Summary
이 프로토콜을 통해 숙주에 대한 프로파지의 영향을 밝힐 수 있습니다. 박테리아 배양은 용원 상태를 가장 잘 지원하는 조건을 사용하여 동기화되어 자발적 유도를 제한합니다. RT-qPCR은 프로파지 제한 유전자 및 파지 제어에서 결합되지 않은 유전자를 용해 복제 주기 동안 발현되는 유전자와 명확하게 구별합니다.
Abstract
온대 파지는 대부분의 박테리아 게놈에서 프로파지로 통합되는 것으로 발견됩니다. 일부 프로파지는 비밀스럽고 박테리아 염색체에 고정되어 있지만 다른 프로파지는 활성화되어 자발적으로 또는 유도 인자에 노출되어 복제 형태로 촉발될 수 있습니다. 프로파지는 일반적으로 숙주 세포에 독소 생산 또는 기타 독성 관련 형질을 부여하는 능력과 관련이 있습니다. 보다 최근의 연구는 그들이 숙주의 생리학을 변화시키는 데 훨씬 더 큰 역할을 할 수 있다는 것을 보여주었습니다. 여기에 설명된 기술을 통해 프로파지가 기회 박테리아 녹농균의 유전자 발현에 어떤 영향을 미치는지 조사할 수 있었습니다.
이 연구에서, 야생형 녹농균 균주 PAO1의 성장은 Liverpool Epidemic Strain(LES) LESB58의 다양한 프로파지 조합을 운반하는 동인성 라이소겐의 성장과 비교되었습니다. 라이소겐 배양에서 박테리아 세포의 일부는 파지 입자의 조립과 관련된 것과 같은 후기 파지 유전자의 세포당 높은 수준의 발현으로 용해성 박테리오파지 복제(자발적 유도)를 지원하여 라이소겐 제한 유전자 발현과 관련된 낮은 수준의 유전자 발현을 마스킹합니다. 따라서 자발적 유도의 영향은 라이소겐 집단에서 프로파지 유전자 발현을 모호하게 할 수 있습니다.
성장 프로파일링 실험은 초기 기하급수적 성장 단계에서 최소화된 자발적 유도를 식별하는 데 사용되었습니다. 이 연구는 초기 기하급수적 성장 단계에서 샘플 배양을 준비하는 방법과 낮은 세포 수에도 불구하고 적절한 대조군을 설정하는 방법을 보고합니다. 이러한 프로토콜은 다양한 조건에서 야생형 및 용원 박테리아의 신뢰할 수 있고 재현 가능한 비교를 보장하여 프로파지 게놈의 전사체 프로파일링을 개선하고 이전에 인식되지 않은 프로파지 기능을 식별하는 데 도움이 됩니다.
Introduction
최근에는 항생제 내성1 및 CRISPR-Cas 기반 유전자 편집2을 해결하기 위한 파지 요법이 박테리오파지 연구에 대한 새로운 관심을 불러일으켰습니다. 다시 말하지만, 생명공학의 발전은 박테리아와 파지 사이의 상호작용에 대한 더 깊은 연구를 가능하게 했다3. 그러나 파지의 치료적 사용("파지 요법")은 파지가 독성 및 내성 유전자를 수평적으로 전달할 수 있는 능력을 가진 이동성 유전 요소로 작용할 수 있다는 우려로 인해 방해를 받고 있다4. "암흑물질(dark matter)"5 (알려지지 않은 기능을 가진 유전자들)의 광활함은 우려스러우면서도 매력적이다. 암흑물질은 파지 생물학에 대한 우리의 이해의 격차로 간주되며, 분자 도구 및 잠재적인 새로운 치료법을 위한 미개척 자원으로 간주된다6. 개선된 유전자 주석 7,8,9 및 새로운 펩타이드 접힘 알고리즘(10)과 함께 고처리량 염기서열 분석 기술의 개발은 파지 유전자의 검출, 설명 및 기능적 예측을 개선하고 있습니다. 그러나 과학은 배양이나 현실 세계에서 대부분의 파지의 유전자 기능을 검증하기에는 아직 멀었다.
RNA 염기서열분석(RNA-Seq)은 파지 감염 중 유전자 발현을 전체적으로 매핑할 수 있으며 용해 및 용원 주기에 관여하는 파지 및 박테리아 요소에 대한 이해를 크게 향상시켰습니다11,12. 용원 과정(lysogenic process) 동안, 온대 파지 게놈(temperate phage genome)은 박테리아 DNA에 통합되어 프로파지(prophage)가 된다 13. 글로벌 유전자 발현 프로파일링 실험은 온대 파지 게놈에 암호화되어 있지만 용원 상태 동안에만 발현되는 프로파지-제한 유전자를 식별하는데 사용될 수 있다11. 이러한 유전자는 파지 구조 단백질을 암호화하지 않으며 파지 감염 과정에 관여하지 않습니다. RNA-Seq는 기능 향상을 유도하거나 기존 박테리아 유전자를 조절하여 박테리아가 변화하는 환경에 적응할 수 있도록 함으로써 박테리아 숙주의 생물학에 영향을 미칠 가능성이 더 높은 유전자를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 다양한 박테리아 기능을 제어하는 미생물 꼭두각시 주인 역할을 하는 프로파지의 능력을 연구할 수 있습니다.
프로파지 제한 유전자 발현의 효과적인 분석에는 두 가지 주요 장벽이 있습니다. 첫째, 취약한 호스트의 가용성이 핵심 문제입니다. 정의에 따르면, 프로파지는 이미 특정 숙주 게놈에 통합되어 있기 때문에 프로파지의 존재 여부와 관계없이 전체 유전자 발현을 비교하기 위해 감수성 야생형 숙주를 찾는 것은 어렵습니다. 이는 다른 감수성 숙주의 de novo 감염 또는 숙주 게놈의 나머지 부분을 방해하지 않고 원래 야생형 분리물에서 프로파지의 삭제를 통해 달성할 수 있습니다. 두 번째 장벽은 용원 개체군의 이질적인 특성에 있습니다. 일부 프로파지는 돌연변이 또는 재조합을 통해 분해되어 박테리아 게놈의 특정 위치에 고정되어 있는 "비밀"이 됩니다. 그러나, 다른 프로파지들은 "활동적"이며, 자발적으로 또는 유도 인자에 노출된 후에 복제적, 용해적 회로로 유도될 수 있다. 많은 용원 배양에서 자발적 유도 속도는 박테리아 세포의 일부가 항상 용해성 파지 복제를 겪고 있음을 의미합니다14,15,16. 이들 집단에서 후기 파지 유전자의 높은 수준의 발현은 리소겐 제한 유전자 발현과 관련된 낮은 수준의 유전자 발현을 가린다11,17. 자발적 프로파지 유도를 받는 리소겐의 비율은 성장 상태, 성장 조건 또는 기타 유발 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서 프로파지가 리소겐에 미치는 영향을 연구하기 위해서는 리소겐 상태에 유리하도록 성장 조건을 최적화하여 자발적인 프로파지 유도 사건을 최대한 최소화해야 합니다.
이 연구는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 리버풀 전염병 균주(LES)의 동거 프로파지 세트의 영향을 조사하기 위해 수행된 준비 작업을 보고합니다. 활성 프로파지를 LES에서 유도 및 분리하여 모델 녹농균 숙주 PAO116,18,19를 감염시키는 데 사용하였다. 야생형 녹농균 균주 PAO1 및 이의 라이소겐 PAO1Φ2의 전체 게놈 염기서열을 분석하여(30배 깊이에서) 야생형 균주의 정체를 확인하고 라이소겐이 동원성임을 확인했습니다. LES는 낭포성 섬유증 환자의 이환율 및 사망률 증가와 관련이 있으며, LES 파지(19)는 낭포성 섬유증 폐 환경에 대한 적응을 돕는 것으로 제안되었다16,19,20. 이러한 프로파지가 숙주20,21의 생물학에 영향을 미친다는 강력한 증거에도 불구하고, 대부분의 유전자 기능은 아직 특성화되지 않았으며, 상호작용의 구체적인 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있다. 전사체학 접근법은 통제된 숙주 배경에서 프로파지 유전자 기능을 경험적으로 밝혀낼 수 있습니다. 자발적 유도는 발현 프로파일에 영향을 미칠 수 있기 때문에 이 기사에서는 용원 상태를 선호하도록 성장 조건을 최적화하는 방법을 설명합니다. 이러한 배양 동기화는 PAO1에서 LES 파지 복제의 중요한 단계와 관련된 주요 유전자 마커의 발현 수준을 정량화하기 위해 Real-Time PCR로 검증할 수 있습니다. 동일한 접근법은 이전에 대장균 11,17,21,22에서 운동성, 내산성 및 항균성 내성에 영향을 미치는 Shiga-toxigenic 파지의 프로파지 제한 기능을 식별하는 데 사용되었습니다.
Protocol
1. 선택 가능한 표시기 호스트 생성(그림 1)
참고: 파지 배양 용해물에는 원래 박테리아 숙주의 오염 세포가 포함될 수 있습니다. 항생제 내성 지시자 균주를 갖는 것은 지시자 균주와 프로파지의 원래 박테리아 숙주를 구별할 수 있도록 합니다. 선택 가능한 지시자 균주를 사용하면 파지 증폭 단계 후 라이소겐 세포에서 파지를 제거하기 위한 원심분리 또는 여과 단계 없이 감염성 파지 입자를 정확하게 계수할 수 있습니다. 또한 선택 가능한 지표 호스트 균주는 파지 계수를 위한 시간과 단계 수를 줄여 여러 조건을 동시에 시험할 수 있습니다.
- 관심 온대 파지에 의한 용해성 및 용원성 감염에 취약한 적절한 지표 숙주 균주를 식별합니다. 녹농균 실험실 균주 PAO118,20을 사용하였으며 3개의 LES 파지(LESΦ2, LESΦ3 및 LESΦ4)에 취약합니다.
- 적절한 선택제(여기서는 리팜피신이 사용됨)를 선택하고 배지 희석 분석을 수행하여 지표 호스트(16μg·mL-1은 PAO1에 대한 MIC임)23,24에 대한 최소 억제 농도(MIC)를 결정합니다.
- MIC 아래(이 경우 5μg·mL−1)에서 시작하여 18-24시간 동안 흔들면서 37°C에서 용원성 국물(LB)의 선택적 물질 농도를 증가시키는 지표 숙주 배양액을 순차적으로 노출시킵니다.
- MIC가 충분히 증가할 때까지 1:100(접종물 대 배지)의 비율로 가장 높은 농도로 성장하는 배양물을 선택제의 2배 증가된 농도(매번 18-24시간)로 옮깁니다. PAO1은 300μg·mL-1 리팜피신에서 리팜피신 내성 균주(PAO1-Rif R)가 되었습니다.
2. 자발적 유도의 시간적 직접 열거 (그림 2)
- 5mL의 LB에 단일 콜로니를 접종하여 라이조겐(예: LES 파지를 품고 있는 녹농균 PAO1 라이소겐)과 지표 숙주(PAO1-RifR)의 하룻밤 스타터 배양을 설정하고 37°C에서 180rpm(18–24시간)에서 진탕하여 배양합니다.
- 100mL의 LB에 1:100의 비율로 야간 배양액을 접종하여 신선한 라이소겐 및 지표 숙주 배양액을 설정하고 37°C에서 진탕(180rpm)하여 배양합니다.
- Miles Misra 기법25를 사용하여 OD600 및 생존 가능한 수를 측정하여 라이소겐 성장을 모니터링합니다. 이를 위해 접종 시점부터 8시간 동안 매시간 각 라이소겐 배양액에서 1mL 샘플을 수집합니다.
- 채취 직후 시료 100μL를 각 배지 900μL에 첨가하여 시료를 순차적으로 희석합니다. 최대 속도로 잘 소용돌이치고 희석할 때마다 팁을 버리고 10−1 에서 10−9까지 희석 시리즈를 계속합니다.
- 필요한 희석액 10μL를 LB 한천 플레이트에 삼중으로 배치하고 건조시킨 후 37°C에서 18-24시간 동안 배양합니다.
- 생존 가능한 박테리아 세포의 수를 계산하려면 쉽게 셀 수 있는 콜로니가 있는 희석액을 찾으십시오. 각 지점의 콜로니 수를 세고 다음 공식을 사용합니다.
참고: 라이소겐 배양이 성장함에 따라 활성 파지 입자는 자발적 유도에 의해 생성됩니다. 감염성 파지의 생산은 라이소겐 집단의 전사체가 이제 용해 파지 복제 신호 및 해당 숙주 세포 반응으로부터 용해 복제 주기 관련 유전자 발현으로 오염됨을 의미합니다. 따라서 데이터 세트에서 가능한 한 많은 배경 전사 노이즈(용해 파지 전사체에 의해 생성됨)를 제한하기 위해 유리 감염 파지 입자에 대한 용원 세포의 비율이 가장 높은 성장 단계를 식별하는 것이 중요합니다.
- 각 측두검체에서 감염성 파지 입자를 열거하기 위해, 적절한 선택제(이 경우 PAO1 숙주의 MIC가 16μg·mL-1에 불과하므로, 이 경우 50μg·mL-1 리팜피신)의 존재 하에 LB(상단 한천)에 있는 멸균 0.4% 세균학적 한천 5mL를 100μL의 중간 지수 위상 지표 호스트(OD600: 0.4–0.5; 이 경우 PAO1-RifR)의 존재 하에 접종합니다. 재료 표 참조, 행 8 및 행 9)
- 동일한 연속 희석액 10μL(2.2.2단계 참조)를 접종된 상단 한천 층에 놓고 건조시킨 후 37°C에서 18-24시간 동안 배양합니다.
- 감염성 파지 입자를 계산하려면 쉽게 셀 수 있는 플라크로 희석을 찾으십시오. 각 지점의 플라크 수를 세십시오.
- 추가 실험 단계를 위해 CFU(콜로니 형성 단위)당 자발적 유도가 최소화되는 시간/조건을 찾습니다.
3. RNA 추출을 위한 비유도 및 유도 라이소겐 배양 준비(그림 3)
- 5mL의 LB에 단일 라이소겐 콜로니를 접종하여 신선한 야간 배양을 설정하고 37°C에서 18-24시간 동안 진탕(180rpm)하여 배양합니다.
- 8개의 250mL 플라스크에서 1:100의 비율로 80mL의 LB에서 야간 배양을 하위 배양합니다.
- 첫 번째 플라스크는 "un-induced"로, 다른 플라스크는 "induced"로 라벨을 붙이고 각 샘플을 채취해야 하는 시점(예: "induced t = 0", "induced t = 10 min", "induced t = 20 min" 등)을 표시합니다. 그림 3).
- 90분 배양 후 OD600 이 0.1–0.2 사이일 때 또는 최소 자연 유도 시(논의 참조) 유도되지 않은 플라스크에 4μL의 1% 빙초산(v/v)을 추가합니다(그림 3).
NOTE: 본 연구의 유도제는 1% 빙초산을 용매로 사용하여 제조되었으므로, 대조 단계로 동일한 양의 용매를 단독으로 첨가하였다. 다른 유도제의 준비에 따라 대체 대조군이 고려될 수 있습니다. - 720mL의 멸균 LB에 유도되지 않은 플라스크로부터 80mL 배양액을 첨가하고, 배양 부피(160mL)의 20%인 부피를 사용하여 즉시 정지 용액(얼음처럼 차가운 5%[v/v] 페놀, pH 4.3, 95%[v/v] 에탄올)을 첨가하고, RNA 전사체를 안정화시키기 위해 최소 30분 동안 2시간 이하로 얼음 위에서 배양한다12, 26,27. 이것은 유도되지 않은 샘플입니다.
- 7개의 250mL 플라스크(그림 3)에서 적절한 유도제(이 경우 1% 빙초산[w/v]로 제조된 25mg·mL-1 노르플록사신, 최종 농도 1μg·mL-1)의 MIC로 나머지 배양을 유도하고, 잘 혼합하고, 37°C에서 180rpm으로 1시간 동안 진탕하여 배양합니다.
참고: 이 단계는 라이소겐 배양을 보다 조정된 용해 복제 상태로 만듭니다. 배양에 있는 대부분의 세포는 감염성 파지 입자의 용해 생산을 겪기 시작합니다. - 유도 플라스크에서 배양액 80mL를 멸균 LB 720mL에 추가하여 유도제를 효과적으로 희석하여 세포가 회복되도록 합니다. 3.5단계에서 언급한 대로 정지 용액을 추가하여 시간 0에서 1시간까지 1분마다 각 플라스크에서 박테리아 세포를 수확합니다.
참고: 정지 용액은 최대 2시간 동안 RNA를 안정화합니다. 그러나 시료 안정성을 높이려면 4°C에서 모든 추가 단계를 수행하십시오. - RNA 분해를 방지하기 위해 후처리 후 2시간을 초과하지 않고 가능한 한 빨리 4°C에서 15분 동안 10,000 x g 에서 원심분리하여 수확합니다.
- 상층액을 버리고 각 샘플을 1.5mL 미세분리 튜브로 옮기기 전에 조정 가능한 자동 피펫을 사용하여 잔류 액체에 박테리아 펠릿을 부드럽게 재현탁시킵니다.
- 마이크로분리 튜브를 4°C의 마이크로퓨지에서 고속(13,000 x g)으로 1분 동안 원심분리하고 잔류 상층액을 버립니다.
- 밀봉된 각 마이크로프리지 튜브를 액체 질소에 담가 펠릿을 급속 동결합니다. 이것은 RNA 추출을 위한 세포의 효율적인 용해에 도움이 될 것입니다.
- 각 냉동 펠릿에 TRIzol(1mL)을 첨가하고 피펫팅(와류 금지)을 통해 현탁액을 균질화합니다. 모든 샘플에 대해 RNA 추출을 수행할 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관합니다.
참고: 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. - 3개의 생물학적 복제물로 3.1–3.13단계를 반복합니다.
4. 유도되지 않은 라이소겐 배양과 유도된 라이소겐 배양에서 RNA의 분리
중요: 이러한 모든 단계는 RNase가 없는 환경에서 수행되어야 합니다28. 작업대는 10% NaClO 또는 독점적인 RNase 비활성화제로 닦아야 합니다. 실험기구는 DEPC 처리와 같은 RNase 억제제로 처리해야 하며, 모든 반응에 뉴클레아제가 없는 물을 사용해야 합니다.
- 3.12단계에서 냉동된 TRIzol 처리된 펠릿을 얼음 위에서 해동하고 분자 생물학 등급 클로로포름 400μL를 추가합니다.
- 바이알을 10초 동안 뒤집어 잘 교반하여 모든 세포의 용해를 완료합니다(소용돌이 방지 ). 그런 다음 실온(21°C)에서 2-5분 동안 배양합니다.
- 4°C 및 13,000 x g 에서 15분 동안 냉장 탁상용 미세분리기를 사용하여 원심분리하여 TRIzol/클로로포름 혼합물에서 수성층을 분리합니다.
- 1,000 μL 피펫을 사용하여 수성상(~ 500 μL, 상층)을 수집하되, 간상 또는 유기상(하부층)을 방해하지 않도록 주의합니다. 새 1.5mL 마이크로퓨지 튜브로 옮깁니다.
- 450μL의 분자생물학 등급 이소프로판올을 분리된 수용상에 첨가하고 반역(와류 금지 )하여 잘 혼합하고 실온(21°C)에서 30분 동안 배양합니다.
- 4°C 및 13,000 x g 에서 30분 동안 냉장 원심분리기를 사용하여 원심분리하여 RNA를 회수합니다.
- RNA 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 버리고 뉴클레아제가 없는 물로 준비된 70% 에탄올 800μL로 펠릿을 두 번 세척합니다(위아래로 피펫팅하지 마십시오). 세척 후 5분 동안 원심분리 단계를 반복하여 RNA 펠릿의 안정성을 보장합니다.
- 에탄올을 버리고 펠릿을 자연 건조하십시오.
알림: 10μL 마이크로팁을 사용하여 펠릿 주위의 에탄올을 조심스럽게 흡입하고 깨끗한 압지에 튜브를 뒤집어 펠릿을 건조시킵니다. RNA 펠릿은 무색으로 변해야 하며 가장자리가 주름지고 눈에 띄어야 합니다. 너무 적게 건조하면 다운스트림 공정에 영향을 줄 수 있는 잔류 에탄올이 남을 수 있으며, 펠릿을 너무 많이 건조하면 재현탁이 어려워질 수 있습니다. - 간헐적 혼합(30초마다)하여 열 셰이커에서 65°C에서 총 3-5분 동안 배양하여 뉴클레아제가 없는 물(50μL)에 RNA를 재현탁시킵니다.
중요: RNA의 2'-OH 그룹은 65°C 이상의 고온과 높은 pH에서 RNA 가닥의 자가절단을 촉매할 수 있습니다. 65°C 미만의 온도는 잔류 DNA의 재현탁을 지연시켜 DNase I 분해로 이후 단계에서 소화해야 하는 DNA의 양을 제한합니다. 따라서 최상의 샘플을 얻으려면 온도를 65°C로 유지하는 것이 중요합니다.
참고: 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있으며 samples는 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
5. DNase 처리에 의한 RNA의 오염 DNA 제거
- 첫 번째 가닥 cDNA 합성 전에 전체 RNA에서 오염 DNA를 제거하려면 0.1 부피의 10x DNase 완충액과 1μL의 DNase 효소를 총 RNA 10μg에 추가합니다. 튜브를 부드럽게 혼합하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
- DNase 불활성화 시약을 재현탁하고 최소 2μL 또는 총 반응 부피의 10% 부피를 추가합니다. 잘 혼합하고 DNase 비활성화 시약을 재분산하는 동안 실온(21°C)에서 5분 동안 샘플을 배양합니다.
- 테이블탑 마이크로 원심분리기를 사용하여 10,000× g 에서 1.5분 동안 원심분리하여 DNase 시약을 펠트합니다.
- RNA를 포함하는 상청액을 펠릿을 방해하지 않고 새 튜브로 옮깁니다.
알림: 제조업체의 지침에 따라 1μL 스케일 UV 분광 광도계와 미세유체 기반 핵산 컴퓨터 분석기를 사용하여 RNA의 품질을 확인하십시오. 정제된 총 RNA는 -80°C에서 보관할 수 있습니다. qRT-PCR의 경우 이 시점에서 RNA를 직접 사용할 수 있습니다. 엄격한 시료 품질이 필요한 RNA 염기서열분석과 같은 보다 민감한 다운스트림 공정의 경우 더 진행하려면 ε 2.0의 A260/230 비율에 도달해야 합니다. - 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 DNA가 없는 RNA 용액의 부피를 500μL로 구성합니다.
- 뉴클레아제가 없는 3M 아세트산나트륨(pH 5.3) 50μL와 이소프로판올 495μL를 추가합니다. 잘 섞고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
참고: 이 단계는 RNA를 침전시킵니다. - 13,000 x g 및 4°C에서 30분 동안 원심분리하여 RNA를 회수합니다.
- 각 세척 후 샘플을 13,000 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 RNA 펠릿을 얼음처럼 차가운 70% 에탄올로 세 번 세척하여 염을 완전히 제거합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 1μL 스케일 UV 분광 광도계와 미세유체 기반 핵산 컴퓨터 분석기를 사용하여 RNA의 품질을 확인합니다. 정제된 총 RNA는 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
참고: 가이드29 는 RNA 품질 표준을 달성하는 데 사용되었습니다. A260/230 비율이 <2.0이면 5.5-5.9단계를 반복합니다.
6. DNase-free RNA의 정성적 및 정량적 분석
- 총 RNA 1μg으로 16S rRNA primer(표 2)를 사용하여 정량적 PCR을 수행하여 각 샘플에 대한 DNase 처리의 효율성을 검증하고 증폭 산물이 생성되지 않음을 확인합니다.
참고: gDNA 오염을 평가하기 위한 이상적인 프라이머는 원핵생물의 인트론-엑손 접합 또는 조절 영역 또는 전사적으로 비활성 부위(30,31)에서 어닐링하도록 설계된 프라이머입니다. - 제조업체의 지침에 따라 미세유체 기반 핵산 컴퓨터 분석기를 사용하여 RNA 무결성 번호(RIN)를 결정합니다.
참고: RIN ≥ 9를 보여주는 샘플은 첫 번째 가닥 합성에 사용해야 합니다. RIN < 9를 나타내는 샘플은 폐기하고 격리 단계(1.1–5.4)를 반복해야 합니다. - 제조업체의 지침에 따라 HS RNA 분석 키트와 형광측정기를 사용하여 총 RNA 농도를 정량화합니다.
7. 첫 번째 가닥 cDNA 합성
- 총 RNA 1μg과 무작위 헥사머 1μL(50ng·μL−1) 및 1μL의 10mM dNTP 혼합물 1μL를 혼합하여 각 샘플에 대한 RNA 프라이머 혼합물을 준비합니다. 그런 다음 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 총 부피를 10μL로 조정합니다.
- 65°C에서 5분 동안 반응을 배양하고 얼음 위에 1분 동안 둡니다.
- 2μL의 10x RT 완충액을 첨가하여 각 샘플에 대한 cDNA 합성 혼합물을 준비합니다. 25 mMMgCl2의 4 μL; 0.1m DTT의 2μL; RNase 억제제 (40 U·μL-1)의 1 μL; 및 1 μL의 역전사 시약(200 U·μL-1)을 표시된 순서로 저장한다.
- cDNA 합성 혼합물을 RNA/프라이머 혼합물에 추가합니다. 부드럽게 혼합하고 샘플을 잠시 원심분리하여 튜브 바닥의 성분을 수집합니다.
- 25°C에서 10분 동안 샘플을 배양한 다음 50°C에서 50분 동안 배양하여 혼합물을 프라이밍합니다. 85°C에서 5분 동안 배양하여 반응을 종료하고 얼음 위에서 식힙니다.
- 각 튜브에 1μL의 RNase H를 추가하고 37°C에서 20분 동안 배양하여 DNA:RNA 하이브리드에서 RNA를 제거합니다.
- 마지막으로, cDNA 합성 반응을 총 부피 80μL로 희석하고, 추가 사용시까지 -80°C에서 보관한다.
참고: 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
8. 파지 복제의 다양한 단계를 나타내는 마커 유전자의 발현 수준을 결정하기 위한 표준 곡선 및 정량적 (q)-PCR
- 관심 파지의 각 복제 단계에 대한 마커 역할을 할 수 있는 표적 유전자 세트를 식별합니다. 우리의 경우 표 2에 자세히 설명되어 있습니다.
- 관련 프라이머를 사용하고 다음 증폭 조건에서 PCR을 사용하여 템플릿 게놈 DNA로부터 각 표적 유전자를 증폭합니다: 95°C에서 2분 동안 초기 변성; 95 °C에서 30 초 동안 변성; 프라이머에 따라 최적의 어닐링 온도에서 30초 동안 어닐링(여기서는 58°C가 사용됨); 72°C에서 1분 동안 연장; 72°C에서 5분 동안 최종 확장.
- PCR 정제 키트를 사용하여 각 앰플리콘을 정제하고 제조업체의 지침에 따라 TA 클로닝 벡터에서 클로닝합니다. Sanger 염기서열분석을 통해 각 복제된 산물의 염기서열을 확인합니다.
참고: 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. - 하기 수학식20을 사용하여 개별 plasmid에 대한 복제 수를 계산한다:
- 분자 등급 뉴클레아제가 없는 멸균H2O에서 플라스미드 DNA를 109 copies/μL에서 102 copies/μL로 연속적으로 희석하여 각 마커 유전자에 대한 표준 템플릿을 준비합니다.
- 삼중의 각 샘플에 대해 1μL의 cDNA(단계 7.7에서)를 사용하여 선호하는 qPCR 시스템에 대한 제조업체의 지침에 따라 각 플라스미드 표준물질과 함께 정량적 PCR을 수행합니다. 각 타겟에 대해 96웰 플레이트에서 PCR을 수행합니다.
- 로그 DNA 복제 수(x축)와 주기 임계값(y축, Ct)을 플로팅하고, Excel 또는 R과 같은 적절한 플랫폼을 사용하여 선형 회귀 계산을 수행하여 결정 계수(R2)와 선형 방정식을 표시합니다.
참고: 결정 계수는 0.98 이상이어야 합니다. - 선형 회귀(단계 8.7)에서 파생된 선형 방정식(y = mx + b)을 사용하여 각 대상에 대한 복제 수를 추정하며, 여기서 y는 추정된 Ct입니다. x는 로그 DNA 사본 번호입니다. m은 DNA 복제 번호에 대한 Ct의 변화를 정의하는 선의 기울기입니다. b는 하나의 DNA 사본(32)에 대해 추정된 Ct를 나타내는 y축 절편이다.
- 각 마커 유전자에 대해 표준 곡선의 선형 회귀 및 다음 방정식의 매개변수를 사용하여 PCR 증폭(E)의 효율성을 계산하며, 여기서 m 은 단계 8.7 및 단계 8.8에서 파생된 기울기입니다.
- 다음 방정식을 사용하여 백분율 효율성 측면에서 모든 프라이머를 검증합니다.
알림: 효율은 90%–110% 범위에 있어야 합니다.
- 다음 공식을 사용하여 DNA의 절대 복제 수를 계산합니다.
여기서 Ct (단계 8.8)는 사이클 임계값, b 는 절편(단계 8.8), m 은 기울기(단계 8.8), E 는 PCR 증폭의 효율(단계 8.9)입니다.
중요: q-PCR에 의한 두 개 이상의 표적 증폭을 비교할 때, 절대 DNA 복제 수를 비교하기 위해 각 표적에 대해 PCR 효율을 계산해야 합니다. - 본 연구에서는 16S rRNA, proC, rpoD 유전자를 일반 내부 대조군으로 사용하였고, gyrB를 유도 대조군으로 사용하였다33,34,35.
참고: RNA seq 데이터에서 내부 대조군을 선택할 때 테스트한 조건에 대한 발현 수준이 변하지 않는 내부 대조군을 선택하는 것이 가장 좋습니다. 적절한 통제에 대한 신중한 고려는 결과의 의미 있는 해석을 위해 항상 중요합니다.
Representative Results
이 연구에서는 비유도 조건에서 성장한 PAO1 LESΦ2 라이소겐 배양에서 파지 생산의 직접적인 시간적 열거를 사용하여 자발적인 LESΦ2 유도의 영향을 확인했습니다. 파지 밀도는 성장의 초기 기하급수적 단계에서 신선한 배지에서 하위 배양 후 ~2.61 x 106 플라크 형성 단위(PFU)·mL−1 2시간의 평균으로 가장 낮은 지점에 있었으며, 이는 라이소겐이 지배적인 상태임을 시사합니다. LESΦ2 역가는 4시간 이내에 평균 ~2.4 x 108 PFU·mL−1로 급격히 증가했으며 6시간 후 최고 밀도에 도달했습니다(평균 ~5.83 x 109 PFU·mL−1; 그림 4).
최소 자발적 유도는 라이소겐 성장의 초기 로그 단계(2시간 후)에서 관찰되었습니다. 그러나, 배양 배지에서 측정 가능한 파지의 존재는 다음을 포함한 많은 이전 사건의 결과였습니다: 단백질 헤드로의 핵산 패키징, 파지 입자로의 단백질 조립, 후기 파지 유전자, 중간 단계 파지 유전자 및 초기 조절 파지 유전자의 발현. 파지 관련 복제 이벤트가 발현되기 전에 감염된 세포를 포착하는 것이 중요했습니다. 따라서 90 min은 입회 전에 문화가 성장할 수 있도록 선택되었습니다. PAO1의 유전자 발현 프로파일을 캡처하기 위해 배양물에서 LESΦ2 라이소겐 샘플을 3.4단계에서 언급한 대로 90분 동안 유도 전 및 유도 후에 수확했습니다. 이 90분 시점은 2.3.2단계의 플라크 분석에서 상주 프로파지의 높은 수준의 자발적 유도가 감지되기 훨씬 전입니다. 초기 기하급수적 성장 동안 박테리아 세포 밀도가 낮았기 때문에 유전자 발현 연구를 위한 충분한 물질을 보장하기 위해 배양 부피를 최대 800mL까지 확장했습니다. 샘플은 10분마다 유도되지 않은 배양 및 유도 배양에서 수집되었으며, RNA를 추출하여 박테리아 성장 중 용해 및 용해 복제에 대한 주요 마커의 발현 프로파일을 매핑했습니다. 총 RNA를 정제하고 16S rRNA 유전자를 표적으로 하는 qPCR 분석을 사용하여 게놈 DNA가 없는지 검증했습니다(단계 6.1). RIN ≥ 9에 도달한 샘플은 품질 관리를 통과하여 cDNA로 변환되었습니다.
주석이 달린 LESΦ2 게놈을 검사하여 온대 파지의 용원 및 용해 복제 주기에서 잘 알려진 유전자를 식별했습니다. 그런 다음 이러한 식별된 유전자를 사용하여 유도 및 비유도 배양에서 라이소겐 주기 제한 및 용해 주기 관련 유전자의 발현 프로파일링을 위한 qRT-PCR을 검증했습니다. 절대 DNA 복제 수를 정량화하고 R36을 사용하여 Wilcoxon 부호 순위 테스트를 수행하여 유도되지 않은 배양과 유도된 배양의 발현 수준을 비교했습니다(그림 5). 유도되지 않은 배양에서 ~2.31 x 109 카피에서 유도 후 30분 후 ~3.02 x 1011 카피로 cro 유전자(용해 복제의 초기 마커)의 발현이 현저하게 증가하였다(Wilcoxon 부호 순위 테스트: p < 0.01). 유사하게, 용해 복제의 중간 단계 마커 인 O 단백질과 P 단백질은 (그리고 파지 게놈 복제에 관여 할 것으로 예측되는) ~ 1.74 x 108에서 ~ 1.25 x 10 10 사본 (Wilcoxon 부호 순위 검정 : p < 0.01) 및 ~ 6.05 x 102에서 ~ 5.68 x10 5 사본 (Wilcoxon 부호 순위 테스트 : p < 0.01)입니다. 마지막으로, 꼬리 관련 구조 유전자는 용해 복제 주기의 후기 마커로 사용되었습니다. 다시 말하지만, 유도되지 않은 배양에서 ~2.31 x 106 카피에서 유도 후 30분 후 ~4.38 x 108 카피로 발현이 크게 증가하는 것을 관찰했습니다(Wilcoxon 부호 순위 테스트: p < 0.01). 따라서, 정량적 RT-PCR 데이터는 용해 복제를 위한 잘 확립된 마커 유전자의 유전자 발현이 예상된 경향을 따랐음을 확인했으며, 초기, 중기 및 후기 마커는 예측된 순서로 다중 배의 차등 발현을 보였습니다(그림 5). 용해 복제에 대한 마커의 발현이 회복 후 30분 후에 상향 조절되었기 때문에, 이는 용해 주기 동안 활성 온대 파지와 박테리아 숙주의 전사체 지형을 연구하기 위한 적절한 대표 시점으로 간주됩니다.
유도되지 않은 조건에서 용해 유전자의 일부 발현을 관찰하여 초기 로그 단계에서 방출된 PFU에 대한 CFU의 비율이 가장 높은 최적화된 배양에서도 일부 자발적 유도가 항상 발생한다는 것을 확인했습니다. 이는 전사체학 데이터에는 항상 일정 수준의 "노이즈"가 존재한다는 것을 의미하며, 이는 유도 및 비유도 배양을 포함하여 신중하게 준비된 대조군의 중요성을 강화합니다. 발현의 접힘 변화를 결정하기 위한 내부 대조군 유전자의 적절한 선택은 유도되지 않은 샘플과 유도된 샘플 모두에서 동일한 수준으로 발현되는 유전자를 식별하기 위해 전사체학 데이터를 주의 깊게 검사하는 데 달려 있습니다. 우리의 예비 결과는 rpoD가 테스트된 가장 신뢰할 수 있는 대조 유전자였으며 가장 안정적인 발현을 가졌음을 시사합니다(~1.71 x 10 유도 전 5개 사본 및 유도 후 30분 후 ~3.33 x 105개 복제; Wilcoxon 부호 순위 검정: p = 0.3594)와 16S rRNA 또는 proC 유전자 비교(그림 5). 내부 통제 표현의 가변성은 성적표의 절대 수를 측정하도록 이끌었습니다. 전사체학 데이터의 향후 검사는 추가 검증을 위한 적절한 내부 통제의 선택에 도움이 될 것입니다.
cI 유전자는 용원성(lysogeny)의 잘 알려진 표지자이기 때문에 유전자 프로파일링 연습에 사용되었습니다. 용해 복제에 대한 마커와 비교하여, cI 유전자의 발현은 비교적 안정적이었지만(그림 5), 이 유전자의 복제 수는 용해 복제에 대한 마커의 복제에 비해 유도되지 않은 배양에서 안심할 수 있을 정도로 높았습니다. 이러한 데이터는 동일한 샘플에서 낮은 PFU 수치와 일치하므로 높은 억제제 발현이 낮은 수준의 파지 생산과 관련이 있음을 확인합니다. 여기에 보고된 데이터는 이 특정 파지에 대한 cI 전사체의 발현이 Stx 파지(11,17)에서 볼 수 있듯이 유도 후 현저하게 하향 조절되지 않음을 보여줍니다. repressor 활성은 일반적으로 transcriptional 및 post-translational 수준 모두에서 제어되므로 repressor 유전자는 전사될 수 있지만 결과 단백질은 즉시 autocleavage를 받습니다. 전사 및 번역 후 대조군을 검증하기 위해 추가 실험이 필요합니다. 또한, 표준 곡선에서 qPCR의 최소 검출 한계는 ~102 사본으로 보입니다.
플라크 및 qRT-PCR 분석에서 얻은 결과는 RNA-Seq 실험을 위한 잘 제어된 입력을 생성하기 위한 배양 및 RNA 시료 전처리에 대한 당사의 전략을 검증합니다. 초기 지수 단계의 유도되지 않은 배양은 낮은 수준의 자발적 유도 및 용해 유전자 발현을 보였으며, 이는 lysogeny의 우세를 시사합니다. 대조적으로, 유도 후 30분 후에 분리한 배양물은 용해 복제의 우세를 나타내는 마커 유전자의 발현이 현저하게 증가한 것으로 나타났습니다.
그림 1: 리팜피신 내성 지표 호스트를 만들기 위한 프로토콜(BioRender.com 로 생성됨). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 동일한 샘플에서 라이소겐의 PFU 및 CFU를 열거하기 위한 실험 설계. (BioRender.com 로 생성) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: RNA 분리를 위한 유도 및 비유도 배양 샘플링을 위한 실험 설계. (BioRender.com 로 생성) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 자발적 유도의 시간적 열거. PAO1 Φ2 라이소겐의 PFU와 동시 CFU, n = 8(2개의 생물학적 복제 및 4개의 기술적 복제)을 사용한 자발적 LES 프로파지 생산의 시간적 계수; 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 짙은 빨간색 점은 CFU·mL−1 (LB)을 나타냅니다. 짙은 파란색 점은 PFU·mL−1 (LB)을 나타냅니다. 라이소겐에 의한 φ2 감염성 파지의 자연 방출은 접종 후 2시간에 측정 가능한 가장 낮은 수준입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 표적 마커 유전자의 절대 복제 수. 파지 마커 유전자의 절대 복제 수는 RT-qPCR을 사용하여 유도된 용원 및 용해 주기에서 중요한 역할을 할 것으로 예상되는 유전자의 예측된 발현 패턴을 확인합니다. 이 점들은 세 개의 생물학적 복제와 세 개의 기술적 반복실험(n = 9)을 모두 나타냅니다. (ᅡ) 빨간색 상자는 lysogeny 마커 cI를 나타냅니다. (B) 녹색은 초기 용해 마커인 cro를 나타냅니다. (C,D) 파란색은 중간 용해 마커, DNA 복제 유전자를 나타냅니다. (E) 자홍색은 후기 용해 마커, 꼬리 구조 유전자를 나타냅니다. (F-H) 회색은 내부 대조군으로 사용된 숙주 마커를 나타내고, (I) 흰색은 유도 대조군으로 사용된 DNA 자이라제 B를 나타냅니다. 수평 실선은 분포의 중위수를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 이 연구에서 설계된 프라이머. 이 연구에 사용된 마커 유전자 및 내부 대조군에 대한 특정 프라이머의 염기서열이 해당 NCBI 가입 ID와 함께 제공됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: qPCR 표준 곡선을 사용하여 계산된 이 연구에 사용된 프라이머의 효율. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
E. coli MC106137,38,39로부터 Stx 파지의 자발적 유도를 보다 정확하게 정량화하기 위해 이전에 플라크 분석에서 사용되었던 선택 가능한 지표 호스트의 생성이 녹농균 파지 LESΦ2에 대해 여기에 설명되어 있습니다. 이 개입은 시료 처리 단계와 시간을 줄여 여러 배양 조건에서 자발적 유도 속도를 동시에 평가할 수 있다는 추가적인 이점이 있습니다. 리팜피신-내성 변이체(40)의 생성 동안에 다른 돌연변이를 발생시킬 위험이 있다; 그러나 이 연구에서 진화된 균주는 관심 배양에서 플라크를 열거하기 위한 지표 숙주로만 사용되었으며 전사체 분석에는 포함되지 않았습니다. 선택 가능한 지표 균주가 관심 파지에 의한 감염에 동등하게 취약한 상태로 유지되는 한, 다른 후천성 돌연변이에 대한 우려는 없습니다. 그럼에도 불구하고, PAO1WT 및 PAO1RIF의 펄스장 겔 전기영동(PFGE) 분석에 의해 제한 단편 길이 다형성 프로파일의 차이가 검출되지 않았다(데이터 미도시).
숙주 세포를 선택할 때, 이미 프로파지를 가지고 있지 않은 지표 균주를 찾는 것은 드뭅니다. 예를 들어, PAO1은 사상체 프로파지 Pf4를 보유하고 있습니다. 이 연구의 실험 대조군은 특정 파지(이 경우 LES 프로파지 2)의 유전자 발현과 이 파지가 박테리아 유전자 발현에 미치는 영향을 직접 검사할 수 있도록 설계되었습니다. LES 프로파지 2를 운반하는 PAO1과 LES 프로파지 2가 결핍된 전사체(라이소겐과 비라이소겐 모두 내인성 Pf4를 운반함)의 전사체를 비교한 결과, 이는 숙주에 대한 Pf4의 영향을 배제하기 위한 내부 대조군 역할을 합니다. 추가적으로, Pf4는 통상적으로 숙주 세포(41 )에서 용해를 일으키지 않으며, 따라서 이들 실험의 결과를 교란시킬 수 없다는 것이 입증되었다.
의미 있는 오믹스 데이터를 생성하기 위한 시료 전처리에서 신중한 품질 관리가 중요하다는 것은 잘 알려져 있다42. 그러나, 앞서 기술한 바와 같이,11, 이러한 연구를 위한 리소겐 배양의 제조에서 프로파지 활성의 신중한 특성화는 거의 수행되지 않는다. 여기에서는 박테리아와 온대 파지 간의 상호 작용을 더 잘 탐구하기 위해 전사체 연구를 위해 잘 제어되고 최적화된 배양 세트를 준비하기 위한 체계적인 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 개체군의 동시성은 유도 항생제인 노르플록사신(norfloxacin)으로 치료하기 전에 배양을 최소 4배로 늘림으로써 제어되었습니다. 연구에서 균주에 대한 노르플록사신의 MIC를 결정함으로써 유도제의 농도가 "유도" 처리를 위한 MIC 바로 위에 있는지 확인할 수 있었습니다. 그런 다음 처리된 세포를 1:10으로 희석하여 1시간 처리 후 노르플록사신 농도를 MIC 이하로 낮추어 세포가 회복되고 파지 복제 과정을 완료하여 세포의 용해 및 감염성 파지 자손의 방출로 끝납니다. 세포는 회복 기간 동안 노르플록사신의 농도가 MIC 아래로 내려간 후에만 유도 자극 후 용해 복제 주기에 들어갑니다. 이 경우 PAO1에 대한 노르플록사신의 MIC가 0.19μg·mL-1이므로 1μg·mL-1 노르플록사신을 초과하면 약물을 MIC 이하로 효과적으로 희석할 수 없습니다. 유도제 희석 수준은 라이소겐 회수 필요성 및 RNA 수확을 위한 배양 밀도 유지와 균형을 이루어야 합니다. 여기에서 논의된 데이터는 배양을 동기화하여 lysogeny가 우세한 샘플을 생성함으로써 자발적 유도로 인한 노이즈를 줄이고 유전자 발현에서 진정한 lysogeny에 의한 변화를 검출할 수 있음을 보여줍니다. 박테리아 세포 밀도가 낮을 때 성장의 초기 기하급수적 단계에서 용원 상태가 우세하기 때문에 RNA-Seq와 같은 후속 유전자 발현 연구를 위해 충분한 RNA를 수확할 수 있도록 배양을 확대하는 것이 좋습니다.
배양을 용해 회로로 강제하기 위한 유도제로서 노르플록사신의 사용은 잘 보고되어 있다43,44; 그러나, 이것은 또한 과정에서의 다른 박테리아 유전자의 발현에 영향을 미칠 것이다(45,46). 이를 완화하기 위해 동일한 유도 및 비유도 조건에서 성장한 대조군 야생형 배양의 RNA 라이브러리를 RNA-Seq 실험에 포함해야 합니다. qRT-PCR에 의한 파지 복제 단계를 검증하기 위해 내부 대조군 및 주요 마커 유전자를 사용하는 것도 정확한 비교를 위해 중요합니다. 정량적 RT-PCR 프로파일링은 다양한 시점에서 각 유전자에 대한 전사체의 절대 수를 비교하여 해석할 수 없습니다. 중요한 것은 프로파일의 모양입니다. 첫째, 어떤 유전자에 대한 전사체의 작은 영역 하나만 샘플링되었기 때문에, 그것이 수명이 짧은 요소인지 아니면 수명이 긴 요소인지는 알 수 없다27. 확실히, 전사체의 RNA-Seq 매핑은 매핑 데이터의 밀도가 유전자의 길이에 따라 크게 변한다는 것을 보여줍니다. 둘째, 용해 주기 또는 용원 생활 방식과 관련된 마커 유전자에 대해 해석되어야 하거나 심지어 파지 조절 회로(11)로부터 분리되어야 하는 것은 유전자 발현 프로파일의 모양이다. 자발적 유도는 라이소겐 배양에서 실질적인 문제이며 항상 용해 주기 관련 유전자의 발현을 초래합니다. 그러나, 프로파일링은 용해 복제 주기와 관련된 유전자가 발현 전 유도(최소 2개의 로그 폴드) 및 상향 조절된 유도 후에서 억제됨을 보여줍니다.
이전에 수행된 Stx 파지와 대장균의 상호작용에 대한 전사체 분석은 용해를 유지하고 용해 회로를 유발하는 데 관여하는 파지 유전자에 대한 철저한 이해를 뒷받침한다11,17. 현재 녹농균(P. aeruginosa)의 LES 파지에는 주석이 달렸지만, 주요 유전자 기능은 잘 알려져 있지 않습니다. 전사체 연구는 LES 프로파지의 재주석을 가능하게 하고 용해 및 용해 주기에 관여하는 유전자에 대한 이해를 향상시킬 것입니다. 유전자 염기서열을 기능에 연결하는 것은 새로운 프로파지 연구에서 중요한 도전이며, 이는 더 나은 주석 도구의 생산을 위해 파지 유전자 기능을 확인하기 위한 더 많은 연구의 필요성을 더욱 강조한다47. 이 비디오 기사에 자세히 설명된 프로토콜과 추가 품질 관리 조치의 광범위한 적용 및 적응은 다양한 프로파지 기능을 밝히고 주석 파이프라인을 개선하고 파지 및 박테리아 생물학에 대한 이해를 변화시키는 데 도움이 될 수 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PAO1 | 6 | ||
| LESB58 | 6 | ||
| LES phages | Induced and purified from LESB58 using Norfloxacin. | This study | |
| Lysogeny Broth (LB) | Merck | 1.10285.500 | |
| LB Agar | Merck | 1.10283.500 | |
| Agar Agar | Fisher | A/1080/53 | |
| Top Agar | 0.4 g Agar Agar+2.5 g LB Broth in 100 mL water; autoclave and use. | - | |
| Rifampicin | Sigma (Stock: 50 mg/mL in Methanol- Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use) | R3501 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher 1% (v/v) in water | 10060000 | |
| Norfloxacin | Sigma (Stock: 25 mg/mL of 1% Glacial Acetic Acid-Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use;To avoid freeze thaw cycles, store as small aliquotes) | N9890 | |
| Phenol saturated with citrate buffer pH 4.3 | Sigma | P-4682 | |
| Molecular Biology grade Ethanol | Fisher | 16695992 | |
| TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
| Chloroform | Fisher | 11398187 | |
| Isopropanol | Fisher | 17150576 | |
| Nuclease-free H2O | Invitrogen | 10526945 | |
| 10X TURBO DNase | Ambion | AM1907 | |
| Qubit RNA HS, BR Kit | Invitrogen | Q10210 | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
| SuperScriptIII first strand synthesis kit | Invitrogen | 18080051 | |
| PCR Reagents | Bioline Mytaq Red 2X | BIO-25043 | |
| qPCR Reagents | Sensifast SYBR Hi Rox | BIO-92020 | |
| PCR purification kit | Isolate II PCR and Gel Kit | BIO-52060 | |
| TA cloning kit | TA Cloning Kit, with pCR 2.1 Vector, without competent cells | K202040 | |
| StepOne Real Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4376600 |
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