Summary
Целью этого протокола является определение аутофагических уровней в раке поджелудочной железы и ацинарных клетках поджелудочной железы с помощью иммунофлуоресценции LC3 и количественного определения точек LC3.
Abstract
Аутофагия представляет собой специализированный катаболический процесс, который избирательно разрушает цитоплазматические компоненты, включая белки и поврежденные органеллы. Аутофагия позволяет клеткам физиологически реагировать на стрессовые стимулы и, таким образом, поддерживать клеточный гомеостаз. Раковые клетки могут модулировать свои уровни аутофагии, чтобы адаптироваться к неблагоприятным условиям, таким как гипоксия, дефицит питательных веществ или повреждение, вызванное химиотерапией. Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы является одним из самых смертоносных видов рака. Раковые клетки поджелудочной железы обладают высокой аутофагической активностью из-за транскрипционной апрегуляции и посттрансляционной активации белков аутофагии.
Здесь клеточная линия PANC-1 использовалась в качестве модели раковых клеток поджелудочной железы человека, а линия ацинарных клеток поджелудочной железы AR42J использовалась в качестве физиологической модели высокодифференцированных клеток млекопитающих. В этом исследовании в качестве индикатора состояния активации аутофагии использовали иммунофлуоресценцию связанного с микротрубочками белка легкой цепи 3 (LC3). LC3 представляет собой белок аутофагии, который в базальных условиях демонстрирует диффузный паттерн распределения в цитоплазме (известный как LC3-I в этом состоянии). Индукция аутофагии запускает конъюгацию LC3 с фосфатидилэтаноламином на поверхности новообразованных аутофагосом с образованием LC3-II, связанного с мембраной белка, который помогает в образовании и расширении аутофагосом. Для количественной оценки количества меченых автофагических структур было использовано программное обеспечение с открытым исходным кодом FIJI с помощью инструмента «3D Objects Counter».
Измерение аутофагических уровней как в физиологических условиях, так и в раковых клетках позволяет нам изучать модуляцию аутофагии при различных условиях, таких как гипоксия, химиотерапия или нокдаун определенных белков.
Introduction
Макроаутофагия (обычно называемая аутофагией) представляет собой специализированный катаболический процесс, который избирательно разрушает цитоплазматические компоненты, включая белки и поврежденные органеллы 1,2. Аутофагия позволяет клеткам физиологически реагировать на стрессовые стимулы и, таким образом, поддерживать клеточный гомеостаз3. Во время аутофагии образуется пузырь с двойной мембраной: аутофагосома. Аутофагосома содержит молекулы груза и направляет их в лизосому для деградации 1,4.
Аутофагосомы украшены легкой цепью белка 3 (LC3)5, ассоциированной с аутофагическим белком, связанным с микротрубочками. Когда аутофагия не индуцирована, LC3 диффундирует в цитоплазме и ядре в конформации LC3-I. С другой стороны, когда индуцируется аутофагия, LC3 конъюгируется с фосфатидилэтаноламином в мембране аутофагических структур6. Эта новая конформация LC3 известна как LC3-II1. Конформационный сдвиг LC3 вызывает изменения в его клеточной локализации и миграции электрофореза в додецилсульфате натрия-полиакриламидном геле (SDS-PAGE), которые могут быть обнаружены такими методами, как иммунофлуоресценция и вестерн-блоттинг 5,7. Таким образом, конъюгация LC3 является ключевым событием в аутофагическом процессе, которое может быть использовано для измерения аутофагической активности.
Ацинарная клетка поджелудочной железы является высокодифференцированной клеткой, которая в здоровых условиях имеет низкий уровень аутофагии. Однако в различных физиологических условиях или при фармакологической стимуляции они могут активировать аутофагию. Следовательно, определение аутофагических уровней в этой клеточной линии полезно для изучения потенциальных прямых или косвенных эффектов различных фармакологических или биологических агентов на аутофагию 8,9.
Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы является одним из самых смертоносных видов рака, учитывая его позднюю диагностику и высокую устойчивость к химиотерапии10. Раковые клетки поджелудочной железы обладают высокой аутофагической активностью из-за транскрипционной апрегуляции и посттрансляционной активации белков, связанных с аутофагией11. Раковые клетки поджелудочной железы могут корректировать свои уровни аутофагии в ответ на неблагоприятные условия, такие как гипоксия, лишение питательных веществ или повреждение, вызванное химиотерапией11. Следовательно, анализ уровней аутофагии в раковых клетках поджелудочной железы может помочь понять, как они адаптируются к различным средам, и оценить эффективность лечения, модулирующего аутофагию.
В этом исследовании показан метод проведения иммунофлуоресценции LC3 на двух различных клеточных моделях поджелудочной железы. Первая модель, клетки PANC-1, послужили моделью для аденокарциномы протоков поджелудочной железы. Эти клетки обрабатывали гемцитабином, химиотерапевтическим агентом, который, как было показано ранее, индуцирует аутофагию, особенно в раковых клетках поджелудочной железы, несущих онкогенный ген вируса саркомы крысы Кирстен (KRAS)12,13. Вторая модель, клетки AR42J, служила более физиологической моделью экзокринных клеток поджелудочной железы. Эти клетки дифференцировались с дексаметазоном, чтобы стать более похожими на ацинарные клетки поджелудочной железы14. В этих клетках аутофагия была фармакологически индуцирована с помощью PP242, который является мощным ингибитором mTOR15. В этом исследовании мы демонстрируем применимость протокола, описанного с двумя разными моделями поджелудочной железы, и его способность различать состояния низкой и высокой аутофагии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка клеток
- Смочите 12-миллиметровые круглые покровные стекла в абсолютном этаноле и поместите их вертикально в лунки 24-луночной пластины.
- Снимите крышку и подвергните многолуночную пластину ультрафиолетовому излучению в течение 15 минут.
- Расположите покровные стекла горизонтально и промойте их с помощью модифицированной среды Dulbecco Eagle Medium (DMEM).
- Семена имеют низкое проходное количество клеток поджелудочной железы. Сумма должна быть скорректирована для получения 50%-75% слияния в день фиксации16.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется застелить 2,5 × 10 4 PANC-1 или 4 × 104 AR42J клеток на лунку, чтобы закрепить клетки через 3 дня. - Культивируют клетки в DMEM, содержащем 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, в инкубаторе при 37 °C в увлажненной атмосфере с 5% углекислого газа (CO2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для клеток PANC-1 рекомендуется инкубировать клетки в течение 2 дней между посевом клеток и следующими шагами. По истечении этого времени клетки могут быть трансфицированы, обработаны или зафиксированы. Этот протокол иллюстрирует лечение гемцитабином в нетрансфицированных клетках PANC-1, а также дифференцировку и обработку PP242 для нетрансфицированных клеток AR42J.
2. Обработка клеток
- Лечение гемцитабином клеток PANC-1
- Приготовьте раствор 1 мкг/мкл гемцитабина в ДМЭМ через 2 дня после посева. Обработайте каждую лунку 2,6 мкл раствора гемцитабина 1 мкг/мкл для достижения окончательного разбавления 20 мкМ.
- Инкубируют клетки в течение 24 ч в инкубаторе.
- Дифференциация AR42J и лечение PP242
- Приготовьте раствор дексаметазона 4 мкг/мл в ДМЭМ.
- Обработайте каждую лунку 4,9 мкл раствора дексаметазона 4 мкг/мл, чтобы получить окончательное разведение 100 нМ.
- Инкубируют клетки в течение 48 ч в инкубаторе.
- Удалите среду и обработайте каждую лунку 0,5 мкл 1 мМ PP242 для получения окончательного разбавления 1 мкМ.
- Инкубируют клетки в течение 2 ч в инкубаторе.
3. Фиксация и проникновение клеток
- Подготовьте 24-луночный планшет с холодным метанолом и 6-луночный планшет с холодным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS; 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8 мМ Na 2 HPO 4, 2 мМ KH2PO4). Держите их на льду.
- Возьмите каждое покровное стекло пинцетом, дважды промойте его в PBS и инкубируйте в течение 6 минут в метаноле.
4. Блокировка ячеек
- Дважды промойте каждое покровное стекло в PBS и инкубируйте в течение 1 ч в 10% фетальной бычьей сыворотке в PBS (блокирующий раствор).
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе протокол может быть приостановлен. Покровные стекла можно хранить в течение ночи в холодильнике в блокирующем растворе, а протокол можно продолжить на следующий день.
5. Инкубация покровных стекол с первичным антителом
- Приготовьте раствор анти-LC3 в соотношении 1:1,000 в блокирующем растворе и держите его на льду.
- Поместите кусок лабораторной герметизирующей пленки на многолуночную крышку.
- Нанесите одну каплю (25 мкл) на покровное стекло раствора анти-LC3 поверх герметизирующей пленки.
- Возьмите каждый покровный лист пинцетом и поместите его на первичную каплю антител, следя за тем, чтобы сторона клетки соприкасалась с раствором.
- Подготовьте влажную камеру, поместив влажный лист бумаги в пластиковую коробку с плоским дном.
- Поместите многолуночную тарелку в камеру влажности, накройте фольгой и выдержите ночь в холодильнике.
6. Инкубация покровных стекол с вторичным антителом
- Извлеките многолуночную пластину из камеры влажности и поместите покровные стекла обратно в многолуночную пластину.
- Выполните три стирки с помощью PBS.
- Приготовьте раствор флуоресцентно меченного антикролика с разведением 1:800 в блокирующем растворе, и выдержите его на льду в защищенном от света месте.
- Поместите кусок герметизирующей пленки на многолуночную крышку.
- Нанесите каплю (25 мкл) на покровное стекло раствора против кроликов на герметизирующую пленку.
- Возьмите каждый покровный лист пинцетом и поместите его на первичную каплю антител, следя за тем, чтобы сторона клетки соприкасалась с раствором.
- Инкубируют многолуночную пластину во влажной камере в течение 2 ч при комнатной температуре (ОТ) в защищенном от света месте.
7. Окрашивание клеток 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI)
- Извлеките многолуночную пластину из камеры влажности и поместите покровные стекла обратно в многолуночную пластину.
- Выполните три стирки с помощью PBS.
- Приготовьте 300 нМ раствор DAPI в PBS (защищенный от света).
- Инкубируйте каждое покровное стекло раствором DAPI в течение 10 минут.
- Выполните три стирки с помощью PBS. Следите за тем, чтобы многолунковая пластина была защищена от света.
8. Монтаж
- Подготовьте два стакана с водой и листом бумаги.
- Поместите одну каплю (10 мкл) на покровное стекло раствора поливинилового спирта-бис(триметилалюминия)-1,4-диазабицикло[2.2.2]октанового аддукта (PVA-DABCO) на предметное стекло.
ПРИМЕЧАНИЕ: PVA-DABCO получают путем объединения 0,25 М DABCO, 10% W/V PVA, 20% глицерина и 50% Tris HCl (1,5 М, pH 8,8) в сверхчистой воде. - Возьмите каждое покровное стекло пинцетом, вымойте его в каждом стакане для воды, высушите в бумаге и поместите его на каплю PVA-DABCO (с ячейками, контактирующими с раствором).
- Дайте ему высохнуть в течение ночи, защищая от света.
9. Просмотр конфокальной микроскопии и захват изображения
- Визуализируйте покровные стекла в инвертированном конфокальном микроскопе, используя объектив размером около 63x17.
- Захват репрезентативных изображений помеченных ячеек.
10. Количественная оценка точек LC3
- Перетащите каждый файл изображения, содержащий захваченные каналы, например «.czi», на экран ImageJ (FIJI), чтобы открыть. Нажмите « ОК» в диалоговом окне и закройте окно консоли .
- На вкладке «Изображение» выберите «Цвет» > «Разделить каналы».
- Закройте изображения, соответствующие каналам, отличным от изображения LC3.
- На вкладке « Изображение » выберите « Настроить > цветовой баланс»
- Перемещайте ползунок «Максимум » влево, пока изображение не станет насыщенным, чтобы визуализировать контуры ячеек.
- Нарисуйте контур ячейки с помощью инструмента « Выделение от руки ».
- Нажмите кнопку « Сброс », чтобы сбросить настройку цвета.
- На вкладке « Правка » выберите « Вырезать », чтобы вырезать выбранный элемент.
- Закройте изображение, не сохраняя его.
- На вкладке " Правка " выберите " Вставить".
- В меню « Анализ» выберите инструмент «Счетчик 3D-объектов».
- Установите пороговое значение. В примере, приведенном в этом исследовании, пороговое значение установлено на уровне 2 000.
- Установите фильтр размера. В этом исследовании он установлен между 50 и 500.
- Убедитесь, что флажки «Объекты » и « Сводка » отмечены.
- Нажмите на кнопку ОК. Количество точек будет описано как объекты, обнаруженные в сводке.
Рисунок 1: Принципиальная схема протокола иммунофлуоресценции LC3. Принципиальная схема, представляющая общий протокол, предусмотренный для иммунофлуоресценции LC3. Рисунок создан с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол выполняет иммунофлуоресценцию LC3 в клеточных линиях поджелудочной железы для определения уровней аутофагии в различных условиях. Результатом этого эксперимента стало получение клеточных изображений из красного и синего каналов, соответствующих LC3 и DAPI. Изображения LC3 показывают клеточное распределение этого белка, тогда как DAPI показывает ядерную локализацию. На рисунке 2А показано репрезентативное изображение иммунофлуоресценции LC3 и ее слияния с окрашиванием DAPI в клетках PANC-1 в условиях базальной или гемцитабиновой обработки. Набор изображений окрашивания LC3 был проанализирован с помощью инструмента 3D Objects Counter на Фиджи . С помощью этого программного обеспечения было количественно определено количество точек LC3 на ячейку. Гистограмма на рисунке 2B показывает результаты количественного определения точек LC3 в клетках PANC-1 в условиях базальной обработки по сравнению с гемцитабином. На этом графике точки LC3 значительно увеличились при лечении гемцитабином, при этом количество точек LC3 непосредственно указывает на аутофагическую активность. Ранее мы также продемонстрировали, что гемцитабин запускает аутофагию в раковых клетках поджелудочной железы12. В целом, метод, представленный в этой статье, позволяет обнаружить уровень увеличения активации аутофагии, индуцированной гемцитабином в этих клетках.
Хотя этот протокол фокусируется на использовании иммунофлуоресценции LC3 для определения аутофагической активности в раковых клетках поджелудочной железы, он потенциально может быть применен к другим клеточным линиям, включая более физиологически значимые модели. Для проверки эффективности метода в оценке физиологических реакций была использована клеточная линия AR42J. Хотя эти клетки получены из экзокринной опухоли поджелудочной железы крысы, они могут быть дифференцированы в экзокринные клетки с помощью глюкокортикоидной стимуляции, что делает их подходящей моделью поджелудочной железы 8,14,18. Клетки AR42J дифференцировали с лечением дексаметазоном 100 нМ в течение 48 часов с последующей обработкой ингибитором mTOR PP242 для индукции аутофагии15. Полученные результаты представлены на рисунке 3, где показано значительное увеличение количества точек LC3 на клетку при обработке PP242.
К настоящему времени мы продемонстрировали, что представленный метод эффективен для оценки аутофагической активности как в раковых клетках, так и в более физиологической модели. Однако важно отметить, что незначительные отклонения от представленного протокола могут привести к неинтерпретируемым результатам.
На рисунке 4А показано репрезентативное изображение из субоптимального эксперимента, в котором слишком много клеток было засеяно на покровных стеклах, и было получено чрезмерное слияние. Такого рода эксперимент может быть неинтерпретируемым по разным причинам. Во-первых, клеточные типы, упомянутые в этой работе, происходят из экзокринной поджелудочной железы, где клетки сгруппированы в ацинусы. При чрезмерном слиянии эти клетки имеют тенденцию накапливаться и расти друг на друге (например, ячейка 1 и ячейка 2 на рисунке 4A, которые находятся над ячейкой 3 и ячейкой 4). Это явление делает практически невозможным узнать, к какой клетке принадлежат точки LC3, что очень затрудняет оценку количества точек в клетке. С другой стороны, клетки с высоким слиянием, как правило, подвергаются стрессу, что вызывает аутофагию. В результате различия в аутофагических уровнях между контрольными и обработанными клетками могут уменьшаться из-за увеличения фоновой аутофагической активности.
На рисунке 4B показано репрезентативное изображение из другого вида субоптимального эксперимента, в котором клетки были зафиксированы параформальдегидом вместо метанола. Хотя этот метод фиксации, как правило, эффективен для сохранения различных белков, он не подходит для LC3, поскольку полученное изображение не точно отражает его истинное распределение. Эта техническая ошибка может сделать невозможным поиск различий между низкими и высокими аутофагическими уровнями.
Как правило, клеточные линии можно обрабатывать, трансфицировать или фиксировать через 1 день после посева. Тем не менее, важно отметить, что в случае клеток PANC-1 необходимо подождать 2 дня после посева, чтобы обеспечить полное прилипание клеток к стеклянным покровным стеклам, прежде чем приступать к последующим этапам эксперимента. На рисунке 4C показано репрезентативное изображение из эксперимента, в котором клетки обрабатывали гемцитабином всего через 1 день после посева. Из рисунка видно, что клетки в этом эксперименте имели круглую форму. Эта морфология уменьшила связь между цитоплазмой и ядром, что затрудняло понимание внутриклеточного распределения LC3 и различение низких и высоких аутофагических уровней. Важно отметить, что AR42J не имеет этой проблемы, и они готовы к обработке или исправлению на следующий день после посева.
Другой неоптимальный результат может быть получен при изменении времени фиксации метанола. Более короткое время фиксации может привести к неполной фиксации, как показано на рисунке 4D, где клетки фиксировались в течение 3 минут. Неполная фиксация может помешать правильному иммуномаркированию LC3, что приводит к нечетким изображениям и неоптимальной количественной оценке.
Рисунок 2: Иммунофлуоресценция LC3 в клетках PANC-1 в базальных условиях или в условиях гемцитабина и количественное определение точек LC3. Клетки PANC-1 либо обрабатывали гемцитабином 20 мкМ в течение 24 часов, либо оставляли без лечения, а затем иммуномечали анти-LC3. (A) Показаны репрезентативные изображения каждого состояния. Масштабная линейка: 10 мкм. (B) Гистограмма представляет средние значения и стандартные ошибки средних значений (SEM) точек LC3 на ячейку для каждого условия. N = 10 клеток на условие из трех независимых экспериментов. p < 0,001 по t-критерию Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Иммунофлуоресценция LC3 в клетках AR42J в базальных условиях или в условиях PP242 и количественное определение точек LC3. Клетки AR42J дифференцировали с дексаметазоном 100 нМ в течение 48 ч, а затем либо обрабатывали 1 мкМ PP242 в течение 2 ч, либо оставляли без лечения с последующей иммуномаркировкой анти-LC3. (A) Показаны репрезентативные изображения каждого состояния. Масштабная линейка: 10 мкм. (B) Гистограмма представляет средние значения и стандартные ошибки средних значений (SEM) точек LC3 на ячейку для каждого условия. N = 10 клеток на условие из трех независимых экспериментов. ** p < 0,01 по t-критерию Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Субоптимальные эксперименты. Показаны репрезентативные изображения иммунофлуоресценции LC3 в субоптимальных экспериментах. Масштабная линейка: 10 мкм. (A) Избыточное слияние: 7 × 104 клетки PANC-1 были посеяны, обработаны гемцитабином и иммуномечены анти-LC3. Четыре ячейки помечены, чтобы показать, что ячейка 1 и ячейка 2 находятся над ячейкой 3 и ячейкой 4. (B) Фиксация PFA: клетки PANC-1 обрабатывали гемцитабином, фиксировали PFA и иммуномечили анти-LC3. (C) Неполное растяжение: клетки PANC-1 обрабатывали гемцитабином на следующий день после посева и иммуномечали анти-LC3. (D) Неполная фиксация: клетки PANC-1 обрабатывали гемцитабином, фиксировали метанолом в течение 3 мин и иммуномечали анти-LC3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Способ, описанный в этом протоколе, позволяет визуализировать эндогенное распределение LC3 в клетке и количественно определять аутофагические уровни в различных условиях. Другой аналогичный метод, используемый для анализа распределения LC3 и определения активации аутофагии, включает меченную флуоресценцией трансфекцию LC3 (например, RFP-LC3)19. Преимущества трансфекции RFP-LC3 заключаются в том, что она не требует фиксации (что позволяет применять этот метод при визуализацииживых клеток 20), дешевле и не зависит от реактивности антител LC3. С другой стороны, иммунофлуоресценция LC3 имеет то преимущество, что обеспечивает изображение эндогенного LC3, что позволяет избежать возможных проблем, связанных с гиперэкспрессией LC3, таких как образование белковых агрегатов, которые не зависят от аутофагии21. Более того, этот метод не зависит от легкости трансфицирования клеток, что означает, что он применим к различным клеточным линиям. Однако, в зависимости от используемого антитела LC3 и его реактивности, существуют некоторые клеточные линии, в которых оно может не работать. Некоторые антитела могут хорошо работать для определенных видов, но не для других, даже если они теоретически совместимы с другими видами. В случае антитела, используемого в этом протоколе (LC3B D11), мы обнаружили, что оно отлично работает для клеток человека (PANC-1, HEK293T, HeLa) и клеток крыс (AR42J). Однако это не работает для клеток мыши (клеток MEF), так как мы наблюдали неспецифическое ядерное окрашивание. Стоит отметить, что количественная оценка пятен LC3, будь то эндогенные или сверхэкспрессированные, имеет ограничения в различении изменений в активации аутофагии, которые могут указывать на повышенную продукцию LC3-II, и изменений в деградации LC3-II, которые могут указывать на состояние аутофагического потока. Дополнительные методы могут быть использованы для комплексной оценки активности аутофагии. Например, использование экспрессии RFP-GFP-LC3 может обеспечить точную оценку, различая LC3-II внутри или снаружи лизосомы22,23.
Как показано на рисунке 4, в протоколе есть некоторые критические шаги, которые не должны быть изменены, учитывая, что их модификация может привести к неоптимальным результатам. Во-первых, важно установить правильное количество ячеек для посева. Когда засевается недостаточное количество клеток, они, как правило, не сопротивляются трансфекции или лечению и остаются округлыми. Напротив, когда клетки засеваются в избытке, они, как правило, растут поверх соседних клеток, что затрудняет фокусировку на отдельных клетках и различение их точек LC3. Примечательно, что в ситуациях, когда клетки находятся в непосредственной близости, но не перекрываются, как показано на рисунке 4А, может быть полезно использовать иммуноокрашивание со специфическими мембранными маркерами, такими как EGFR, чтобы различать положительные маркеры, принадлежащие каждой клетке24. Однако важно отметить, что некоторые маркеры, такие как E-кадгерин и EpCAM, не подходят для этой цели в клетках PANC-1 из-за их сниженной экспрессии мембраны, что является результатом типичного процесса эпителиально-мезенхимального перехода, связанного с этим типом клеток25,26,27. Во-вторых, при работе конкретно с клетками PANC-1 важно подождать не менее 1 дня между посевом и последующими этапами эксперимента. И наоборот, когда не ждать подходящего времени, ячейки могут быть округлены, что затрудняет интерпретацию результатов. В-третьих, фиксация является важнейшим этапом в этом протоколе. Как мы показали, метод работает только при адекватной фиксации метанола. Фиксация параформальдегида не работает правильно для иммуномечения LC3, в то время как время фиксации метанола не следует изменять, учитывая, что более короткое время может привести к неполной фиксации. Мы протестировали время фиксации метанола до 1 часа и не наблюдали различий в маркировке LC3. Тем не менее, мы не рекомендуем использовать длительное время фиксации, так как фиксация метанола может привести к потере растворимых клеточных белков и свободных флуоресцентных молекул28. Поэтому рекомендуется придерживаться стандартного времени фиксации, чтобы обеспечить точные и надежные результаты.
Некоторые изменения могут быть приняты в описанном протоколе. Например, вместо 24-луночной пластины можно использовать 12-луночную пластину, а также выращивать ячейки над 15-миллиметровыми круглыми покровными стеклами вместо 12-миллиметровых покровных стекол. При этом следует учитывать, что количество клеток, подлежащих посеву, а также объемы используемых реагентов будут больше, чем описанные в данном протоколе. В этом случае следует посеять 4 × 10 4 PANC-1 и 6,5 × 104 AR42J. Кроме того, используемое блокирующее решение может быть заменено другими, такими как 1% BSA в PBS, и это приведет к аналогичным результатам. Таким же образом время блокировки может быть увеличено до 24 часов без существенного изменения результатов. Время инкубации и концентрация антител могут быть скорректированы и могут изменяться, например, при использовании другого антитела LC3. Несмотря на то, что в этом исследовании готовится раствор PVA-DABCO, можно также использовать коммерческие монтажные решения. С другой стороны, метод количественной оценки может быть изменен. Например, возможно применение некоторых фильтров или масок к изображениям, а для количественной оценки точек можно использовать альтернативный инструмент.
В этой работе мы направили применение иммунофлуоресценции LC3 для изучения поведения раковых клеток поджелудочной железы. В этих клетках аутофагия базально активируется и может модулироваться в ответ на различные стрессовые ситуации, такие как химиотерапия, гипоксия или дефицит питательных веществ11,12. Определение аутофагии в этих клетках может быть применимо для изучения клеточного ответа на химиотерапию, лучевую терапию или другие методы лечения, которые модулируют аутофагию. Как показано на рисунке 3, представленный метод может быть применен в физиологических моделях. Хотя в этой работе мы сосредоточились на количественной оценке аутофагических уровней, иммунофлуоресценция LC3 также может позволить оценить колокализацию между LC3 и различными белками. Он может служить, например, в качестве механистического подхода для маркировки белков в разных точках аутофагического процесса и оценки того, влияет ли на колокализацию с LC3 некоторые методы лечения или подавление некоторых белков. Таким образом, можно определить, например, прерывает ли какой-либо ингибитор аутофагии аутофагический поток до или после конъюгации LC3. Наконец, метод также может быть адаптирован к образцам тканей для определения активации аутофагии на животных моделях или в образцах биопсии человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
О конфликте интересов не было заявлено.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Университета Буэнос-Айреса (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), Национального совета по научным исследованиям и технологиям (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; и PUE 22920170100033) и Национального агентства по развитию науки и технологий (PICT 2019-01664).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
References
- Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).
- Kitada, M., Koya, D. Autophagy in metabolic disease and ageing. Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).
- Ktistakis, N. T., Tooze, S. A.
- Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E.
- Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).
- Mizushima, N., Yoshimori, T. How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).
- Vanasco, V., et al. Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).
- Williams, J. A. Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini. Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).
- Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T.
- Li, J., et al. Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer. Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).
- Ropolo, A., et al. A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS. Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).
- Pardo, R., et al. Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells. Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).
- Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells. Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
- Segeritz, C. -P., Vallier, L. Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. , Academic Press. Cambridge, MA. 151-172 (2017).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Grasso, D., et al. a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).
- Ropolo, A., et al. The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).
- Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond. Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. Methods for the detection of autophagy in mammalian cells. Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).
- Yoshii, S. R., Mizushima, N.
- Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers. 13 (18), 4504 (2021).
- Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT. Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).
- Kim, S. K., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model. Cancers. 12 (5), 1305 (2020).
- Meng, Y., et al. Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
