Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

通过转录组学了解温带噬菌体对其溶原的影响

Published: January 5, 2024 doi: 10.3791/64945
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1, 2, 1
1Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, Institute of Infection, Veterinary and Ecological Sciences (IVES), University of Liverpool, 2School of Science, Engineering, and Environment, University of Salford

Summary

该协议能够揭示噬菌体对其宿主的影响。细菌培养物使用最能支持溶原状态的条件进行同步，从而限制了自发诱导。RT-qPCR明确区分噬菌体限制性基因和与噬菌体对照未偶联的基因与裂解复制周期中表达的基因。

Abstract

温带噬菌体被发现作为噬菌体整合在大多数细菌基因组中。一些噬菌体是隐秘的并固定在细菌染色体中，但其他噬菌体是活跃的，可以自发或通过暴露于诱导因子触发成复制形式。噬菌体通常与赋予宿主细胞毒素产生或其他毒力相关特征的能力有关。最近的研究表明，它们可以在改变宿主的生理机能方面发挥更大的作用。这里描述的技术使我们能够研究噬菌体如何影响机会性细菌铜 绿假单胞菌的基因表达。

在这项工作中，比较了野生型 铜绿假单胞菌菌 株PAO1的生长情况与携带利物浦流行株（LES）LESB58不同噬菌体组合的同基因溶原的生长情况。在溶菌原培养中，一部分细菌细胞将支持裂解噬菌体复制（自发诱导），每个细胞的晚期噬菌体基因（例如与噬菌体颗粒组装相关的基因）的高水平表达，从而掩盖了与溶原限制性基因表达相关的低水平基因表达。因此，自发诱导的影响可以掩盖溶菌原群体中的噬菌体基因表达。

生长谱实验用于识别自发诱导，在早期指数生长阶段，自发诱导是最小的。本研究报告了如何在早期指数生长阶段制备样品培养物，以及如何在细胞数量低的情况下设置足够的对照。这些方案确保了在各种条件下野生型和溶原细菌的可靠和可重复的比较，从而改善了噬菌体基因组的转录组学分析，并有助于鉴定以前未识别的噬菌体功能。

Introduction

最近，用于解决抗菌素耐药性的噬菌体疗法1 和基于 CRISPR-Cas 的基因编辑2 重新引起了人们对噬菌体研究的兴趣。同样，生物技术的进步使人们能够更深入地研究细菌和噬菌体之间的相互作用3。然而，噬菌体的治疗用途（“噬菌体疗法”）受到阻碍，因为人们担心噬菌体充当具有水平转移毒力和抗性基因的能力的移动遗传元件4。“暗物质”5（功能未知的基因）的广阔既令人不安又诱人。暗物质被认为是我们对噬菌体生物学理解的一个空白，也是分子工具和潜在新疗法的未开发资源6。高通量测序技术的发展，以及改进的基因注释7、8、9 和新的肽折叠算法10，正在改善噬菌体基因的检测、描述和功能预测。然而，科学还远未验证大多数噬菌体在文化或现实世界中的基因功能。

RNA 测序 （RNA-Seq） 可以对噬菌体感染期间的基因表达进行全局定位，并显着提高了对参与裂解和溶原循环的噬菌体和细菌元件的理解11,12。在溶原过程中，温带噬菌体基因组被整合到细菌 DNA 中成为噬菌体13。全局基因表达谱实验可用于鉴定在温带噬菌体基因组上编码但仅在溶原状态下表达的噬菌体限制性基因11。这些基因不编码噬菌体结构蛋白，也不参与任何噬菌体感染过程。RNA-Seq可用于鉴定那些更有可能影响细菌宿主生物学的基因，无论是通过诱导功能增益还是调节现有的细菌基因，从而通常使细菌能够适应不断变化的环境。因此，可以研究噬菌体充当微生物傀儡大师的能力，控制一系列细菌功能。

有效分析噬菌体限制性基因表达存在两个主要障碍。首先，易受感染宿主的可用性是一个关键问题。根据定义，噬菌体已经被整合到其特定的宿主基因组中，因此很难找到一个易感的野生型宿主来比较噬菌体存在和不存在时的整体基因表达。这可以通过从头感染另一个易感宿主或从原始野生型分离株中删除噬菌体来实现，而不会破坏宿主基因组的其余部分。第二个障碍在于溶原种群的异质性。一些噬菌体通过突变或重组降解成为“隐秘”，这意味着它们被固定在细菌基因组的特定位置。然而，其他噬菌体是“活跃的”，可以自发地或在暴露于诱导因子后诱导进入复制的裂解循环。在许多溶原培养物中，自发诱导的速率意味着一部分细菌细胞总是在进行裂解噬菌体复制14,15,16。这些群体中晚期噬菌体基因的高水平表达掩盖了与溶原限制性基因表达相关的低水平基因表达11,17。接受自发噬菌体诱导的溶原比例可能随生长状态、生长条件或其他触发因素而变化。因此，为了研究噬菌体对溶原的影响，必须通过优化生长条件以有利于溶原状态来尽可能减少自发的噬菌体诱导事件。

本研究报告了为调查铜绿假单胞菌利物浦流行菌株 （LES） 的一组同居噬菌体的影响而进行的准备工作。从LES中诱导并分离活性噬菌体，用于感染模型铜绿假单胞菌宿主菌株PAO116,18,19。对野生型铜绿假单胞菌菌株PAO1及其溶菌原PAO1Φ2的全基因组进行测序（覆盖深度为30倍），以确保野生型菌株的鉴定，并确认溶菌原是同源的。LES 与囊性纤维化患者的发病率和死亡率增加有关，并且 LES 噬菌体 19 被认为有助于适应囊性纤维化肺环境16,19,20。尽管有强有力的证据表明这些噬菌体会影响其宿主的生物学20,21，但它们的大部分基因功能尚未表征，并且对相互作用的具体机制知之甚少。转录组学方法可以根据经验揭示噬菌体基因在受控宿主背景下的功能。由于自发诱导会影响表达谱，本文介绍了如何优化生长条件以有利于溶原状态。这种培养物的同步可以通过实时PCR进行验证，以量化与PAO1中LES噬菌体复制的关键阶段相关的关键遗传标记的表达水平。以前曾使用相同的方法鉴定志贺产毒噬菌体的噬菌体限制性功能，这些功能会影响大肠杆菌 11、17、21、22 的运动性、耐酸性和抗菌素耐药性。

Protocol

1. 创建一个可选的指标主机（图 1）

注：噬菌体培养裂解物可能含有来自原始细菌宿主的污染细胞。具有抗生素耐药指示菌株可以区分指示菌株和原噬菌体的原始细菌宿主。使用可选的指示菌株可以准确计数感染性噬菌体颗粒，而无需离心或过滤步骤，即可在噬菌体扩增步骤后从溶菌原细胞中去除噬菌体。可选择的指示剂宿主菌株还减少了噬菌体计数的时间和步骤数，因此可以同时试验多种条件。

  1. 确定合适的指示宿主菌株，该菌株易受目标温和噬菌体的裂解和溶原感染。使用铜绿假单胞菌实验室菌株 PAO118,20，对三种 LES 噬菌体（LESΦ2、LESΦ3 和 LESΦ4）敏感。
  2. 选择合适的选择性试剂（此处使用利福平），并进行肉汤稀释测定以确定指示剂宿主的最低抑制浓度 （MIC）（16 μg·mL−1 是 PAO1 的 MIC）23,24。
  3. 依次将指示剂宿主培养物暴露于溶原性肉汤（LB）中浓度增加的选择性试剂中，从低于MIC（在这种情况下为5μg·mL - 1）开始，在37°C下振荡18-24小时。
  4. 将以1：100（接种物与培养基）的比例以最高浓度生长的培养物转移到两倍增加的选择性剂中（每次18-24小时），直到MIC充分增加。PAO1在300 μg·mL−1利福平时成为利福平耐药菌株（PAO1-Rif R）。

2. 自发诱导的时间直接枚举（图2）

  1. 通过在5mL LB中接种单个菌落，建立溶菌原（例如，铜 绿假单胞菌 PAO1溶菌原携带LES噬菌体）和指示剂宿主（PAO1-RifR）的过夜起始培养物，并在37°C下以180rpm（18-24小时）振荡孵育。
  2. 通过将过夜培养物以1：100的比例接种在100mL LB中，并在37°C下振荡孵育（180rpm）来建立新鲜的溶菌原和指示剂宿主培养物。
    1. 通过使用 Miles Misra 技术测量 OD600 和活菌计数来监测溶菌原生长25.为此，从接种点开始每小时从每种溶菌原培养物中收集 1 mL 样品，持续 8 小时。
    2. 收集后立即将 100 μL 样品加入 900 μL 相应培养基中，连续稀释样品。以最大速度充分涡旋，在每次稀释时丢弃尖端，并继续稀释系列从10-1到10-9。
    3. 将10μL所需的稀释液一式三份点在LB琼脂平板上，使其干燥，并在37°C下孵育18-24小时。
    4. 要计算活细菌细胞的数量，请找到具有易于计数的菌落的稀释液。计算每个点的菌落数，然后使用以下公式：
      Equation 1
      注意：随着溶菌原培养物的生长，活性噬菌体颗粒将通过自发诱导产生。感染性噬菌体的产生意味着溶菌原群体的转录组现在被裂解噬菌体复制信号和相应的宿主细胞反应的裂解复制周期相关基因表达污染。因此，重要的是要确定溶原细胞与游离感染性噬菌体颗粒比例最高的生长阶段，以便限制数据集中尽可能多的背景转录噪声（由裂解噬菌体转录组产生）。
  3. 为了计数每个时间样品中的感染性噬菌体颗粒，在LB（顶部琼脂）中接种5mL无菌0.4%细菌琼脂和100μL中指数期指示剂宿主（OD600：0.4-0.5;在这种情况下，PAO1-RifR）在适当的选择性试剂（在这种情况下为50μg·mL-1利福平）存在下，因为PAO1宿主的MIC仅为16μg·mL - 1;参见材料表， 第 8 行和第 9 行）
    1. 将10μL相同的连续稀释液（参见步骤2.2.2）点在接种的顶部琼脂层上，并在37°C孵育18-24小时之前使其干燥。
    2. 要计算感染性噬菌体颗粒，请找到具有易于计数的斑块的稀释液。计算每个斑点的牙菌斑数量。
      Equation 2
    3. 为进一步的实验步骤找出每个CFU（菌落形成单位）自发诱导最少的时间/条件。

3. 制备用于RNA提取的未诱导和诱导溶菌原培养物（图3）

  1. 通过在5mL LB中接种溶菌原的单个菌落来建立新鲜的过夜培养物，并在37°C下振荡（180rpm）孵育18-24小时。
  2. 在 8 个 250 mL 烧瓶中以 1：100 的比例在 80 mL LB 中传代培养过夜培养物。
  3. 将第一个烧瓶标记为“未诱导”，将其他烧瓶标记为“诱导”，以及应收获每个样品的时间点（即“诱导 t = 0”、“诱导 t = 10 分钟”、“诱导 t = 20 分钟”等; 图3）。
  4. 孵育90分钟后，当OD600 在0.1-0.2之间时，或在最小的自发诱导时（参见讨论），向未诱导的烧瓶中加入4μL的1%冰醋酸（v / v）（图3）。
    注：由于本工作中的诱导剂是使用1%冰醋酸作为溶剂制成的，因此单独加入相同量的溶剂作为对照步骤。根据不同诱导剂的制备，可以考虑替代对照。
  5. 将来自未诱导烧瓶的 80 mL 培养物加入 720 mL 无菌 LB 中，并立即使用培养体积 （160 mL） 的 20% 体积加入终止溶液（冰冷的 5% [v/v] 苯酚，pH 4.3,95% [v/v] 乙醇），并在冰上孵育至少 30 分钟且不超过 2 小时以稳定 RNA 转录物12，26,27.这是非诱导样本。
  6. 用适当诱导剂的MIC（在这种情况下，25mg·mL - 1诺氟沙星，在1%冰醋酸[w / v]中制备，以1μg·mL - 1的终浓度使用），在七个250mL烧瓶（图3）中诱导剩余的培养物，充分混合，并在37°C下孵育，并以180rpm振荡1小时。
    注意：此步骤将迫使溶菌原培养物进入更协调的裂解复制状态。培养物中的大多数细胞将开始裂解产生感染性噬菌体颗粒。
  7. 通过将诱导瓶中的 80 mL 培养物添加到 720 mL 无菌 LB 中，使细胞恢复，这有效地稀释了诱导剂。如步骤3.5所述，从时间0到1小时，每10分钟从每个烧瓶中收获细菌细胞，加入终止溶液。
    注：终止溶液可使RNA稳定长达2小时。然而，为了增强样品的稳定性，在4°C下执行所有进一步的步骤。
  8. 尽快在4°C下以10,000× g 离心15分钟，处理后不超过2小时以避免RNA降解。
  9. 弃去上清液，使用可调节的自动移液管将细菌沉淀轻轻重悬于残留液体中，然后再将每个样品转移到 1.5 mL 微量离心管中。
  10. 将微量离心管在4°C的微量离心机中1分钟，弃去残留的上清液。
  11. 通过将每个密封的微量离心管放入液氮中来快速冷冻颗粒。这将有助于有效裂解细胞以提取 RNA。
  12. 向每个冷冻沉淀中加入TRIzol（1mL），并通过移液使悬浮液均质化（不要涡旋）。储存在-80°C，直到准备对所有样品进行RNA提取。
    注意：此时可以暂停协议。
  13. 重复步骤3.1-3.13，进行三次生物学重复。

4. 从非诱导和诱导溶菌原培养物中分离 RNA

关键：所有这些步骤都应在无 RNase 的环境中执行28.工作台应用 10% NaClO 或专有的 RNase 灭活剂擦拭。实验室器皿应用RNase抑制剂（如DEPC处理）处理，所有反应均应使用无核酸酶的水。

  1. 将步骤3.12中冷冻的TRIzol处理的沉淀在冰上解冻，并加入400μL分子生物学级氯仿。
  2. 通过倒置10秒充分搅拌小瓶以完成所有细胞的裂解（ 不要 涡旋）。然后，在室温（21°C）下孵育2-5分钟。
  3. 通过使用冷冻台式微量离心机在4°C和13,000× g 下离心15分钟，将水层从TRIzol /氯仿混合物中分离出来。
  4. 使用 1,000 μL 移液管收集水相（~ 500 μL，顶层），注意不要干扰相间相或有机相（底层）。转移到新的 1.5 mL 微量离心管中。
  5. 向分离的水相中加入450μL分子生物学级异丙醇，倒置（ 不 涡旋）充分混合，并在室温（21°C）下孵育30分钟。
  6. 通过使用冷冻离心机在4°C和13,000× g 离心30分钟来回收RNA。
  7. 在不干扰RNA沉淀的情况下弃去上清液，并用800μL用无核酸酶水制备的70%乙醇洗涤沉淀两次（不要上下移液）。每次洗涤后重复离心步骤5分钟，确保RNA沉淀的稳定性。
  8. 弃去乙醇，然后风干颗粒。
    注意：使用 10 μL 微量尖端小心地吸出沉淀周围的乙醇，并通过在干净的印迹纸上倒置试管来干燥沉淀。RNA沉淀应变为无色，边缘应呈现褶皱和可见。干燥太少会留下残留的乙醇，从而影响下游工艺，而过多地干燥颗粒会使重悬变得困难。
  9. 通过在65°C下在热振荡器上间歇混合（每30秒）孵育总共3-5分钟，将RNA重悬于无核酸酶的水（50μL）中。
    关键：RNA的2'-OH基团能够在65°C以上的高温和高pH值下催化RNA链的自切割。低于 65 °C 的温度将延缓残留 DNA 的重悬，从而限制了 DNase I 消化后期必须消化的 DNA 量。因此，将温度保持在65°C对于获得最佳样品至关重要。
    注意：此时可以暂停方案，样品可以储存在−80°C。

5. 通过DNase处理从RNA中去除污染DNA

  1. 为了在第一链cDNA合成之前从总RNA中去除污染的DNA，将0.1体积的10x DNase缓冲液和1μL的DNase酶加入到10μg总RNA中。轻轻混合试管，并在37°C孵育30分钟。
  2. 重悬 DNase 灭活试剂，并加入至少 2 μL 或总反应体积的 10% 体积。充分混合，并在DNase失活试剂再分散期间在室温（21°C）下孵育样品5分钟。
  3. 使用台式微量离心机以10,000 ×g 离心1.5分钟，沉淀DNase试剂。
  4. 将含有RNA的上清液转移到新鲜管中，而不干扰沉淀。
    注：按照制造商的说明，使用 1 μL 刻度紫外分光光度计和基于微流体的核酸计算机分析仪检查 RNA 的质量;纯化的总RNA可以储存在-80°C。 对于qRT-PCR，此时可直接使用RNA。对于更敏感的下游工艺，如RNA测序，需要严格的样品质量，必须达到260/230 比ε 2.0才能进一步进行。
  5. 使用无核酸酶的水将无DNA的RNA溶液的体积补足至500μL。
  6. 加入 50 μL 无核酸酶的 3 M 乙酸钠 （pH 5.3） 和 495 μL 异丙醇。充分混合，在室温下孵育30分钟。
    注意：此步骤将沉淀RNA。
  7. 通过在13,000× g 和4°C离心30分钟来回收RNA。
  8. 每次洗涤后将样品在13,000× g 和4°C下离心5分钟，用冰冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀三次，以完全除去盐。
  9. 按照制造商的说明，使用 1 μL 规模的紫外分光光度计和基于微流体的核酸计算机分析仪检查 RNA 的质量;纯化的总RNA可以储存在-80°C。
    注：指南29 用于达到RNA质量标准。如果 A260/230 比率为 <2.0，则重复步骤 5.5–5.9。

6. 无DNase RNA的定性和定量分析

  1. 通过使用16S rRNA引物（表2）和1μg总RNA进行定量PCR，验证每个样品的DNase处理效率，并确认未产生扩增产物。
    注：评估gDNA污染的理想引物是设计用于在原核生物的内含子-外显子连接或调节区域或转录失活位点退火的引物30,31。
  2. 按照制造商的说明，使用基于微流控的核酸计算机分析仪确定 RNA 完整性数 （RIN）。
    注：显示 RIN ≥ 9 的样品应用于第一链合成。显示 RIN < 9 的样品应丢弃，并应重复分离步骤 （1.1–5.4）。
  3. 根据制造商的说明，使用HS RNA测定试剂盒和荧光计定量总RNA浓度。

7. 第一链cDNA合成

  1. 通过将 1 μg 总 RNA 与 1 μL 随机六聚体 （50 ng·μL−1） 和 1 μL 10 mM dNTP 混合物混合，为每个样品制备 RNA 引物混合物。然后，使用无核酸酶的水将总体积调节至10μL。
  2. 将反应在65°C孵育5分钟，并置于冰上1分钟。
  3. 通过加入 2 μL 10x RT 缓冲液为每个样品制备 cDNA 合成混合物;4 μL 25 mM MgCl2;2 μL 0.1 M DTT;1 μL RNase 抑制剂 （40 U·μL−1）;和 1 μL 逆转录试剂 （200 U·μL−1） 按指定顺序。
  4. 将cDNA合成混合物添加到RNA/引物混合物中。轻轻混合，然后短暂离心样品以收集管底部的成分。
  5. 通过将样品在25°C下孵育10分钟，然后在50°C下孵育50分钟来引发混合物。 通过在85°C孵育5分钟终止反应，并在冰上冷却。
  6. 向每个试管中加入1μL RNase H，并在37°C下孵育20分钟，以从DNA：RNA杂交体中除去RNA。
  7. 最后，将cDNA合成反应稀释至总体积为80μL，并将其储存在-80°C直至进一步使用。
    注意：此时可以暂停协议。

8.标准曲线和定量（q）-PCR确定指示噬菌体复制不同阶段的标记基因的表达水平

  1. 确定一组靶基因，这些靶基因可以作为目标噬菌体复制的每个阶段的标记物。在我们的例子中，这些如 表 2 中详细说明。
  2. 使用相关引物并使用PCR扩增模板基因组DNA中的每个靶基因，扩增条件如下：在95°C下初始变性2分钟;在95°C下变性30秒;根据引物的不同，在最佳退火温度下退火30 s（此处使用58 °C）;在 72°C 下延伸 1 分钟;最终在72°C下延伸5分钟。
  3. 使用PCR纯化试剂盒纯化每个扩增子，并按照制造商的说明将其克隆到TA克隆载体中。通过Sanger测序验证每个克隆产物的序列。
    注意：此时可以暂停协议。
  4. 使用以下公式20计算单个质粒的拷贝数：
    Equation 3
  5. 通过在分子级无核酸酶无菌H 2 O中将质粒DNA从109拷贝/μL连续稀释到102拷贝/μL，为每个标记基因制备标准模板。
  6. 根据制造商对首选qPCR系统的说明进行定量PCR，每个样品一式三份，其中1μLcDNA（来自步骤7.7），以及一式三份的相应质粒标准品;在96孔板中对每个靶标进行PCR。
  7. 绘制对数 DNA 拷贝数（x 轴）与循环阈值（y 轴，Ct）的关系图，并使用适当的平台（如 Excel 或 R）执行线性回归计算，以显示决定系数 （R2） 和线性方程。
    注意：决定系数应高于 0.98。
  8. 使用从线性回归（步骤 8.7）得出的线性方程 （y = mx + b） 估计每个靶标的拷贝数，其中 y 是估计的 Ct;x 是对数 DNA 拷贝数;m 是线的斜率，它定义了 Ct 相对于 DNA 拷贝数的变化;b 是 y 轴截距，表示一个 DNA 拷贝32 的估计 Ct。
  9. 对于每个标记基因，使用标准曲线的线性回归参数和以下公式计算PCR扩增（E）的效率，其中 m 是从步骤8.7和步骤8.8得出的斜率：
    Equation 4
  10. 使用以下公式验证所有引物的效率百分比：
    注意： 效率必须在 90%–110% 的范围内。
    Equation 5
  11. 使用以下公式计算DNA的绝对拷贝数：
    Equation 6
    其中 Ct （步骤8.8）是循环阈值， b 是截距（步骤8.8）， m 是斜率（步骤8.8）， E 是PCR扩增的效率（步骤8.9）。
    关键：当比较q-PCR对两个或多个靶标的扩增时，必须计算每个靶标的PCR效率，以比较绝对DNA拷贝数。
  12. 本研究以16S rRNA、proC和rpoD基因作为一般内控，gyrB作为诱导对照33,34,35。
    注：从RNA seq数据中选择内部对照时，最好选择在测试条件下表达水平不变的内部对照。仔细考虑适当的控制对于有意义地解释结果总是很重要的。

Representative Results

在这项工作中，使用在非诱导条件下生长的 PAO1 LESΦ2 溶菌原培养物的噬菌体产生的直接时间计数来确定自发 LESΦ2 诱导的影响。噬菌体密度处于最低点，在生长早期指数期，在新鲜培养基中传代培养后2 h，噬菌体密度达到最低点，平均值为~2.61 x 106个噬菌斑形成单位（PFU）·mL−1，表明溶原性是优势状态。LESΦ2滴度在4 h内迅速升高至~2.4 x 108 PFU·mL−1的平均值，6 h后达到最高密度（平均值为~5.83 x 109 PFU·mL−1;图4）。

在溶菌原生长的早期对数期（2小时后）观察到最小的自发诱导。然而，培养基中噬菌体的可测量存在是许多先前事件的结果，包括以下内容：核酸包装到蛋白质头部，蛋白质组装成噬菌体颗粒，以及晚期噬菌体基因、中期噬菌体基因和早期调节噬菌体基因的表达。在噬菌体相关复制事件表达之前捕获受感染的细胞很重要;因此，选择90 min让培养物在诱导前生长。为了捕获 PAO1 的基因表达谱，在诱导前和诱导后 90 分钟内收获来自培养物的 LESΦ2 溶菌原样品，如步骤 3.4 所述。这个 90 分钟的时间点远在通过步骤 2.3.2 的斑块测定检测到驻留噬菌体的高水平自发诱导之前。由于早期指数生长期间细菌细胞密度较低，因此将培养体积放大至 800 mL，以确保为基因表达研究提供充足的材料。从非诱导培养物中收集样品，每 10 分钟收集一次诱导培养物，提取 RNA 以绘制细菌生长过程中溶原和裂解复制关键标记物的表达谱。使用靶向 16S rRNA基因的qPCR测定法纯化总RNA并验证基因组DNA的缺失（步骤6.1）。达到 RIN ≥ 9 的样品通过了质量控制并转化为 cDNA。

对带注释的 LESΦ2 基因组进行检测，以鉴定在温带噬菌体溶原和裂解复制周期中众所周知的基因。然后使用这些鉴定的基因来验证qRT-PCR对来自诱导和非诱导培养物的溶原周期限制和裂解周期相关基因的表达谱。我们量化了绝对 DNA 拷贝数，并使用 R36 进行了 Wilcoxon 符号秩测试，以比较未诱导和诱导培养物中的表达水平（图 5）。观察到 cro 基因（裂解复制的早期标志物）的表达显着增加，从未诱导培养物中的 ~2.31 x 109 拷贝增加到诱导后 30 分钟的 ~3.02 x10 11 拷贝（Wilcoxon 符号秩检验：p < 0.01）。同样，O蛋白和P蛋白是裂解复制的中期标志物（预计参与噬菌体基因组复制），也显示出从~1.74 x 108到~1.25 x 10 10拷贝（Wilcoxon符号秩检验：p < 0.01）和从~6.05 x 102到~5.68 x10 5拷贝（Wilcoxon符号秩检验： p < 0.01）。最后，将尾部相关结构基因作为裂解复制周期的晚期标记。同样，我们观察到表达从未诱导培养物中的~2.31 x 106拷贝显着增加到诱导后30分钟的~4.38 x 108拷贝（Wilcoxon符号秩检验：p < 0.01）。因此，定量RT-PCR数据证实，用于裂解复制的成熟标记基因的基因表达遵循预期的趋势，早期、中期和晚期标记物在预测的顺序中显示出多倍的差异表达（图5）。由于裂解复制标记物的表达在恢复后 30 分钟上调，因此这被认为是研究裂解周期中活性温带噬菌体及其细菌宿主转录组学景观的适当代表性时间点。

我们在未诱导的条件下观察到一些裂解基因的表达，证实一些自发诱导总是发生，即使在优化的培养物中，溶原数量在早期对数期以最高的 CFU 与释放的 PFU 的比率表示。这意味着转录组学数据中总会存在一定程度的“噪声”，这加强了精心准备的对照（包括诱导和非诱导培养）的重要性。适当选择内部对照基因以确定表达的倍数变化依赖于仔细检查转录组学数据，以鉴定在未诱导和诱导样品中以相同水平表达的基因。我们的初步结果表明，rpoD 是测试的最可靠的对照基因，并且具有最稳定的表达（诱导前 ~1.71 x 10 5 拷贝，诱导后 30 分钟~3.33 x 105 拷贝;Wilcoxon符号秩检验：p = 0.3594）与16S rRNA或proC基因相比（图5）。内部对照表达的可变性导致了转录本绝对数量的测量。未来对转录组学数据的检查将支持选择适当的内部对照品进行进一步验证。

cI基因被用于我们的基因分析工作，因为它是公认的溶原性标志物。与裂解复制标记物相比，cI基因的表达相对稳定（图5），但与裂解复制标记物相比，该基因在非诱导培养物中的拷贝数高得令人放心。这些数据与相同样品中的低PFU数一致，从而证实了高阻遏蛋白表达与较低的噬菌体产生水平相关。这里报告的数据表明，这种特定噬菌体的cI转录本的表达在诱导后没有显着下调，如Stx噬菌体11,17所示。阻遏蛋白活性通常在转录和翻译后水平上都受到控制，因此阻遏蛋白基因可以被转录，但所得蛋白会立即进行自切割。需要进一步的实验来验证转录和翻译后对照。此外，从我们的标准曲线来看，qPCR的最小检测限似乎为~102拷贝。

总之，我们从噬菌斑和qRT-PCR检测中发现的结果验证了我们的培养和RNA样品制备策略，为RNA-Seq实验生成良好控制的输入。早期指数期的非诱导培养物表现出低水平的自发诱导和裂解基因表达，表明溶原性占主导地位。相反，诱导后 30 分钟分离的培养物显示标记基因的表达显着增加，这表明裂解复制占主导地位。

Figure 1
图 1：用于创建利福平耐药指示剂主机的协议（使用 BioRender.com 创建）。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2：从 同一样品中计数溶菌原的 PFU 和 CFU 的实验设计。 （使用 BioRender.com 创建） 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3：用于 RNA 分离的诱导和非诱导培养物采样的实验设计。 （使用 BioRender.com 创建） 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4：自发诱导的时间枚举。使用来自 PAO1 Φ2 溶菌原的 PFU 和同时的 CFU 对自发 LES 噬菌体产生的时间计数，n = 8（两个生物学重复和四个技术重复）;误差线表示标准偏差。暗红色点表示 LB 中的 CFU·mL−1 ;深蓝色点表示 LB 中的 PFU·mL−1 。溶原自发释放φ2感染性噬菌体在接种后2小时处于最低可测量水平。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图5：靶标记基因的绝对拷贝数。噬菌体标记基因的绝对拷贝数证实了使用RT-qPCR得出的预测表达模式，这些基因有望在溶原和裂解周期中发挥重要作用。这些点代表三个生物学重复和三个技术重复 （n = 9）。（一）红框代表溶原性标志物cI;（B）绿色代表早期裂解标志物，cro;（C，D）蓝色代表中间裂解标记物，DNA复制基因;（E）品红色代表晚期裂解标记、尾部结构基因;（F-H）灰色代表用作内部对照的宿主标记物，（I）白色代表用作诱导对照的DNA旋转酶B。水平实线表示分布的中位数。请点击这里查看此图的较大版本.

表1：本研究中设计的引物。 提供了本研究中使用的标记基因和内部对照的特异性引物序列，以及它们相应的 NCBI 登录 ID。 请按此下载此表格。

表2：使用qPCR标准曲线计算的本研究中使用的引物效率。请按此下载此表格。

Discussion

此处描述了铜绿假单胞菌噬菌体 LESΦ2 的可选择指示剂宿主的创建，该宿主以前用于斑块测定，以更准确地量化来自大肠杆菌 MC1061 37,38,39 的 Stx 噬菌体的自发诱导。这种干预的额外好处是减少了样品处理步骤和时间，从而能够同时评估多种培养条件下的自发诱导率。在利福平耐药变体的产生过程中存在产生其他突变的风险40;然而，在这项工作中，进化的菌株仅用作从感兴趣的培养物中计数斑块的指示宿主，不包括在转录组学分析中。只要可选择的指示菌株仍然同样容易受到目标噬菌体的感染，就不必担心其他获得性突变。然而，通过PAO1WT和PAO1RIF的脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析，未检测到限制性片段长度多态性谱的差异（数据未显示）。

在选择宿主细胞时，很少能找到尚未含有噬菌体的指示菌株。例如，PAO1 含有丝状原噬菌体 Pf4。本研究的实验对照旨在能够直接检查特定噬菌体（在本例中为 LES 噬菌体 2）的基因表达以及该噬菌体对细菌基因表达的影响。在比较携带 LES 噬菌体 2 和缺乏 LES 噬菌体 2（溶菌原和非溶菌原都携带内源性 Pf4）的 PAO1 转录本时，它们作为内部对照以排除 Pf4 对宿主的影响。此外，已经证明 Pf4 通常不会引起其宿主细胞41 的裂解，因此不能混淆这些实验的结果。

众所周知，仔细的质量控制在样品制备中至关重要，以产生有意义的组学数据42。然而，如前所述11，在为此类研究制备溶菌原培养物时，很少对噬菌体活性进行仔细表征。在这里，我们详细介绍了我们的系统方案，用于制备一组控制良好且优化的用于转录组学研究的培养物，以更好地探索细菌和温带噬菌体之间的相互作用。在用诱导抗生素诺氟沙星处理之前，通过使培养物至少加倍四次来控制群体的同步性。通过确定研究中菌株的诺氟沙星的MIC，我们可以确保诱导剂的浓度刚好高于“诱导”治疗的MIC。然后将处理过的细胞按1：10稀释，以在处理1小时后将诺氟沙星浓度降低到MIC以下，以使细胞恢复并完成噬菌体复制过程，最终裂解细胞并释放感染性噬菌体后代。只有在恢复期间诺氟沙星的浓度低于 MIC 时，细胞才会在诱导刺激后进入裂解复制周期。在这种情况下，诺氟沙星高于1 μg·mL-1意味着药物不能有效地稀释到MIC以下，因为诺氟沙星对PAO1的MIC为0.19 μg·mL-1。诱导剂稀释水平必须与溶原回收的需要和收获RNA的培养密度的保留相平衡。这里讨论的数据表明，可以同步培养物以创建溶原性占主导地位的样品，从而减少自发诱导的噪音，并能够检测真正的溶原性驱动的基因表达变化。由于溶原状态在细菌细胞密度低的生长早期指数阶段占主导地位，我们建议扩大培养规模以收获足够的RNA用于后续的基因表达研究，如RNA-Seq。

使用诺氟沙星作为诱导剂迫使培养物进入裂解循环已有充分报道43,44;然而，这也会影响其他细菌基因的表达45,46。为了缓解这种情况，在RNA-Seq实验中应包括在相同诱导和非诱导条件下生长的对照野生型培养物的RNA文库。使用内部对照和关键标记基因通过qRT-PCR验证噬菌体复制阶段对于准确比较也至关重要。定量RT-PCR谱分析不能通过比较每个基因在不同时间点的转录本的绝对数量来解释;重要的是轮廓的形状。首先，对任何基因的转录本中只有一个小区域进行了采样，因此它是短寿命还是长寿命的元素是未知的27。当然，转录本的RNA-Seq定位表明，定位数据的密度在基因长度上显着变化。其次，基因表达谱的形状应该被解释为与裂解周期或溶原生活方式相关的标记基因，甚至与噬菌体调节回路脱钩11。自发诱导是溶菌原培养中的一个真正问题，并且总是会导致裂解周期相关基因的表达。然而，分析确实表明，与裂解复制周期相关的基因在诱导前（至少两个对数折叠）的表达中受到抑制，并在诱导后上调。

先前对 Stx 噬菌体与大肠杆菌相互作用进行的转录组学分析支持对参与维持溶原和触发裂解循环的噬菌体基因的透彻理解11,17。目前，铜绿假单胞菌的LES噬菌体已被注释，但其关键基因功能尚不清楚。转录组学研究将能够重新注释LES噬菌体，并提高我们对溶原和裂解周期中涉及的基因的理解。将基因序列与功能联系起来是新型噬菌体研究中的一个主要挑战，这进一步凸显了需要更多的研究来确认噬菌体基因功能，以产生更好的注释工具47。本视频文章中详述的方案和额外质量控制措施的更广泛应用和调整可能有助于揭示各种噬菌体功能，从而改进注释流程并改变我们对噬菌体和细菌生物学的理解。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAO1 6
LESB58 6
LES phages Induced and purified from LESB58 using Norfloxacin. This study
Lysogeny Broth (LB) Merck 1.10285.500
LB Agar Merck 1.10283.500
Agar Agar Fisher A/1080/53
Top Agar 0.4 g Agar Agar+2.5 g LB Broth in 100 mL water; autoclave and use. -
Rifampicin Sigma (Stock: 50 mg/mL in Methanol- Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use) R3501
Glacial Acetic Acid Fisher 1% (v/v) in water 10060000
Norfloxacin Sigma (Stock: 25 mg/mL of 1% Glacial Acetic Acid-Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use;To avoid freeze thaw cycles, store as small aliquotes) N9890
Phenol saturated with citrate buffer pH 4.3 Sigma P-4682
Molecular Biology grade Ethanol Fisher 16695992
TRIzol Invitrogen 12044977
Chloroform Fisher 11398187
Isopropanol Fisher 17150576
Nuclease-free H2O Invitrogen 10526945
10X TURBO DNase Ambion AM1907
Qubit RNA HS, BR Kit Invitrogen Q10210
Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent 5067-1511
SuperScriptIII first strand synthesis kit Invitrogen 18080051
PCR Reagents Bioline Mytaq Red 2X BIO-25043
qPCR Reagents Sensifast SYBR Hi Rox BIO-92020
PCR purification kit Isolate II PCR and Gel Kit BIO-52060
TA cloning kit TA Cloning Kit, with pCR 2.1 Vector, without competent cells K202040
StepOne Real Time PCR system Thermo Fisher Scientific 4376600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lin, D. M., Koskella, B., Lin, H. C. Phage therapy: An alternative to antibiotics in the age of multi-drug resistance. World Journal of Gastrointestinal Pharmacology and Therapeutics. 8 (3), 162-173 (2017).
  2. Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New tools for genetic manipulations from bacterial immunity systems. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 209-228 (2015).
  3. Santos, S. B., Azeredo, J. Bacteriophage-based biotechnological applications. Viruses. 11 (8), 737 (2019).
  4. Rodríguez-Rubio, L., Jofre, J., Muniesa, M. Is genetic mobilization considered when using bacteriophages in antimicrobial therapy. Antibiotics. 6 (4), 32 (2017).
  5. Hatfull, G. F. Dark Matter of the biosphere: The amazing world of bacteriophage diversity. Journal of Virology. 89 (16), 8107-8110 (2015).
  6. Yukgehnaish, K., et al. PhageLeads: Rapid assessment of phage therapeutic suitability using an ensemble Machine Learning approach. Viruses. 14 (2), 342 (2022).
  7. Seemann, T. Prokka: Rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics. 30 (14), 2068-2069 (2014).
  8. Arndt, D., et al. PHASTER: A better, faster version of the PHAST phage search tool. Nucleic Acids Research. 44, W16-W21 (2016).
  9. Banerjee, S., et al. FINDER: An automated software package to annotate eukaryotic genes from RNA-Seq data and associated protein sequences. BMC Bioinformatics. 22 (1), 205 (2021).
  10. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  11. Veses-Garcia, M., et al. Transcriptomic analysis of Shiga-toxigenic bacteriophage carriage reveals a profound regulatory effect on acid resistance in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8118-8125 (2015).
  12. Owen, S. V., et al. A window into lysogeny: revealing temperate phage biology with transcriptomics. Microbial Genomics. 6 (2), e000330 (2020).
  13. Davies, E. V., Winstanley, C., Fothergill, J. L., James, C. E. The role of temperate bacteriophages in bacterial infection. FEMS Microbiology Letters. 363 (5), 015 (2016).
  14. Livny, J., Friedman, D. I. Characterizing spontaneous induction of Stx encoding phages using a selectable reporter system. Molecular Microbiology. 51 (6), 1691-1704 (2004).
  15. Fogg, P. C. M., et al. Identification of multiple integration sites for Stx-phage Φ24B in the Escherichia coli genome, description of a novel integrase and evidence for a functional anti-repressor. Microbiology. 153 (12), 4098-4110 (2007).
  16. James, C. E., et al. Differential infection properties of three inducible prophages from an epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa. BMC Microbiology. 12, 216 (2012).
  17. Riley, L. M., et al. Identification of genes expressed in cultures of E. coli lysogens carrying the Shiga toxin-encoding prophage Φ24B. BMC Microbiology. 12 (1), 42 (2012).
  18. Stover, C. K., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).
  19. Winstanley, C., et al. Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa. Genome Research. 19 (1), 12-23 (2009).
  20. Davies, E. V., et al. Temperate phages enhance pathogen fitness in chronic lung infection. The ISME Journal. 10 (10), 2553-2555 (2016).
  21. Allison, H. E. Stx-phages: drivers and mediators of the evolution of STEC and STEC-like pathogens. Future Microbiology. 2 (2), 165-174 (2007).
  22. Allison, H. E., et al. Immunity profiles of wild-type and recombinant Shiga-like toxin-encoding bacteriophages and characterization of novel double lysogens. Infection and Immunity. 71 (6), 3409-3418 (2003).
  23. Mori, N., et al. A peptide based on homologous sequences of the β-barrel assembly machinery component BamD potentiates antibiotic susceptibility of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (9), 2173-2181 (2012).
  24. Chojnacki, M., et al. A novel, broad-spectrum antimicrobial combination for the treatment of Pseudomonas aeruginosa corneal infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (10), e00777 (2019).
  25. Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. The estimation of the bactericidal power of the blood. Epidemiology & Infection. 38 (6), 732-749 (1938).
  26. Srikumar, S., et al. RNA-seq brings new insights to the intra-macrophage transcriptome of Salmonella Typhimurium. PLoS Pathogens. 11 (11), e1005262 (2015).
  27. Kröger, C., et al. The transcriptional landscape and small RNAs of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), E1277-E1286 (2012).
  28. Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2019).
  29. Koetsier, G. A practical guide to analyzing nucleic acid concentration and purity with microvolume spectrophotometers. New England BioLabs Inc. , Available from: https://www.neb.com/-/media/nebus/files/application-notes/technote_mvs_analysis_of_nucleic_acid_concentration_and_purity.pdf?rev=c24cea043416420d84fb6bf7b554dbbb (2019).
  30. Saunders, N. A., Lee, M. A. Real-Time PCR: Advanced Technologies and Applications. , Caister Academic Press. Norfolk, UK. (2013).
  31. Bustin, S. A. A-Z of Quantitative PCR. , International University Line. La Jolla, CA. (2004).
  32. Ruijter, J. M., et al. Efficiency correction is required for accurate quantitative PCR analysis and reporting. Clinical Chemistry. 67 (6), 829-842 (2021).
  33. Fothergill, J. L., Neill, D. R., Loman, N., Winstanley, C., Kadioglu, A. Pseudomonas aeruginosa adaptation in the nasopharyngeal reservoir leads to migration and persistence in the lungs. Nature Communications. 5 (1), 4780 (2014).
  34. Huang, J., et al. Temperature-dependent expression of phzM and its regulatory genes lasI and ptsP in rhizosphere isolate Pseudomonas sp. strain M18. Applied and Environmental Microbiology. 75 (20), 6568-6580 (2009).
  35. Savli, H., et al. Expression stability of six housekeeping genes: a proposal for resistance gene quantification studies of Pseudomonas aeruginosa by real-time quantitative RT-PCR. Journal of Medical Microbiology. 52 (5), 403-408 (2003).
  36. Kassambara, A. rstatix: Pipe-Friendly Framework for Basic Statistical Tests. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=rstatix (2022).
  37. McDonald, J. E., et al. High-throughput method for rapid induction of prophages from lysogens and its application in the study of Shiga toxin-encoding Escherichia coli strains. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2360-2365 (2010).
  38. Smith, D. L., et al. Short-tailed Stx phages exploit the conserved YaeT protein to disseminate Shiga toxin genes among Enterobacteria. Journal of Bacteriology. 189 (20), 7223-7233 (2007).
  39. James, C. E., et al. Lytic and lysogenic infection of diverse Escherichia coli and Shigella strains with a verocytotoxigenic bacteriophage. Applied and Environmental Microbiology. 67 (9), 4335-4337 (2001).
  40. Rees, V. E., et al. Characterization of hypermutator Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis in Australia. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (4), e02538 (2019).
  41. Li, Y., et al. Excisionase in Pf filamentous prophage controls lysis-lysogeny decision-making in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 111 (2), 495-513 (2019).
  42. Van Kampen, A. H. C., Moerland, P. D. Taking bioinformatics to systems medicine. Systems Medicine. 1386, 17-41 (2016).
  43. Matsushiro, A., Sato, K., Miyamoto, H., Yamamura, T., Honda, T. Induction of prophages of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 with norfloxacin. Journal of Bacteriology. 181 (7), 2257-2260 (1999).
  44. James, C. E., et al. Lytic activity by temperate phages of Pseudomonas aeruginosa in long-term cystic fibrosis chronic lung infections. The ISME Journal. 9 (6), 1391-1398 (2015).
  45. Shaw, K. J., et al. Comparison of the changes in global gene expression of Escherichia coli induced by four bactericidal agents. Microbial Physiology. 5 (2), 105-122 (2003).
  46. Long, H., et al. Antibiotic treatment enhances the genome-wide mutation rate of target cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), E2498-E2505 (2016).
  47. González-Tortuero, E., et al. VIGA: A sensitive, precise and automatic de novo VIral Genome Annotator. bioRxiv. , (2018).

Tags

本月《JoVE》第203期
通过转录组学了解温带噬菌体对其溶原的影响
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Krishnamurthi, R.,… More

Krishnamurthi, R., González-Tortuero, E., Plahe, G., Goodhead, I. B., Fothergill, J. L., James, C. E., Allison, H. E. Understanding the Impact of Temperate Bacteriophages on Their Lysogens Through Transcriptomics. J. Vis. Exp. (203), e64945, doi:10.3791/64945 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter