक उपयुक्त चयनात्मक एजेंट चुनें (रिफैम्पिसिन का उपयोग यहां किया गया था), और संकेतक मेजबान के लिए न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) निर्धारित करने के लिए एक शोरबा कमजोर पड़ने की परख करें (16 μg.mL-1 PAO1 के लिए एमआईसी है)23,24।
  3. क्रमिक रूप से संकेतक मेजबान संस्कृतियों को लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) में चयनात्मक एजेंट की बढ़ती सांद्रता के लिए उजागर करें, एमआईसी के नीचे (इस मामले में 5 μg.mL-1), 18-24 घंटे के लिए, झटकों के साथ, और 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  4. 1:100 (इनोकुलम से मध्यम) के अनुपात में उच्चतम सांद्रता पर बढ़ने वाली संस्कृति को चयनात्मक एजेंट (हर बार 18-24 घंटे) की दो गुना बढ़ी हुई सांद्रता में स्थानांतरित करें जब तक कि एमआईसी को पर्याप्त रूप से नहीं बढ़ाया जाता है। पीएओ 1 300 μg.mL-1 रिफैम्पिसिन पर एक रिफैम्पिसिन-प्रतिरोधी तनाव (PAO1-Rif R) बन गया।

2. सहज प्रेरण की अस्थायी प्रत्यक्ष गणना (चित्रा 2)।

  1. लाइसोजेन (उदाहरण के लिए, पी. एरुगिनोसा पीएओ1 लाइसोजेन हार्बरिंग एलईएस फेज) और इंडिकेटर होस्ट (पीएओ1-आरआईएफआर) दोनों की रातोंरात स्टार्टर कल्चर सेट करें, जिसमें 5 एमएल एलबी में एक कॉलोनी को इंजेक्ट किया जाए, और 180 आरपीएम (18-24 घंटे) पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाए।
  2. 1:100 के अनुपात में 100 एमएल एलबी में रात भर की संस्कृतियों को शामिल करके ताजा लाइसोजेन और संकेतक मेजबान संस्कृतियों को स्थापित करें, और झटकों (180 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    1. माइल्स मिश्रा तकनीक25 का उपयोग करके ओडी600 और व्यवहार्य गणना को मापकर लाइसोजेन विकास की निगरानी करें। ऐसा करने के लिए, 8 घंटे के लिए टीकाकरण के बिंदु से हर घंटे प्रत्येक लाइसोजेन संस्कृति से 1 एमएल नमूना एकत्र करें।
    2. संबंधित माध्यम के 900 μL में नमूने के 100 μL जोड़कर संग्रह के तुरंत बाद नमूने को क्रमबद्ध रूप से पतला करें। भंवर अधिकतम गति से अच्छी तरह से करें, प्रत्येक कमजोर पड़ने पर नोक को छोड़ दें, और कमजोर पड़ने की श्रृंखला को 10−1 से 10−9 तक जारी रखें।
    3. एलबी एगर प्लेट पर तीन प्रतियों में आवश्यक तनुकरण के 10 μL को स्पॉट करें, सूखने की अनुमति दें, और 18-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. व्यवहार्य जीवाणु कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए, आसानी से गिनने योग्य कॉलोनियों के साथ एक कमजोर पड़ने का पता लगाएं। प्रत्येक स्थान पर कॉलोनियों की संख्या की गणना करें, और उसके बाद निम्न सूत्र का उपयोग करें:
      Equation 1
      नोट: जैसे-जैसे लाइसोजेन संस्कृति बढ़ती है, सक्रिय फेज कण सहज प्रेरण द्वारा उत्पादित किए जाएंगे। संक्रामक फेज के उत्पादन का मतलब है कि लाइसोजेन आबादी का प्रतिलेख अब लिटिक फेज प्रतिकृति संकेत और संबंधित मेजबान सेल प्रतिक्रिया से लिटिक प्रतिकृति चक्र से जुड़े जीन अभिव्यक्ति से दूषित है। इस प्रकार, विकास चरण की पहचान करना महत्वपूर्ण है जिस पर मुक्त संक्रामक फेज कणों के लिए लाइसोजेनिक कोशिकाओं का अनुपात उच्चतम है ताकि डेटा सेट में जितना संभव हो उतना पृष्ठभूमि प्रतिलेखन शोर (लिटिक फेज ट्रांसक्रिपटम द्वारा उत्पन्न) को सीमित किया जा सके।
  3. प्रत्येक अस्थायी नमूने में संक्रामक फेज कणों की गणना करने के लिए, एलबी (शीर्ष आगर) में 5 मिलीलीटर बाँझ 0.4% बैक्टीरियोलॉजिकल एगर को मध्य-घातीय चरण संकेतक मेजबान (ओडी 600: 0.4–0.5; इस मामले में, पीएओ 1-आरआईएफआर) के100 μL के साथ एक उपयुक्त चयनात्मक एजेंट (इस मामले में 50 μg.mL-1 रिफैम्पिसिन) की उपस्थिति में टीका लगाएं, क्योंकि पीएओ 1 मेजबान का एमआईसी केवल 16 μg-mL-1 है। पंक्ति 8 और पंक्ति 9)
    1. टीका लगाए गए शीर्ष आगर परत पर उसी सीरियल तनुकरण (चरण 2.2.2 देखें) के 10 μL को स्पॉट करें, और 18-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सूखने से पहले सूखने दें।
    2. संक्रामक फेज कणों की गणना करने के लिए, आसानी से गिनने योग्य सजीले टुकड़े के साथ एक कमजोर पड़ने का पता लगाएं। प्रत्येक स्थान पर सजीले टुकड़े की संख्या की गणना करें।
      Equation 2
    3. उस समय/स्थिति का पता लगाएं जिसके लिए आगे के प्रयोगात्मक चरणों के लिए प्रति सीएफयू (कॉलोनी बनाने की इकाई) सहज प्रेरण न्यूनतम है।

3. आरएनए निष्कर्षण के लिए गैर-प्रेरित और प्रेरित लाइसोजेन संस्कृतियों की तैयारी (चित्रा 3)।

  1. 5 एमएल एलबी में लाइसोजेन की एक कॉलोनी को इंजेक्ट करके एक ताजा रातोंरात संस्कृति स्थापित करें, और 18-24 घंटे के लिए झटकों (180 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. उपसंस्कृति आठ 250 एमएल फ्लास्क में 1: 100 के अनुपात में एलबी के 80 एमएल में रातोंरात संस्कृति।
  3. पहले फ्लास्क को "गैर-प्रेरित" और दूसरों को "प्रेरित" के रूप में लेबल करें, साथ ही समय बिंदु जब प्रत्येक नमूने को काटा जाना चाहिए (यानी, "प्रेरित टी = 0", "प्रेरित टी = 10 मिनट", "प्रेरित टी = 20 मिनट", आदि; चित्र 3)।
  4. 90 मिनट के इनक्यूबेशन के बाद, जब OD600 0.1-0.2 के बीच होता है, या न्यूनतम सहज प्रेरण के समय (चर्चा देखें), गैर-प्रेरित फ्लास्क में 1% ग्लेशियल एसिटिक एसिड (v/v) के 4 μL जोड़ें (चित्रा 3)।
    नोट: चूंकि इस काम में उत्प्रेरण एजेंट विलायक के रूप में 1% ग्लेशियल एसिटिक एसिड का उपयोग करके बनाया गया था, इसलिए विलायक की समान मात्रा को नियंत्रण चरण के रूप में अकेले जोड़ा गया था। विभिन्न प्रेरकों की तैयारी के आधार पर वैकल्पिक नियंत्रणों पर विचार किया जा सकता है।
  5. गैर-प्रेरित फ्लास्क से 80 एमएल कल्चर को 720 एमएल बाँझ एलबी में जोड़ें, और तुरंत स्टॉप सॉल्यूशन (आइस-कोल्ड 5% [वी / वी] फिनोल, पीएच 4.3, 95% [वी / वी] इथेनॉल) को कल्चर वॉल्यूम (160 एमएल) के 20% का उपयोग करके जोड़ें, और आरएनए ट्रांसक्रिप्ट्स 12 को स्थिर करने के लिए कम से कम 30 मिनट और 2 घंटे से अधिक समय तक बर्फ पर इनक्यूबेट करें। 26,27. यह गैर-प्रेरित नमूना है।
  6. सात 250 एमएल फ्लास्क (चित्रा 3) में शेष संस्कृतियों को एक उपयुक्त उत्प्रेरण एजेंट के एमआईसी के साथ प्रेरित करें (इस मामले में, 25 मिलीग्राम एमएल -1 नॉरफ्लॉक्सासिन, 1% ग्लेशियल एसिटिक एसिड [डब्ल्यू / वी] में तैयार, 1 μg.mL-1 की अंतिम एकाग्रता पर उपयोग किया जाता है), अच्छी तरह मिलाएं, और 37 डिग्री सेल्सियस पर और 1 घंटे के लिए 180 आरपीएम पर हिलाने के साथ इनक्यूबेट करें।
    नोट: यह कदम लाइसोजेन संस्कृति को लिटिक प्रतिकृति की अधिक समन्वित स्थिति में मजबूर करेगा। संस्कृति में अधिकांश कोशिकाएं संक्रामक फेज कणों के लिटिक उत्पादन से गुजरना शुरू कर देंगी।
  7. प्रेरित फ्लास्क से 720 एमएल बाँझ एलबी में 80 एमएल कल्चर जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करने की अनुमति दें, जो प्रभावी रूप से उत्प्रेरण एजेंट को पतला करता है। प्रत्येक फ्लास्क से बैक्टीरियल कोशिकाओं को हर 10 मिनट में समय 0 से 1 घंटे तक एक स्टॉप समाधान जोड़कर काट लें, जैसा कि चरण 3.5 में बताया गया है।
    नोट: स्टॉप समाधान आरएनए को 2 घंटे तक स्थिर करता है। हालांकि, नमूना स्थिरता को बढ़ाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर आगे के सभी चरणों का पालन करें।
  8. जितनी जल्दी हो सके 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 10,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कटाई करें, आरएनए क्षरण से बचने के लिए उपचार के बाद 2 घंटे से अधिक नहीं।
  9. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और प्रत्येक नमूने को 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने से पहले एक समायोज्य स्वचालित पिपेट का उपयोग करके अवशिष्ट तरल में बैक्टीरिया के छर्रों को धीरे से पुन: निलंबित करें।
  10. 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोफ्यूज में उच्च गति (13,000 x ग्राम) पर माइक्रोफ्यूज ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें, और अवशिष्ट सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
  11. प्रत्येक सील माइक्रोफ्यूज ट्यूब को तरल नाइट्रोजन में डुबोकर छर्रों को फ्लैश-फ्रीज करें। यह आरएनए निष्कर्षण के लिए कोशिकाओं के कुशल लाइसिस में सहायता करेगा।
  12. प्रत्येक जमे हुए गोली में टीआरआईज़ोल (1 एमएल) जोड़ें, और पाइपिंग द्वारा निलंबन को समरूप करें (भंवर न करें)। सभी नमूनों के लिए आरएनए निष्कर्षण करने के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: प्रोटोकॉल इस बिंदु पर रोका जा सकता है।
  13. तीन जैविक प्रतिकृतियों के साथ चरण 3.1-3.13 दोहराएं।

4. गैर-प्रेरित और प्रेरित लाइसोजेन संस्कृतियों से आरएनए का अलगाव।

महत्वपूर्ण: इन सभी चरणों को RNase-मुक्तवातावरण में किया जाना चाहिए। वर्कबेंच को 10% NaClO या मालिकाना RNase इनएक्टिवेटर्स के साथ मिटा दिया जाना चाहिए। लैबवेयर को डीईपीसी उपचार जैसे आरएनएस इनहिबिटर के साथ इलाज किया जाना चाहिए, और सभी प्रतिक्रियाओं में न्यूक्लियस-मुक्त पानी का उपयोग किया जाना चाहिए।

  1. बर्फ पर चरण 3.12 से जमे हुए टीआरआईज़ोल-उपचारित छर्रों को पिघलाएं, और आणविक जीव विज्ञान-ग्रेड क्लोरोफॉर्म के 400 μL जोड़ें।
  2. सभी कोशिकाओं के लाइसिस को पूरा करने के लिए शीशियों को 10 सेकंड के लिए उलटा करके अच्छी तरह से हिलाएं (भंवर न करें)। फिर, 2-5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (21 डिग्री सेल्सियस) पर इनक्यूबेट करें।
  3. क्लोरोफॉर्म मिश्रण से जलीय परत को 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस और 13,000 एक्स जी पर 15 मिनट के लिए प्रशीतित टेबल-टॉप माइक्रोफ्यूज का उपयोग करके सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग करें।
  4. 1,000 μL पिपेट का उपयोग करके जलीय चरण (~ 500 μL, शीर्ष परत) एकत्र करें, इस बात का ध्यान रखें कि इंटरफेज़ या कार्बनिक चरण (नीचे की परत) को परेशान न करें। एक नए 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. अलग किए गए जलीय चरण में आणविक जीव विज्ञान-ग्रेड आइसोप्रोपेनोल के 450 μL जोड़ें, व्युत्क्रम द्वारा अच्छी तरह मिलाएं (भंवर न करें), और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (21 डिग्री सेल्सियस) पर इनक्यूबेट करें।
  6. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 13,000 एक्स जी पर प्रशीतित सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा आरएनए को पुनर्प्राप्त करें।
  7. आरएनए गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें, और न्यूक्लियस-मुक्त पानी के साथ तैयार 70% इथेनॉल के 800 μL के साथ गोली को दो बार धोएं (ऊपर और नीचे पाइप न करें)। प्रत्येक धोने के बाद 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन चरण को दोहराकर आरएनए गोली की स्थिरता सुनिश्चित करें।
  8. इथेनॉल को छोड़ दें, और गोली को हवा में सुखाएं।
    नोट: 10 μL माइक्रोटिप का उपयोग करके गोली के चारों ओर इथेनॉल को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें, और ट्यूब को साफ ब्लोटिंग पेपर पर घुमाकर गोली को सुखाएं। आरएनए गोली रंगहीन हो जानी चाहिए, और किनारों को उखड़ा और दिखाई देना चाहिए। बहुत कम सुखाने से अवशिष्ट इथेनॉल बच सकता है जो डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकता है, और गोली को बहुत अधिक सूखने से रीसस्पेंशन मुश्किल हो सकता है।
  9. कुल 3-5 मिनट के लिए आंतरायिक मिश्रण (हर 30 सेकंड) के साथ थर्मो-शेकर पर 65 डिग्री सेल्सियस पर इंजेक्ट करके न्यूक्लियस-मुक्त पानी (50 μL) में आरएनए को पुन: निलंबित करें।
    महत्वपूर्ण: आरएनए का 2'- ओएच समूह 65 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के उच्च तापमान और उच्च पीएच पर आरएनए स्ट्रैंड के ऑटोक्लीवेज को उत्प्रेरित करने में सक्षम है। 65 डिग्री सेल्सियस से नीचे का तापमान अवशिष्ट डीएनए के पुन: निलंबन को मंद कर देगा, इस प्रकार डीएनए की मात्रा को सीमित कर देगा जिसे बाद के चरण में DNase I पाचन के साथ पचाया जाना चाहिए। इसलिए, सबसे अच्छा नमूने प्राप्त करने के लिए तापमान 65 डिग्री सेल्सियस पर रखना महत्वपूर्ण है।
    नोट: प्रोटोकॉल को इस बिंदु पर रोका जा सकता है, और नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।

5. DNase उपचार द्वारा आरएनए से दूषित डीएनए को हटाना

  1. पहले स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण से पहले कुल आरएनए से दूषित डीएनए को हटाने के लिए, कुल आरएनए के 10 μg में 10x DNase बफर का 0.1 वॉल्यूम और DNase एंजाइम का 1 μL जोड़ें। ट्यूब को धीरे से मिलाएं, और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. DNase निष्क्रियता अभिकर्मक को पुन: निलंबित करें, और कुल प्रतिक्रिया मात्रा का न्यूनतम 2 μL या 10% मात्रा जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं, और DNase निष्क्रियता अभिकर्मक के पुन: फैलाव के दौरान कमरे के तापमान (21 डिग्री सेल्सियस) पर 5 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
  3. 1.5 मिनट के लिए 10,000 × ग्राम पर टेबल-टॉप माइक्रोसेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा डीनेस अभिकर्मकों को पेलेट करें।
  4. गोली को परेशान किए बिना आरएनए युक्त सतह पर तैरनेवाला को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: निर्माता के निर्देशों के अनुसार 1 μL स्केल यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित न्यूक्लिक एसिड कंप्यूटर विश्लेषक का उपयोग करके आरएनए की गुणवत्ता की जांच करें; शुद्ध कुल आरएनए को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। क्यूआरटी-पीसीआर के लिए, आरएनए का उपयोग सीधे इस बिंदु पर किया जा सकता है। आरएनए अनुक्रमण जैसी अधिक संवेदनशील डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं के लिए, जिन्हें कठोर नमूना गुणवत्ता की आवश्यकता होती है, आगे बढ़ने के लिए ε 2.0 के ए260/230 अनुपात तक पहुंचना चाहिए।
  5. न्यूक्लियस-मुक्त पानी का उपयोग करके 500 μL के लिए डीएनए-मुक्त आरएनए समाधान की मात्रा बनाएं।
  6. न्यूक्लियस-मुक्त 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच 5.3) के 50 μL और आइसोप्रोपेनोल के 495 μL जोड़ें। अच्छी तरह मिलाएं, और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: यह कदम आरएनए को अवक्षेपित करेगा।
  7. 30 मिनट के लिए 13,000 x g और 4 °C पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा आरएनए को पुनर्प्राप्त करें।
  8. नमक को पूरी तरह से हटाने के लिए प्रत्येक धोने के बाद नमूने को 13,000 x g और 4 °C पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करके आरएनए गोली को बर्फ-ठंडे 70% इथेनॉल के साथ तीन बार धोएं।
  9. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 1 μL स्केल यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और माइक्रोफ्लुइडिक आधारित न्यूक्लिक एसिड कंप्यूटर विश्लेषक का उपयोग करके आरएनए की गुणवत्ता की जांच करें; शुद्ध कुल आरएनए को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    नोट: गाइड29 का उपयोग आरएनए गुणवत्ता मानकों को प्राप्त करने के लिए किया गया था। यदि A260/230 अनुपात <2.0 है, तो चरण 5.5–5.9 दोहराएँ।

6. DNase-मुक्त आरएनए का गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण

  1. कुल आरएनए के 1 μg के साथ 16 S RRNA प्राइमरों (तालिका 2) का उपयोग करके मात्रात्मक पीसीआर करके प्रत्येक नमूने के लिए DNase उपचार की दक्षता को मान्य करें, और पुष्टि करें कि कोई प्रवर्धन उत्पाद उत्पन्न नहीं हुआ है।
    नोट: जीडीएनए संदूषण का आकलन करने के लिए आदर्श प्राइमर प्राइमर होंगे जो प्रोकैरियोट्स में इंट्रोन-एक्सॉन जंक्शनों या नियामक क्षेत्रों में या ट्रांसक्रिप्शनल रूप से निष्क्रिय साइटों30,31 पर नष्ट करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित न्यूक्लिक एसिड कंप्यूटर विश्लेषक का उपयोग करके आरएनए अखंडता संख्या (आरआईएन) निर्धारित करें।
    नोट: नमूने जो आरआईएन ≥ 9 दिखाते हैं, उनका उपयोग पहले-स्ट्रैंड संश्लेषण के लिए किया जाना चाहिए। आरआईएन < 9 दिखाने वाले नमूने को छोड़ दिया जाना चाहिए, और अलगाव चरणों (1.1-5.4) को दोहराया जाना चाहिए।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एचएस आरएनए परख किट और फ्लोरिमीटर का उपयोग करके कुल आरएनए एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें।

7. फर्स्ट-स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण।

  1. यादृच्छिक हेक्सामर्स (50 ng.μL-1) के 1 μL और 10 mM dNTP मिश्रण के 1 μL के साथ कुल आरएनए के 1 μg को मिलाकर प्रत्येक नमूने के लिए एक आरएनए प्राइमर मिश्रण तैयार करें। फिर, न्यूक्लियस-मुक्त पानी का उपयोग करके कुल मात्रा को 10 μL में समायोजित करें।
  2. 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें, और 1 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
  3. 10x RT बफर के 2 μL जोड़कर प्रत्येक नमूने के लिए एक सीडीएनए संश्लेषण मिश्रण तैयार करें; 25 mM MgCl2 का 4 μL; 0.1 एम डीटीटी का 2 μL; RNase अवरोधक का 1 μL (40 U.μL-1); और संकेतित क्रम में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन अभिकर्मक (200 यू.μएल-1) का 1 μL।
  4. प्राइमर मिश्रण में सीडीएनए संश्लेषण मिश्रण जोड़ें। धीरे से मिलाएं, और ट्यूब के निचले भाग में घटकों को इकट्ठा करने के लिए नमूने को संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूने को इंजेक्ट करके मिश्रण को प्राइम करें, इसके बाद 50 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिनट। 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर इंजेशन करके प्रतिक्रियाओं को समाप्त करें, और बर्फ पर ठंडा करें।
  6. प्रत्येक ट्यूब में 1 μL RNase H जोड़ें, और डीएनए: आरएनए हाइब्रिड से आरएनए को हटाने के लिए 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  7. अंत में, सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया को 80 μL की कुल मात्रा में पतला करें, और इसे आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: प्रोटोकॉल इस बिंदु पर रोका जा सकता है।

8. मानक वक्र और मात्रात्मक (क्यू)-पीसीआर मार्कर जीन के अभिव्यक्ति स्तर को निर्धारित करने के लिए जो फेज प्रतिकृति के विभिन्न चरणों को इंगित करते हैं।

  1. लक्ष्य जीन के एक सेट की पहचान करें जो रुचि के फेज की प्रतिकृति के प्रत्येक चरण के लिए मार्कर के रूप में कार्य कर सकता है। हमारे मामले में, ये तालिका 2 में विस्तृत थे।
  2. प्रासंगिक प्राइमरों का उपयोग करके टेम्पलेट जीनोमिक डीएनए से प्रत्येक लक्ष्य जीन को बढ़ाएं और निम्नलिखित प्रवर्धन स्थितियों के साथ पीसीआर का उपयोग करें: 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृतीकरण; 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण; 30 सेकंड के लिए प्राइमरों (58 डिग्री सेल्सियस का उपयोग यहां किया गया था) के आधार पर इष्टतम एनीलिंग तापमान पर एनीलिंग; 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार; और 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार।
  3. पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके प्रत्येक एम्पलीकॉन को शुद्ध करें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार उन्हें टीए क्लोनिंग वेक्टर में क्लोन करें। सेंगर अनुक्रमण द्वारा प्रत्येक क्लोन उत्पाद के अनुक्रम को सत्यापित करें।
    नोट: प्रोटोकॉल इस बिंदु पर रोका जा सकता है।
  4. निम्नलिखित समीकरण20 का उपयोग करके अलग-अलग प्लास्मिड के लिए प्रतिलिपि संख्या की गणना करें:
    Equation 3
  5. आणविक-ग्रेड न्यूक्लियस-मुक्त बाँझ एच 2 ओ में प्लास्मिड डीएनए को 109 प्रतियों / μL से 102 प्रतियों / μL तक क्रमिक रूप से पतला करके प्रत्येक मार्कर जीन के लिए एक मानक टेम्पलेट तैयार करें।
  6. तीन प्रतियों में संबंधित प्लास्मिड मानकों के साथ-साथ प्रत्येक नमूने के लिए 1 μL cDNA (चरण 7.7 से) के साथ पसंदीदा QPCR प्रणाली के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार मात्रात्मक पीसीआर करें; प्रत्येक लक्ष्य के लिए 96-वेल प्लेट में पीसीआर का प्रदर्शन करें।
  7. लॉग डीएनए कॉपी नंबर (एक्स-अक्ष) बनाम चक्र सीमा (वाई-अक्ष, सीटी) को प्लॉट करें, और निर्धारण गुणांक (आर 2) और एक रैखिक समीकरण को प्रदर्शित करने के लिए रैखिक प्रतिगमन गणना करने के लिए एक्सेल या आर जैसे उपयुक्त प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करें।
    नोट: निर्धारण का गुणांक 0.98 से ऊपर होना चाहिए।
  8. रैखिक प्रतिगमन (चरण 8.7) से प्राप्त रैखिक समीकरण (y = mx + b) का उपयोग करके प्रत्येक लक्ष्य के लिए प्रतिलिपि संख्या का अनुमान लगाएं, जहां y अनुमानित सीटी है; एक्स लॉग डीएनए कॉपी नंबर है; एम रेखा का ढलान है, जो डीएनए कॉपी संख्या के संबंध में सीटी में परिवर्तन को परिभाषित करता है; और बी वाई-अक्ष इंटरसेप्ट है जो एक डीएनए कॉपी32 के लिए अनुमानित सीटी का प्रतिनिधित्व करता है।
  9. प्रत्येक मार्कर जीन के लिए मानक वक्र के रैखिक प्रतिगमन और निम्नलिखित समीकरण से मापदंडों का उपयोग करके पीसीआर प्रवर्धन (ई) की दक्षता की गणना करें, जहां एम चरण 8.7 और चरण 8.8 से प्राप्त ढलान है:
    Equation 4
  10. निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके सभी प्राइमरों को उनकी प्रतिशत दक्षता के संदर्भ में मान्य करें:
    नोट: दक्षता 90% -110% की सीमा में होनी चाहिए।
    Equation 5
  11. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके डीएनए की पूर्ण प्रतिलिपि संख्या की गणना करें:
    Equation 6
    जहां सीटी (चरण 8.8) चक्र सीमा है, बी इंटरसेप्ट (चरण 8.8) है, एम ढलान (चरण 8.8) है, और ई पीसीआर प्रवर्धन (चरण 8.9) की दक्षता है।
    महत्वपूर्ण: क्यू-पीसीआर द्वारा दो या अधिक लक्ष्यों के प्रवर्धन की तुलना करते समय, पूर्ण डीएनए कॉपी संख्याओं की तुलना करने के लिए प्रत्येक लक्ष्य के लिए पीसीआर दक्षता की गणना की जानी चाहिए।
  12. इस अध्ययन में, 16 एस आरआरएनए, प्रोसी और आरपीओडी जीन का उपयोग सामान्य आंतरिक नियंत्रण के रूप में किया गया था, और जीआईआरबी का उपयोग प्रेरण नियंत्रण33,34,35 के रूप में किया गया था।
    नोट: आरएनए सेक डेटा से आंतरिक नियंत्रण चुनते समय, आंतरिक नियंत्रणों का चयन करना सबसे अच्छा है जो परीक्षण की गई स्थितियों के लिए अभिव्यक्ति स्तर में परिवर्तन नहीं करते हैं। परिणामों की सार्थक व्याख्या के लिए उचित नियंत्रणों का सावधानीपूर्वक विचार हमेशा महत्वपूर्ण होता है।

Representative Results

इस काम में, गैर-उत्प्रेरण स्थितियों के तहत उगाए गए पीएओ 1 एलईएस 2 लाइसोजेन संस्कृति से फेज उत्पादन की प्रत्यक्ष अस्थायी गणना का उपयोग सहज एलईएस 2 प्रेरण के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए किया गया था। विकास के शुरुआती घातीय चरण के दौरान ताजा माध्यम में उपसंस्कृति के बाद फेज घनत्व ~ 2.61 x 106 प्लाक बनाने वाली इकाइयों (पीएफयू) एमएल -1 2 घंटे के औसत के साथ अपने निम्नतम बिंदु पर था, जिससे पता चलता है कि लाइसोजेनी प्रमुख अवस्था थी। LESQUE2 टिटर तेजी से 4 घंटे के भीतर ~ 2.4 x 108 PFU.mL-1 के औसत तक बढ़ गया और 6 घंटे के बाद उच्चतम घनत्व तक पहुंच गया (~ 5.83 x 109 PFU.mL-1 का औसत; चित्रा 4)।

लाइसोजेन विकास के शुरुआती लॉग चरण (2 घंटे के बाद) के दौरान न्यूनतम सहज प्रेरण देखा गया था। हालांकि, संस्कृति माध्यम में फेज की औसत दर्जे की उपस्थिति कई पूर्व घटनाओं का परिणाम थी, जिनमें निम्नलिखित शामिल थे: प्रोटीन हेड्स में न्यूक्लिक एसिड की पैकेजिंग, फेज कणों में प्रोटीन की असेंबली, और लेट फेज जीन, मध्य-चरण फेज जीन और प्रारंभिक नियामक फेज जीन की अभिव्यक्ति। फेज से जुड़ी प्रतिकृति घटनाओं की अभिव्यक्ति से पहले संक्रमित कोशिकाओं को पकड़ना महत्वपूर्ण था; इसलिए, प्रेरण से पहले संस्कृति को बढ़ने देने के लिए 90 मिनट चुना गया था। पीएओ 1 की जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल को पकड़ने के लिए, एक संस्कृति से एलईएस 2 लाइसोजेन नमूने 90 मिनट की अवधि में पूर्व-प्रेरण और पोस्ट-इंडक्शन की कटाई की गई थी, जैसा कि चरण 3.4 में उल्लेख किया गया है। यह 90 मिनट का समय बिंदु चरण 2.3.2 से पट्टिका परख द्वारा निवासी प्रोफेज के सहज प्रेरण के उच्च स्तर का पता लगाने से पहले है। चूंकि प्रारंभिक घातीय वृद्धि के दौरान जीवाणु कोशिका घनत्व कम था, इसलिए जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए पर्याप्त सामग्री सुनिश्चित करने के लिए संस्कृति की मात्रा को 800 एमएल तक बढ़ाया गया था। नमूने हर 10 मिनट में अनियंत्रित संस्कृति और प्रेरित संस्कृतियों से एकत्र किए गए थे, और बैक्टीरिया के विकास के दौरान लाइसोजेनी और लिटिक प्रतिकृति के लिए प्रमुख मार्करों की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल को मैप करने के लिए आरएनए निकाला गया था। कुल आरएनए को 16 एस आरआरएनए जीन (चरण 6.1) को लक्षित करने वाले क्यूपीसीआर परख का उपयोग करके जीनोमिक डीएनए की अनुपस्थिति के लिए शुद्ध और मान्य किया गया था। 9 ≥ एक आरआईएन तक पहुंचने वाले नमूने गुणवत्ता नियंत्रण से गुजरे और सीडीएनए में परिवर्तित हो गए।

एनोटेट किए गए एलईएस 2 जीनोम की जांच उन जीनों की पहचान करने के लिए की गई थी जो समशीतोष्ण फेज के लाइसोजेनिक और लिटिक प्रतिकृति चक्रों में प्रसिद्ध खिलाड़ी हैं। इन पहचाने गए जीनों का उपयोग तब प्रेरित और गैर-प्रेरित संस्कृतियों से लाइसोजेन चक्र-प्रतिबंधित और लिटिक चक्र से जुड़े जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग के लिए क्यूआरटी-पीसीआर को मान्य करने के लिए किया गया था। हमने पूर्ण डीएनए कॉपी संख्या की मात्रा निर्धारित की और गैर-प्रेरित और प्रेरित संस्कृतियों में अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना करने के लिए आर36 का उपयोग करके विलकॉक्सन हस्ताक्षरित-रैंक परीक्षण किया (चित्रा 5)। गैर-प्रेरित संस्कृतियों में ~ 2.31 x 10 9 प्रतियों से ~ 3.02 x 1011 प्रतियों तक क्रो जीन (लिटिक प्रतिकृति का एक प्रारंभिक मार्कर) की अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई (विलकॉक्सन हस्ताक्षरित-रैंक परीक्षण: पी < 0.01)। इसी तरह, ओ प्रोटीन और पी प्रोटीन, जो लिटिक प्रतिकृति के मध्य-चरण मार्कर हैं (और फेज जीनोम प्रतिकृति में शामिल होने की भविष्यवाणी की जाती है), ने भी ~ 1.74 x 108 से ~ 1.25 x 1010 प्रतियों (विलकॉक्सन हस्ताक्षरित-रैंक परीक्षण: पी < 0.01) और ~ 6.05 x 102 से ~ 5.68 x 105 प्रतियों (विलकॉक्सन हस्ताक्षरित-रैंक परीक्षण) से महत्वपूर्ण अपरेगुलेशन दिखाया। पी < 0.01), क्रमशः। अंत में, पूंछ से जुड़े संरचनात्मक जीन का उपयोग लिटिक प्रतिकृति चक्र के देर से मार्कर के रूप में किया गया था। फिर, हमने गैर-प्रेरित संस्कृतियों में ~ 2.31 x 106 प्रतियों से ~ 4.38 x 108 प्रतियों को प्रेरण के 30 मिनट बाद अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय वृद्धि देखी (विलकॉक्सन हस्ताक्षरित-रैंक परीक्षण: पी < 0.01)। इस प्रकार, मात्रात्मक आरटी-पीसीआर डेटा ने पुष्टि की कि लिटिक प्रतिकृति के लिए अच्छी तरह से स्थापित मार्कर जीन की जीन अभिव्यक्ति ने अपेक्षित प्रवृत्ति का पालन किया, जिसमें प्रारंभिक, मध्य और देर से मार्कर अनुमानित क्रम में कई गुना अंतर अभिव्यक्ति दिखाते हैं (चित्रा 5)। चूंकि लिटिक प्रतिकृति के लिए मार्करों की अभिव्यक्ति को रिकवरी के 30 मिनट बाद विनियमित किया गया था, इसलिए इसे लिटिक चक्र के दौरान सक्रिय समशीतोष्ण फेज और उनके जीवाणु मेजबानों के ट्रांसक्रिप्टोमिक परिदृश्य का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त प्रतिनिधि समय बिंदु माना जाता है।

हमने गैर-प्रेरित स्थितियों में लिटिक जीन की कुछ अभिव्यक्ति देखी, यह पुष्टि करते हुए कि कुछ सहज प्रेरण हमेशा होता है, यहां तक कि अनुकूलित संस्कृतियों में भी जिसमें प्रारंभिक लॉग चरण में सीएफयू से जारी पीएफयू के उच्चतम अनुपात के साथ लाइसोजेन संख्याओं का प्रतिनिधित्व किया जाता है। इसका मतलब यह है कि ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स डेटा में हमेशा "शोर" का कुछ स्तर होगा, जो प्रेरित और गैर-प्रेरित संस्कृतियों सहित सावधानीपूर्वक तैयार नियंत्रणों के महत्व को मजबूत करता है। अभिव्यक्ति में गुना परिवर्तन ों को निर्धारित करने के लिए आंतरिक नियंत्रण जीन का उचित विकल्प उन जीनों की पहचान करने के लिए ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स डेटा की सावधानीपूर्वक जांच करने पर निर्भर करता है जो गैर-प्रेरित और प्रेरित नमूने दोनों में समान स्तर पर व्यक्त किए जाते हैं। हमारे प्रारंभिक परिणामों से पता चलता है कि आरपीओडी परीक्षण किया गया सबसे विश्वसनीय नियंत्रण जीन था और इसमें सबसे स्थिर अभिव्यक्ति थी (प्रेरण से पहले ~ 1.71 x 10 5 प्रतियां और ~ 3.33 x 105 प्रतियां 30 मिनट पोस्ट-प्रेरण; विलकॉक्सन हस्ताक्षरित-रैंक परीक्षण: पी = 0.3594) 16 एस आरआरएनए या प्रोसी जीन (चित्रा 5) की तुलना में। आंतरिक नियंत्रणों की अभिव्यक्ति की परिवर्तनशीलता ने प्रतिलिपियों की पूर्ण संख्या के माप को जन्म दिया। ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स डेटा की भविष्य की परीक्षा आगे के सत्यापन के लिए उपयुक्त आंतरिक नियंत्रण की पसंद का समर्थन करेगी।

सीआई जीन का उपयोग हमारे जीन प्रोफाइलिंग अभ्यास में किया गया था, क्योंकि यह लाइसोजेनी का एक अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त मार्कर है। लिटिक प्रतिकृति के मार्करों की तुलना में, सीआई जीन की अभिव्यक्ति अपेक्षाकृत स्थिर थी (चित्रा 5), लेकिन इस जीन की प्रतिलिपि संख्या लिटिक प्रतिकृति के लिए मार्करों की तुलना में गैर-प्रेरित संस्कृतियों में आश्वस्त रूप से अधिक थी। ये डेटा एक ही नमूने में कम पीएफयू संख्या ओं के साथ समझौते में हैं, इस प्रकार पुष्टि करते हैं कि उच्च दमनकारी अभिव्यक्ति फेज उत्पादन के निचले स्तर से जुड़ी थी। यहां रिपोर्ट किए गए आंकड़ों से पता चलता है कि इस विशेष फेज के लिए सीआई प्रतिलेख की अभिव्यक्ति प्रेरण के बाद काफी कम नहीं है, जैसा कि एसटीएक्स फेज11,17 में देखा गया है। दमनकारी गतिविधि को आमतौर पर ट्रांसक्रिप्शनल और पोस्ट-ट्रांसलेशनल दोनों स्तरों पर नियंत्रित किया जाता है, इसलिए दमनकारी जीन को स्थानांतरित किया जा सकता है, लेकिन परिणामी प्रोटीन तुरंत ऑटोक्लीवेज के अधीन होता है। ट्रांसक्रिप्शनल और पोस्ट-ट्रांसलेशनल नियंत्रणों को मान्य करने के लिए आगे के प्रयोग की आवश्यकता है। इसके अलावा, हमारे मानक वक्र से, क्यूपीसीआर की न्यूनतम पहचान सीमा ~ 102 प्रतियां प्रतीत होती है।

साथ में, पट्टिका और क्यूआरटी-पीसीआर परख ों से हमारे निष्कर्ष आरएनए-सेक प्रयोगों के लिए एक अच्छी तरह से नियंत्रित इनपुट उत्पन्न करने के लिए संस्कृति और आरएनए नमूना तैयारी के लिए हमारी रणनीति को मान्य करते हैं। प्रारंभिक-घातीय चरण में गैर-प्रेरित संस्कृतियों ने सहज प्रेरण और लिटिक जीन अभिव्यक्ति के निम्न स्तर का प्रदर्शन किया, जो लाइसोजेनी के प्रभुत्व का सुझाव देता है। इसके विपरीत, प्रेरण के 30 मिनट बाद पृथक संस्कृतियों ने मार्कर जीन की अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाई जो लिटिक प्रतिकृति के प्रभुत्व का संकेत देते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: रिफैम्पिसिन प्रतिरोधी संकेतक होस्ट बनाने के लिए प्रोटोकॉल (BioRender.com के साथ बनाया गया)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एक ही नमूने से एक लाइसोजेन के पीएफयू और सीएफयू की गणना के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन। (BioRender.com के साथ बनाया गया) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: आरएनए अलगाव के लिए प्रेरित और गैर-प्रेरित संस्कृतियों के नमूने के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन। (BioRender.com के साथ बनाया गया) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सहज प्रेरण की अस्थायी गणना। पीएओ 1 से पीएफयू का उपयोग करके सहज एलईएस प्रोफेज उत्पादन की अस्थायी गणना समवर्ती सीएफयू, एन = 8 (दो जैविक और चार तकनीकी प्रतिकृतियां) के साथ पीएओ 1 × 2 लाइसोजेन से; त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. गहरे लाल बिंदु एलबी में सीएफयू-एमएल -1 को इंगित करते हैं; गहरे नीले बिंदु एलबी में पीएफयू-एमएल -1 को इंगित करते हैं। लाइसोजेन्स द्वारा 2 संक्रामक फेज की सहज रिहाई टीकाकरण के 2 घंटे बाद सबसे कम मापने योग्य स्तर पर होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: लक्ष्य मार्कर जीन की पूर्ण प्रतिलिपि संख्या। फेज मार्कर जीन की पूर्ण प्रतिलिपि संख्या आरटी-क्यूपीसीआर का उपयोग करके प्राप्त अनुमानित अभिव्यक्ति पैटर्न की पुष्टि करती है, जीन के लाइसोजेनी और लिटिक चक्रों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने की उम्मीद है। बिंदु तीन जैविक और तीन तकनीकी प्रतिकृति (एन = 9) दोनों का प्रतिनिधित्व करते हैं। (A) लाल बॉक्स लाइसोजेनी मार्कर, सीआई का प्रतिनिधित्व करता है; (बी) हरा प्रारंभिक लिटिक मार्कर, क्रो का प्रतिनिधित्व करता है; (सी, डी) नीला मध्य लिटिक मार्करों, डीएनए प्रतिकृति जीन का प्रतिनिधित्व करता है; (ई) मैजेंटा देर से लिटिक मार्कर, पूंछ संरचनात्मक जीन का प्रतिनिधित्व करता है; (एफ-एच) ग्रे मेजबान मार्करों का प्रतिनिधित्व करता है जो आंतरिक नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाते थे, और (आई) सफेद डीएनए ग्यारस बी का प्रतिनिधित्व करता है, जिसका उपयोग प्रेरण नियंत्रण के रूप में किया जाता था। ठोस क्षैतिज रेखाएं वितरण के औसत को दर्शाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: इस अध्ययन में डिज़ाइन किए गए प्राइमर। इस अध्ययन में उपयोग किए गए मार्कर जीन और आंतरिक नियंत्रणों के लिए विशिष्ट प्राइमरों के अनुक्रम उनके संबंधित एनसीबीआई परिग्रहण आईडी के साथ प्रदान किए गए हैं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: इस अध्ययन में उपयोग किए गए प्राइमरों की दक्षता की गणना क्यूपीसीआर मानक वक्र का उपयोग करके की जाती है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

ई कोलाई एमसी 106137,38,39 से एसटीएक्स फेज के सहज प्रेरण को अधिक सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए पट्टिका परख में उपयोग किए जाने वाले एक चयन योग्य संकेतक मेजबान का निर्माण यहां पी एरुगिनोसा फेज लेस2 के लिए वर्णित किया गया है। इस हस्तक्षेप में नमूना प्रसंस्करण चरणों और समय को कम करने का अतिरिक्त लाभ है, इस प्रकार कई संस्कृति स्थितियों में सहज प्रेरण दरों के एक साथ मूल्यांकन को सक्षम किया जा सकता है। रिफैम्पिसिन-प्रतिरोधी वेरिएंट40 के निर्माण के दौरान अन्य उत्परिवर्तन उत्पन्न करने का खतरा है; हालांकि, इस काम में, विकसित तनाव का उपयोग केवल रुचि की संस्कृतियों से सजीले टुकड़े की गणना के लिए एक संकेतक मेजबान के रूप में किया गया था और ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण में शामिल नहीं किया गया था। जब तक चयन योग्य संकेतक तनाव रुचि के फेज द्वारा संक्रमण के लिए समान रूप से अतिसंवेदनशील रहता है, तब तक अन्य अधिग्रहित उत्परिवर्तनों के बारे में कोई चिंता नहीं है। फिर भी, पीएओ 1डब्ल्यूटी और पीएओ 1आरआईएफ (डेटा नहीं दिखाया गया) के पल्स फील्ड जेल वैद्युतकणसंचलन (पीएफजीई) विश्लेषण द्वारा प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता प्रोफाइल में कोई अंतर नहीं पाया गया था।

मेजबान कोशिकाओं को चुनते समय, एक संकेतक तनाव ढूंढना दुर्लभ है जो पहले से ही प्रोफेज को परेशान नहीं करता है। बिंदु में एक मामले के रूप में, पीएओ 1 फिलामेंटस प्रोफेज पीएफ 4 को परेशान करता है। इस अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक नियंत्रण ों को विशिष्ट फेज (इस मामले में, एलईएस प्रोफेज 2) की जीन अभिव्यक्ति और बैक्टीरिया जीन अभिव्यक्ति पर इस फेज के प्रभावों की सीधे जांच करने में सक्षम होने के लिए डिज़ाइन किया गया था। एलईएस प्रोफेज 2 ले जाने वाले पीएओ 1 से प्रतिलिपियों की तुलना में और एलईएस प्रोफेज 2 (लाइसोजेन और गैर-लाइसोजेन दोनों अंतर्जात पीएफ 4 ले जाते हैं), जो मेजबान पर पीएफ 4 के प्रभाव को बाहर करने के लिए आंतरिक नियंत्रण के रूप में काम करते हैं। इसके अतिरिक्त, यह प्रदर्शित किया गया है कि पीएफ 4 आमतौर पर अपने मेजबान सेल41 में लाइसिस का कारण नहीं बनता है और इसलिए, इन प्रयोगों के परिणामों को भ्रमित करने में सक्षम नहीं है।

यह अच्छी तरह से स्थापित है कि सार्थक ओमिक्स डेटा42 के उत्पादन के लिए नमूना तैयारी में सावधानीपूर्वक गुणवत्ता नियंत्रण महत्वपूर्ण है। हालांकि, जैसा कि पहले11 वर्णित है, ऐसे अध्ययनों के लिए लाइसोजेन संस्कृतियों की तैयारी में प्रोफेज गतिविधि का सावधानीपूर्वक लक्षण वर्णन शायद ही कभी किया जाता है। यहां, हम बैक्टीरिया और समशीतोष्ण फेज के बीच बातचीत का बेहतर पता लगाने के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक अध्ययन के लिए संस्कृतियों के एक अच्छी तरह से नियंत्रित और अनुकूलित सेट तैयार करने के लिए हमारे व्यवस्थित प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं। आबादी की समकालिकता को प्रेरित एंटीबायोटिक नॉरफ्लॉक्सासिन के साथ इलाज करने से पहले संस्कृति को कम से कम चार दोहरीकरण के माध्यम से लाकर नियंत्रित किया गया था। अध्ययन में तनाव के लिए नॉरफ्लॉक्सासिन के एमआईसी का निर्धारण करके, हम यह सुनिश्चित कर सकते हैं कि उत्प्रेरण एजेंट की एकाग्रता "प्रेरण" उपचार के लिए एमआईसी से ठीक ऊपर थी। उपचारित कोशिकाओं को 1 घंटे के उपचार के बाद एमआईसी के नीचे नॉरफ्लॉक्सासिन एकाग्रता को कम करने के लिए 1:10 पतला किया गया था ताकि कोशिकाओं को फेज प्रतिकृति प्रक्रिया को ठीक करने और पूरा करने की अनुमति मिल सके, सेल के लाइसिस में समाप्त हो सके और संक्रामक फेज संतान की रिहाई हो सके। कोशिकाएं केवल प्रेरण उत्तेजना के बाद लिटिक प्रतिकृति चक्र में प्रवेश करती हैं जब रिकवरी अवधि के दौरान नॉरफ्लॉक्सासिन की एकाग्रता एमआईसी से नीचे लाई जाती है। इस मामले में, 1 μg.mL-1 नॉरफ्लॉक्सासिन से ऊपर जाने का मतलब है कि दवा को एमआईसी के नीचे प्रभावी रूप से पतला नहीं किया जा सकता है, क्योंकि PAO1 के लिए नॉरफ्लॉक्सासिन के लिए एमआईसी 0.19 μg.mL-1 है। इंड्यूसर कमजोर पड़ने के स्तर को लाइसोजेन रिकवरी की आवश्यकता और आरएनए की कटाई के लिए संस्कृति घनत्व के प्रतिधारण के साथ संतुलित किया जाना चाहिए। यहां चर्चा किए गए डेटा से पता चलता है कि नमूने बनाने के लिए संस्कृतियों को सिंक्रनाइज़ करना संभव है जिसमें लाइसोजेनी हावी है, इस प्रकार सहज प्रेरण से शोर को कम करता है और जीन अभिव्यक्ति में सच्चे लाइसोजेनी-संचालित परिवर्तनों का पता लगाने में सक्षम बनाता है। चूंकि लाइसोजेनिक अवस्था विकास के प्रारंभिक-घातीय चरण में प्रमुख होती है जब जीवाणु कोशिका घनत्व कम होता है, इसलिए हम आरएनए-सेक जैसे बाद के जीन अभिव्यक्ति अध्ययनों के लिए पर्याप्त आरएनए की कटाई के लिए संस्कृतियों को बढ़ाने का सुझाव देते हैं।

लिटिक चक्र में संस्कृतियों को मजबूर करने के लिए एक उत्प्रेरण एजेंट के रूप में नॉरफ्लॉक्सासिन का उपयोग अच्छी तरह से रिपोर्ट किया गया है43,44; हालांकि, यह प्रक्रिया45,46 में अन्य जीवाणु जीन की अभिव्यक्ति को भी प्रभावित करेगा। इसे कम करने के लिए, एक ही उत्प्रेरण और गैर-उत्प्रेरण स्थितियों के तहत उगाए गए जंगली प्रकार की संस्कृतियों को नियंत्रित करने वाले आरएनए पुस्तकालयों को आरएनए-सेक प्रयोगों में शामिल किया जाना चाहिए। क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा फेज प्रतिकृति के चरणों को मान्य करने के लिए आंतरिक नियंत्रण और प्रमुख मार्कर जीन का उपयोग भी सटीक तुलना के लिए महत्वपूर्ण है। मात्रात्मक आरटी-पीसीआर प्रोफाइलिंग की व्याख्या विभिन्न समय बिंदुओं पर प्रत्येक जीन के लिए प्रतिलेख की पूर्ण संख्या की तुलना करके नहीं की जा सकती है; यह प्रोफ़ाइल का आकार है जो मायने रखता है। सबसे पहले, किसी भी जीन के लिए प्रतिलेख में केवल एक छोटे से क्षेत्र का नमूना लिया गया है, इसलिए क्या यह अल्पकालिक या लंबे समय तक रहने वाला तत्वहै, यह अज्ञात है। निश्चित रूप से, प्रतिलेख के आरएनए-सेक मैपिंग से पता चलता है कि मैपिंग डेटा का घनत्व जीन की लंबाई में काफी भिन्न होता है। दूसरे, यह जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल का आकार है जिसे लिटिक चक्र या लाइसोजेनिक जीवन शैली से जुड़े मार्कर जीन के लिए व्याख्या की जानी चाहिए या यहां तक कि फेज नियामक सर्किट11 से भी अयुग्मित किया जाना चाहिए। लाइसोजेन संस्कृति में सहज प्रेरण एक वास्तविक मुद्दा है और इसके परिणामस्वरूप हमेशा लिटिक चक्र से जुड़े जीन की अभिव्यक्ति होगी। हालांकि, प्रोफाइलिंग से पता चलता है कि लिटिक प्रतिकृति चक्र से जुड़े जीन उनकी अभिव्यक्ति पूर्व-प्रेरण (कम से कम दो लॉग फोल्ड) और अप-विनियमित पोस्ट-प्रेरण में दबा दिए जाते हैं।

कोलाई के साथ एसटीएक्स फेज इंटरैक्शन के पहले आयोजित ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण लाइसोजेनी को बनाए रखने और लिटिक चक्र11,17 को ट्रिगर करने में शामिल फेज जीन की पूरी तरह से समझ का समर्थन करते हैं। वर्तमान में, पी एरुगिनोसा के एलईएस फेज को एनोटेट किया गया है, लेकिन उनके प्रमुख जीन कार्यों को कम अच्छी तरह से समझा जाता है। ट्रांसक्रिप्टोमिक अध्ययन एलईएस प्रोफेज के पुन: एनोटेशन को सक्षम करेगा और लाइसोजेनी और लिटिक चक्र में शामिल जीन की हमारी समझ में सुधार करेगा। जीन अनुक्रम को फ़ंक्शन से जोड़ना उपन्यास प्रोफेज के अध्ययन में एक बड़ी चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है, जो बेहतर एनोटेशन टूल47 के उत्पादन के लिए फेज जीन कार्यों की पुष्टि करने के लिए अधिक अध्ययन की आवश्यकता पर प्रकाश डालता है। इस वीडियो लेख में विस्तृत प्रोटोकॉल और अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण उपायों के व्यापक अनुप्रयोग और अनुकूलन से विभिन्न प्रोफेज कार्यों का अनावरण करने में मदद मिल सकती है और इस प्रकार, एनोटेशन पाइपलाइनों में सुधार हो सकता है और फेज और जीवाणु जीव विज्ञान की हमारी समझ बदल सकती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAO1 6
LESB58 6
LES phages Induced and purified from LESB58 using Norfloxacin. This study
Lysogeny Broth (LB) Merck 1.10285.500
LB Agar Merck 1.10283.500
Agar Agar Fisher A/1080/53
Top Agar 0.4 g Agar Agar+2.5 g LB Broth in 100 mL water; autoclave and use. -
Rifampicin Sigma (Stock: 50 mg/mL in Methanol- Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use) R3501
Glacial Acetic Acid Fisher 1% (v/v) in water 10060000
Norfloxacin Sigma (Stock: 25 mg/mL of 1% Glacial Acetic Acid-Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use;To avoid freeze thaw cycles, store as small aliquotes) N9890
Phenol saturated with citrate buffer pH 4.3 Sigma P-4682
Molecular Biology grade Ethanol Fisher 16695992
TRIzol Invitrogen 12044977
Chloroform Fisher 11398187
Isopropanol Fisher 17150576
Nuclease-free H2O Invitrogen 10526945
10X TURBO DNase Ambion AM1907
Qubit RNA HS, BR Kit Invitrogen Q10210
Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent 5067-1511
SuperScriptIII first strand synthesis kit Invitrogen 18080051
PCR Reagents Bioline Mytaq Red 2X BIO-25043
qPCR Reagents Sensifast SYBR Hi Rox BIO-92020
PCR purification kit Isolate II PCR and Gel Kit BIO-52060
TA cloning kit TA Cloning Kit, with pCR 2.1 Vector, without competent cells K202040
StepOne Real Time PCR system Thermo Fisher Scientific 4376600

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ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स के माध्यम से उनके लाइसोजेन्स पर समशीतोष्ण बैक्टीरियोफेज के प्रभाव को समझना
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Krishnamurthi, R.,… More

Krishnamurthi, R., González-Tortuero, E., Plahe, G., Goodhead, I. B., Fothergill, J. L., James, C. E., Allison, H. E. Understanding the Impact of Temperate Bacteriophages on Their Lysogens Through Transcriptomics. J. Vis. Exp. (203), e64945, doi:10.3791/64945 (2024).

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