Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Forståelse af virkningen af tempererede bakteriofager på deres lysogener gennem transkriptomik

Published: January 5, 2024 doi: 10.3791/64945
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1, 2, 1
1Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, Institute of Infection, Veterinary and Ecological Sciences (IVES), University of Liverpool, 2School of Science, Engineering, and Environment, University of Salford

Summary

Denne protokol gør det muligt at afsløre virkningen af profager på deres værter. Bakteriekulturer synkroniseres ved hjælp af betingelser, der bedst understøtter den lysogene tilstand, hvilket begrænser spontan induktion. RT-qPCR skelner entydigt mellem prophagebegrænsede gener og dem, der er afkoblet fra fagkontrol, fra dem, der udtrykkes under den lytiske replikationscyklus.

Abstract

Tempererede fager findes integreret som fager i de fleste bakterielle genomer. Nogle profager er kryptiske og fikserede i bakteriekromosomet, men andre er aktive og kan udløses i en replikativ form enten spontant eller ved eksponering for inducerende faktorer. Fager er almindeligvis forbundet med evnen til at give toksinproduktion eller andre virulensassocierede træk på deres værtscelle. Nyere undersøgelser har vist, at de kan spille en meget større rolle i at ændre deres værters fysiologi. Den her beskrevne teknik har gjort os i stand til at undersøge, hvordan fager påvirker genekspression i den opportunistiske bakterie Pseudomonas aeruginosa.

I dette arbejde blev væksten af vildtypen P. aeruginosa-stammen PAO1 sammenlignet med væksten af isogene lysogener, der bærer forskellige kombinationer af profager fra Liverpool Epidemic Strain (LES) LESB58. I en lysogenkultur vil en andel af bakterieceller understøtte lytisk bakteriofagreplikation (spontan induktion) med et højt ekspressionsniveau pr. celle af sene faggener, såsom dem, der er forbundet med samling af fagpartikler, hvilket maskerer genekspressionen på lavt niveau forbundet med lysogenbegrænset genekspression. Virkningen af spontan induktion kan således skjule profaggenekspression på tværs af en lysogenpopulation.

Vækstprofileringseksperimenter blev brugt til at identificere spontan induktion, som var minimal i den tidlige eksponentielle vækstfase. Denne undersøgelse rapporterer, hvordan man forbereder prøvekulturer i den tidlige eksponentielle vækstfase, og hvordan man opretter passende kontroller på trods af lave celletal. Disse protokoller sikrer pålidelig og reproducerbar sammenligning af vildtype- og lysogene bakterier under forskellige forhold, hvilket forbedrer den transkriptomiske profilering af profaggenomer og hjælper med at identificere tidligere ukendte profagfunktioner.

Introduction

For nylig har fagterapi til bekæmpelse af antimikrobiel resistens1 og CRISPR-Cas-baseret genredigering2 skabt fornyet interesse for bakteriofagforskning. Igen har fremskridt inden for bioteknologi muliggjort en dybere undersøgelse af interaktionerne mellem bakterier og fager3. Den terapeutiske anvendelse af ("fagterapi") hæmmes imidlertid af bekymringer om fager, der fungerer som mobile genetiske elementer med evnen til at overføre virulens og resistensgener vandret4. Udvidelsen af "mørkt stof"5 (gener med ukendte funktioner) er både foruroligende og lokkende. Mørkt stof betragtes som et hul i vores forståelse af fagbiologi og en stort set uudnyttet ressource til molekylære værktøjer og potentielle nye behandlinger6. Udviklingen af high-throughput sekventeringsteknikker sammen med forbedret genannotation 7,8,9 og nye peptidfoldningsalgoritmer10 forbedrer detektion, beskrivelse og funktionel forudsigelse af faggener. Videnskaben er dog stadig langt fra at validere de fleste fagers genfunktioner i kultur eller i den virkelige verden.

RNA-sekventering (RNA-Seq) kan globalt kortlægge genekspression under faginfektion og har signifikant forbedret forståelsen af både- og bakterieelementer, der er involveret i lytiske og lysogene cyklusser11,12. Under lysogene processer integreres tempererede faggenomer i bakterielt DNA for at blive profager13. Globale genekspressionsprofileringseksperimenter kan bruges til at identificere prophagebegrænsede gener, der er kodet på tempererede faggenomer, men kun udtrykt under den lysogene tilstand11. Sådanne gener koder ikke for fagstrukturelle proteiner og er ikke involveret i nogen faginfektionsprocesser. RNA-Seq kan bruges til at identificere de gener, der er mere tilbøjelige til at påvirke bakterieværtens biologi, enten ved at inducere en gevinst af funktion eller regulere de eksisterende bakteriegener, hvilket ofte gør det muligt for bakterierne at tilpasse sig skiftende miljøer. Derfor kunne profagernes evne til at fungere som mikrobielle marionetmestre, der styrer en række bakteriefunktioner, undersøges.

Der er to store barrierer for effektiv analyse af prophage-begrænset genekspression. For det første er tilgængeligheden af modtagelige værter et centralt spørgsmål. Per definition er profager allerede inkorporeret i deres specifikke værtsgenom, så det er udfordrende at finde en modtagelig vildtypevært til at sammenligne den globale genekspression i tilstedeværelsen og fraværet af prophagen. Dette kan opnås enten gennem de novo-infektion af en anden modtagelig vært eller sletning af profagen fra det oprindelige vildtypeisolat uden at forstyrre resten af værtsgenomet. Den anden barriere ligger i den heterogene karakter af lysogene populationer. Nogle profager nedbrydes gennem mutation eller rekombination for at blive "kryptiske", hvilket betyder, at de er fastgjort på et bestemt sted i bakteriegenomet. Imidlertid er andre profager "aktive" og kan induceres i en replikativ, lytisk cyklus spontant eller efter eksponering for inducerende faktorer. I mange lysogene kulturer betyder hastigheden af spontan induktion, at en del af bakteriecellerne altid gennemgår lytisk fagreplikation14,15,16. Et højt ekspressionsniveau af sene faggener i disse populationer maskerer genekspressionen på lavt niveau forbundet med lysogenbegrænset genekspression11,17. Andelen af lysogener, der gennemgår spontan profaginduktion, kan variere med væksttilstanden, vækstbetingelserne eller andre udløsere. For at studere virkningerne af profager på lysogenet skal spontane profaginduktionshændelser minimeres så meget som muligt ved at optimere vækstbetingelserne for at favorisere den lysogene tilstand.

Denne undersøgelse rapporterer det forberedende arbejde, der er udført for at undersøge indflydelsen fra et sæt samlevende profager fra Liverpool Epidemic Strain (LES) af Pseudomonas aeruginosa. Aktive profager blev induceret og isoleret fra LES og anvendt til at inficere modellen P. aeruginosa-værtsstammen, PAO116,18,19. Hele genomerne af vildtypen P. aeruginosa-stammen, PAO1, og dens lysogen, PAO1Φ2, blev sekventeret (i en dybde på 30x dækning) for at sikre identiteten af vildtypestammen og for at bekræfte, at lysogen var isogen. LES har været forbundet med øget sygelighed og dødelighed hos patienter med cystisk fibrose, og LES-fager 19 er blevet foreslået at hjælpe tilpasning til lungemiljøet for cystisk fibrose16,19,20. På trods af stærke beviser for, at disse fager påvirker biologien hos deres vært20,21, er størstedelen af deres genfunktioner endnu ikke karakteriseret, og de specifikke interaktionsmekanismer er dårligt forstået. En transkriptomisk tilgang kan empirisk afdække profaggenets funktioner i en kontrolleret værtsbaggrund. Da spontan induktion kan påvirke ekspressionsprofiler, beskriver denne artikel, hvordan man optimerer vækstbetingelserne for at favorisere den lysogene tilstand. En sådan synkronisering af kulturer kan valideres ved PCR i realtid for at kvantificere ekspressionsniveauerne for vigtige genetiske markører, der er forbundet med afgørende stadier af LES-fagreplikation i PAO1. Den samme tilgang er tidligere blevet brugt til at identificere de prophagebegrænsede funktioner af shiga-toksigeniske fager, der påvirker motilitet, syreresistens og antimikrobiel resistens i Escherichia coli11,17,21,22.

Protocol

1. Opret en valgbar indikatorvært (figur 1)

BEMÆRK: Fagkulturlysater kan indeholde forurenende celler fra den oprindelige bakterievært. At have en antibiotikaresistent indikatorstamme muliggør diskrimination mellem indikatorstammen og den oprindelige bakterievært for prophagen. Brug af en valgbar indikatorstamme muliggør nøjagtig optælling af de infektiøse fagpartikler uden at kræve centrifugerings- eller filtreringstrin for at fjerne fagen fra lysogencellerne efter fagamplifikationstrinnene. Den valgbare indikatorværtsstamme reducerer også tiden og antallet af trin til fagtælling, så flere betingelser kan afprøves samtidigt.

  1. Identificer en passende indikatorværtsstamme, der er modtagelig for lytisk og lysogen infektion af den tempererede af interesse. P. aeruginosa-laboratoriestammen PAO118,20 blev anvendt og er modtagelig for de tre LES-fager (LESΦ2, LESΦ3 og LESΦ4).
  2. Vælg et passende selektivt middel (rifampicin blev brugt her), og udfør et bouillonfortyndingsassay for at bestemme den mindste hæmmende koncentration (MIC) for indikatorværten (16 μg·ml−1 er MIC for PAO1)23,24.
  3. Indikatorværtskulturerne udsættes sekventielt for stigende koncentrationer af det selektive middel i lysogenbouillon (LB), startende under MIC (i dette tilfælde 5 μg·ml−1), i 18–24 timer, under omrystning og ved 37 °C.
  4. Den kultur, der vokser i den højeste koncentration i forholdet 1:100 (podning til medium), overføres til to gange øgede koncentrationer af det selektive agens (18-24 timer hver gang), indtil den multilaterale investeringsdomstol er blevet øget tilstrækkeligt. PAO1 blev en rifampicinresistent stamme (PAO1-RifR) ved 300 μg·ml-1 rifampicin.

2. Tidsmæssig direkte opregning af spontan induktion (figur 2)

  1. Opsæt natstarterkulturer af både lysogen (f.eks. P. aeruginosa PAO1 lysogen med LES-fager) og indikatorvært (PAO1-RifR) ved at inokulere en enkelt koloni i 5 ml LB og inkubere ved 37 °C med omrystning ved 180 omdr./min. (18-24 timer).
  2. Friske lysogen- og indikatorværtskulturer opsættes ved at pode natkulturerne i 100 ml LB i forholdet 1:100 og inkuberes ved 37 °C under omrystning (180 omdr./min.).
    1. Overvåg lysogenvæksten ved at måle OD600 og levedygtig tælling ved hjælp af Miles Misra teknik25. For at gøre dette skal du indsamle en 1 ml prøve fra hver lysogenkultur hver time fra podningsstedet i 8 timer.
    2. Prøven fortyndes serielt umiddelbart efter opsamlingen ved at tilsætte 100 μL af prøven til 900 μL af det pågældende substrat. Vortex godt ved den maksimale hastighed, kassér spidsen ved hver fortynding, og fortsæt fortyndingsserien fra 10-1 til 10-9.
    3. 10 μL af de krævede fortyndinger anbringes i tre eksemplarer på en LB-agarplade, tørres og inkuberes ved 37 °C i 18-24 timer.
    4. For at beregne antallet af levedygtige bakterieceller skal du finde en fortynding med let tællelige kolonier. Tæl antallet af kolonier på hvert sted, og brug derefter følgende formel:
      Equation 1
      BEMÆRK: Efterhånden som lysogenkulturen vokser, produceres aktive fagpartikler ved spontan induktion. Produktionen af infektiøse fager betyder, at transkriptomet af lysogenpopulationen nu er forurenet med lytisk replikationscyklusassocieret genekspression fra det lytiske fagreplikationssignal og det tilsvarende værtscellerespons. Det er derfor vigtigt at identificere det vækststadium, hvor andelen af lysogene celler til frie infektiøse fagpartikler er højest for at begrænse så meget baggrundstranskriptionsstøj (genereret af det lytiske fagtranskriptom) som muligt i datasættet.
  3. For at opregne de infektiøse fagpartikler i hver tidsprøve podes 5 ml steril 0,4% bakteriologisk agar i LB (top agar) med 100 μL midteksponentiel faseindikatorvært (OD600: 0,4-0,5; i dette tilfælde PAO1-RifR) i nærværelse af et passende selektivt middel (50 μg·ml-1 rifampicin i dette tilfælde, da MIC for PAO1-værten kun er 16 μg·ml−1; se materialetabel, række 8 og række 9)
    1. Der anbringes 10 μL af samme seriefortynding (se trin 2.2.2) på det podede øverste agarlag, og det tørrer, inden det inkuberes ved 37 °C i 18-24 timer.
    2. For at beregne de infektiøse fagpartikler skal du finde en fortynding med let tællelige plaques. Tæl antallet af plaketter på hvert sted.
      Equation 2
    3. Find den tid/tilstand, hvor den spontane induktion pr. CFU (kolonidannende enhed) er minimal for de videre eksperimentelle trin.

3. Fremstilling af ikke-inducerede og inducerede lysogenkulturer til RNA-ekstraktion (figur 3)

  1. Opsæt en frisk natkultur ved at inokulere en enkelt koloni af lysogen i 5 ml LB og inkubere ved 37 °C med omrystning (180 omdr./min.) i 18-24 timer.
  2. Subkultur natten over kultur i 80 ml LB i et forhold på 1:100 i otte 250 ml kolber.
  3. Den første kolbe mærkes som "ikke-induceret" og de andre som "induceret" sammen med tidspunkterne for, hvornår hver prøve skal høstes (dvs. "induceret t = 0", "induceret t = 10 min", "induceret t = 20 min" osv. Figur 3).
  4. Efter 90 minutters inkubation, når OD600 er mellem 0,1-0,2, eller på tidspunktet for minimal spontan induktion (se diskussionen), tilsættes 4 μL 1% iseddike (v/v) til den ikke-inducerede kolbe (figur 3).
    BEMÆRK: Da det inducerende middel i dette arbejde blev fremstillet ved anvendelse af 1% iseddike som opløsningsmiddel, blev den samme mængde opløsningsmiddel tilsat alene som et kontroltrin. Alternative kontroller kan overvejes afhængigt af fremstillingen af forskellige induktorer.
  5. Der tilsættes 80 ml kulturen fra den ikke-inducerede kolbe til 720 ml steril LB, og straks tilsættes stopopløsningen (iskold 5% [v/v] phenol, pH 4,3, 95% [v/v] ethanol) med et volumen, der er 20% af dyrkningsvolumenet (160 ml), og inkuberes på is i mindst 30 minutter og ikke længere end 2 timer for at stabilisere RNA-transkripterne12. 26,27. Dette er den ikke-inducerede prøve.
  6. De resterende kulturer hældes i syv 250 ml kolber (figur 3) med MIC af et passende inducerende middel (i dette tilfælde 25 mg·ml-1 norfloxacin, fremstillet i 1% iseddike [w/v], anvendt i en slutkoncentration på 1 μg·ml−1), blandes godt og inkuberes ved 37 °C og omrystes ved 180 rpm i 1 time.
    BEMÆRK: Dette trin vil tvinge lysogenkulturen til en mere koordineret tilstand af lytisk replikation. De fleste celler i kulturen vil begynde at gennemgå lytisk produktion af infektiøse fagpartikler.
  7. Cellerne får mulighed for at komme sig ved at tilsætte 80 ml kultur fra den inducerede kolbe til 720 ml steril LB, som effektivt fortynder det inducerende middel. Bakteriecellerne høstes fra hver kolbe hvert 10. minut fra tid 0 til 1 time ved tilsætning af en stopopløsning som nævnt i trin 3.5.
    BEMÆRK: Stopopløsningen stabiliserer RNA'et i op til 2 timer. For at øge prøvestabiliteten skal du dog udføre alle yderligere trin ved 4 °C.
  8. Der høstes hurtigst muligt ved centrifugering ved 10.000 x g i 15 minutter ved 4 °C, dog højst 2 timer efter behandling for at undgå RNA-nedbrydning.
  9. Supernatanten kasseres, og bakteriepillerne i den resterende væske resuspenderes forsigtigt igen ved hjælp af en justerbar automatisk pipette, inden hver prøve overføres til et 1,5 ml mikrofugerør.
  10. Mikrofugensorreglassene centrifugeres ved høj hastighed (13.000 x g) i en mikrofuge ved 4 °C i 1 min., og restsupernatanten kasseres.
  11. Lynfrys pillerne ved at kaste hvert forseglet mikrofugerør i flydende nitrogen. Dette vil hjælpe den effektive lysering af cellerne til RNA-ekstraktion.
  12. Tilsæt TRIzol (1 ml) til hver frossen pellet, og homogeniser suspensionen ved pipettering (ikke hvirvel). Opbevares ved -80 °C, indtil den er klar til at udføre RNA-ekstraktion for alle prøverne.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause på dette tidspunkt.
  13. Gentag trin 3.1-3.13 med tre biologiske replikater.

4. Isolering af RNA fra ikke-inducerede og inducerede lysogenkulturer

KRITISK: Alle disse trin skal udføres i et RNase-frit miljø28. Arbejdsbordene skal tørres af med 10% NaClO eller proprietære RNase-inaktiveringsapparater. Labware skal behandles med RNase-hæmmere såsom DEPC-behandling, og nukleasefrit vand skal anvendes i alle reaktioner.

  1. De frosne TRIzol-behandlede pellets fra trin 3.12 optøs på is, og der tilsættes 400 μL chloroform af molekylærbiologikvalitet.
  2. Omryst hætteglassene godt ved invertering i 10 sekunder for at fuldføre lysen af alle celler ( hvirvelstrøm ). Derefter inkuberes ved stuetemperatur (21 °C) i 2-5 min.
  3. Det vandige lag adskilles fra TRIzol/chloroform-blandingen ved centrifugering ved hjælp af en nedkølet mikrofuge på bordet ved 4 °C og 13 000 x g i 15 minutter.
  4. Opsaml den vandige fase (~ 500 μL, øverste lag) ved hjælp af en 1.000 μL pipette, og pas på ikke at forstyrre interfasen eller den organiske fase (bundlag). Overfør til et nyt 1,5 ml mikrofugerør.
  5. Der tilsættes 450 μL molekylærbiologisk isopropanol til den separerede vandige fase, blandes godt ved invertering (hvirvelstrømmen må ikke anvendes) og inkuberes ved stuetemperatur (21 °C) i 30 minutter.
  6. RNA'et genvindes ved centrifugering ved hjælp af en nedkølet centrifuge ved 4 °C og 13.000 x g i 30 minutter.
  7. Supernatanten kasseres uden at forstyrre RNA-pelleten, og pelletpen vaskes to gange med 800 μL 70 % ethanol fremstillet med nukleasefrit vand (pipette ikke op og ned). Sørg for stabiliteten af RNA-pelleten ved at gentage centrifugeringstrinnet i 5 minutter efter hver vask.
  8. Kassér ethanolen, og lufttør pelleten.
    BEMÆRK: Opsug ethanolen omkring pelleten forsigtigt ved hjælp af en 10 μL mikrotip, og tør pelleten ved at vende røret på rent blottingpapir. RNA-pelleten skal blive farveløs, og kanterne skal fremstå ruffled og synlige. Tørring for lidt kan efterlade resterende ethanol, der kan påvirke nedstrøms processer, og tørring af pellet for meget kan gøre resuspensionen vanskelig.
  9. RNA'et resuspenderes i nukleasefrit vand (50 μL) ved at inkubere ved 65 °C på en termoryster med intermitterende blanding (hver 30. s) i alt 3-5 minutter.
    KRITISK: 2'- OH-gruppen af RNA er i stand til at katalysere autokallingen af RNA-strenge ved en høj temperatur over 65 ° C og en høj pH. Temperaturer under 65 °C vil forsinke resuspensionen af det resterende DNA og dermed begrænse mængden af DNA, der skal fordøjes på et senere tidspunkt med DNase I-fordøjelsen. Derfor er det afgørende at holde temperaturen på 65 °C for at opnå de bedste prøver.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause på dette tidspunkt, og prøverne kan opbevares ved -80 °C.

5. Fjernelse af kontaminerende DNA fra RNA ved DNase-behandling

  1. For at fjerne kontaminerende DNA fra det totale RNA før den første strengede cDNA-syntese tilsættes et 0,1 volumen 10x DNase-buffer og 1 μL DNase-enzym til 10 μg total RNA. Bland glasset forsigtigt, og inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
  2. DNase-inaktiveringsreagenset resuspenderes, og der tilsættes mindst 2 μL eller et volumen på 10 % af det totale reaktionsvolumen. Bland godt, og inkuber prøverne i 5 minutter ved stuetemperatur (21 °C) under redispersionen af DNase-inaktiveringsreagenset.
  3. DNase-reagenserne pelleteres ved centrifugering ved hjælp af en bordmikrocentrifuge ved 10.000 × g i 1,5 min.
  4. Supernatanten indeholdende RNA'et overføres til et frisk rør uden at forstyrre pellet.
    BEMÆRK: Kontroller kvaliteten af RNA ved hjælp af et 1 μL skala UV-spektrofotometer og mikrofluidisk baseret nukleinsyrecomputeranalysator i henhold til producentens anvisninger; oprenset totalt RNA kan opbevares ved -80 °C. For qRT-PCR kan RNA bruges direkte på dette tidspunkt. For mere følsomme downstream-processer, såsom RNA-sekventering, der kræver streng prøvekvalitet, skal der nås et A260/230-forhold på ε 2,0 for at gå videre.
  5. Der fyldes op til volumenet af den DNA-frie RNA-opløsning til 500 μL ved hjælp af nukleasefrit vand.
  6. Der tilsættes 50 μL nukleasefrit 3 M natriumacetat (pH 5,3) og 495 μL isopropanol. Bland godt og inkuber ved stuetemperatur i 30 min.
    BEMÆRK: Dette trin vil udfælde RNA'et.
  7. RNA'et genvindes ved centrifugering ved 13.000 x g og 4 °C i 30 minutter.
  8. RNA-pelleten vaskes tre gange med iskold 70% ethanol ved at centrifugere prøverne ved 13.000 x g og 4 °C i 5 minutter efter hver vask for at fjerne saltene helt.
  9. Kontroller kvaliteten af RNA'et ved hjælp af et 1 μL skala UV-spektrofotometer og mikrofluidisk baseret nukleinsyrecomputeranalysator i henhold til producentens anvisninger; oprenset totalt RNA kan opbevares ved -80 °C.
    BEMÆRK: Guide29 blev brugt til at opnå RNA-kvalitetsstandarderne. Hvis forholdet A260/230 er <2,0, skal du gentage trin 5,5-5,9.

6. Kvalitativ og kvantitativ analyse af DNase-fri RNA

  1. Valider effektiviteten af DNase-behandlingen for hver prøve ved at udføre en kvantitativ PCR ved hjælp af 16S rRNA-primere (tabel 2) med 1 μg total RNA, og bekræft, at der ikke produceres noget amplifikationsprodukt.
    BEMÆRK: De ideelle primere til vurdering af gDNA-forurening ville være primere, der er designet til at anneal ved intron-exon-kryds eller regulatoriske regioner i prokaryoter eller på transkriptionelt inaktive steder30,31.
  2. Bestem RNA-integritetsnummeret (RIN) ved hjælp af en mikrofluidisk-baseret nukleinsyrecomputeranalysator i henhold til producentens anvisninger.
    BEMÆRK: Prøver, der viser en RIN ≥ 9, skal bruges til den første strengsyntese. Prøver, der viser en RIN < 9, kasseres, og isolationstrinnene (1.1-5.4) gentages.
  3. Kvantificer den samlede RNA-koncentration ved hjælp af HS RNA-analysesættet og et fluorimeter i henhold til producentens anvisninger.

7. Første streng cDNA-syntese

  1. Der fremstilles en RNA-primerblanding for hver prøve ved at blande 1 μg total RNA med 1 μL tilfældige hexamerer (50 ng·μL-1) og 1 μL 10 mM dNTP-blanding. Derefter justeres det samlede volumen til 10 μL ved hjælp af nukleasefrit vand.
  2. Reaktionen inkuberes ved 65 °C i 5 minutter og lægges på is i 1 min.
  3. Der fremstilles en cDNA-synteseblanding for hver prøve ved tilsætning af 2 μL 10x RT-buffer; 4 μL 25 mM MgCl2; 2 μL 0,1 M DTT; 1 μL RNase-hæmmer (40 U·μL-1); og 1 μL af det omvendte transkriptionsreagens (200 U·μL−1) i den angivne rækkefølge.
  4. Tilsæt cDNA-synteseblandingen til RNA/primer-blandingen. Bland forsigtigt, og centrifuger prøverne kort for at samle komponenterne i bunden af røret.
  5. Blandingen primer blandingen ved at inkubere prøverne i 10 minutter ved 25 °C efterfulgt af 50 minutter ved 50 °C. Reaktionerne afsluttes ved inkubation ved 85 °C i 5 minutter og afkøles på is.
  6. Der tilsættes 1 μL RNase H til hvert rør, og der inkuberes ved 37 °C i 20 minutter for at fjerne RNA'et fra DNA:RNA-hybriden.
  7. Endelig fortyndes cDNA-syntesereaktionen til et samlet volumen på 80 μL, og den opbevares ved -80 °C indtil yderligere brug.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause på dette tidspunkt.

8. Standardkurve og kvantitativ (q)-PCR til bestemmelse af ekspressionsniveauerne for markørgener, der angiver forskellige stadier af fagreplikation

  1. Identificer et sæt målgener, der kan fungere som markører for hvert trin i replikation af fagen af interesse. I vores tilfælde var disse som beskrevet i tabel 2.
  2. Hvert af målgenerne fra skabelongenomisk DNA amplificeres ved hjælp af relevante primere og ved hjælp af PCR med følgende amplifikationsbetingelser: indledende denaturering ved 95 °C i 2 min; denaturering ved 95 °C i 30 s; udglødning ved den optimale udglødningstemperatur afhængigt af primerne (58 °C blev anvendt her) i 30 s; forlængelse ved 72 °C i 1 min; og endelig forlængelse ved 72 °C i 5 min.
  3. Rens hver amplicon ved hjælp af et PCR-rensningssæt, og klon dem i en TA-kloningsvektor i henhold til producentens instruktioner. Kontroller sekvensen af hvert klonet produkt ved hjælp af Sanger-sekventering.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause på dette tidspunkt.
  4. Beregn kopinummeret for individuelle plasmider ved hjælp af følgende ligning20:
    Equation 3
  5. Der udarbejdes en standardskabelon for hvert markørgen ved seriel fortynding af plasmid-DNA'et fra 109 kopier/μL til 10 2 kopier/μL i molekylær nukleasefri steril H2 O.
  6. Udfør kvantitativ PCR i henhold til producentens anvisninger for det foretrukne qPCR-system med 1 μL cDNA (fra trin 7.7) for hver prøve i tre eksemplarer sammen med de respektive plasmidstandarder i tre eksemplarer; udføre PCR i en 96-brøndplade for hvert mål.
  7. Log DNA-kopinummeret (x-aksen) plottes i forhold til cyklustærsklen (y-aksen, Ct), og brug en passende platform som Excel eller R til at udføre en lineær regressionsberegning for at vise bestemmelseskoefficienten (R2) og en lineær ligning.
    BEMÆRK: Determineringskoefficienten skal være over 0,98.
  8. Anslå kopinummeret for hvert mål ved hjælp af den lineære ligning (y = mx + b) afledt af den lineære regression (trin 8.7), hvor y er den estimerede Ct; x er log-DNA-kopinummeret; m er linjens hældning, som definerer ændringen i Ct med hensyn til DNA-kopinummeret; og b er y-akseskæringspunktet, der repræsenterer den estimerede Ct for en DNA-kopi32.
  9. For hvert markørgen beregnes effektiviteten af PCR-amplifikationen (E) ved hjælp af parametrene fra den lineære regression af standardkurven og følgende ligning, hvor m er hældningen afledt af trin 8.7 og trin 8.8:
    Equation 4
  10. Valider alle primerne med hensyn til deres procentvise effektivitet ved hjælp af følgende ligning:
    BEMÆRK: Effektiviteten skal ligge i området 90% -110%.
    Equation 5
  11. Beregn det absolutte kopinummer af DNA'et ved hjælp af følgende formel:
    Equation 6
    hvor Ct (trin 8.8) er cyklustærsklen, b er skæringspunktet (trin 8.8), m er hældningen (trin 8.8), og E er effektiviteten af PCR-forstærkning (trin 8.9).
    KRITISK: Når man sammenligner forstærkningen af to eller flere mål med q-PCR, skal PCR-effektiviteten beregnes for hvert mål for at sammenligne de absolutte DNA-kopinumre.
  12. I denne undersøgelse blev 16S rRNA-, proC- og rpoD-generne brugt som de generelle interne kontroller, og gyrB blev brugt som induktionskontrol33,34,35.
    BEMÆRK: Når du vælger interne kontroller fra RNA seq-dataene, er det bedst at vælge interne kontroller, der ikke ændrer sig i ekspressionsniveauer for de testede betingelser. Omhyggelig overvejelse af passende kontroller er altid vigtig for en meningsfuld fortolkning af resultaterne.

Representative Results

I dette arbejde blev den direkte tidsmæssige optælling af fagproduktion fra en PAO1 LESΦ2 lysogenkultur dyrket under ikke-inducerende forhold brugt til at bestemme virkningen af spontan LESΦ2-induktion. Fagtætheden var på sit laveste punkt med et gennemsnit på ~ 2,61 x 106 plakdannende enheder (PFU) · ml-1 2 timer efter subkultur i frisk medium i den tidlige eksponentielle vækstfase, hvilket tyder på, at lysogeni var den dominerende tilstand. LESΦ2-titeren steg hurtigt til et gennemsnit på ~2,4 x 108 PFU·mL−1 inden for 4 timer og nåede den højeste densitet efter 6 timer (gennemsnit på ~5,83 x 109 PFU·mL−1; Figur 4).

Minimal spontan induktion blev observeret i den tidlige logfase af lysogenvækst (efter 2 timer). Den målbare tilstedeværelse af fager i kulturmediet var imidlertid resultatet af mange tidligere begivenheder, herunder følgende: emballering af nukleinsyrer i proteinhoveder, samling af proteiner i fagpartikler og ekspression af sene faggener, faggener i mellemstadiet og tidlige regulatoriske faggener. Det var vigtigt at fange de inficerede celler før ekspressionen af de fagassocierede replikationshændelser; Derfor blev 90 min valgt til at lade kulturen vokse før induktion. For at fange genekspressionsprofilen for PAO1 blev LESΦ2 lysogenprøver fra en kultur høstet før induktion og postinduktion over en periode på 90 minutter, som nævnt i trin 3.4. Dette 90 minutters tidspunkt er længe før høje niveauer af spontan induktion af beboerprofagen detekteres af plaqueanalysen fra trin 2.3.2. Da bakteriecelletætheden var lav under tidlig eksponentiel vækst, blev dyrkningsvolumenerne skaleret op til 800 ml for at sikre rigeligt materiale til genekspressionsstudierne. Prøverne blev indsamlet fra den uinducerede kultur og inducerede kulturer hvert 10. minut, og RNA blev ekstraheret for at kortlægge ekspressionsprofilen for nøglemarkørerne for lysogeni og lytisk replikation under bakterievæksten. Total RNA blev oprenset og valideret for fravær af genomisk DNA ved hjælp af qPCR-assays rettet mod 16S rRNA-genet (trin 6.1). Prøverne, der nåede en RIN ≥ 9, bestod kvalitetskontrol og blev konverteret til cDNA.

Det kommenterede LESΦ2-genom blev undersøgt for at identificere gener, der er velkendte spillere i de lysogene og lytiske replikationscyklusser af tempererede fager. Disse identificerede gener blev derefter brugt til at validere qRT-PCR til ekspressionsprofilering af de lysogencyklusbegrænsede og lytiske cyklusassocierede gener fra inducerede og ikke-inducerede kulturer. Vi kvantificerede det absolutte DNA-kopinummer og gennemførte en Wilcoxon-signeret rangtest ved hjælp af R36 for at sammenligne ekspressionsniveauerne i ikke-inducerede og inducerede kulturer (figur 5). En markant stigning i ekspressionen af cro-genet (en tidlig markør for lytisk replikation) fra ~2,31 x 109 kopier i ikke-inducerede kulturer til ~3,02 x 1011 kopier 30 min post-induktion (Wilcoxon signeret-rang test: p < 0,01) blev observeret. På samme måde viste O-proteiner og P-proteiner, som er midttrinsmarkører for lytisk replikation (og forudsiges at være involveret i faggenomreplikation), også signifikant opregulering fra ~ 1,74 x 108 til ~ 1,25 x 10 10 kopier (Wilcoxon signeret rangtest: p < 0,01) og fra ~ 6,05 x 102 til ~ 5,68 x10 5 kopier (Wilcoxon signeret rangtest: p < 0,01). Endelig blev de haleassocierede strukturelle gener brugt som sene markører for den lytiske replikationscyklus. Igen observerede vi en signifikant stigning i ekspression fra ~ 2,31 x 106 kopier i ikke-inducerede kulturer til ~ 4,38 x 108 kopier 30 minutter efter induktion (Wilcoxon signeret rangtest: p < 0,01). De kvantitative RT-PCR-data bekræftede således, at genekspressionen af veletablerede markørgener til lytisk replikation fulgte den forventede tendens, hvor de tidlige, midterste og sene markører viste flerfold differentialekspression i den forudsagte rækkefølge (figur 5). Da ekspressionen af markørerne for lytisk replikation blev opreguleret 30 minutter efter genopretning, betragtes dette som et passende repræsentativt tidspunkt for undersøgelse af det transkriptomiske landskab af aktive tempererede fager og deres bakterielle værter under den lytiske cyklus.

Vi observerede en vis ekspression af lytiske gener under ikke-inducerede forhold, hvilket bekræfter, at der altid forekommer en spontan induktion, selv i optimerede kulturer, hvor lysogentallene er repræsenteret med det højeste forhold mellem CFU og frigivet PFU i den tidlige logfase. Dette betyder, at der altid vil være et vist niveau af "støj" i transkriptomics-dataene, hvilket forstærker vigtigheden af omhyggeligt forberedte kontroller, herunder inducerede og ikke-inducerede kulturer. Det passende valg af de interne kontrolgener til bestemmelse af foldændringer i ekspression afhænger af omhyggelig undersøgelse af transkriptomiske data for at identificere gener, der udtrykkes på samme niveau i både de ikke-inducerede og inducerede prøver. Vores foreløbige resultater tyder på, at rpoD var det mest pålidelige kontrolgen, der blev testet, og havde det mest stabile udtryk (~1,71 x 10 5 kopier før induktion og ~3,33 x 105 kopier 30 minutter efter induktion; Wilcoxon signeret rangtest: p = 0,3594) sammenlignet med 16S rRNA- eller proC-generne (figur 5). Variabiliteten af ekspressionen af de interne kontroller førte til måling af det absolutte antal transkripter. Fremtidig undersøgelse af transkriptomiske data vil understøtte valget af passende interne kontroller til yderligere validering.

CI-genet blev brugt i vores genprofileringsøvelse, da det er en velkendt markør for lysogeni. Sammenlignet med markørerne for lytisk replikation var ekspressionen af ci-genet relativt stabil (figur 5), men kopinummeret af dette gen var betryggende højt i de ikke-inducerede kulturer sammenlignet med markørerne for lytisk replikation. Disse data stemmer overens med de lave PFU-tal i de samme prøver, hvilket bekræfter, at høj repressorekspression var forbundet med lavere niveauer af fagproduktion. De data, der rapporteres her, viser, at ekspressionen af ci-transkriptet for denne særlige ikke er signifikant nedreguleret efter induktion, som det ses i Stx-fagerne11,17. Repressoraktivitet kontrolleres normalt på både transkriptionelt og posttranslationelt niveau, så repressorgenet kan transkriberes, men det resulterende protein udsættes straks for autospaltning. Yderligere eksperimenter er nødvendige for at validere transkriptionelle og posttranslationelle kontroller. Desuden ser minimumsdetektionsgrænsen for qPCR ud til at være ~ 102 kopier fra vores standardkurve.

Sammen validerer vores resultater fra plak- og qRT-PCR-assays vores strategi for dyrkning og forberedelse af RNA-prøver for at generere et velkontrolleret input til RNA-Seq-eksperimenter. De ikke-inducerede kulturer i den tidlige eksponentielle fase udviste lave niveauer af spontan induktion og lytisk genekspression, hvilket tyder på lysogenis dominans. I modsætning hertil viste de kulturer, der blev isoleret 30 minutter efter induktion, signifikante stigninger i ekspressionen af markørgener, der indikerer dominansen af lytisk replikation.

Figure 1
Figur 1: Protokollen til oprettelse af den rifampicinresistente indikatorvært (oprettet med BioRender.com). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Det eksperimentelle design til tælling af PFU og CFU for et lysogen fra samme prøve. (Oprettet med BioRender.com) Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Det eksperimentelle design til prøveudtagning af inducerede og ikke-inducerede kulturer til RNA-isolering. (Oprettet med BioRender.com) Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Tidsmæssig optælling af spontan induktion. Tidsmæssig optælling af spontan LES-profagproduktion ved hjælp af PFU fra PAO1 Φ2-lysogen med den samtidige CFU, n = 8 (to biologiske og fire tekniske replikater); Fejlbjælkerne repræsenterer standardafvigelsen. De mørkerøde punkter angiver CFU·mL−1 i LB; de mørkeblå punkter angiver PFU·mL−1 i LB. Den spontane frigivelse af φ2-infektiøse af lysogenerne er på det laveste målbare niveau ved 2 timer efter podning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Absolut kopinummer af målmarkørgenerne. Det absolutte antal fagmarkørgener bekræfter de forudsagte ekspressionsmønstre, afledt ved hjælp af RT-qPCR, af gener, der forventes at spille vigtige roller i lysogeni og lytiske cyklusser. Prikkerne repræsenterer både tre biologiske og tre tekniske replikater (n = 9). (A) Den røde boks repræsenterer lysogenimarkøren, cI; (B) grøn repræsenterer den tidlige lytiske markør, cro; (C,D) blå repræsenterer de midtlytiske markører, DNA-replikationsgener; (E) magenta repræsenterer de sene lytiske markører, halestrukturelle gener; (F-H) grå repræsenterer værtsmarkørerne, der blev brugt som interne kontroller, og (I) hvid repræsenterer DNA-gyrase B, som blev brugt som induktionskontrol. De ubrudte vandrette linjer viser fordelingens median. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Primere designet i denne undersøgelse. Sekvenserne af specifikke primere for markørgenerne og de interne kontroller, der anvendes i denne undersøgelse, leveres sammen med deres tilsvarende NCBI-tiltrædelses-id'er. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Effektiviteten af de primere, der blev anvendt i denne undersøgelse, beregnet ved hjælp af qPCR-standardkurven. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Oprettelsen af en selekterbar indikatorvært, der tidligere blev brugt i plakassays for mere nøjagtigt at kvantificere den spontane induktion af Stx-fra E. coli MC106137,38,39, er beskrevet her for P. aeruginosa- LESΦ2. Denne intervention har den ekstra fordel, at den reducerer prøvebehandlingstrinnene og -tiden, hvilket muliggør samtidig vurdering af spontane induktionshastigheder under flere dyrkningsforhold. Der er risiko for at generere andre mutationer under dannelsen af rifampicinresistente varianter40; I dette arbejde blev den udviklede stamme imidlertid kun brugt som indikatorvært til optælling af plaques fra kulturer af interesse og blev ikke inkluderet i den transkriptomiske analyse. Så længe den valgbare indikatorstamme forbliver lige så modtagelig for infektion af fagen af interesse, er der ingen bekymring for andre erhvervede mutationer. Ikke desto mindre blev der ikke påvist forskelle i polymorfiprofilerne for restriktionsfragmentlængde ved pulsfeltgelelektroforese (PFGE) analyse af PAO1WT og PAO1RIF (data ikke vist).

Når man vælger værtsceller, er det sjældent at finde en indikatorstamme, der ikke allerede har prophager. Som et eksempel har PAO1 den trådformede prophage Pf4. De eksperimentelle kontroller til denne undersøgelse var designet til direkte at kunne undersøge genekspressionen af specifikke fager (i dette tilfælde LES-profag 2) og de virkninger, denne har på bakteriel genekspression. I sammenligningen af transkripter fra PAO1, der bærer LES-profagen 2 og mangler LES-prophage 2 (både lysogen og ikke-lysogen bærer den endogene Pf4), som tjener som interne kontroller for at udelukke virkningen af Pf4 på værten. Derudover er det blevet påvist, at Pf4 normalt ikke forårsager lysis i sin værtscelle41 og derfor ikke er i stand til at forvirre resultaterne af disse eksperimenter.

Det er veletableret, at omhyggelig kvalitetskontrol er afgørende for prøveforberedelsen med henblik på at producere meningsfulde omics-data42. Som tidligere beskrevet11 udføres imidlertid sjældent den omhyggelige karakterisering af profagaktivitet ved fremstilling af lysogenkulturer til sådanne undersøgelser. Her beskriver vi vores systematiske protokoller til forberedelse af et velkontrolleret og optimeret sæt kulturer til transkriptomiske undersøgelser for bedre at udforske interaktionerne mellem bakterier og tempererede fager. Befolkningens synkronicitet blev kontrolleret ved at bringe kulturen gennem mindst fire fordoblinger, før den blev behandlet med det inducerende antibiotikum norfloxacin. Ved at bestemme MIC for norfloxacin for stammen i undersøgelsen kunne vi sikre, at koncentrationen af det inducerende middel var lige over MIC til "induktionsbehandlingen". De behandlede celler blev derefter fortyndet 1:10 for at sænke norfloxacinkoncentrationen under MIC efter 1 times behandling for at give cellerne mulighed for at komme sig og fuldføre fagreplikationsprocessen, der sluttede i lysering af cellen og frigivelse af infektiøst fagafkom. Cellerne går først ind i den lytiske replikationscyklus efter induktionsstimulus, når koncentrationen af norfloxacin er bragt under MIC i restitutionsperioden. I dette tilfælde betyder overskridelse af 1 μg·ml-1 norfloxacin, at lægemidlet ikke effektivt kunne fortyndes under MIC, da MIC for norfloxacin for PAO1 er 0,19 μg·ml-1. Niveauet af inducerfortynding skal afbalanceres med behovet for lysogengenvinding og tilbageholdelse af kulturtætheden til høst af RNA. De data, der diskuteres her, viser, at det er muligt at synkronisere kulturer for at skabe prøver, hvor lysogeni dominerer, hvilket reducerer støj fra spontan induktion og muliggør påvisning af ægte lysogeni-drevne ændringer i genekspression. Da den lysogene tilstand er fremherskende i den tidlige eksponentielle vækstfase, når bakteriecelletætheden er lav, foreslår vi at opskalere kulturerne for at høste nok RNA til efterfølgende genekspressionsundersøgelser som RNA-Seq.

Anvendelsen af norfloxacin som inducerende middel til at tvinge kulturer ind i den lytiske cyklus er velrapporteret43,44; Dette vil dog også påvirke ekspressionen af andre bakteriegener i processen45,46. For at afbøde dette bør RNA-biblioteker fra kontrolvildtypekulturer, der dyrkes under de samme inducerende og ikke-inducerende betingelser, inkluderes i RNA-Seq-eksperimenter. Brugen af interne kontroller og nøglemarkørgener til at validere stadierne af fagreplikation ved qRT-PCR er også afgørende for nøjagtige sammenligninger. Kvantitativ RT-PCR-profilering kan ikke fortolkes ved at sammenligne det absolutte antal transkripter for hvert gen på forskellige tidspunkter; Det er profilens form, der betyder noget. For det første er kun en lille region i transkriptet for ethvert gen blevet samplet, så om det er et kortvarigt eller længerelivet element er ukendt27. RNA-Seq-kortlægning af transkripter viser bestemt, at tætheden af kortlægningsdataene varierer betydeligt over længden af et gen. For det andet er det formen på genekspressionsprofilen, der skal fortolkes for et markørgen, der er forbundet med den lytiske cyklus eller den lysogene livsstil eller endda afkoblet fra fagreguleringskredsløbene11. Spontan induktion er et reelt problem i lysogenkulturen og vil altid resultere i ekspression af lytiske cyklusassocierede gener. Profilering viser imidlertid, at de gener, der er forbundet med den lytiske replikationscyklus, undertrykkes i deres ekspression før induktion (mindst to logfolder) og opreguleret efter induktion.

De tidligere udførte transkriptomiske analyser af Stx-faginteraktioner med E. coli understøtter en grundig forståelse af de faggener, der er involveret i at opretholde lysogeni og udløse den lytiske cyklus11,17. I øjeblikket er LES-fagerne af P. aeruginosa blevet kommenteret, men deres vigtigste genfunktioner forstås mindre godt. Transkriptomiske undersøgelser vil muliggøre genannotering af LES-profagerne og forbedre vores forståelse af de gener, der er involveret i lysogeni og lytisk cyklus. At forbinde gensekvens med funktion udgør en stor udfordring i studiet af nye former, hvilket yderligere understreger behovet for flere undersøgelser for at bekræfte faggenets funktioner til produktion af bedre annotationsværktøjer47. Den bredere anvendelse og tilpasning af protokollerne og ekstra kvalitetskontrolforanstaltninger, der er beskrevet i denne videoartikel, kan hjælpe med at afsløre forskellige profagfunktioner og dermed forbedre annotationsrørledninger og transformere vores forståelse af og bakteriebiologi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAO1 6
LESB58 6
LES phages Induced and purified from LESB58 using Norfloxacin. This study
Lysogeny Broth (LB) Merck 1.10285.500
LB Agar Merck 1.10283.500
Agar Agar Fisher A/1080/53
Top Agar 0.4 g Agar Agar+2.5 g LB Broth in 100 mL water; autoclave and use. -
Rifampicin Sigma (Stock: 50 mg/mL in Methanol- Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use) R3501
Glacial Acetic Acid Fisher 1% (v/v) in water 10060000
Norfloxacin Sigma (Stock: 25 mg/mL of 1% Glacial Acetic Acid-Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use;To avoid freeze thaw cycles, store as small aliquotes) N9890
Phenol saturated with citrate buffer pH 4.3 Sigma P-4682
Molecular Biology grade Ethanol Fisher 16695992
TRIzol Invitrogen 12044977
Chloroform Fisher 11398187
Isopropanol Fisher 17150576
Nuclease-free H2O Invitrogen 10526945
10X TURBO DNase Ambion AM1907
Qubit RNA HS, BR Kit Invitrogen Q10210
Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent 5067-1511
SuperScriptIII first strand synthesis kit Invitrogen 18080051
PCR Reagents Bioline Mytaq Red 2X BIO-25043
qPCR Reagents Sensifast SYBR Hi Rox BIO-92020
PCR purification kit Isolate II PCR and Gel Kit BIO-52060
TA cloning kit TA Cloning Kit, with pCR 2.1 Vector, without competent cells K202040
StepOne Real Time PCR system Thermo Fisher Scientific 4376600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lin, D. M., Koskella, B., Lin, H. C. Phage therapy: An alternative to antibiotics in the age of multi-drug resistance. World Journal of Gastrointestinal Pharmacology and Therapeutics. 8 (3), 162-173 (2017).
  2. Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New tools for genetic manipulations from bacterial immunity systems. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 209-228 (2015).
  3. Santos, S. B., Azeredo, J. Bacteriophage-based biotechnological applications. Viruses. 11 (8), 737 (2019).
  4. Rodríguez-Rubio, L., Jofre, J., Muniesa, M. Is genetic mobilization considered when using bacteriophages in antimicrobial therapy. Antibiotics. 6 (4), 32 (2017).
  5. Hatfull, G. F. Dark Matter of the biosphere: The amazing world of bacteriophage diversity. Journal of Virology. 89 (16), 8107-8110 (2015).
  6. Yukgehnaish, K., et al. PhageLeads: Rapid assessment of phage therapeutic suitability using an ensemble Machine Learning approach. Viruses. 14 (2), 342 (2022).
  7. Seemann, T. Prokka: Rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics. 30 (14), 2068-2069 (2014).
  8. Arndt, D., et al. PHASTER: A better, faster version of the PHAST phage search tool. Nucleic Acids Research. 44, W16-W21 (2016).
  9. Banerjee, S., et al. FINDER: An automated software package to annotate eukaryotic genes from RNA-Seq data and associated protein sequences. BMC Bioinformatics. 22 (1), 205 (2021).
  10. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  11. Veses-Garcia, M., et al. Transcriptomic analysis of Shiga-toxigenic bacteriophage carriage reveals a profound regulatory effect on acid resistance in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8118-8125 (2015).
  12. Owen, S. V., et al. A window into lysogeny: revealing temperate phage biology with transcriptomics. Microbial Genomics. 6 (2), e000330 (2020).
  13. Davies, E. V., Winstanley, C., Fothergill, J. L., James, C. E. The role of temperate bacteriophages in bacterial infection. FEMS Microbiology Letters. 363 (5), 015 (2016).
  14. Livny, J., Friedman, D. I. Characterizing spontaneous induction of Stx encoding phages using a selectable reporter system. Molecular Microbiology. 51 (6), 1691-1704 (2004).
  15. Fogg, P. C. M., et al. Identification of multiple integration sites for Stx-phage Φ24B in the Escherichia coli genome, description of a novel integrase and evidence for a functional anti-repressor. Microbiology. 153 (12), 4098-4110 (2007).
  16. James, C. E., et al. Differential infection properties of three inducible prophages from an epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa. BMC Microbiology. 12, 216 (2012).
  17. Riley, L. M., et al. Identification of genes expressed in cultures of E. coli lysogens carrying the Shiga toxin-encoding prophage Φ24B. BMC Microbiology. 12 (1), 42 (2012).
  18. Stover, C. K., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).
  19. Winstanley, C., et al. Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa. Genome Research. 19 (1), 12-23 (2009).
  20. Davies, E. V., et al. Temperate phages enhance pathogen fitness in chronic lung infection. The ISME Journal. 10 (10), 2553-2555 (2016).
  21. Allison, H. E. Stx-phages: drivers and mediators of the evolution of STEC and STEC-like pathogens. Future Microbiology. 2 (2), 165-174 (2007).
  22. Allison, H. E., et al. Immunity profiles of wild-type and recombinant Shiga-like toxin-encoding bacteriophages and characterization of novel double lysogens. Infection and Immunity. 71 (6), 3409-3418 (2003).
  23. Mori, N., et al. A peptide based on homologous sequences of the β-barrel assembly machinery component BamD potentiates antibiotic susceptibility of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (9), 2173-2181 (2012).
  24. Chojnacki, M., et al. A novel, broad-spectrum antimicrobial combination for the treatment of Pseudomonas aeruginosa corneal infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (10), e00777 (2019).
  25. Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. The estimation of the bactericidal power of the blood. Epidemiology & Infection. 38 (6), 732-749 (1938).
  26. Srikumar, S., et al. RNA-seq brings new insights to the intra-macrophage transcriptome of Salmonella Typhimurium. PLoS Pathogens. 11 (11), e1005262 (2015).
  27. Kröger, C., et al. The transcriptional landscape and small RNAs of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), E1277-E1286 (2012).
  28. Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2019).
  29. Koetsier, G. A practical guide to analyzing nucleic acid concentration and purity with microvolume spectrophotometers. New England BioLabs Inc. , Available from: https://www.neb.com/-/media/nebus/files/application-notes/technote_mvs_analysis_of_nucleic_acid_concentration_and_purity.pdf?rev=c24cea043416420d84fb6bf7b554dbbb (2019).
  30. Saunders, N. A., Lee, M. A. Real-Time PCR: Advanced Technologies and Applications. , Caister Academic Press. Norfolk, UK. (2013).
  31. Bustin, S. A. A-Z of Quantitative PCR. , International University Line. La Jolla, CA. (2004).
  32. Ruijter, J. M., et al. Efficiency correction is required for accurate quantitative PCR analysis and reporting. Clinical Chemistry. 67 (6), 829-842 (2021).
  33. Fothergill, J. L., Neill, D. R., Loman, N., Winstanley, C., Kadioglu, A. Pseudomonas aeruginosa adaptation in the nasopharyngeal reservoir leads to migration and persistence in the lungs. Nature Communications. 5 (1), 4780 (2014).
  34. Huang, J., et al. Temperature-dependent expression of phzM and its regulatory genes lasI and ptsP in rhizosphere isolate Pseudomonas sp. strain M18. Applied and Environmental Microbiology. 75 (20), 6568-6580 (2009).
  35. Savli, H., et al. Expression stability of six housekeeping genes: a proposal for resistance gene quantification studies of Pseudomonas aeruginosa by real-time quantitative RT-PCR. Journal of Medical Microbiology. 52 (5), 403-408 (2003).
  36. Kassambara, A. rstatix: Pipe-Friendly Framework for Basic Statistical Tests. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=rstatix (2022).
  37. McDonald, J. E., et al. High-throughput method for rapid induction of prophages from lysogens and its application in the study of Shiga toxin-encoding Escherichia coli strains. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2360-2365 (2010).
  38. Smith, D. L., et al. Short-tailed Stx phages exploit the conserved YaeT protein to disseminate Shiga toxin genes among Enterobacteria. Journal of Bacteriology. 189 (20), 7223-7233 (2007).
  39. James, C. E., et al. Lytic and lysogenic infection of diverse Escherichia coli and Shigella strains with a verocytotoxigenic bacteriophage. Applied and Environmental Microbiology. 67 (9), 4335-4337 (2001).
  40. Rees, V. E., et al. Characterization of hypermutator Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis in Australia. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (4), e02538 (2019).
  41. Li, Y., et al. Excisionase in Pf filamentous prophage controls lysis-lysogeny decision-making in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 111 (2), 495-513 (2019).
  42. Van Kampen, A. H. C., Moerland, P. D. Taking bioinformatics to systems medicine. Systems Medicine. 1386, 17-41 (2016).
  43. Matsushiro, A., Sato, K., Miyamoto, H., Yamamura, T., Honda, T. Induction of prophages of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 with norfloxacin. Journal of Bacteriology. 181 (7), 2257-2260 (1999).
  44. James, C. E., et al. Lytic activity by temperate phages of Pseudomonas aeruginosa in long-term cystic fibrosis chronic lung infections. The ISME Journal. 9 (6), 1391-1398 (2015).
  45. Shaw, K. J., et al. Comparison of the changes in global gene expression of Escherichia coli induced by four bactericidal agents. Microbial Physiology. 5 (2), 105-122 (2003).
  46. Long, H., et al. Antibiotic treatment enhances the genome-wide mutation rate of target cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), E2498-E2505 (2016).
  47. González-Tortuero, E., et al. VIGA: A sensitive, precise and automatic de novo VIral Genome Annotator. bioRxiv. , (2018).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 203
Forståelse af virkningen af tempererede bakteriofager på deres lysogener gennem transkriptomik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Krishnamurthi, R.,… More

Krishnamurthi, R., González-Tortuero, E., Plahe, G., Goodhead, I. B., Fothergill, J. L., James, C. E., Allison, H. E. Understanding the Impact of Temperate Bacteriophages on Their Lysogens Through Transcriptomics. J. Vis. Exp. (203), e64945, doi:10.3791/64945 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter