Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Förstå effekten av tempererade bakteriofager på deras lysogener genom transkriptomik

Published: January 5, 2024 doi: 10.3791/64945
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1, 2, 1
1Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, Institute of Infection, Veterinary and Ecological Sciences (IVES), University of Liverpool, 2School of Science, Engineering, and Environment, University of Salford

Summary

Detta protokoll gör det möjligt att avslöja effekten av profetior på deras värdar. Bakteriekulturer synkroniseras med hjälp av förhållanden som bäst stöder det lysogena tillståndet, vilket begränsar spontan induktion. RT-qPCR skiljer entydigt profagbegränsade gener och de som inte är kopplade till fagkontroll från de som uttrycks under den lytiska replikationscykeln.

Abstract

Tempererade fager finns integrerade som profager i de flesta bakteriegenom. Vissa profager är kryptiska och fixerade i bakteriekromosomen, men andra är aktiva och kan utlösas till replikativ form antingen spontant eller genom exponering för inducerande faktorer. Profager förknippas ofta med förmågan att ge toxinproduktion eller andra virulensassocierade egenskaper till sin värdcell. Nyare studier har visat att de kan spela en mycket större roll för att förändra fysiologin hos sina värdar. Tekniken som beskrivs här har gjort det möjligt för oss att undersöka hur profager påverkar genuttrycket hos den opportunistiska bakterien Pseudomonas aeruginosa.

I detta arbete jämfördes tillväxten av vildtypsstammen P. aeruginosa PAO1 med tillväxten av isogena lysogener som bär på olika kombinationer av profager från Liverpool Epidemic Strain (LES) LESB58. I en lysogenodling kommer en andel bakterieceller att stödja lytisk bakteriofagreplikation (spontan induktion) med en hög uttrycksnivå per cell av sena faggener, såsom de som är associerade med sammansättningen av fagpartiklar, och på så sätt maskera det lågnivågenuttryck som är associerat med lysogenbegränsat genuttryck. Effekten av spontan induktion kan således skymma prophagens genuttryck i en lysogenpopulation.

Tillväxtprofileringsexperiment användes för att identifiera spontan induktion, som var minimal under den tidiga exponentiella tillväxtfasen. Denna studie rapporterar hur man förbereder provkulturer under den tidiga exponentiella tillväxtfasen och hur man sätter upp adekvata kontroller trots lågt cellantal. Dessa protokoll säkerställer en tillförlitlig och reproducerbar jämförelse av vildtypsbakterier och lysogena bakterier under olika förhållanden, vilket förbättrar den transkriptomiska profileringen av profaggenomen och hjälper till att identifiera tidigare okända profagfunktioner.

Introduction

På senare tid har fagterapi för att bekämpa antimikrobiell resistens1 och CRISPR-Cas-baserad genredigering2 skapat förnyat intresse för bakteriofagforskning. Återigen har framsteg inom bioteknik möjliggjort en djupare undersökning av interaktionerna mellan bakterier och fager3. Den terapeutiska användningen av fager ("fagterapi") hämmas dock av farhågor om att fager fungerar som rörliga genetiska element med kapacitet att överföra virulens- och resistensgener horisontellt4. Utbredningen av "mörk materia"5 (gener med okända funktioner) är både oroande och lockande. Mörk materia anses vara en lucka i vår förståelse av fagbiologi och en i stort sett outnyttjad resurs för molekylära verktyg och potentiella nya terapier6. Utvecklingen av sekvenseringstekniker med hög genomströmning, tillsammans med förbättrad genannotering 7,8,9 och nya peptidveckningsalgoritmer10, förbättrar detektion, beskrivning och funktionell förutsägelse av faggener. Vetenskapen är dock fortfarande långt ifrån att validera de flesta fagers genfunktioner i kulturen eller i den verkliga världen.

RNA-sekvensering (RNA-Seq) kan globalt kartlägga genuttryck under faginfektion och har avsevärt förbättrat förståelsen av både- och bakterieelement som är involverade i lytiska och lysogena cykler11,12. Under lysogena processer integreras tempererade faggenom i bakteriellt DNA för att bli profager13. Experiment med global genuttrycksprofilering kan användas för att identifiera profagbegränsade gener som kodas på tempererade faggenom men som endast uttrycks under det lysogenatillståndet. Sådana gener kodar inte för fagstrukturella proteiner och är inte involverade i några faginfektionsprocesser. RNA-Seq kan användas för att identifiera de gener som är mer benägna att påverka bakterievärdens biologi, antingen genom att inducera en funktionsökning eller genom att reglera de befintliga bakteriegenerna, vilket ofta gör det möjligt för bakterierna att anpassa sig till förändrade miljöer. Därför kan profagers förmåga att fungera som mikrobiella marionettmästare, som kontrollerar en rad bakteriella funktioner, studeras.

Det finns två stora hinder för en effektiv analys av profagbegränsat genuttryck. För det första är tillgången på mottagliga värdar en nyckelfråga. Per definition är profager redan inkorporerade i deras specifika värdgenom, så det är utmanande att hitta en mottaglig vildtypsvärd för att jämföra det globala genuttrycket i närvaro och frånvaro av profagen. Detta kan åstadkommas antingen genom nyinfektion av en annan mottaglig värd eller genom att profagen avlägsnas från det ursprungliga vildtypsisolatet, utan att resten av värdgenomet störs. Det andra hindret ligger i den heterogena karaktären hos lysogena populationer. Vissa profager bryts ned genom mutation eller rekombination för att bli "kryptiska", vilket innebär att de är fixerade på en specifik plats i bakteriegenomet. Andra profager är dock "aktiva" och kan induceras i en replikativ, lytisk cykel spontant eller efter exponering för inducerande faktorer. I många lysogena kulturer innebär den spontana induktionshastigheten att en del av bakteriecellerna alltid genomgår lytisk fagreplikation14,15,16. En hög nivå av uttryck av sena faggener i dessa populationer maskerar det låga genuttrycket som är associerat med lysogenbegränsat genuttryck11,17. Andelen lysogener som genomgår spontan profaginduktion kan variera med tillväxttillståndet, tillväxtförhållandena eller andra utlösande faktorer. Därför, för att studera effekterna av profager på lysogenet, måste spontana profaginduktionshändelser minimeras så mycket som möjligt genom att optimera tillväxtförhållandena för att gynna det lysogena tillståndet.

Denna studie redovisar det förberedande arbete som gjorts för att undersöka påverkan av en uppsättning samboende profager från Liverpool Epidemic Strain (LES) av Pseudomonas aeruginosa. Aktiva profager inducerades och isolerades från LES och användes för att infektera värdstammen av modell P. aeruginosa, PAO116,18,19. Hela genomet hos vildtypsstammen av P. aeruginosa, PAO1, och dess lysogen, PAO1Φ2, sekvenserades (på ett djup av 30x täckning) för att säkerställa identiteten hos vildtypsstammen och för att bekräfta att lysogenen var isogen. LES har associerats med ökad morbiditet och mortalitet hos patienter med cystisk fibros, och LES-fager 19 har föreslagits för att underlätta anpassning till lungmiljön med cystisk fibros16,19,20. Trots starka bevis för att dessa profager påverkar biologin hos deras värd20,21, är majoriteten av deras genfunktioner ännu inte karakteriserade, och de specifika mekanismerna för interaktion är dåligt förstådda. En transkriptomikmetod kan empiriskt avslöja profaggenens funktioner i en kontrollerad värdbakgrund. Eftersom spontan induktion kan påverka uttrycksprofiler beskriver den här artikeln hur man optimerar tillväxtförhållandena för att gynna det lysogena tillståndet. Sådan synkronisering av kulturer kan valideras med realtids-PCR för att kvantifiera uttrycksnivåerna av viktiga genetiska markörer som är associerade med avgörande steg av LES-fagreplikation i PAO1. Samma tillvägagångssätt har tidigare använts för att identifiera de profagbegränsade funktionerna hos Shiga-toxigenic fager som påverkar motilitet, syraresistens och antimikrobiell resistens i Escherichia coli11,17,21,22.

Protocol

1. Skapa en valbar indikatorvärd (bild 1)

OBS: Fagkulturlysat kan innehålla kontaminerande celler från den ursprungliga bakterievärden. Att ha en antibiotikaresistent indikatorstam möjliggör diskriminering mellan indikatorstammen och den ursprungliga bakteriella värden för profagen. Genom att använda en valbar indikatorstam kan man räkna de infektiösa fagpartiklarna korrekt utan att behöva centrifugera eller filtrera bort fagen från lysogencellerna efter fagförstärkningsstegen. Den valbara indikatorvärdstammen minskar också tiden och antalet steg för fagräkning så att flera tillstånd kan testas samtidigt.

  1. Identifiera en lämplig indikatorvärdstam som är mottaglig för lytisk och lysogen infektion med hjälp av den tempererade fagen av intresse. Laboratoriestammen PAO118,20 av P. aeruginosa användes och är känslig för de tre LES-fagerna (LESΦ2, LESΦ3 och LESΦ4).
  2. Välj ett lämpligt selektivt medel (rifampicin användes här) och utför en buljongspädningsanalys för att bestämma den minsta hämmande koncentrationen (MIC) för indikatorvärden (16 μg·ml−1 är MIC för PAO1)23,24.
  3. Exponera indikatorvärdkulturerna sekventiellt för ökande koncentrationer av det selektiva ämnet i lysogenibuljong (LB), med början under MIC (i detta fall 5 μg·ml−1), under 18–24 timmar, med skakning och vid 37 °C.
  4. Överför den kultur som växer med den högsta koncentrationen i förhållandet 1:100 (inokulat till medium) till tvåfaldigt ökade koncentrationer av det selektiva ämnet (18–24 timmar varje gång) tills MIC har ökats tillräckligt. PAO1 blev en rifampicinresistent stam (PAO1-RifR) vid 300 μg·ml−1 rifampicin.

2. Direkt tidsmässig uppräkning av spontan induktion (figur 2)

  1. Sätt upp startkulturer över natten av både lysogen (t.ex . P. aeruginosa PAO1 lysogen med LES-fager) och indikatorvärd (PAO1-RifR) genom att inokulera en enda koloni i 5 ml LB och inkubera vid 37 °C med skakning vid 180 rpm (18–24 timmar).
  2. Sätt upp färska lysogen- och indikatorvärdkulturer genom att inokulera nattkulturerna i 100 ml LB i förhållandet 1:100 och inkubera vid 37 °C med skakning (180 rpm).
    1. Övervaka lysogentillväxten genom att mäta OD600 och livskraftig räkning med hjälp av Miles Misra-tekniken25. För att göra detta, samla in ett 1 ml prov från varje lysogenkultur varje timme från inokuleringspunkten i 8 timmar.
    2. Späd provet i serie omedelbart efter insamlingen genom att tillsätta 100 μl av provet till 900 μl av respektive medium. Virvla väl vid maximal hastighet, kassera spetsen vid varje utspädning och fortsätt spädningsserien från 10−1 till 10−9.
    3. Spotta ut 10 μl av de erforderliga spädningarna i tre exemplar på en LB-agarplatta, låt torka och inkubera vid 37 °C i 18–24 timmar.
    4. För att beräkna antalet livskraftiga bakterieceller, hitta en utspädning med lätt räknade kolonier. Räkna antalet kolonier på varje plats och använd sedan följande formel:
      Equation 1
      OBS: När lysogenkulturen växer kommer aktiva fagpartiklar att produceras genom spontan induktion. Produktionen av infektiösa fager innebär att transkriptomet i lysogenpopulationen nu är kontaminerat med lytisk replikationscykelassocierat genuttryck från den lytiska fagreplikationssignalen och motsvarande värdcellssvar. Det är därför viktigt att identifiera det tillväxtstadium där andelen lysogena celler i förhållande till fria infektiösa fagpartiklar är som högst för att begränsa så mycket bakgrundstranskriptionsbrus (som genereras av det lytiska fagtranskriptomet) som möjligt i datamängden.
  3. För att räkna de infektiösa fagpartiklarna i varje temporalt prov, inokulera 5 ml steril 0,4 % bakteriologisk agar i LB (toppagar) med 100 μL indikatorvärd i mitten av exponentialfasen (OD600: 0,4–0,5; i detta fall PAO1-RifR) i närvaro av ett lämpligt selektivt ämne (50 μg·ml-1 rifampicin i detta fall, eftersom MIC-värdet för PAO1-värden endast är 16 μg·ml−1; se materialförteckning, rad 8 och rad 9)
    1. Spotta ut 10 μl av samma seriespädning (se steg 2.2.2) på det inokulerade övre agarskiktet och låt torka innan det inkuberas vid 37 °C i 18–24 timmar.
    2. För att beräkna de infektiösa fagpartiklarna, hitta en utspädning med lätt räknade plack. Räkna antalet plaketter på varje plats.
      Equation 2
    3. Hitta den tid/det tillstånd för vilket den spontana induktionen per CFU (kolonibildande enhet) är minimal för de fortsatta experimentella stegen.

3. Beredning av icke-inducerade och inducerade lysogenkulturer för RNA-extraktion (figur 3)

  1. Skapa en ny odling över natten genom att inokulera en enda koloni av lysogenet i 5 ml LB och inkubera vid 37 °C med skakning (180 rpm) i 18–24 timmar.
  2. Subkultur: Nattodling i 80 ml LB i förhållandet 1:100 i åtta 250 ml kolvar.
  3. Märk den första kolven som "oinducerad" och de andra som "inducerad" tillsammans med tidpunkterna för varje prov som ska tas (dvs. "inducerad t = 0", "inducerad t = 10 min", "inducerad t = 20 min" osv. Figur 3).
  4. Efter 90 minuters inkubation, när OD600 ligger mellan 0,1 och 0,2, eller vid tidpunkten för minimal spontan induktion (se diskussion), tillsätt 4 μl 1 % isättika (v/v) till den icke-inducerade kolven (figur 3).
    OBS: Eftersom induceringsmedlet i detta arbete tillverkades med 1 % isättika som lösningsmedel, tillsattes samma mängd lösningsmedel ensamt som ett kontrollsteg. Alternativa kontroller kan övervägas beroende på beredning av olika inducerare.
  5. Tillsätt 80 ml odling från den icke inducerade kolven till 720 ml steril LB och tillsätt omedelbart stopplösningen (iskall 5 % [v/v] fenol, pH 4,3, 95 % [v/v] etanol) med en volym som är 20 % av odlingsvolymen (160 ml) och inkubera på is i minst 30 minuter och högst 2 timmar för att stabilisera RNA-transkripten12. 26,27. Detta är det icke-inducerade provet.
  6. Tillsätt de återstående kulturerna i sju 250 ml kolvar (figur 3) med MIC av ett lämpligt induceringsmedel (i detta fall 25 mg·ml-1 norfloxacin, berett i 1 % isättika [w/v], använt vid en slutlig koncentration av 1 μg·ml-1 ), blanda väl och inkubera vid 37 °C och skaka vid 180 varv per minut i 1 timme.
    OBS: Detta steg kommer att tvinga lysogenkulturen till ett mer samordnat tillstånd av lytisk replikation. De flesta celler i kulturen kommer att börja genomgå lytisk produktion av infektiösa fagpartiklar.
  7. Låt cellerna återhämta sig genom att tillsätta 80 ml odling från den inducerade kolven till 720 ml steril LB, vilket effektivt späder ut induceringsmedlet. Skörda bakteriecellerna från varje kolv var 10:e minut från tid 0 till 1 timme genom att tillsätta en stopplösning, som nämns i steg 3.5.
    OBS: Stopplösningen stabiliserar RNA:t i upp till 2 timmar. För att förbättra provets stabilitet ska dock alla ytterligare steg utföras vid 4 °C.
  8. Skördas genom centrifugering vid 10 000 x g i 15 minuter vid 4 °C så snart som möjligt, dock högst 2 timmar efter behandlingen för att undvika RNA-nedbrytning.
  9. Kassera supernatanten och återsuspendera försiktigt bakteriepelletsen i restvätskan med hjälp av en justerbar automatisk pipett innan du överför varje sample till ett 1.5 ml mikrofugerör.
  10. Centrifugera mikrofugerören med hög hastighet (13 000 x g) i en mikrofuge vid 4 °C i 1 minut och kassera resterna.
  11. Snabbfrys pelletsen genom att sänka varje förseglat mikrofugerör i flytande kväve. Detta kommer att bidra till en effektiv lys av cellerna för RNA-extraktion.
  12. Tillsätt TRIzol (1 ml) till varje fryst pellet och homogenisera suspensionen genom pipettering (virvla inte). Förvaras vid −80 °C tills det är dags att utföra RNA-extraktion för alla prover.
    OBS: Protokollet kan pausas vid denna tidpunkt.
  13. Upprepa steg 3.1–3.13 med tre biologiska replikat.

4. Isolering av RNA från icke-inducerade och inducerade lysogenkulturer

KRITISK: Alla dessa steg bör utföras i en RNase-fri miljö28. Arbetsbänkarna ska torkas av med 10 % NaClO eller proprietära RNase-inaktivatorer. Laboratorieutrustningen bör behandlas med RNas-hämmare såsom DEPC-behandling, och nukleasfritt vatten bör användas i alla reaktioner.

  1. Tina de frysta TRIzol-behandlade pelletsen från steg 3.12 på is och tillsätt 400 μL kloroform av molekylärbiologisk kvalitet.
  2. Rör om injektionsflaskorna väl genom inversion i 10 s för att slutföra lyseringen av alla celler (virvla inte ). Inkubera sedan i rumstemperatur (21 °C) i 2–5 minuter.
  3. Separera vattenskiktet från TRIzol/kloroformblandningen genom centrifugering med en kyld mikrofuge vid 4 °C och 13 000 x g i 15 minuter.
  4. Samla upp vattenfasen (~ 500 μL, toppskiktet) med en 1 000 μL pipett, var noga med att inte störa interfasen eller den organiska fasen (bottenskiktet). Överför till ett nytt 1.5 ml mikrofugerör.
  5. Tillsätt 450 μl isopropanol av molekylärbiologisk kvalitet till den separerade vattenfasen, blanda väl genom invertering (virvla inte ) och inkubera vid rumstemperatur (21 °C) i 30 minuter.
  6. Återvinn RNA genom centrifugering med en kyld centrifug vid 4 °C och 13 000 x g i 30 minuter.
  7. Kassera supernatanten utan att störa RNA-pelleten och tvätta pelleten två gånger med 800 μl 70 % etanol beredd med nukleasfritt vatten (pipettera inte upp och ner). Säkerställ stabiliteten hos RNA-pelleten genom att upprepa centrifugeringssteget i 5 minuter efter varje tvätt.
  8. Kassera etanolen och lufttorka pelleten.
    OBS: Aspirera etanolen runt pelleten försiktigt med en 10 μL mikrospets och torka pelleten genom att vända röret på rent läskpapper. RNA-pelleten ska bli färglös och kanterna ska vara rufsiga och synliga. Att torka för lite kan lämna kvarvarande etanol som kan påverka nedströmsprocesser, och att torka pelleten för mycket kan göra resuspensionen svår.
  9. Återsuspendera RNA:t i nukleasfritt vatten (50 μl) genom inkubation vid 65 °C på termoskakapparat med intermittent blandning (var 30:e sekund) i totalt 3–5 minuter.
    KRITISK: 2'-OH-gruppen av RNA kan katalysera autoklyvningen av RNA-strängar vid en hög temperatur över 65 °C och ett högt pH. Temperaturer under 65 °C fördröjer resuspensionen av rest-DNA, vilket begränsar mängden DNA som måste brytas ner i ett senare skede med DNas I-uppslutningen. Därför är det viktigt att hålla temperaturen vid 65 °C för att få de bästa proverna.
    OBS: Protokollet kan pausas vid denna tidpunkt och samples kan förvaras vid −80 °C.

5. Avlägsnande av kontaminerande DNA från RNA genom DNase-behandling

  1. För att avlägsna kontaminerande DNA från det totala RNA:t före den första strängens cDNA-syntes, tillsätt en 0,1 volym 10x DNas-buffert och 1 μL DNas-enzym till 10 μg totalt RNA. Blanda röret försiktigt och inkubera vid 37 °C i 30 minuter.
  2. Återsuspendera DNase-inaktiveringsreagenset och tillsätt minst 2 μl eller 10 volymprocent av den totala reaktionsvolymen. Blanda väl och inkubera proverna i 5 minuter vid rumstemperatur (21 °C) under återdispergeringen av DNase-inaktiveringsreagenset.
  3. Pelletera DNase-reagenserna genom centrifugering med en mikrocentrifug på 10 000 × g i 1,5 min.
  4. Överför supernatanten som innehåller RNA till ett nytt rör utan att störa pelleten.
    OBS: Kontrollera kvaliteten på RNA med en UV-spektrofotometer i skala 1 μL och mikrofluidbaserad nukleinsyradatoranalysator enligt tillverkarens instruktioner; renat totalt RNA kan lagras vid −80 °C. För qRT-PCR kan RNA användas direkt vid denna tidpunkt. För känsligare nedströmsprocesser, såsom RNA-sekvensering, som kräver sträng provkvalitet, måste ett A260/230-förhållande på ε 2,0 uppnås för att gå vidare.
  5. Fyll volymen av den DNA-fria RNA-lösningen till 500 μl med nukleasfritt vatten.
  6. Tillsätt 50 μl nukleasfritt 3 M natriumacetat (pH 5,3) och 495 μL isopropanol. Blanda väl och inkubera i rumstemperatur i 30 min.
    OBS: Detta steg kommer att fälla ut RNA.
  7. Återvinn RNA genom centrifugering vid 13 000 x g och 4 °C i 30 minuter.
  8. Tvätta RNA-pelleten tre gånger med iskall 70 % etanol genom att centrifugera proverna vid 13 000 x g och 4 °C i 5 minuter efter varje tvätt för att avlägsna salterna helt.
  9. Kontrollera kvaliteten på RNA med hjälp av en UV-spektrofotometer i skala 1 μL och mikrofluidbaserad nukleinsyradatoranalysator enligt tillverkarens instruktioner; renat totalt RNA kan lagras vid −80 °C.
    OBS: Guide29 användes för att uppnå RNA-kvalitetsstandarderna. Om förhållandet A260/230 är <2,0, upprepa sedan steg 5.5–5.9.

6. Kvalitativ och kvantitativ analys av DNas-fritt RNA

  1. Validera DNase-behandlingens effektivitet för varje sample genom att utföra en kvantitativ PCR med 16S rRNA-primrar (tabell 2) med 1 μg totalt RNA och bekräfta att ingen amplifieringsprodukt produceras.
    OBS: De idealiska primrarna för att bedöma gDNA-kontaminering skulle vara primers som är utformade för att glödga vid intron-exon-korsningar eller regulatoriska regioner i prokaryoter eller vid transkriptionellt inaktiva platser30,31.
  2. Bestäm RNA-integritetsnumret (RIN) med hjälp av en mikrofluidbaserad nukleinsyradatoranalysator enligt tillverkarens instruktioner.
    OBS: Samples som visar ett RIN ≥ 9 bör användas för den första strängsyntesen. Prover som visar ett referensnummer < 9 bör kasseras och isoleringsstegen (1.1–5.4) bör upprepas.
  3. Kvantifiera den totala RNA-koncentrationen med hjälp av HS RNA-analyssatsen och en fluorimeter enligt tillverkarens instruktioner.

7. Första strängens cDNA-syntes

  1. Bered en RNA-primerblandning för varje prov genom att blanda 1 μg totalt RNA med 1 μl slumpmässiga hexamerer (50 ng·μL−1) och 1 μL 10 mM dNTP-blandning. Justera sedan den totala volymen till 10 μL med nukleasfritt vatten.
  2. Inkubera reaktionen vid 65 °C i 5 minuter och lägg den på is i 1 minut.
  3. Bered en cDNA-syntesblandning för varje prov genom att tillsätta 2 μl 10x RT-buffert; 4 μl 25 mM MgCl2; 2 μL 0,1 M DTT; 1 μl RNashämmare (40 U·μL−1); och 1 μL av det omvända transkriptionsreagenset (200 U·μL−1) i angiven ordning.
  4. Tillsätt cDNA-syntesblandningen till RNA/primerblandningen. Blanda försiktigt och centrifugera proverna kort för att samla upp komponenterna i botten av röret.
  5. Grunda blandningen genom att inkubera proverna i 10 minuter vid 25 °C, följt av 50 minuter vid 50 °C. Avsluta reaktionerna genom att inkubera vid 85 °C i 5 minuter och kyl på is.
  6. Tillsätt 1 μl RNas H till varje rör och inkubera vid 37 °C i 20 minuter för att avlägsna RNA från DNA:RNA-hybriden.
  7. Späd slutligen ut cDNA-syntesreaktionen till en total volym på 80 μL och förvara den vid −80 °C tills vidare användning.
    OBS: Protokollet kan pausas vid denna tidpunkt.

8. Standardkurva och kvantitativ (q)-PCR för bestämning av uttrycksnivåerna för markörgener som indikerar olika stadier av fagreplikation

  1. Identifiera en uppsättning målgener som kan fungera som markörer för varje steg i replikationen av fagen av intresse. I vårt fall var dessa som beskrivs i tabell 2.
  2. Amplifiera var och en av målgenerna från mallens genomiska DNA med hjälp av relevanta primrar och med användning av PCR med följande amplifieringsbetingelser: initial denaturering vid 95 °C i 2 minuter; Denaturering vid 95 °C i 30 s. glödgning vid optimal glödgningstemperatur beroende på primers (58 °C användes här) i 30 s; förlängning vid 72°C i 1 min; och slutlig förlängning vid 72 °C i 5 minuter.
  3. Rena varje amplikon med ett PCR-reningskit och klona dem i en TA-kloningsvektor enligt tillverkarens instruktioner. Verifiera sekvensen för varje klonad produkt med Sanger-sekvensering.
    OBS: Protokollet kan pausas vid denna tidpunkt.
  4. Beräkna kopietalet för enskilda plasmider med hjälp av följande ekvation20:
    Equation 3
  5. Bered en standardmall för varje markörgen genom att seriespäda plasmid-DNA från 109 kopior/μl till 102 kopior/μl i nukleasfri sterilH2O-klassav molekylär kvalitet.
  6. Utför kvantitativ PCR enligt tillverkarens instruktioner för det föredragna qPCR-systemet med 1 μl cDNA (från steg 7.7) för varje prov i tre exemplar, tillsammans med respektive plasmidstandard i tre exemplar. utföra PCR i en 96-hålars platta för varje mål.
  7. Plotta Log DNA-kopienumret (x-axeln) kontra cykeltröskeln (y-axeln, Ct) och använd en lämplig plattform som Excel eller R för att utföra en linjär regressionsberäkning för att visa bestämningskoefficienten (R2) och en linjär ekvation.
    OBS: Bestämningskoefficienten bör vara över 0.98.
  8. Uppskatta antalet kopior för varje mål med hjälp av den linjära ekvationen (y = mx + b) härledd från den linjära regressionen (steg 8.7), där y är den uppskattade Ct. x är logaritmarnas DNA-kopienummer, m är lutningen på den linje som definierar förändringen i Ct med avseende på antalet DNA-kopior, och b är skärningspunkten på y-axeln som representerar den uppskattade Ct för en DNA-kopia32.
  9. För varje markörgen beräknas effektiviteten av PCR-amplifieringen (E) med hjälp av parametrarna från den linjära regressionen av standardkurvan och följande ekvation, där m är lutningen härledd från steg 8.7 och steg 8.8:
    Equation 4
  10. Validera alla primers med avseende på deras procentuella effektivitet med hjälp av följande ekvation:
    OBS: Effektiviteten måste ligga i intervallet 90%–110%.
    Equation 5
  11. Beräkna det absoluta antalet kopior av DNA med hjälp av följande formel:
    Equation 6
    där Ct (steg 8.8) är cykeltröskeln, b är skärningspunkten (steg 8.8), m är lutningen (steg 8.8) och E är effektiviteten av PCR-amplifiering (steg 8.9).
    KRITISK: Vid jämförelse av amplifieringen av två eller flera mål med q-PCR måste PCR-effektiviteten beräknas för varje mål för att jämföra det absoluta antalet DNA-kopior.
  12. I denna studie användes 16S rRNA-, proC- och rpoD-generna som de allmänna interna kontrollerna, och gyrB användes som induktionskontroll33,34,35.
    OBS: När du väljer interna kontroller från RNA seq-data är det bäst att välja interna kontroller som inte förändras i uttrycksnivåer för de testade förhållandena. Noggranna överväganden av lämpliga kontroller är alltid viktiga för en meningsfull tolkning av resultaten.

Representative Results

I detta arbete användes den direkta tidsmässiga räkningen av fagproduktion från en PAO1 LESΦ2-lysogenkultur odlad under icke-inducerande förhållanden för att bestämma effekten av spontan LESΦ2-induktion. Fagtätheten var som lägst med ett medelvärde på ~2,61 x 106 plackbildande enheter (PFU)·ml−1 2 timmar efter subkultur i färskt medium under den tidiga exponentiella tillväxtfasen, vilket tyder på att lysogeni var det dominerande tillståndet. LESΦ2-titern ökade snabbt till ett medelvärde på ~2,4 x 108 PFU·mL−1 inom 4 timmar och nådde den högsta densiteten efter 6 timmar (medelvärde ~5,83 x 109 PFU·mL−1; Figur 4).

Minimal spontan induktion observerades under den tidiga logaritmningsfasen av lysogentillväxten (efter 2 timmar). Den mätbara närvaron av fager i odlingsmediet var dock resultatet av många tidigare händelser, inklusive följande: packningen av nukleinsyror i proteinhuvuden, sammansättningen av proteiner till fagpartiklar och uttrycket av sena faggener, mellanstadiefaggener och tidiga regulatoriska faggener. Det var viktigt att fånga de infekterade cellerna innan uttrycket av de fagassocierade replikationshändelserna; Därför valdes 90 min för att låta kulturen växa innan induktion. För att fånga genuttrycksprofilen för PAO1 skördades LESΦ2-lysogenprover från en kultur före induktion och efter induktion under en 90-minutersperiod, som nämnts i steg 3.4. Denna 90-minuterstidpunkt är långt innan höga nivåer av spontan induktion av den inneboende profagen detekteras av plackanalysen från steg 2.3.2. Eftersom bakteriecelltätheten var låg under den tidiga exponentiella tillväxten, skalades odlingsvolymerna upp till 800 ml för att säkerställa gott om material för genuttrycksstudierna. Proverna samlades in från den icke-inducerade kulturen och inducerade kulturer var 10:e minut, och RNA extraherades för att kartlägga uttrycksprofilen för nyckelmarkörerna för lysogeni och lytisk replikation under bakterietillväxten. Totalt RNA renades och validerades för frånvaro av genomiskt DNA med hjälp av qPCR-analyser riktade mot 16S rRNA-genen (steg 6.1). Proverna som nådde ett RIN-≥ 9 klarade kvalitetskontrollen och konverterades till cDNA.

Det annoterade LESΦ2-genomet undersöktes för att identifiera gener som är välkända aktörer i de lysogena och lytiska replikationscyklerna hos tempererade fager. Dessa identifierade gener användes sedan för att validera qRT-PCR för uttrycksprofilering av de lysogencykelbegränsade och lytiska cykelassocierade generna från inducerade och icke-inducerade kulturer. Vi kvantifierade det absoluta antalet DNA-kopior och genomförde ett Wilcoxon-signed-rank-test med R36 för att jämföra uttrycksnivåerna i icke-inducerade och inducerade kulturer (Figur 5). En markant ökning av uttrycket av cro-genen (en tidig markör för lytisk replikation) från ~2,31 x 109 kopior i icke-inducerade kulturer till ~3,02 x 10 11 kopior 30 minuter efter induktion (Wilcoxon signed-rank test: p < 0,01) observerades. På liknande sätt visade O-proteiner och P-proteiner, som är mittstegsmarkörer för lytisk replikation (och förutspås vara involverade i faggenomreplikation), också signifikant uppreglering från ~1,74 x 108 till ~1,25 x 10 10 kopior (Wilcoxon signed-rank test: p < 0,01) och från ~ 6,05 x 102 till ~5,68 x10 5 kopior (Wilcoxon signed-rank test: p < 0,01). Slutligen användes de svansassocierade strukturella generna som sena markörer för den lytiska replikationscykeln. Återigen observerade vi en signifikant ökning av uttrycket från ~2,31 x 106 kopior i icke-inducerade kulturer till ~4,38 x 108 kopior 30 minuter efter induktion (Wilcoxon signed-rank test: p < 0,01). Således bekräftade kvantitativa RT-PCR-data att genuttrycket av väletablerade markörgener för lytisk replikation följde den förväntade trenden, med de tidiga, mellersta och sena markörerna som visade flerfaldigt differentiellt uttryck i den förutsagda ordningen (Figur 5). Eftersom uttrycket av markörerna för lytisk replikation uppreglerades 30 minuter efter återhämtning, anses detta vara en lämplig representativ tidpunkt för att studera det transkriptomiska landskapet av aktiva tempererade fager och deras bakterievärdar under den lytiska cykeln.

Vi observerade ett visst uttryck av lytiska gener under icke-inducerade förhållanden, vilket bekräftar att en viss spontan induktion alltid sker, även i optimerade kulturer där lysogenantalet representeras med den högsta kvoten CFU till frisatt PFU i den tidiga logfasen. Detta innebär att det alltid kommer att finnas en viss nivå av "brus" i transkriptomikdata, vilket förstärker vikten av noggrant förberedda kontroller, inklusive inducerade och icke-inducerade kulturer. Det lämpliga valet av de interna kontrollgenerna för att bestämma veckförändringarna i uttrycket bygger på att noggrant undersöka transkriptomikdata för att identifiera gener som uttrycks på samma nivå i både de icke-inducerade och inducerade proverna. Våra preliminära resultat tyder på att rpoD var den mest tillförlitliga kontrollgenen som testades och hade det mest stabila uttrycket (~1,71 x 10 5 kopior före induktion och ~3,33 x 105 kopior 30 minuter efter induktion; Wilcoxon signed-rank test: p = 0,3594) jämfört med 16S rRNA- eller proC-generna (figur 5). Variabiliteten i uttrycket för de interna kontrollerna ledde till mätning av det absoluta antalet transkriptioner. Framtida undersökning av transkriptomikdata kommer att stödja valet av lämpliga interna kontroller för vidare validering.

Ci-genen användes i vår genprofilering, eftersom den är en välkänd markör för lysogeni. Jämfört med markörerna för lytisk replikation var uttrycket av ci-genen relativt stabilt (Figur 5), men antalet kopior av denna gen var betryggande högt i de icke-inducerade odlingarna jämfört med markörerna för lytisk replikation. Dessa data överensstämmer med de låga PFU-talen i samma prover, vilket bekräftar att högt repressoruttryck var associerat med lägre nivåer av fagproduktion. De data som rapporteras här visar att uttrycket av cI-transkriptionen för just denna inte är signifikant nedreglerad efter induktion, vilket ses i Stx-fagerna 11,17. Repressoraktiviteten kontrolleras normalt på både transkriptions- och posttranslationell nivå, så repressorgenen kan transkriberas, men det resulterande proteinet utsätts omedelbart för autoklyvning. Ytterligare experiment krävs för att validera transkriptionella och posttranslationella kontroller. Dessutom, från vår standardkurva, verkar den lägsta detektionsgränsen för qPCR vara ~102 kopior.

Tillsammans validerar våra resultat från plack- och qRT-PCR-analyser vår strategi för odling och RNA-provberedning för att generera en välkontrollerad input för RNA-Seq-experiment. De icke-inducerade odlingarna i den tidiga exponentiella fasen uppvisade låga nivåer av spontan induktion och lytiskt genuttryck, vilket tyder på dominansen av lysogeni. Däremot visade de kulturer som isolerades 30 minuter efter induktion signifikanta ökningar i uttrycket av markörgener som indikerar dominansen av lytisk replikation.

Figure 1
Figur 1: Protokollet för att skapa den rifampicinresistenta indikatorvärden (Created with BioRender.com). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Den experimentella designen för att räkna PFU och CFU för en lysogen från samma prov. (Skapad med BioRender.com) Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Den experimentella designen för provtagningsinducerade och icke-inducerade kulturer för RNA-isolering. (Skapad med BioRender.com) Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Tidsmässig uppräkning av spontan induktion. Tidsmässig räkning av spontan produktion av LES-profag med PFU från PAO1 Φ2-lysogen med samtidig CFU, n = 8 (två biologiska och fyra tekniska replikat). Felstaplarna representerar standardavvikelsen. De mörkröda prickarna indikerar CFU·mL−1 i LB; de mörkblå punkterna anger PFU·mL−1 i LB. Den spontana frisättningen av den infektiösa φ2-fagen av lysogenerna är på den lägsta mätbara nivån 2 timmar efter inokuleringen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Absolut antal kopior av målmarkörgenerna. Det absoluta antalet kopior av fagmarkörgener bekräftar de förutsagda uttrycksmönstren, härledda med hjälp av RT-qPCR, för gener som förväntas spela viktiga roller i lysogeni och lytiska cykler. Prickarna representerar både tre biologiska och tre tekniska replikat (n = 9). (A) Den röda rutan representerar lysogenimarkören, cI; (B) grönt representerar den tidiga lytiska markören, cro; (C,D) blått representerar de mellersta lytiska markörerna, DNA-replikationsgener; (E) magenta representerar den senlytiska markören, svansstrukturella gener; (F–H) grått representerar värdmarkörerna som användes som interna kontroller, och (I) vitt representerar DNA-gyras B, som användes som induktionskontroll. De heldragna horisontella linjerna visar medianen för fördelningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Primers som designats i denna studie. Sekvenserna av specifika primers för markörgenerna och interna kontroller som används i denna studie tillhandahålls, tillsammans med deras motsvarande NCBI-anslutnings-ID. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Effektiviteten hos de primers som användes i denna studie beräknad med hjälp av qPCR-standardkurvan. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Discussion

Skapandet av en valbar indikatorvärd, som tidigare använts i plackanalyser för att mer exakt kvantifiera den spontana induktionen av Stx-från E. coli MC106137,38,39, har beskrivits här för P. aeruginosa- LESΦ2. Denna intervention har den extra fördelen att den minskar provbearbetningsstegen och tiden, vilket möjliggör samtidig bedömning av spontana induktionshastigheter under flera odlingsförhållanden. Det finns en risk för att andra mutationer genereras under skapandet av rifampicinresistenta varianter40; I detta arbete användes dock den utvecklade stammen endast som en indikatorvärd för räkning av plack från kulturer av intresse och inkluderades inte i den transkriptomiska analysen. Så länge den valbara indikatorstammen förblir lika mottaglig för infektion av fagen av intresse, finns det ingen oro för andra förvärvade mutationer. Trots detta upptäcktes inga skillnader i polymorfismprofilerna för restriktionsfragmentets längd genom pulsfältsgelelektrofores (PFGE) analys av PAO1WT och PAO1RIF (data visas inte).

När man väljer värdceller är det sällsynt att hitta en indikatorstam som inte redan hyser prophager. Som ett exempel härbärgerar PAO1 den filamentösa profagen Pf4. De experimentella kontrollerna för denna studie var utformade för att direkt kunna undersöka genuttrycket hos specifika fager (i detta fall LES prophage 2) och de effekter denna har på bakteriellt genuttryck. I jämförelsen av transkript från PAO1 som bär LES-profag 2 och saknar LES-profag 2 (både lysogen och icke-lysogen bär på det endogena Pf4), som fungerar som interna kontroller för att utesluta effekten av Pf4 på värden. Dessutom har det visats att Pf4 vanligtvis inte orsakar lys i sin värdcell41 och därför inte kan förvirra resultaten av dessa experiment.

Det är väl etablerat att noggrann kvalitetskontroll är avgörande vid provberedning för att producera meningsfulla omics-data42. Som tidigare beskrivits11 utförs dock sällan den noggranna karakteriseringen av profagaktivitet vid beredning av lysogenkulturer för sådana studier. Här beskriver vi våra systematiska protokoll för att förbereda en välkontrollerad och optimerad uppsättning kulturer för transkriptomiska studier för att bättre utforska interaktionerna mellan bakterier och tempererade fager. Populationens synkronicitet kontrollerades genom att kulturen genomgick minst fyra fördubblingar innan den behandlades med det inducerande antibiotikumet norfloxacin. Genom att bestämma MIC för norfloxacin för stammen i studien kunde vi säkerställa att koncentrationen av induceringsmedlet låg strax över MIC för "induktionsbehandlingen". De behandlade cellerna späddes sedan 1:10 för att sänka norfloxacinkoncentrationen under MIC efter 1 timmes behandling för att cellerna skulle kunna återhämta sig och slutföra fagreplikationsprocessen, vilket slutade med att cellen lyserades och att infektiös fagavkomma frigjordes. Cellerna går in i den lytiska replikationscykeln först efter induktionsstimulus när koncentrationen av norfloxacin har förts under MIC under återhämtningsperioden. I detta fall innebär ett överskott av 1 μg·ml−1 norfloxacin att läkemedlet inte effektivt kan spädas ut under MIC, eftersom MIC för norfloxacin för PAO1 är 0,19 μg·ml−1. Graden av inducerspädning måste vägas mot behovet av återvinning av lysogen och bibehållande av odlingstätheten för att skörda RNA. De data som diskuteras här visar att det är möjligt att synkronisera kulturer för att skapa prover där lysogeni dominerar, vilket minskar bruset från spontan induktion och möjliggör detektion av verkliga lysogenidrivna förändringar i genuttryck. Eftersom det lysogena tillståndet är dominerande i den tidiga exponentiella tillväxtfasen när bakteriecelltätheten är låg, föreslår vi att man skalar upp kulturerna för att skörda tillräckligt med RNA för efterföljande genuttrycksstudier såsom RNA-Seq.

Användningen av norfloxacin som ett inducerande medel för att tvinga in kulturer i den lytiska cykeln är välrapporterad43,44; Detta kommer dock också att påverka uttrycket av andra bakteriegener i processen45,46. För att mildra detta bör RNA-bibliotek från kontrollkulturer av vildtyp som odlats under samma inducerande och icke-inducerande förhållanden inkluderas i RNA-Seq-experiment. Användningen av interna kontroller och nyckelmarkörgener för att validera stadierna av fagreplikation med qRT-PCR är också avgörande för korrekta jämförelser. Kvantitativ RT-PCR-profilering kan inte tolkas genom att jämföra det absoluta antalet transkript för varje gen vid olika tidpunkter; Det är profilens form som spelar roll. För det första har endast en liten region i transkriptet för någon gen provtagits, så om det är ett kortlivat eller mer långlivat elementär okänt. Visst visar RNA-Seq-kartläggning av transkript att densiteten av kartläggningsdata varierar avsevärt över längden på en gen. För det andra är det formen på genuttrycksprofilen som bör tolkas för en markörgen som är associerad med den lytiska cykeln eller den lysogena livsstilen eller till och med frikopplad från fagregleringskretsarna11. Spontan induktion är ett verkligt problem i lysogenodling och kommer alltid att resultera i uttryck av lytiska cykelassocierade gener. Profilering visar dock att de gener som är associerade med den lytiska replikationscykeln undertrycks i sitt uttryck före induktion (minst två logaritmiska veck) och uppreglerat efter induktion.

De tidigare genomförda transkriptomiska analyserna av Stx-faginteraktioner med E. coli stöder en grundlig förståelse av faggenerna som är involverade i att upprätthålla lysogeni och utlösa den lytiska cykeln11,17. För närvarande har LES-fagerna hos P. aeruginosa annoterats, men deras viktigaste genfunktioner är mindre väl kända. Transkriptomiska studier kommer att göra det möjligt att på nytt annotera LES-profagerna och förbättra vår förståelse av de gener som är involverade i lysogeni- och lytcykeln. Att koppla gensekvens till funktion utgör en stor utmaning i studiet av nya profager, vilket ytterligare belyser behovet av fler studier för att bekräfta faggenens funktioner för produktion av bättre annoteringsverktyg47. Den bredare tillämpningen och anpassningen av protokollen och extra kvalitetskontrollåtgärder som beskrivs i den här videoartikeln kan hjälpa till att avslöja olika profagfunktioner och därmed förbättra annoteringspipelines och förändra vår förståelse av- och bakteriebiologi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAO1 6
LESB58 6
LES phages Induced and purified from LESB58 using Norfloxacin. This study
Lysogeny Broth (LB) Merck 1.10285.500
LB Agar Merck 1.10283.500
Agar Agar Fisher A/1080/53
Top Agar 0.4 g Agar Agar+2.5 g LB Broth in 100 mL water; autoclave and use. -
Rifampicin Sigma (Stock: 50 mg/mL in Methanol- Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use) R3501
Glacial Acetic Acid Fisher 1% (v/v) in water 10060000
Norfloxacin Sigma (Stock: 25 mg/mL of 1% Glacial Acetic Acid-Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use;To avoid freeze thaw cycles, store as small aliquotes) N9890
Phenol saturated with citrate buffer pH 4.3 Sigma P-4682
Molecular Biology grade Ethanol Fisher 16695992
TRIzol Invitrogen 12044977
Chloroform Fisher 11398187
Isopropanol Fisher 17150576
Nuclease-free H2O Invitrogen 10526945
10X TURBO DNase Ambion AM1907
Qubit RNA HS, BR Kit Invitrogen Q10210
Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent 5067-1511
SuperScriptIII first strand synthesis kit Invitrogen 18080051
PCR Reagents Bioline Mytaq Red 2X BIO-25043
qPCR Reagents Sensifast SYBR Hi Rox BIO-92020
PCR purification kit Isolate II PCR and Gel Kit BIO-52060
TA cloning kit TA Cloning Kit, with pCR 2.1 Vector, without competent cells K202040
StepOne Real Time PCR system Thermo Fisher Scientific 4376600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lin, D. M., Koskella, B., Lin, H. C. Phage therapy: An alternative to antibiotics in the age of multi-drug resistance. World Journal of Gastrointestinal Pharmacology and Therapeutics. 8 (3), 162-173 (2017).
  2. Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New tools for genetic manipulations from bacterial immunity systems. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 209-228 (2015).
  3. Santos, S. B., Azeredo, J. Bacteriophage-based biotechnological applications. Viruses. 11 (8), 737 (2019).
  4. Rodríguez-Rubio, L., Jofre, J., Muniesa, M. Is genetic mobilization considered when using bacteriophages in antimicrobial therapy. Antibiotics. 6 (4), 32 (2017).
  5. Hatfull, G. F. Dark Matter of the biosphere: The amazing world of bacteriophage diversity. Journal of Virology. 89 (16), 8107-8110 (2015).
  6. Yukgehnaish, K., et al. PhageLeads: Rapid assessment of phage therapeutic suitability using an ensemble Machine Learning approach. Viruses. 14 (2), 342 (2022).
  7. Seemann, T. Prokka: Rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics. 30 (14), 2068-2069 (2014).
  8. Arndt, D., et al. PHASTER: A better, faster version of the PHAST phage search tool. Nucleic Acids Research. 44, W16-W21 (2016).
  9. Banerjee, S., et al. FINDER: An automated software package to annotate eukaryotic genes from RNA-Seq data and associated protein sequences. BMC Bioinformatics. 22 (1), 205 (2021).
  10. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  11. Veses-Garcia, M., et al. Transcriptomic analysis of Shiga-toxigenic bacteriophage carriage reveals a profound regulatory effect on acid resistance in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8118-8125 (2015).
  12. Owen, S. V., et al. A window into lysogeny: revealing temperate phage biology with transcriptomics. Microbial Genomics. 6 (2), e000330 (2020).
  13. Davies, E. V., Winstanley, C., Fothergill, J. L., James, C. E. The role of temperate bacteriophages in bacterial infection. FEMS Microbiology Letters. 363 (5), 015 (2016).
  14. Livny, J., Friedman, D. I. Characterizing spontaneous induction of Stx encoding phages using a selectable reporter system. Molecular Microbiology. 51 (6), 1691-1704 (2004).
  15. Fogg, P. C. M., et al. Identification of multiple integration sites for Stx-phage Φ24B in the Escherichia coli genome, description of a novel integrase and evidence for a functional anti-repressor. Microbiology. 153 (12), 4098-4110 (2007).
  16. James, C. E., et al. Differential infection properties of three inducible prophages from an epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa. BMC Microbiology. 12, 216 (2012).
  17. Riley, L. M., et al. Identification of genes expressed in cultures of E. coli lysogens carrying the Shiga toxin-encoding prophage Φ24B. BMC Microbiology. 12 (1), 42 (2012).
  18. Stover, C. K., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).
  19. Winstanley, C., et al. Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa. Genome Research. 19 (1), 12-23 (2009).
  20. Davies, E. V., et al. Temperate phages enhance pathogen fitness in chronic lung infection. The ISME Journal. 10 (10), 2553-2555 (2016).
  21. Allison, H. E. Stx-phages: drivers and mediators of the evolution of STEC and STEC-like pathogens. Future Microbiology. 2 (2), 165-174 (2007).
  22. Allison, H. E., et al. Immunity profiles of wild-type and recombinant Shiga-like toxin-encoding bacteriophages and characterization of novel double lysogens. Infection and Immunity. 71 (6), 3409-3418 (2003).
  23. Mori, N., et al. A peptide based on homologous sequences of the β-barrel assembly machinery component BamD potentiates antibiotic susceptibility of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (9), 2173-2181 (2012).
  24. Chojnacki, M., et al. A novel, broad-spectrum antimicrobial combination for the treatment of Pseudomonas aeruginosa corneal infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (10), e00777 (2019).
  25. Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. The estimation of the bactericidal power of the blood. Epidemiology & Infection. 38 (6), 732-749 (1938).
  26. Srikumar, S., et al. RNA-seq brings new insights to the intra-macrophage transcriptome of Salmonella Typhimurium. PLoS Pathogens. 11 (11), e1005262 (2015).
  27. Kröger, C., et al. The transcriptional landscape and small RNAs of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), E1277-E1286 (2012).
  28. Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2019).
  29. Koetsier, G. A practical guide to analyzing nucleic acid concentration and purity with microvolume spectrophotometers. New England BioLabs Inc. , Available from: https://www.neb.com/-/media/nebus/files/application-notes/technote_mvs_analysis_of_nucleic_acid_concentration_and_purity.pdf?rev=c24cea043416420d84fb6bf7b554dbbb (2019).
  30. Saunders, N. A., Lee, M. A. Real-Time PCR: Advanced Technologies and Applications. , Caister Academic Press. Norfolk, UK. (2013).
  31. Bustin, S. A. A-Z of Quantitative PCR. , International University Line. La Jolla, CA. (2004).
  32. Ruijter, J. M., et al. Efficiency correction is required for accurate quantitative PCR analysis and reporting. Clinical Chemistry. 67 (6), 829-842 (2021).
  33. Fothergill, J. L., Neill, D. R., Loman, N., Winstanley, C., Kadioglu, A. Pseudomonas aeruginosa adaptation in the nasopharyngeal reservoir leads to migration and persistence in the lungs. Nature Communications. 5 (1), 4780 (2014).
  34. Huang, J., et al. Temperature-dependent expression of phzM and its regulatory genes lasI and ptsP in rhizosphere isolate Pseudomonas sp. strain M18. Applied and Environmental Microbiology. 75 (20), 6568-6580 (2009).
  35. Savli, H., et al. Expression stability of six housekeeping genes: a proposal for resistance gene quantification studies of Pseudomonas aeruginosa by real-time quantitative RT-PCR. Journal of Medical Microbiology. 52 (5), 403-408 (2003).
  36. Kassambara, A. rstatix: Pipe-Friendly Framework for Basic Statistical Tests. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=rstatix (2022).
  37. McDonald, J. E., et al. High-throughput method for rapid induction of prophages from lysogens and its application in the study of Shiga toxin-encoding Escherichia coli strains. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2360-2365 (2010).
  38. Smith, D. L., et al. Short-tailed Stx phages exploit the conserved YaeT protein to disseminate Shiga toxin genes among Enterobacteria. Journal of Bacteriology. 189 (20), 7223-7233 (2007).
  39. James, C. E., et al. Lytic and lysogenic infection of diverse Escherichia coli and Shigella strains with a verocytotoxigenic bacteriophage. Applied and Environmental Microbiology. 67 (9), 4335-4337 (2001).
  40. Rees, V. E., et al. Characterization of hypermutator Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis in Australia. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (4), e02538 (2019).
  41. Li, Y., et al. Excisionase in Pf filamentous prophage controls lysis-lysogeny decision-making in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 111 (2), 495-513 (2019).
  42. Van Kampen, A. H. C., Moerland, P. D. Taking bioinformatics to systems medicine. Systems Medicine. 1386, 17-41 (2016).
  43. Matsushiro, A., Sato, K., Miyamoto, H., Yamamura, T., Honda, T. Induction of prophages of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 with norfloxacin. Journal of Bacteriology. 181 (7), 2257-2260 (1999).
  44. James, C. E., et al. Lytic activity by temperate phages of Pseudomonas aeruginosa in long-term cystic fibrosis chronic lung infections. The ISME Journal. 9 (6), 1391-1398 (2015).
  45. Shaw, K. J., et al. Comparison of the changes in global gene expression of Escherichia coli induced by four bactericidal agents. Microbial Physiology. 5 (2), 105-122 (2003).
  46. Long, H., et al. Antibiotic treatment enhances the genome-wide mutation rate of target cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), E2498-E2505 (2016).
  47. González-Tortuero, E., et al. VIGA: A sensitive, precise and automatic de novo VIral Genome Annotator. bioRxiv. , (2018).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 203
Förstå effekten av tempererade bakteriofager på deras lysogener genom transkriptomik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Krishnamurthi, R.,… More

Krishnamurthi, R., González-Tortuero, E., Plahe, G., Goodhead, I. B., Fothergill, J. L., James, C. E., Allison, H. E. Understanding the Impact of Temperate Bacteriophages on Their Lysogens Through Transcriptomics. J. Vis. Exp. (203), e64945, doi:10.3791/64945 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter