Dieses Protokoll ermöglicht es, die Auswirkungen von Prophagen auf ihre Wirte aufzudecken. Die Bakterienkulturen werden unter Bedingungen synchronisiert, die den lysogenen Zustand am besten unterstützen und die spontane Induktion begrenzen. Die RT-qPCR unterscheidet eindeutig zwischen Prophagen-restriktiven Genen und solchen, die von der Phagenkontrolle abgekoppelt sind, von solchen, die während des lytischen Replikationszyklus exprimiert werden.
Phagen der gemäßigten Breiten sind als Prophagen in die meisten bakteriellen Genome integriert. Einige Prophagen sind kryptisch und im bakteriellen Chromosom fixiert, andere sind jedoch aktiv und können entweder spontan oder durch die Exposition gegenüber induzierenden Faktoren in eine replikative Form getriggert werden. Prophagen werden häufig mit der Fähigkeit in Verbindung gebracht, ihrer Wirtszelle Toxinproduktion oder andere virulenzassoziierte Eigenschaften zu verleihen. Neuere Studien haben gezeigt, dass sie eine viel größere Rolle bei der Veränderung der Physiologie ihrer Wirte spielen können. Mit der hier beschriebenen Technik konnten wir untersuchen, wie Prophagen die Genexpression im opportunistischen Bakterium Pseudomonas aeruginosa beeinflussen.
In dieser Arbeit wurde das Wachstum des Wildtyp-P. aeruginosa-Stammes PAO1 mit dem von isogenen Lysogenen verglichen, die verschiedene Kombinationen von Prophagen aus dem Liverpool Epidemic (LES) LESB58 tragen. In einer Lysogenkultur unterstützt ein Teil der Bakterienzellen die lytische Bakteriophagenreplikation (spontane Induktion) mit einer hohen Expression von späten Phagengenen pro Zelle, wie sie mit der Assemblierung von Phagenpartikeln verbunden sind, und maskiert so die mit der Lysogen-eingeschränkten Genexpression verbundene Genexpression auf niedrigem Niveau. Die Auswirkungen der spontanen Induktion können daher die Expression von Prophagen-Genen in einer Lysogenpopulation verschleiern.
Wachstumsprofiling-Experimente wurden verwendet, um eine spontane Induktion zu identifizieren, die während der frühen exponentiellen Wachstumsphase minimal war. In dieser Studie wird berichtet, wie Probenkulturen während der frühen exponentiellen Wachstumsphase präpariert werden können und wie trotz geringer Zellzahlen adäquate Kontrollen eingerichtet werden können. Diese Protokolle gewährleisten den zuverlässigen und reproduzierbaren Vergleich von Wildtyp- und lysogenen Bakterien unter verschiedenen Bedingungen, wodurch das transkriptomische Profiling von Prophagengenomen verbessert und die Identifizierung bisher unbekannter Prophagenfunktionen unterstützt wird.
In jüngster Zeit haben die Phagentherapie zur Bekämpfung der antimikrobiellen Resistenz1 und die CRISPR-Cas-basierte Geneditierung2 das Interesse an der Bakteriophagenforschung wieder geweckt. Auch hier haben Fortschritte in der Biotechnologie eine tiefere Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Bakterien und Phagen ermöglicht3. Der therapeutische Einsatz von Phagen (“Phagentherapie”) wird jedoch durch Bedenken behindert, dass Phagen als mobile genetische Elemente fungieren und in der Lage sind, Virulenz- und Resistenzgene horizontal zu übertragen4. Die Ausdehnung der “Dunklen Materie“5 (Gene mit unbekannten Funktionen) ist sowohl beunruhigend als auch verlockend. Dunkle Materie gilt als eine Lücke in unserem Verständnis der Phagenbiologie und als weitgehend ungenutzte Ressource für molekulare Werkzeuge und potenzielle neuartige Therapeutika6. Die Entwicklung von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechniken, zusammen mit verbesserter Genannotation 7,8,9 und neuen Peptidfaltungsalgorithmen10, verbessert die Detektion, Beschreibung und funktionelle Vorhersage von Phagengenen. Die Wissenschaft ist jedoch noch weit davon entfernt, die Genfunktionen der meisten Phagen in Kultur oder in der realen Welt zu validieren.
Die RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) kann die Genexpression während einer Phageninfektion global abbilden und hat das Verständnis sowohl der Phagen- als auch der bakteriellen Elemente, die an lytischen und lysogenen Zyklen beteiligt sind, erheblich verbessert11,12. Während lysogener Prozesse werden gemäßigte Phagengenome in bakterielle DNA integriert, um zu Prophagen zu werden13. Globale Genexpressions-Profiling-Experimente können verwendet werden, um Prophagen-restriktive Gene zu identifizieren, die auf gemäßigten Phagengenomen kodiert, aber nur während des lysogenen Zustands exprimiert werden11. Solche Gene kodieren keine Phagen-Strukturproteine und sind nicht an Phageninfektionsprozessen beteiligt. RNA-Seq kann verwendet werden, um diejenigen Gene zu identifizieren, die mit größerer Wahrscheinlichkeit die Biologie des bakteriellen Wirts beeinflussen, entweder indem sie einen Funktionsgewinn induzieren oder die vorhandenen bakteriellen Gene regulieren, wodurch sich die Bakterien oft an veränderte Umgebungen anpassen können. Daher konnte die Fähigkeit von Prophagen untersucht werden, als mikrobielle Puppenspieler zu fungieren, die eine Reihe von bakteriellen Funktionen steuern.
Es gibt zwei Haupthindernisse für die effektive Analyse der Prophagen-restriktiven Genexpression. Erstens ist die Verfügbarkeit von anfälligen Wirten ein zentrales Thema. Per Definition sind Prophagen bereits in ihr spezifisches Wirtsgenom eingebaut, so dass es schwierig ist, einen empfänglichen Wildtyp-Wirt zu finden, um die globale Genexpression in An- und Abwesenheit des Prophagen zu vergleichen. Dies kann entweder durch die De-novo-Infektion eines anderen empfänglichen Wirts oder durch die Deletion des Prophagen aus dem ursprünglichen Wildtyp-Isolat erreicht werden, ohne den Rest des Wirtsgenoms zu stören. Das zweite Hindernis liegt in der heterogenen Natur der lysogenen Populationen. Einige Prophagen werden durch Mutation oder Rekombination abgebaut, um “kryptisch” zu werden, was bedeutet, dass sie an einer bestimmten Stelle des bakteriellen Genoms fixiert sind. Andere Prophagen sind jedoch “aktiv” und können spontan oder nach Exposition gegenüber induzierenden Faktoren in einen replikativen, lytischen Zyklus induziert werden. In vielen lysogenen Kulturen führt die Geschwindigkeit der spontanen Induktion dazu, dass ein Teil der Bakterienzellen immer eine lytische Phagenreplikation durchläuft14,15,16. Eine hohe Expression von späten Phagengenen in diesen Populationen maskiert die niedrige Genexpression, die mit der Lysogen-restriktiven Genexpression assoziiert ist11,17. Der Anteil der Lysogene, die eine spontane Prophageninduktion durchlaufen, kann mit dem Wachstumszustand, den Wachstumsbedingungen oder anderen Auslösern variieren. Um die Auswirkungen von Prophagen auf das Lysogen zu untersuchen, müssen daher spontane Prophageninduktionsereignisse so weit wie möglich minimiert werden, indem die Wachstumsbedingungen optimiert werden, um den lysogenen Zustand zu begünstigen.
Diese Studie berichtet über die Vorarbeiten, die durchgeführt wurden, um den Einfluss einer Reihe von kohabitierenden Prophagen aus dem Liverpool Epidemic Strain (LES) von Pseudomonas aeruginosa zu untersuchen. Aktive Prophagen wurden induziert und aus LES isoliert und zur Infektion des Modell-P. aeruginosa-Wirtsstamms, PAO116,18,19, verwendet. Die gesamten Genome des Wildtyp-P. aeruginosa-Stammes, PAO1, und seines Lysogens, PAO1Φ2, wurden sequenziert (in einer Tiefe von 30-facher Abdeckung), um die Identität des Wildtyp-Stammes sicherzustellen und zu bestätigen, dass das Lysogen isogen ist. Der LES wurde mit einer erhöhten Morbidität und Mortalität bei Mukoviszidose-Patienten in Verbindung gebracht, und es wurde vermutet, dass LES-Phagen 19 die Anpassung an die Mukoviszidose-Lungenumgebung unterstützen16,19,20. Trotz starker Hinweise darauf, dass diese Prophagen die Biologie ihres Wirts beeinflussen20,21, müssen die meisten ihrer Genfunktionen noch charakterisiert werden, und die spezifischen Mechanismen der Interaktion sind nur unzureichend verstanden. Ein Transkriptomik-Ansatz kann die Funktionen des Prophagen-Gens in einem kontrollierten Wirtshintergrund empirisch aufdecken. Da die spontane Induktion die Expressionsprofile beeinflussen kann, wird in diesem Artikel beschrieben, wie die Wachstumsbedingungen optimiert werden können, um den lysogenen Zustand zu begünstigen. Eine solche Synchronisierung von Kulturen kann durch Real-Time-PCR validiert werden, um die Expressionsniveaus wichtiger genetischer Marker zu quantifizieren, die mit entscheidenden Stadien der LES-Phagenreplikation in PAO1 assoziiert sind. Derselbe Ansatz wurde bereits verwendet, um die prophageneingeschränkten Funktionen von Shiga-toxigenen Phagen zu identifizieren, die die Motilität, Säureresistenz und antimikrobielle Resistenz in Escherichia coli11,17,21,22 beeinflussen.
Die Schaffung eines selektierbaren Indikatorwirts, der zuvor in Plaque-Assays verwendet wurde, um die spontane Induktion von Stx-Phagen aus E. coli MC106137,38,39 genauer zu quantifizieren, wurde hier für den P. aeruginosa-Phagen LESΦ2 beschrieben. Diese Intervention hat den zusätzlichen Vorteil, dass die Probenverarbeitungsschritte und die Probenzeit reduziert werden, wodurch die gleichzeitige Bewertung der spontanen Induktionsraten unter mehreren Kulturbedingungen ermöglicht wird. Es besteht die Gefahr, dass bei der Bildung von Rifampicin-resistenten Varianten weitere Mutationen entstehen40; In dieser Arbeit wurde der entwickelte Stamm jedoch nur als Indikatorwirt für die Zählung von Plaques aus interessierenden Kulturen verwendet und nicht in die transkriptomische Analyse einbezogen. Solange der selektierbare Indikatorstamm gleichermaßen anfällig für eine Infektion durch den interessierenden Phagen bleibt, gibt es keine Bedenken hinsichtlich anderer erworbener Mutationen. Nichtsdestotrotz wurden bei der Pulsfeld-Gelelektrophorese-Analyse (PFGE) von PAO1WT und PAO1RIF keine Unterschiede in den Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismusprofilen festgestellt (Daten nicht gezeigt).
Bei der Auswahl der Wirtszellen ist es selten, einen Indikatorstamm zu finden, der nicht bereits Prophagen beherbergt. Ein typisches Beispiel dafür ist PAO1, das den filamentösen Prophagen Pf4 beherbergt. Die experimentellen Kontrollen für diese Studie wurden so konzipiert, dass sie die Genexpression bestimmter Phagen (in diesem Fall LES Prophage 2) und die Auswirkungen dieses Phagen auf die bakterielle Genexpression direkt untersuchen können. Im Vergleich von Transkripten von PAO1, die den LES Prophage 2 tragen und denen der LES Prophage 2 fehlt (sowohl Lysogen als auch Nicht-Lysogen tragen das endogene Pf4), die als interne Kontrollen dienen, um den Einfluss von Pf4 auf den Wirt auszuschließen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Pf4 normalerweise keine Lyse in seiner Wirtszelle41 verursacht und daher nicht in der Lage ist, die Ergebnisse dieser Experimente zu verfälschen.
Es ist allgemein bekannt, dass eine sorgfältige Qualitätskontrolle bei der Probenvorbereitung entscheidend ist, um aussagekräftige Omics-Daten zu erzeugen42. Wie bereits11 beschrieben, wird die sorgfältige Charakterisierung der Prophagenaktivität bei der Herstellung von Lysogenkulturen für solche Studien jedoch nur selten durchgeführt. Hier beschreiben wir unsere systematischen Protokolle zur Vorbereitung eines gut kontrollierten und optimierten Satzes von Kulturen für transkriptomische Studien, um die Wechselwirkungen zwischen Bakterien und gemäßigten Phagen besser zu untersuchen. Die Synchronizität der Population wurde kontrolliert, indem die Kultur durch mindestens vier Verdopplungen gebracht wurde, bevor sie mit dem induzierenden Antibiotikum Norfloxacin behandelt wurde. Durch die Bestimmung des MHK von Norfloxacin für den Stamm in der Studie konnten wir sicherstellen, dass die Konzentration des auslösenden Mittels knapp über dem MHK für die “Induktions”-Behandlung lag. Die behandelten Zellen wurden dann um 1:10 verdünnt, um die Norfloxacinkonzentration nach der 1-stündigen Behandlung unter das MHK zu senken, damit sich die Zellen erholen und den Phagenreplikationsprozess abschließen konnten, der mit der Lyse der Zelle und der Freisetzung infektiöser Phagennachkommen endete. Die Zellen treten nach dem Induktionsreiz erst dann in den lytischen Replikationszyklus ein, wenn die Konzentration von Norfloxacin während der Erholungsphase unter den MHK gesenkt wurde. In diesem Fall bedeutet ein Überschreiten von 1 μg·ml−1 Norfloxacin, dass das Arzneimittel unterhalb des MHK nicht wirksam verdünnt werden kann, da das MHK für Norfloxacin für PAO1 0,19 μg·mL−1 beträgt. Der Grad der Induktorverdünnung muss mit der Notwendigkeit der Lysogenrückgewinnung und der Beibehaltung der Kulturdichte für die RNA-Ernte in Einklang gebracht werden. Die hier diskutierten Daten zeigen, dass es möglich ist, Kulturen zu synchronisieren, um Proben zu erzeugen, in denen die Lysogenese dominiert, wodurch das Rauschen der spontanen Induktion reduziert und der Nachweis echter lysogenesebedingter Veränderungen in der Genexpression ermöglicht wird. Da der lysogene Zustand in der frühen exponentiellen Phase des Wachstums vorherrscht, wenn die bakterielle Zelldichte gering ist, schlagen wir vor, die Kulturen zu skalieren, um genügend RNA für nachfolgende Genexpressionsstudien wie RNA-Seq zu ernten.
Die Verwendung von Norfloxacin als Induktionsmittel, um Kulturen in den lytischen Zyklus zu zwingen, ist gut berichtet43,44; Dies wirkt sich jedoch auch auf die Expression anderer bakterieller Gene aus45,46. Um dies zu mildern, sollten RNA-Bibliotheken aus Kontroll-Wildtyp-Kulturen, die unter den gleichen induzierenden und nicht-induzierenden Bedingungen gezüchtet wurden, in RNA-Seq-Experimente einbezogen werden. Die Verwendung interner Kontrollen und wichtiger Markergene zur Validierung der Stadien der Phagenreplikation mittels qRT-PCR ist ebenfalls entscheidend für genaue Vergleiche. Quantitatives RT-PCR-Profiling kann nicht interpretiert werden, indem die absolute Anzahl der Transkripte für jedes Gen zu verschiedenen Zeitpunkten verglichen wird. Auf die Form des Profils kommt es an. Erstens wurde nur eine kleine Region im Transkript für ein Gen beprobt, so dass unbekannt ist, ob es sich um ein kurzlebiges oder längerlebiges Element handelt27. Sicherlich zeigt die RNA-Seq-Kartierung von Transkripten, dass die Dichte der Mapping-Daten über die Länge eines Gens signifikant variiert. Zweitens ist es die Form des Genexpressionsprofils, die für ein Markergen interpretiert werden sollte, das mit dem lytischen Zyklus oder der lysogenen Lebensweise assoziiert oder sogar von den Phagen-Regelkreisen entkoppelt ist11. Spontane Induktion ist ein echtes Problem in der Lysogenkultur und führt immer zur Expression von Genen, die mit dem lytischen Zyklus assoziiert sind. Das Profiling zeigt jedoch, dass die Gene, die mit dem lytischen Replikationszyklus assoziiert sind, in ihrer Expression vor der Induktion (mindestens zwei logarithmische Faltungen) unterdrückt und nach der Induktion hochreguliert sind.
Die zuvor durchgeführten transkriptomischen Analysen von Stx-Phageninteraktionen mit E. coli unterstützen ein gründliches Verständnis der Phagengene, die an der Aufrechterhaltung der Lysogenese und der Auslösung des lytischen Zyklus beteiligt sind11,17. Derzeit sind die LES-Phagen von P. aeruginosa annotiert, aber ihre wichtigsten Genfunktionen sind weniger gut verstanden. Transkriptomische Studien werden die Re-Annotation der LES-Prophagen ermöglichen und unser Verständnis der Gene verbessern, die an der Lysogenese und dem lytischen Zyklus beteiligt sind. Die Verknüpfung von Gensequenz und Funktion stellt eine große Herausforderung bei der Untersuchung neuartiger Prophagen dar, was die Notwendigkeit weiterer Studien zur Bestätigung der Phagengenfunktionen für die Herstellung besserer Annotationswerkzeuge unterstreicht47. Die breitere Anwendung und Anpassung der Protokolle und zusätzlichen Qualitätskontrollmaßnahmen, die in diesem Videoartikel beschrieben werden, könnte dazu beitragen, verschiedene Prophagenfunktionen zu enthüllen und damit die Annotationspipelines zu verbessern und unser Verständnis der Phagen- und Bakterienbiologie zu verändern.
PAO1 | 6 | ||
LESB58 | 6 | ||
LES phages | Induced and purified from LESB58 using Norfloxacin. | This study | |
Lysogeny Broth (LB) | Merck | 1.10285.500 | |
LB Agar | Merck | 1.10283.500 | |
Agar Agar | Fisher | A/1080/53 | |
Top Agar | 0.4 g Agar Agar+2.5 g LB Broth in 100 mL water; autoclave and use. | – | |
Rifampicin | Sigma (Stock: 50 mg/mL in Methanol- Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use) | R3501 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher 1% (v/v) in water | 10060000 | |
Norfloxacin | Sigma (Stock: 25 mg/mL of 1% Glacial Acetic Acid-Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use;To avoid freeze thaw cycles, store as small aliquotes) | N9890 | |
Phenol saturated with citrate buffer pH 4.3 | Sigma | P-4682 | |
Molecular Biology grade Ethanol | Fisher | 16695992 | |
TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
Chloroform | Fisher | 11398187 | |
Isopropanol | Fisher | 17150576 | |
Nuclease-free H2O | Invitrogen | 10526945 | |
10X TURBO DNase | Ambion | AM1907 | |
Qubit RNA HS, BR Kit | Invitrogen | Q10210 | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
SuperScriptIII first strand synthesis kit | Invitrogen | 18080051 | |
PCR Reagents | Bioline Mytaq Red 2X | BIO-25043 | |
qPCR Reagents | Sensifast SYBR Hi Rox | BIO-92020 | |
PCR purification kit | Isolate II PCR and Gel Kit | BIO-52060 | |
TA cloning kit | TA Cloning Kit, with pCR 2.1 Vector, without competent cells | K202040 | |
StepOne Real Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4376600 |