Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Forstå virkningen av tempererte bakteriofager på deres lysogener gjennom transkriptomikk

Published: January 5, 2024 doi: 10.3791/64945
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1, 2, 1
1Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, Institute of Infection, Veterinary and Ecological Sciences (IVES), University of Liverpool, 2School of Science, Engineering, and Environment, University of Salford

Summary

Denne protokollen gjør det mulig å avsløre virkningen av profager på vertene. Bakteriekulturer synkroniseres ved hjelp av forhold som best støtter den lysogene tilstanden, og begrenser spontan induksjon. RT-qPCR skiller utvetydig profagbegrensede gener og de som ikke er koblet fra fagkontroll fra de som uttrykkes under den lytiske replikasjonssyklusen.

Abstract

Tempererte fager finnes integrert som profager i de fleste bakteriegenomer. Noen profager er kryptiske og faste i bakteriekromosomet, men andre er aktive og kan utløses i en replikerende form enten spontant eller ved eksponering for induserende faktorer. Profager er ofte forbundet med evnen til å gi toksinproduksjon eller andre virulensassosierte egenskaper på vertscellen. Nyere studier har vist at de kan spille en mye større rolle i å endre fysiologien til vertene sine. Teknikken beskrevet her har gjort det mulig å undersøke hvordan profager påvirker genuttrykk i den opportunistiske bakterien Pseudomonas aeruginosa.

I dette arbeidet ble veksten av villtype P. aeruginosa-stammen PAO1 sammenlignet med veksten av isogene lysogener som bærer forskjellige kombinasjoner av profager fra Liverpool Epidemic Strain (LES) LESB58. I en lysogenkultur vil en andel bakterieceller støtte lytisk bakteriofagreplikasjon (spontan induksjon) med et høyt ekspresjonsnivå per celle av sene faggener, slik som de som er forbundet med samlingen av fagpartikler, og dermed maskere genuttrykket på lavt nivå assosiert med lysogenbegrenset genuttrykk. Virkningen av spontan induksjon kan dermed skjule profaggenuttrykk over en lysogenpopulasjon.

Vekstprofileringseksperimenter ble brukt for å identifisere spontan induksjon, som var minimal i den tidlige eksponentielle vekstfasen. Denne studien rapporterer hvordan man forbereder prøvekulturer i den tidlige eksponentielle vekstfasen og hvordan man setter opp tilstrekkelige kontroller til tross for lave celletall. Disse protokollene sikrer pålitelig og reproduserbar sammenligning av villtype og lysogene bakterier under forskjellige forhold, og forbedrer dermed transkriptomisk profilering av profaggenomer og hjelper til med identifisering av tidligere ukjente profagfunksjoner.

Introduction

Nylig har fagterapi for å takle antimikrobiell resistens1 og CRISPR-Cas-basert genredigering2 generert fornyet interesse for bakteriofagforskning. Igjen har fremskritt innen bioteknologi muliggjort dypere undersøkelse av samspillet mellom bakterier og fager3. Imidlertid hindres terapeutisk bruk av ("fagterapi") av bekymringer om fager som fungerer som mobile genetiske elementer med kapasitet til å overføre virulens- og resistensgener horisontalt4. Utbredelsen av "mørk materie"5 (gener med ukjente funksjoner) er både urovekkende og fristende. Mørk materie regnes som et gap i vår forståelse av fagbiologi og en stort sett uutnyttet ressurs for molekylære verktøy og potensiell ny terapi6. Utviklingen av sekvenseringsteknikker med høy gjennomstrømning, sammen med forbedret genannotasjon 7,8,9 og nye peptidfoldingsalgoritmer10, forbedrer deteksjon, beskrivelse og funksjonell prediksjon av faggener. Imidlertid er vitenskapen fortsatt langt fra å validere de fleste fagers genfunksjoner i kultur eller i den virkelige verden.

RNA-sekvensering (RNA-Seq) kan globalt kartlegge genuttrykk under faginfeksjon og har betydelig forbedret forståelsen av både- og bakterieelementene involvert i lytiske og lysogene sykluser11,12. Under lysogene prosesser blir tempererte faggenomer integrert i bakterielt DNA for å bli profager13. Globale genuttrykksprofileringseksperimenter kan brukes til å identifisere profagbegrensede gener som er kodet på tempererte faggenomer, men bare uttrykt under den lysogene tilstanden11. Slike gener koder ikke fagstrukturelle proteiner og er ikke involvert i noen faginfeksjonsprosesser. RNA-Seq kan brukes til å identifisere de gener som er mer sannsynlig å påvirke bakterievertens biologi, enten ved å indusere en gevinst av funksjon eller regulere de eksisterende bakterielle gener, og dermed ofte gjøre det mulig for bakteriene å tilpasse seg skiftende miljøer. Derfor kan profagens evne til å fungere som mikrobielle dukkemestere, som kontrollerer en rekke bakterielle funksjoner, studeres.

Det er to store barrierer for effektiv analyse av profagbegrenset genuttrykk. For det første er tilgjengeligheten av mottakelige verter et sentralt problem. Per definisjon er profager allerede innlemmet i deres spesifikke vertsgenom, så det er utfordrende å finne en mottakelig villtypevert for å sammenligne det globale genuttrykket i nærvær og fravær av profagen. Dette kan oppnås enten gjennom de novo-infeksjon av en annen mottakelig vert eller sletting av profagen fra det opprinnelige villtypeisolatet, uten å forstyrre resten av vertsgenomet. Den andre barrieren ligger i den heterogene naturen til lysogene populasjoner. Noen profager nedbrytes gjennom mutasjon eller rekombinasjon for å bli "kryptiske", noe som betyr at de er festet på et bestemt sted av bakteriegenomet. Imidlertid er andre profager "aktive" og kan induseres til en repliktiv, lytisk syklus spontant eller etter eksponering for induserende faktorer. I mange lysogene kulturer betyr frekvensen av spontan induksjon at en andel av bakteriecellene alltid gjennomgår lytisk fagreplikasjon14,15,16. Et høyt ekspresjonsnivå av senfaggener i disse populasjonene maskerer genuttrykket på lavt nivå assosiert med lysogenbegrenset genuttrykk11,17. Andelen lysogener som gjennomgår spontan profaginduksjon kan variere med veksttilstand, vekstbetingelser eller andre utløsere. Derfor, for å studere virkningen av profager på lysogenet, må spontane profaginduksjonshendelser minimeres så mye som mulig ved å optimalisere vekstforholdene for å favorisere den lysogene tilstanden.

Denne studien rapporterer det forberedende arbeidet som er gjort for å undersøke påvirkningen av et sett med samboende profager fra Liverpool Epidemic Strain (LES) av Pseudomonas aeruginosa. Aktive profager ble indusert og isolert fra LES og brukt til å infisere modellen P. aeruginosa vertsstamme, PAO116,18,19. Hele genomet av villtype P. aeruginosa-stammen, PAO1, og dens lysogen, PAO1Φ2, ble sekvensert (i en dybde på 30x dekning) for å sikre identiteten til villtypestammen og for å bekrefte at lysogenet var isogent. LES har vært assosiert med økt sykelighet og dødelighet hos pasienter med cystisk fibrose, og LES-fager 19 har blitt foreslått for å hjelpe tilpasning til cystisk fibrose lungemiljø16,19,20. Til tross for sterke bevis på at disse profagene påvirker biologien til verten20,21, er flertallet av deres genfunksjoner ennå ikke karakterisert, og de spesifikke mekanismene for interaksjon er dårlig forstått. En transkriptomisk tilnærming kan empirisk avdekke profaggenfunksjonene i en kontrollert vertsbakgrunn. Siden spontan induksjon kan påvirke ekspresjonsprofiler, beskriver denne artikkelen hvordan vekstbetingelsene kan optimaliseres for å favorisere den lysogene tilstanden. Slik synkronisering av kulturer kan valideres ved sanntids PCR for å kvantifisere ekspresjonsnivåene av viktige genetiske markører som er assosiert med viktige stadier av LES-fagreplikasjon i PAO1. Den samme tilnærmingen har blitt brukt tidligere for å identifisere de profagbegrensede funksjonene til Shiga-toksigene fager som påvirker motilitet, syreresistens og antimikrobiell resistens i Escherichia coli11,17,21,22.

Protocol

1. Opprett en valgbar indikatorvert (figur 1)

MERK: Fagkulturlysater kan inneholde forurensende celler fra den opprinnelige bakterielle verten. Å ha en antibiotikaresistent indikatorstamme tillater diskriminering mellom indikatorstammen og den opprinnelige bakterielle verten av profagen. Ved hjelp av en valgbar indikatorstamme muliggjøres nøyaktig oppregning av de infeksiøse fagpartiklene uten å kreve sentrifugering eller filtreringstrinn for å fjerne fagen fra lysogencellene etter fagforsterkningstrinnene. Den valgbare indikatorvertsstammen reduserer også tid og antall trinn for fagoppregning, slik at flere forhold kan prøves samtidig.

  1. Identifiser en egnet indikatorvertsstamme som er utsatt for lytisk og lysogen infeksjon av den tempererte fagen av interesse. P. aeruginosa lab-stammen PAO118,20 ble brukt og er utsatt for de tre LES-fagene (LESΦ2, LESΦ3 og LESΦ4).
  2. Velg et egnet selektivt middel (rifampicin ble brukt her), og utfør en buljongfortynningsanalyse for å bestemme minste hemmende konsentrasjon (MIC) for indikatorverten (16 μg·mL−1 er MIC for PAO1)23,24.
  3. Utsett indikatorvertskulturene sekvensielt for økende konsentrasjoner av selektiv agens i lysogen buljong (LB), som starter under MIC (i dette tilfellet 5 μg·ml−1), i 18–24 timer, med risting, og ved 37 °C.
  4. Overfør kulturen som vokser ved høyeste konsentrasjon i forholdet 1:100 (inokulum til medium) til to ganger økte konsentrasjoner av selektivt middel (18-24 timer hver gang) til MIC er økt tilstrekkelig. PAO1 ble en rifampicinresistent stamme (PAO1-RifR) ved 300 μg·ml-1 rifampicin.

2. Tidsmessig direkte oppregning av spontan induksjon (figur 2)

  1. Sett opp startkulturer over natten av både lysogen (f.eks. P. aeruginosa PAO1 lysogen som har LES-fager) og indikatorvert (PAO1-RifR) ved å inokulere en enkelt koloni i 5 ml LB, og inkubere ved 37 ° C med risting ved 180 o / min (18-24 timer).
  2. Sett opp ferske lysogen- og indikatorvertskulturer ved å inokulere nattens kulturer i 100 ml LB i forholdet 1:100, og inkuber ved 37 °C med risting (180 rpm).
    1. Overvåk lysogenveksten ved å måle OD600 og levedyktig telling ved hjelp av Miles Misra-teknikken25. For å gjøre dette, samle en 1 ml prøve fra hver lysogenkultur hver time fra inokulasjonspunktet i 8 timer.
    2. Seriell fortynn prøven umiddelbart etter innsamling ved å tilsette 100 μL av prøven til 900 μL av det respektive medium. Virvel godt ved maksimal hastighet, kast spissen ved hver fortynning, og fortsett fortynningsserien fra 10-1 til 10-9.
    3. Spot 10 μL av de nødvendige fortynningene i triplikat på en LB-agarplate, la tørke og inkuber ved 37 °C i 18–24 timer.
    4. For å beregne antall levedyktige bakterieceller, finn en fortynning med lett tellbare kolonier. Tell antall kolonier på hvert sted, og bruk deretter følgende formel:
      Equation 1
      MERK: Etter hvert som lysogenkulturen vokser, vil aktive fagpartikler bli produsert ved spontan induksjon. Produksjonen av infeksiøse fager betyr at transkriptomet av lysogenpopulasjonen nå er forurenset med lytisk replikasjonssyklus-assosiert genuttrykk fra det lytiske fagreplikasjonssignalet og den tilsvarende vertscelleresponsen. Det er derfor viktig å identifisere vekststadiet der andelen lysogene celler til frie infeksiøse fagpartikler er høyest for å begrense så mye bakgrunnstranskripsjonsstøy (generert av det lytiske fagtranskriptomet) som mulig i datasettet.
  3. For å oppregne de infeksiøse fagpartiklene i hver tidsprøve, inokuler 5 ml steril 0,4 % bakteriologisk agar i LB (øverste agar) med 100 μL midteksponentiell faseindikatorvert (OD600: 0,4–0,5; i dette tilfellet PAO1-RifR) i nærvær av et passende selektivt middel (50 μg·ml−1 rifampicin i dette tilfellet, da MIC for PAO1-verten bare er 16 μg·mL−1; se Materialfortegnelse, Rad 8 og rad 9)
    1. Spot 10 mikrol av samme seriefortynning (se trinn 2.2.2) på det inokulerte øverste agarlaget, og la det tørke før inkubering ved 37 °C i 18–24 timer.
    2. For å beregne de infeksiøse fagpartiklene, finn en fortynning med lett tellbare plakk. Tell antall plaketter på hvert sted.
      Equation 2
    3. Finn tiden / tilstanden for hvilken spontan induksjon per CFU (kolonidannende enhet) er minimal for de videre eksperimentelle trinnene.

3. Fremstilling av ikke-induserte og induserte lysogenkulturer for RNA-ekstraksjon (figur 3)

  1. Sett opp en ny kultur over natten ved å inokulere en enkelt koloni av lysogenet i 5 ml LB, og inkuber ved 37 ° C med risting (180 rpm) i 18-24 timer.
  2. Subkultur over natten kultur i 80 ml LB i forholdet 1:100 i åtte 250 ml kolber.
  3. Merk den første kolben som "ikke-indusert" og de andre som "indusert", sammen med tidspunktene når hver prøve skal høstes (dvs. "indusert t = 0", "indusert t = 10 min", "indusert t = 20 min", etc.; Figur 3).
  4. Etter 90 min inkubasjon, når OD600 er mellom 0,1–0,2, eller ved tidspunktet for minimal spontan induksjon (se diskusjonen), tilsett 4 μL 1 % iseddik (v/v) til den ikke-induserte kolben (figur 3).
    MERK: Da induserende middel i dette arbeidet ble laget ved bruk av 1% iseddik som løsningsmiddel, ble samme mengde løsningsmiddel tilsatt alene som et kontrolltrinn. Alternative kontroller kan vurderes avhengig av tilberedning av forskjellige induktorer.
  5. Tilsett 80 ml kulturen fra den ikke-induserte kolben til 720 ml steril LB, og tilsett umiddelbart stoppløsningen (iskald 5% [v / v] fenol, pH 4,3, 95% [v / v] etanol) ved hjelp av et volum som er 20% av kulturvolumet (160 ml), og inkuber på is i minst 30 minutter og ikke lenger enn 2 timer for å stabilisere RNA-transkripsjonene12, 26,27. Dette er den ikke-induserte prøven.
  6. Induser de resterende kulturene i syv 250 ml kolber (figur 3) med MIC av et egnet induserende middel (i dette tilfellet 25 mg·ml−1 norfloksacin, fremstilt i 1 % iseddik [w/v], brukt i en endelig konsentrasjon på 1 μg·mL−1), bland godt og inkuber ved 37 °C og med risting ved 180 rpm i 1 time.
    MERK: Dette trinnet vil tvinge lysogenkulturen til en mer koordinert tilstand av lytisk replikasjon. De fleste celler i kulturen vil begynne å gjennomgå lytisk produksjon av smittsomme fagpartikler.
  7. La cellene komme seg ved å tilsette 80 ml kultur fra den induserte kolben til 720 ml steril LB, som effektivt fortynner induseringsmiddelet. Høst bakteriecellene fra hver kolbe hvert 10. minutt fra tid 0 til 1 time ved å legge til en stoppløsning, som nevnt i trinn 3.5.
    MERK: Stoppløsningen stabiliserer RNA i opptil 2 timer. For å forbedre prøvestabiliteten må du imidlertid utføre alle de ytterligere trinnene ved 4 °C.
  8. Høst ved sentrifugering ved 10 000 x g i 15 minutter ved 4 °C så snart som mulig, ikke over 2 timer etter behandling for å unngå RNA-nedbrytning.
  9. Kast supernatanten og resuspender bakteriepelletsene forsiktig i restvæsken ved hjelp av en justerbar automatisk pipette før hver prøve overføres til et mikrofugerør på 1,5 ml.
  10. Sentrifuger mikrofugerørene ved høy hastighet (13 000 x g) i en mikrofuge ved 4 °C i 1 min, og kast den gjenværende supernatanten.
  11. Flashfrys pellets ved å kaste hvert forseglede mikrofugerør i flytende nitrogen. Dette vil hjelpe effektiv lysis av cellene for RNA-ekstraksjon.
  12. Tilsett TRIzol (1 ml) til hver frossen pellet, og homogeniser suspensjonen ved pipettering (ikke virvel). Oppbevares ved -80 °C til klar til å utføre RNA-ekstraksjon for alle prøvene.
    MERK: Protokollen kan settes på pause på dette tidspunktet.
  13. Gjenta trinn 3.1–3.13 med tre biologiske replikater.

4. Isolering av RNA fra ikke-induserte og induserte lysogenkulturer

KRITISK: Alle disse trinnene skal utføres i et RNase-fritt miljø28. Arbeidsbenkene skal tørkes med 10% NaClO eller proprietære RNase-inaktivatorer. Laboratoriet bør behandles med RNase-hemmere som DEPC-behandling, og nukleasefritt vann bør brukes i alle reaksjonene.

  1. Tine de frosne TRIzol-behandlede pellets fra trinn 3.12 på is, og tilsett 400 μL molekylærbiologisk kloroform.
  2. Agiter hetteglassene godt ved inversjon i 10 s for å fullføre lysis av alle celler ( ikke virvel). Inkuber deretter ved romtemperatur (21 °C) i 2–5 minutter.
  3. Separer det vandige laget fra TRIzol/kloroformblandingen ved sentrifugering ved hjelp av en nedkjølt bordmikrofuge ved 4 °C og 13 000 x g i 15 minutter.
  4. Samle den vandige fasen (~ 500 μL, øverste lag) ved hjelp av en 1000 μL pipette, pass på at du ikke forstyrrer interfasen eller organisk fase (bunnlag). Overfør til et nytt 1,5 ml mikrofugerør.
  5. Tilsett 450 μL molekylærbiologisk isopropanol til den separerte vandige fasen, bland godt ved inversjon ( ikke virvel), og inkuber ved romtemperatur (21 °C) i 30 minutter.
  6. Gjenvinn RNA ved sentrifugering ved hjelp av en nedkjølt sentrifuge ved 4 °C og 13 000 x g i 30 minutter.
  7. Kast supernatanten uten å forstyrre RNA-pelleten, og vask pelleten to ganger med 800 μl 70 % etanol tilberedt med nukleasefritt vann (ikke pipett opp og ned). Sørg for stabiliteten til RNA-pelleten ved å gjenta sentrifugeringstrinnet i 5 minutter etter hver vask.
  8. Kast etanolen, og lufttørk pelleten.
    MERK: Aspirer etanolen rundt pelleten forsiktig med en 10 μL mikrospiss, og tørk pelleten ved å snu røret på rent blottpapir. RNA-pelleten skal bli fargeløs, og kantene skal virke ruffled og synlige. Tørking av for lite kan etterlate gjenværende etanol som kan påvirke nedstrøms prosesser, og tørking av pelleten for mye kan gjøre resuspensjonen vanskelig.
  9. Resuspender RNA i nukleasefritt vann (50 μL) ved å inkubere ved 65 °C på en termo-shaker med intermitterende blanding (hver 30. s) i totalt 3-5 minutter.
    KRITISK: 2'- OH-gruppen av RNA er i stand til å katalysere autospaltningen av RNA-tråder ved høy temperatur over 65 ° C og høy pH. Temperaturer under 65 °C vil forsinke resuspenderingen av rest-DNA, og dermed begrense mengden DNA som må fordøyes på et senere tidspunkt med DNase I-fordøyelsen. Derfor er det viktig å holde temperaturen på 65 °C for å oppnå de beste prøvene.
    MERK: Protokollen kan settes på pause på dette tidspunktet, og prøvene kan lagres ved -80 °C.

5. Fjerning av forurensende DNA fra RNA ved DNase-behandling

  1. For å fjerne forurensende DNA fra det totale RNA før den første streng cDNA-syntesen, legg til et 0,1 volum av 10x DNase-buffer og 1 μL DNase-enzym til 10 μg totalt RNA. Bland tuben forsiktig, og rug ved 37 °C i 30 minutter.
  2. Resuspender DNase-inaktiveringsreagenset, og tilsett minst 2 μL eller et 10% volum av det totale reaksjonsvolumet. Bland godt, og inkuber prøvene i 5 minutter ved romtemperatur (21 °C) under redispersjonen av DNase-inaktiveringsreagenset.
  3. Pellet DNase-reagensene ved sentrifugering ved bruk av en mikrosentrifuge på bordet ved 10 000 × g i 1,5 minutter.
  4. Overfør supernatanten som inneholder RNA til et nytt rør uten å forstyrre pelleten.
    MERK: Kontroller kvaliteten på RNA ved hjelp av et UV-spektrofotometer på 1 μL skala og mikrovæskebasert nukleinsyrecomputeranalysator i henhold til produsentens instruksjoner; renset totalt RNA kan lagres ved -80 °C. For qRT-PCR kan RNA brukes direkte på dette punktet. For mer følsomme nedstrømsprosesser, for eksempel RNA-sekvensering, som krever streng prøvekvalitet, må et A260/230-forhold på ε 2.0 nås for å fortsette videre.
  5. Øk volumet av den DNA-frie RNA-løsningen til 500 μL ved bruk av nukleasefritt vann.
  6. Tilsett 50 μL nukleasefritt 3 M natriumacetat (pH 5,3) og 495 μL isopropanol. Bland godt, og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter.
    MERK: Dette trinnet vil utfelle RNA.
  7. Gjenvinn RNA ved sentrifugering ved 13 000 x g og 4 °C i 30 minutter.
  8. Vask RNA-pelleten tre ganger med iskald 70% etanol ved å sentrifugere prøvene ved 13 000 x g og 4 °C i 5 minutter etter hver vask for å fjerne saltene helt.
  9. Kontroller kvaliteten på RNA ved hjelp av et UV-spektrofotometer på 1 μL skala og mikrofluidbasert nukleinsyrecomputeranalysator i henhold til produsentens instruksjoner; renset totalt RNA kan lagres ved -80 °C.
    MERK: Guiden29 ble brukt til å oppnå RNA-kvalitetsstandardene. Hvis forholdet A260/230 er <2,0, gjentar du trinn 5,5–5,9.

6. Kvalitativ og kvantitativ analyse av DNase-fritt RNA

  1. Validere effektiviteten av DNase-behandlingen for hver prøve ved å utføre en kvantitativ PCR ved bruk av 16S rRNA-primere (tabell 2) med 1 μg totalt RNA, og bekreft at det ikke produseres noe amplifikasjonsprodukt.
    MERK: De ideelle primerne for å vurdere gDNA-forurensning ville være primere som er designet for å anneal ved intron-eksonkryss eller regulatoriske regioner i prokaryoter eller på transkripsjonelt inaktive steder30,31.
  2. Bestem RNA-integritetsnummeret (RIN) ved hjelp av en mikrovæskebasert nukleinsyrecomputeranalysator i henhold til produsentens instruksjoner.
    MERK: Prøver som viser en RIN ≥ 9 bør brukes til førstestrengssyntesen. Prøver som viser RIN < 9 bør kasseres, og isolasjonstrinnene (1.1–5.4) bør gjentas.
  3. Kvantifiser den totale RNA-konsentrasjonen ved hjelp av HS RNA-analysesettet og et fluorimeter i henhold til produsentens instruksjoner.

7. Førstestrengs cDNA-syntese

  1. Forbered en RNA-primerblanding for hver prøve ved å blande 1 μg totalt RNA med 1 μL tilfeldige hexamere (50 ng·μL-1) og 1 μL 10 mM dNTP-blanding. Juster deretter totalvolumet til 10 μL ved bruk av nukleasefritt vann.
  2. Inkuber reaksjonen ved 65 °C i 5 min, og legg på is i 1 min.
  3. Forbered en cDNA-synteseblanding for hver prøve ved å tilsette 2 μL 10x RT-buffer; 4 μL av 25 mM MgCl2; 2 μL på 0,1 M DTT; 1 μL RNasehemmer (40 U·μL−1); og 1 μL av reverstranskripsjonsreagenset (200 U·μL−1) i angitt rekkefølge.
  4. Tilsett cDNA-synteseblandingen til RNA / primerblandingen. Bland forsiktig, og sentrifuge prøvene kort for å samle komponentene i bunnen av røret.
  5. Klargjør blandingen ved å ruge på prøvene i 10 minutter ved 25 °C, etterfulgt av 50 minutter ved 50 °C. Avslutt reaksjonene ved å ruge ved 85 °C i 5 minutter, og avkjøl på is.
  6. Tilsett 1 μL RNase H til hvert rør, og inkuber ved 37 °C i 20 minutter for å fjerne RNA fra DNA:RNA-hybriden.
  7. Til slutt, fortynn cDNA-syntesereaksjonen til et totalt volum på 80 μL, og oppbevar den ved -80 ° C til videre bruk.
    MERK: Protokollen kan settes på pause på dette tidspunktet.

8. Standard kurve og kvantitativ (q) -PCR for å bestemme ekspresjonsnivåene av markørgener som indikerer forskjellige stadier av fagreplikasjon

  1. Identifiser et sett med målgener som kan fungere som markører for hvert stadium av replikasjon av fagen av interesse. I vårt tilfelle var disse som beskrevet i tabell 2.
  2. Forsterk hvert av målgenene fra malgenomisk DNA ved bruk av relevante primere og bruk av PCR med følgende amplifikasjonsbetingelser: initial denaturering ved 95 °C i 2 minutter; denaturering ved 95 °C i 30 s; glødning ved optimal glødetemperatur avhengig av primere (58 °C ble brukt her) i 30 s; forlengelse ved 72 °C i 1 min; og endelig forlengelse ved 72 °C i 5 min.
  3. Rens hver amplikon ved hjelp av et PCR-rensesett, og klon dem i en TA-kloningsvektor i henhold til produsentens instruksjoner. Bekreft sekvensen for hvert klonede produkt ved Sanger-sekvensering.
    MERK: Protokollen kan settes på pause på dette tidspunktet.
  4. Beregn kopinummeret for individuelle plasmider ved hjelp av følgende ligning20:
    Equation 3
  5. Forbered en standardmal for hvert markørgen ved serielt å fortynne plasmid-DNA fra 109 kopier/μL til 10 2 kopier/μL i molekylær nukleasefri steril H2 O.
  6. Utfør kvantitativ PCR i henhold til produsentens instruksjoner for det foretrukne qPCR-systemet med 1 μL cDNA (fra trinn 7.7) for hver prøve i tre eksemplarer, sammen med de respektive plasmidstandardene i tre eksemplarer; utføre PCR i en 96-brønnsplate for hvert mål.
  7. Plott Log DNA-kopinummeret (x-aksen) versus syklusterskelen (y-aksen, Ct), og bruk en passende plattform som Excel eller R for å utføre en lineær regresjonsberegning for å vise bestemmelseskoeffisienten (R2) og en lineær ligning.
    MERK: Bestemmelseskoeffisienten skal være over 0,98.
  8. Beregn kopinummeret for hvert mål ved hjelp av den lineære ligningen (y = mx + b) avledet fra den lineære regresjonen (trinn 8.7), hvor y er estimert Ct; x er loggen DNA-kopinummer; m er linjens helling, som definerer endringen i Ct med hensyn til DNA-kopinummeret; og b er y-akseskjæringspunktet som representerer estimert Ct for en DNA-kopi32.
  9. For hvert markørgen beregner du effektiviteten av PCR-amplifikasjonen (E) ved å bruke parametrene fra den lineære regresjonen til standardkurven og følgende ligning, hvor m er helningen avledet fra trinn 8.7 og trinn 8.8:
    Equation 4
  10. Valider alle primere når det gjelder prosentvis effektivitet ved hjelp av følgende ligning:
    MERK: Effektiviteten må ligge i området 90%-110%.
    Equation 5
  11. Beregn det absolutte kopinummeret til DNA ved å bruke følgende formel:
    Equation 6
    der Ct (trinn 8.8) er syklusterskelen, b er skjæringspunktet (trinn 8.8), m er stigningstallet (trinn 8.8), og E er effekten av PCR-amplifikasjon (trinn 8.9).
    KRITISK: Ved sammenligning av amplifisering av to eller flere mål med q-PCR, må PCR-effektiviteten beregnes for hvert mål for å sammenligne de absolutte DNA-kopitallene.
  12. I denne studien ble 16S rRNA-, proC- og rpoD-genene brukt som de generelle interne kontrollene, og gyrB ble brukt som induksjonskontroll33,34,35.
    MERK: Når du velger interne kontroller fra RNA seq-dataene, er det best å velge interne kontroller som ikke endres i uttrykksnivåer for de testede forholdene. Nøye vurdering av hensiktsmessige kontroller er alltid viktig for en meningsfull tolkning av resultatene.

Representative Results

I dette arbeidet ble den direkte tidsmessige oppregningen av fagproduksjon fra en PAO1 LESΦ2 lysogenkultur dyrket under ikke-induserende forhold brukt til å bestemme virkningen av spontan LESΦ2-induksjon. Fagtettheten var på sitt laveste punkt med et gjennomsnitt på ~2,61 x 106 plakkdannende enheter (PFU)·mL−1 2 timer etter subkultur i ferskt medium i den tidlige eksponentielle vekstfasen, noe som tyder på at lysogeni var den dominerende tilstanden. LESΦ2-titeren økte raskt til et gjennomsnitt på ~2,4 x 108 PFU·mL−1 innen 4 timer og nådde høyeste tetthet etter 6 timer (gjennomsnitt på ~5,83 x 109 PFU·mL−1; Figur 4).

Minimal spontan induksjon ble observert i den tidlige loggfasen av lysogenvekst (etter 2 timer). Den målbare tilstedeværelsen av fager i kulturmediet var imidlertid resultatet av mange tidligere hendelser, inkludert følgende: pakking av nukleinsyrer i proteinhoder, montering av proteiner i fagpartikler og ekspresjon av senfaggener, faggener i mellomstadiet og tidlige regulatoriske faggener. Det var viktig å fange opp de infiserte cellene før ekspresjon av fagassosierte replikasjonshendelser; Derfor ble 90 min valgt for å la kulturen vokse før induksjon. For å fange opp genuttrykksprofilen til PAO1 ble LESΦ2-lysogenprøver fra en kultur høstet pre-induksjon og post-induksjon over en periode på 90 minutter, som nevnt i trinn 3.4. Dette 90 minutters tidspunktet er godt før høye nivåer av spontan induksjon av den residente profagen oppdages av plakkanalysen fra trinn 2.3.2. Siden bakteriecelletettheten var lav under tidlig eksponentiell vekst, ble kulturvolumene skalert opp til 800 ml for å sikre rikelig materiale for genuttrykksstudiene. Prøvene ble tatt fra uindusert dyrkning og induserte kulturer hvert 10. minutt, og RNA ble ekstrahert for å kartlegge ekspresjonsprofilen til nøkkelmarkørene for lysogeni og lytisk replikasjon under bakterieveksten. Totalt RNA ble renset og validert for fravær av genomisk DNA ved bruk av qPCR-analyser rettet mot 16S rRNA-genet (trinn 6.1). Prøvene som nådde en RIN ≥ 9 besto kvalitetskontroll og ble konvertert til cDNA.

Det annoterte LESΦ2-genomet ble undersøkt for å identifisere gener som er kjente aktører i lysogene og lytiske replikasjonssykluser av tempererte fager. Disse identifiserte genene ble deretter brukt til å validere qRT-PCR for ekspresjonsprofilering av lysogensyklusbegrensede og lytiske syklusassosierte gener fra induserte og ikke-induserte kulturer. Vi kvantifiserte det absolutte DNA-kopinummeret og gjennomførte en Wilcoxon-signed-rank-test med R36 for å sammenligne uttrykksnivåene i ikke-induserte og induserte kulturer (figur 5). En markert økning i uttrykket av cro-genet (en tidlig markør for lytisk replikasjon) fra ~2,31 x 109 kopier i ikke-induserte kulturer til ~3,02 x 1011 kopier 30 minutter etter induksjon (Wilcoxon signed-rank test: p < 0,01) ble observert. På samme måte viste O-proteiner og P-proteiner, som er midtstadiemarkører for lytisk replikasjon (og antas å være involvert i faggenomreplikasjon), også signifikant oppregulering fra ~ 1,74 x 108 til ~ 1,25 x 10 10 kopier (Wilcoxon signed-rank test: p < 0,01) og fra ~ 6,05 x 102 til ~ 5,68 x10 5 kopier (Wilcoxon signed-rank test: p < 0,01), henholdsvis. Til slutt ble de haleassosierte strukturelle genene brukt som sene markører for den lytiske replikasjonssyklusen. Igjen observerte vi en signifikant økning i uttrykk fra ~ 2,31 x 106 kopier i ikke-induserte kulturer til ~ 4,38 x 108 kopier 30 min etter induksjon (Wilcoxon signed-rank test: p < 0,01). Dermed bekreftet de kvantitative RT-PCR-dataene at genuttrykket av veletablerte markørgener for lytisk replikasjon fulgte den forventede trenden, med de tidlige, midtre og sene markørene som viste flerfoldig differensialuttrykk i predikert rekkefølge (figur 5). Siden uttrykket av markørene for lytisk replikasjon ble oppregulert 30 minutter etter restitusjon, anses dette som et passende representativt tidspunkt for å studere det transkriptomiske landskapet til aktive tempererte fager og deres bakterielle verter under den lytiske syklusen.

Vi observerte noe ekspresjon av lytiske gener i ikke-induserte forhold, noe som bekrefter at en viss spontan induksjon alltid forekommer, selv i optimaliserte kulturer der lysogentallene er representert med det høyeste forholdet mellom CFU og frigjort PFU i tidlig loggfase. Dette betyr at det alltid vil være et visst nivå av "støy" i transkriptomikkdataene, noe som forsterker viktigheten av nøye forberedte kontroller, inkludert induserte og ikke-induserte kulturer. Det riktige valget av internkontrollgenene for å bestemme foldendringene i ekspresjon er avhengig av nøye undersøkelse av transkriptomikkdataene for å identifisere gener som uttrykkes på samme nivå i både ikke-induserte og induserte prøver. Våre foreløpige resultater tyder på at rpoD var det mest pålitelige kontrollgenet som ble testet og hadde det mest stabile uttrykket (~1,71 x 10 5 kopier før induksjon og ~3,33 x 105 kopier 30 minutter etter induksjon; Wilcoxon signed-rank test: p = 0,3594) sammenlignet med 16S rRNA- eller proC-genene (figur 5). Variasjonen i uttrykket for de interne kontrollene førte til måling av det absolutte antall transkripsjoner. Fremtidig undersøkelse av transkriptomikkdataene vil støtte valget av hensiktsmessige interne kontroller for videre validering.

cI-genet ble brukt i vår genprofileringsøvelse, da det er en anerkjent markør for lysogeni. Sammenlignet med markørene for lytisk replikasjon var uttrykket av cI-genet relativt stabilt (figur 5), men kopinummeret til dette genet var betryggende høyt i ikke-induserte kulturer sammenlignet med markørene for lytisk replikasjon. Disse dataene stemmer overens med de lave PFU-tallene i de samme prøvene, og bekrefter dermed at høyt repressoruttrykk var assosiert med lavere nivåer av fagproduksjon. Dataene som er rapportert her, viser at uttrykket av cI-transkripsjonen for denne spesielle fagen ikke er signifikant nedregulert etter induksjon, som sett i Stx-fagene11,17. Repressoraktivitet styres normalt både på transkripsjons- og posttranslasjonsnivå, slik at repressorgenet kan transkriberes, men det resulterende proteinet blir umiddelbart utsatt for autospaltning. Ytterligere eksperimentering er nødvendig for å validere transkripsjonelle og posttranslasjonelle kontroller. Videre, fra vår standardkurve, ser minimumsdeteksjonsgrensen for qPCR ut til å være ~ 102 eksemplarer.

Sammen validerer våre funn fra plakk og qRT-PCR-analyser vår strategi for kultur og forberedelse av RNA-prøver for å generere en godt kontrollert inngang for RNA-Seq-eksperimenter. De ikke-induserte kulturene i tidlig eksponentiell fase viste lave nivåer av spontan induksjon og lytisk genuttrykk, noe som tyder på lysogeniens dominans. I motsetning til dette viste kulturer isolert 30 minutter etter induksjon signifikante økninger i uttrykket av markørgener som indikerer dominansen av lytisk replikasjon.

Figure 1
Figur 1: Protokollen for oppretting av rifampicinresistent indikatorvert (Opprettet med BioRender.com). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Det eksperimentelle designet for å telle PFU og CFU av et lysogen fra samme utvalg. (Opprettet med BioRender.com) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Det eksperimentelle designet for prøvetaking induserte og ikke-induserte kulturer for RNA-isolasjon. (Laget med BioRender.com) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4 Tidsmessig oppregning av spontan induksjon. Temporal oppregning av spontan LES profagproduksjon ved bruk av PFU fra PAO1 Φ2 lysogen med samtidig CFU, n = 8 (to biologiske og fire tekniske replikater); Feilfeltene representerer standardavviket. De mørkerøde punktene indikerer CFU·mL−1 i LB; de mørkeblå punktene indikerer PFU·ml−1 i LB. Den spontane frigjøringen av lysogenenes φ2-infeksiøse er på det laveste målbare nivået 2 timer etter inokulering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Absolutt kopinummer av målmarkørgenene. Det absolutte kopinummeret av fagmarkørgener bekrefter de forutsagte uttrykksmønstrene, avledet ved hjelp av RT-qPCR, av gener som forventes å spille viktige roller i lysogeni og lytiske sykluser. Prikkene representerer både tre biologiske og tre tekniske replikater (n = 9). (A) Den røde boksen representerer lysogenimarkøren, cI; (B) grønn representerer den tidlige lytiske markøren, cro; (C,D) blå representerer de midtlytiske markørene, DNA-replikasjonsgener; (E) magenta representerer den sene lytiske markøren, halestrukturelle gener; (F–H) grått representerer vertsmarkørene som ble brukt som interne kontroller, og (I) hvitt representerer DNA-gyrase B, som ble brukt som induksjonskontroll. De heltrukne horisontale linjene viser medianen for fordelingen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Primere designet i denne studien. Sekvensene av spesifikke primere for markørgenene og internkontrollene som ble brukt i denne studien er gitt, sammen med deres tilsvarende NCBI-tiltredelses-IDer. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Effektiviteten til primerne som ble brukt i denne studien, beregnet ved hjelp av qPCR-standardkurven. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Opprettelsen av en valgbar indikatorvert, tidligere brukt i plakkanalyser for mer nøyaktig å kvantifisere spontan induksjon av Stx-fra E. coli MC106137,38,39, er beskrevet her for P. aeruginosa- LESΦ2. Denne intervensjonen har den ekstra fordelen av å redusere prøvebehandlingstrinnene og -tiden, og muliggjør dermed samtidig vurdering av spontane induksjonshastigheter ved flere kulturforhold. Det er fare for å generere andre mutasjoner under opprettelsen av rifampicinresistente varianter40; I dette arbeidet ble imidlertid den utviklede stammen bare brukt som indikatorvert for oppregning av plakk fra kulturer av interesse og ble ikke inkludert i den transkriptomiske analysen. Så lenge den valgbare indikatorstammen forblir like utsatt for infeksjon av fagen av interesse, er det ingen bekymring for andre ervervede mutasjoner. Likevel ble det ikke påvist forskjeller i restriksjonsfragmentlengdepolymorfismeprofilene ved analyse av pulsfeltgelelektroforese (PFGE) av PAO1WT og PAO1RIF (data ikke vist).

Når du velger vertsceller, er det sjelden å finne en indikatorstamme som ikke allerede har profager. Som et eksempel på dette har PAO1 den trådformede profagen Pf4. De eksperimentelle kontrollene for denne studien ble designet for å kunne direkte undersøke genuttrykket av spesifikke fager (i dette tilfellet LES prophage 2) og effektene denne fagen har på bakteriell genuttrykk. I sammenligningen av transkripsjoner fra PAO1 som bærer LES prophage 2 og mangler LES prophage 2 (både lysogen og ikke-lysogen bærer den endogene Pf4), som tjener som internkontroll for å utelukke virkningen av Pf4 på verten. I tillegg har det blitt påvist at Pf4 vanligvis ikke forårsaker lysis i vertscellen41 og derfor ikke er i stand til å forvirre resultatene av disse eksperimentene.

Det er veletablert at nøye kvalitetskontroll er avgjørende i prøveforberedelse for å produsere meningsfulle omics-data42. Imidlertid, som tidligere beskrevet11, utføres sjelden forsiktig karakterisering av profagaktivitet ved fremstilling av lysogenkulturer for slike studier. Her beskriver vi våre systematiske protokoller for å forberede et godt kontrollert og optimalisert sett med kulturer for transkriptomiske studier for bedre å utforske samspillet mellom bakterier og tempererte fager. Synkroniseringen av befolkningen ble kontrollert ved å bringe kulturen gjennom minst fire doblinger før den ble behandlet med det induserende antibiotikumet norfloxacin. Ved å bestemme MIC for norfloxacin for stammen i studien, kunne vi sikre at konsentrasjonen av induksjonsmidlet var like over MIC for "induksjon" -behandlingen. De behandlede cellene ble deretter fortynnet 1:10 for å senke norfloxacinkonsentrasjonen under MIC etter 1-timers behandling for å tillate cellene å gjenopprette og fullføre fagreplikasjonsprosessen, som endte i lysis av cellen og frigjøring av infeksiøs fagavkom. Cellene går bare inn i den lytiske replikasjonssyklusen etter induksjonsstimulansen når konsentrasjonen av norfloxacin er brakt under MIC i gjenopprettingsperioden. I dette tilfellet betyr det å gå over 1 μg·ml−1 norfloksacin at legemidlet ikke effektivt kunne fortynnes under MIC, da MIC for norfloxacin for PAO1 er 0,19 μg·ml−1. Nivået av induktorfortynning må balanseres med behovet for lysogenutvinning og oppbevaring av kulturtettheten for høsting av RNA. Dataene som diskuteres her, viser at det er mulig å synkronisere kulturer for å lage prøver der lysogeni dominerer, og dermed redusere støyen fra spontan induksjon og muliggjøre påvisning av sanne lysogenidrevne endringer i genuttrykk. Siden den lysogene tilstanden er dominerende i den tidlige eksponentielle vekstfasen når bakteriecelletettheten er lav, foreslår vi å skalere opp kulturene for å høste nok RNA til påfølgende genuttrykksstudier som RNA-Seq.

Bruken av norfloxacin som et induserende middel for å tvinge kulturer inn i lytisk syklus er godt rapportert43,44; Dette vil imidlertid også påvirke uttrykket av andre bakteriegener i prosessen45,46. For å redusere dette, bør RNA-biblioteker fra kontrollkulturer av villtype dyrket under de samme induserende og ikke-induserende forholdene inkluderes i RNA-Seq-eksperimenter. Bruken av interne kontroller og nøkkelmarkørgener for å validere stadiene av fagreplikasjon ved qRT-PCR er også avgjørende for nøyaktige sammenligninger. Kvantitativ RT-PCR-profilering kan ikke tolkes ved å sammenligne det absolutte antall transkripsjoner for hvert gen på forskjellige tidspunkter; Det er formen på profilen som betyr noe. For det første har bare en liten region i transkripsjonen for noe gen blitt samplet, så om det er et kortvarig eller mer langvarig element er ukjent27. Riktignok viser RNA-Seq-kartlegging av transkripsjoner at tettheten av kartleggingsdataene varierer betydelig over lengden av et gen. For det andre er det formen på genuttrykksprofilen som skal tolkes for et markørgen assosiert med den lytiske syklusen eller den lysogene livsstilen eller til og med frakoblet fra fagreguleringskretsene11. Spontan induksjon er et reelt problem i lysogenkulturen og vil alltid resultere i uttrykk for lytiske syklusassosierte gener. Profilering viser imidlertid at genene assosiert med den lytiske replikasjonssyklusen er undertrykt i deres ekspre-induksjon (minst to logfolder) og oppregulert postinduksjon.

De tidligere utførte transkriptomiske analysene av Stx-faginteraksjoner med E. coli støtter en grundig forståelse av faggenene som er involvert i å opprettholde lysogeni og utløse den lytiske syklusen11,17. For tiden har LES-fagene til P. aeruginosa blitt annotert, men deres nøkkelgenfunksjoner er mindre godt forstått. Transkriptomiske studier vil muliggjøre re-annotasjon av LES-profagene og forbedre vår forståelse av genene som er involvert i lysogeni og lytisk syklus. Kobling av gensekvens til funksjon representerer en stor utfordring i studiet av nye profager, noe som ytterligere fremhever behovet for flere studier for å bekrefte faggenfunksjonene for produksjon av bedre merknadsverktøy47. Den bredere anvendelsen og tilpasningen av protokollene og ekstra kvalitetskontrolltiltak som er beskrevet i denne videoartikkelen, kan bidra til å avdekke ulike profagfunksjoner og dermed forbedre merknadsrørledninger og transformere vår forståelse av- og bakteriebiologi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAO1 6
LESB58 6
LES phages Induced and purified from LESB58 using Norfloxacin. This study
Lysogeny Broth (LB) Merck 1.10285.500
LB Agar Merck 1.10283.500
Agar Agar Fisher A/1080/53
Top Agar 0.4 g Agar Agar+2.5 g LB Broth in 100 mL water; autoclave and use. -
Rifampicin Sigma (Stock: 50 mg/mL in Methanol- Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use) R3501
Glacial Acetic Acid Fisher 1% (v/v) in water 10060000
Norfloxacin Sigma (Stock: 25 mg/mL of 1% Glacial Acetic Acid-Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use;To avoid freeze thaw cycles, store as small aliquotes) N9890
Phenol saturated with citrate buffer pH 4.3 Sigma P-4682
Molecular Biology grade Ethanol Fisher 16695992
TRIzol Invitrogen 12044977
Chloroform Fisher 11398187
Isopropanol Fisher 17150576
Nuclease-free H2O Invitrogen 10526945
10X TURBO DNase Ambion AM1907
Qubit RNA HS, BR Kit Invitrogen Q10210
Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent 5067-1511
SuperScriptIII first strand synthesis kit Invitrogen 18080051
PCR Reagents Bioline Mytaq Red 2X BIO-25043
qPCR Reagents Sensifast SYBR Hi Rox BIO-92020
PCR purification kit Isolate II PCR and Gel Kit BIO-52060
TA cloning kit TA Cloning Kit, with pCR 2.1 Vector, without competent cells K202040
StepOne Real Time PCR system Thermo Fisher Scientific 4376600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lin, D. M., Koskella, B., Lin, H. C. Phage therapy: An alternative to antibiotics in the age of multi-drug resistance. World Journal of Gastrointestinal Pharmacology and Therapeutics. 8 (3), 162-173 (2017).
  2. Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New tools for genetic manipulations from bacterial immunity systems. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 209-228 (2015).
  3. Santos, S. B., Azeredo, J. Bacteriophage-based biotechnological applications. Viruses. 11 (8), 737 (2019).
  4. Rodríguez-Rubio, L., Jofre, J., Muniesa, M. Is genetic mobilization considered when using bacteriophages in antimicrobial therapy. Antibiotics. 6 (4), 32 (2017).
  5. Hatfull, G. F. Dark Matter of the biosphere: The amazing world of bacteriophage diversity. Journal of Virology. 89 (16), 8107-8110 (2015).
  6. Yukgehnaish, K., et al. PhageLeads: Rapid assessment of phage therapeutic suitability using an ensemble Machine Learning approach. Viruses. 14 (2), 342 (2022).
  7. Seemann, T. Prokka: Rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics. 30 (14), 2068-2069 (2014).
  8. Arndt, D., et al. PHASTER: A better, faster version of the PHAST phage search tool. Nucleic Acids Research. 44, W16-W21 (2016).
  9. Banerjee, S., et al. FINDER: An automated software package to annotate eukaryotic genes from RNA-Seq data and associated protein sequences. BMC Bioinformatics. 22 (1), 205 (2021).
  10. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  11. Veses-Garcia, M., et al. Transcriptomic analysis of Shiga-toxigenic bacteriophage carriage reveals a profound regulatory effect on acid resistance in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8118-8125 (2015).
  12. Owen, S. V., et al. A window into lysogeny: revealing temperate phage biology with transcriptomics. Microbial Genomics. 6 (2), e000330 (2020).
  13. Davies, E. V., Winstanley, C., Fothergill, J. L., James, C. E. The role of temperate bacteriophages in bacterial infection. FEMS Microbiology Letters. 363 (5), 015 (2016).
  14. Livny, J., Friedman, D. I. Characterizing spontaneous induction of Stx encoding phages using a selectable reporter system. Molecular Microbiology. 51 (6), 1691-1704 (2004).
  15. Fogg, P. C. M., et al. Identification of multiple integration sites for Stx-phage Φ24B in the Escherichia coli genome, description of a novel integrase and evidence for a functional anti-repressor. Microbiology. 153 (12), 4098-4110 (2007).
  16. James, C. E., et al. Differential infection properties of three inducible prophages from an epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa. BMC Microbiology. 12, 216 (2012).
  17. Riley, L. M., et al. Identification of genes expressed in cultures of E. coli lysogens carrying the Shiga toxin-encoding prophage Φ24B. BMC Microbiology. 12 (1), 42 (2012).
  18. Stover, C. K., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).
  19. Winstanley, C., et al. Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa. Genome Research. 19 (1), 12-23 (2009).
  20. Davies, E. V., et al. Temperate phages enhance pathogen fitness in chronic lung infection. The ISME Journal. 10 (10), 2553-2555 (2016).
  21. Allison, H. E. Stx-phages: drivers and mediators of the evolution of STEC and STEC-like pathogens. Future Microbiology. 2 (2), 165-174 (2007).
  22. Allison, H. E., et al. Immunity profiles of wild-type and recombinant Shiga-like toxin-encoding bacteriophages and characterization of novel double lysogens. Infection and Immunity. 71 (6), 3409-3418 (2003).
  23. Mori, N., et al. A peptide based on homologous sequences of the β-barrel assembly machinery component BamD potentiates antibiotic susceptibility of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (9), 2173-2181 (2012).
  24. Chojnacki, M., et al. A novel, broad-spectrum antimicrobial combination for the treatment of Pseudomonas aeruginosa corneal infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (10), e00777 (2019).
  25. Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. The estimation of the bactericidal power of the blood. Epidemiology & Infection. 38 (6), 732-749 (1938).
  26. Srikumar, S., et al. RNA-seq brings new insights to the intra-macrophage transcriptome of Salmonella Typhimurium. PLoS Pathogens. 11 (11), e1005262 (2015).
  27. Kröger, C., et al. The transcriptional landscape and small RNAs of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), E1277-E1286 (2012).
  28. Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2019).
  29. Koetsier, G. A practical guide to analyzing nucleic acid concentration and purity with microvolume spectrophotometers. New England BioLabs Inc. , Available from: https://www.neb.com/-/media/nebus/files/application-notes/technote_mvs_analysis_of_nucleic_acid_concentration_and_purity.pdf?rev=c24cea043416420d84fb6bf7b554dbbb (2019).
  30. Saunders, N. A., Lee, M. A. Real-Time PCR: Advanced Technologies and Applications. , Caister Academic Press. Norfolk, UK. (2013).
  31. Bustin, S. A. A-Z of Quantitative PCR. , International University Line. La Jolla, CA. (2004).
  32. Ruijter, J. M., et al. Efficiency correction is required for accurate quantitative PCR analysis and reporting. Clinical Chemistry. 67 (6), 829-842 (2021).
  33. Fothergill, J. L., Neill, D. R., Loman, N., Winstanley, C., Kadioglu, A. Pseudomonas aeruginosa adaptation in the nasopharyngeal reservoir leads to migration and persistence in the lungs. Nature Communications. 5 (1), 4780 (2014).
  34. Huang, J., et al. Temperature-dependent expression of phzM and its regulatory genes lasI and ptsP in rhizosphere isolate Pseudomonas sp. strain M18. Applied and Environmental Microbiology. 75 (20), 6568-6580 (2009).
  35. Savli, H., et al. Expression stability of six housekeeping genes: a proposal for resistance gene quantification studies of Pseudomonas aeruginosa by real-time quantitative RT-PCR. Journal of Medical Microbiology. 52 (5), 403-408 (2003).
  36. Kassambara, A. rstatix: Pipe-Friendly Framework for Basic Statistical Tests. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=rstatix (2022).
  37. McDonald, J. E., et al. High-throughput method for rapid induction of prophages from lysogens and its application in the study of Shiga toxin-encoding Escherichia coli strains. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2360-2365 (2010).
  38. Smith, D. L., et al. Short-tailed Stx phages exploit the conserved YaeT protein to disseminate Shiga toxin genes among Enterobacteria. Journal of Bacteriology. 189 (20), 7223-7233 (2007).
  39. James, C. E., et al. Lytic and lysogenic infection of diverse Escherichia coli and Shigella strains with a verocytotoxigenic bacteriophage. Applied and Environmental Microbiology. 67 (9), 4335-4337 (2001).
  40. Rees, V. E., et al. Characterization of hypermutator Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis in Australia. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (4), e02538 (2019).
  41. Li, Y., et al. Excisionase in Pf filamentous prophage controls lysis-lysogeny decision-making in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 111 (2), 495-513 (2019).
  42. Van Kampen, A. H. C., Moerland, P. D. Taking bioinformatics to systems medicine. Systems Medicine. 1386, 17-41 (2016).
  43. Matsushiro, A., Sato, K., Miyamoto, H., Yamamura, T., Honda, T. Induction of prophages of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 with norfloxacin. Journal of Bacteriology. 181 (7), 2257-2260 (1999).
  44. James, C. E., et al. Lytic activity by temperate phages of Pseudomonas aeruginosa in long-term cystic fibrosis chronic lung infections. The ISME Journal. 9 (6), 1391-1398 (2015).
  45. Shaw, K. J., et al. Comparison of the changes in global gene expression of Escherichia coli induced by four bactericidal agents. Microbial Physiology. 5 (2), 105-122 (2003).
  46. Long, H., et al. Antibiotic treatment enhances the genome-wide mutation rate of target cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), E2498-E2505 (2016).
  47. González-Tortuero, E., et al. VIGA: A sensitive, precise and automatic de novo VIral Genome Annotator. bioRxiv. , (2018).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 203
Forstå virkningen av tempererte bakteriofager på deres lysogener gjennom transkriptomikk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Krishnamurthi, R.,… More

Krishnamurthi, R., González-Tortuero, E., Plahe, G., Goodhead, I. B., Fothergill, J. L., James, C. E., Allison, H. E. Understanding the Impact of Temperate Bacteriophages on Their Lysogens Through Transcriptomics. J. Vis. Exp. (203), e64945, doi:10.3791/64945 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter