Summary
L’objectif de ce protocole est de déterminer les niveaux autophagiques dans le cancer du pancréas et les cellules acineuses pancréatiques par immunofluorescence CL3 et quantification des points CL3.
Abstract
L’autophagie est un processus catabolique spécialisé qui dégrade sélectivement les composants cytoplasmiques, y compris les protéines et les organites endommagés. L’autophagie permet aux cellules de répondre physiologiquement aux stimuli de stress et, ainsi, de maintenir l’homéostasie cellulaire. Les cellules cancéreuses peuvent moduler leurs niveaux d’autophagie pour s’adapter à des conditions défavorables telles que l’hypoxie, une carence en nutriments ou des dommages causés par la chimiothérapie. L’adénocarcinome pancréatique canalaire est l’un des types de cancer les plus mortels. Les cellules cancéreuses du pancréas ont une activité d’autophagie élevée en raison de la régulation transcriptionnelle à la hausse et de l’activation post-traductionnelle des protéines d’autophagie.
Ici, la lignée cellulaire PANC-1 a été utilisée comme modèle de cellules cancéreuses humaines pancréatiques, et la lignée cellulaire acineuse pancréatique AR42J a été utilisée comme modèle physiologique de cellules de mammifères hautement différenciées. Cette étude a utilisé l’immunofluorescence de la chaîne légère 3 (CL3) de la protéine associée aux microtubules comme indicateur de l’état de l’activation de l’autophagie. LC3 est une protéine d’autophagie qui, dans des conditions basales, présente un schéma diffus de distribution dans le cytoplasme (connu sous le nom de LC3-I dans cette condition). L’induction de l’autophagie déclenche la conjugaison de la CL3 à la phosphatidyléthanolamine à la surface des autophagosomes nouvellement formés pour former la LC3-II, une protéine liée à la membrane qui aide à la formation et à l’expansion des autophagosomes. Pour quantifier le nombre de structures autophagiques étiquetées, le logiciel open source FIJI a été utilisé à l’aide de l’outil « 3D Objects Counter ».
La mesure des niveaux autophagiques à la fois dans les conditions physiologiques et dans les cellules cancéreuses nous permet d’étudier la modulation de l’autophagie dans diverses conditions telles que l’hypoxie, le traitement de chimiothérapie ou l’élimination de certaines protéines.
Introduction
La macroautophagie (communément appelée autophagie) est un processus catabolique spécialisé qui dégrade sélectivement les composants cytoplasmiques, y compris les protéines et les organites endommagés 1,2. L’autophagie permet aux cellules de répondre physiologiquement aux stimuli de stress et, ainsi, de maintenir l’homéostasie cellulaire3. Au cours de l’autophagie, une vésicule à double membrane se forme : l’autophagosome. L’autophagosome contient les molécules de cargaison et les conduit au lysosome pour la dégradation 1,4.
Les autophagosomes sont décorés par la chaîne légère 3 (CL3)5 de la protéine autophagique associée aux microtubules. Lorsque l’autophagie n’est pas induite, la CL3 est diffusée dans le cytoplasme et le noyau dans la conformation LC3-I. En revanche, lorsque l’autophagie est induite, la CL3 est conjuguée à une phosphatidyléthanolamine dans la membrane des structures autophagiques6. Cette nouvelle conformation LC3 est connue sous le nom de LC3-II1. Le décalage de conformation de la CL3 provoque des changements dans sa localisation cellulaire et sa migration par électrophorèse sur gel de sulfate de sodium dodécyle-polyacrylamide (SDS-PAGE), qui peuvent être détectées par des techniques telles que l’immunofluorescence et le Western blot 5,7. De cette façon, la conjugaison de la CL3 est un événement clé dans le processus autophagique qui peut être utilisé pour mesurer l’activité autophagique.
La cellule acineuse pancréatique est une cellule hautement différenciée qui, dans des conditions saines, a un faible taux d’autophagie. Cependant, dans différentes conditions physiologiques ou sous stimulation pharmacologique, ils peuvent activer l’autophagie. Par conséquent, la détermination des niveaux autophagiques dans cette lignée cellulaire est utile pour étudier les effets directs ou indirects potentiels de différents agents pharmacologiques ou biologiques sur l’autophagie 8,9.
L’adénocarcinome pancréatique canalaire est l’un des types de cancer les plus mortels, compte tenu de son diagnostic tardif et de sa résistance élevée à la chimiothérapie10. Les cellules cancéreuses du pancréas ont une activité d’autophagie élevée en raison de la régulation transcriptionnelle positive et de l’activation post-traductionnelle des protéines liées à l’autophagie11. Les cellules cancéreuses du pancréas peuvent ajuster leurs niveaux d’autophagie en réponse à des conditions défavorables telles que l’hypoxie, la privation de nutriments ou les dommages induits par la chimiothérapie11. Par conséquent, l’analyse des niveaux d’autophagie dans les cellules cancéreuses du pancréas peut aider à comprendre comment elles s’adaptent à divers environnements et à évaluer l’efficacité des traitements modulateurs de l’autophagie.
Cette étude montre une méthode pour effectuer l’immunofluorescence LC3 dans deux modèles cellulaires pancréatiques distincts. Le premier modèle, les cellules PANC-1, a servi de modèle pour l’adénocarcinome canalaire pancréatique. Ces cellules ont été traitées avec de la gemcitabine, un agent de chimiothérapie dont il a déjà été démontré qu’il induisait l’autophagie, en particulier dans les cellules cancéreuses du pancréas porteuses du gène oncogène du virus du sarcome du rat de Kirsten (KRAS)12,13. Le deuxième modèle, les cellules AR42J, a servi de modèle plus physiologique des cellules pancréatiques exocrines. Ces cellules ont été différenciées avec la dexaméthasone pour devenir plus semblables aux cellules pancréatiques acineuses14. Dans ces cellules, l’autophagie a été induite pharmacologiquement par l’utilisation de PP242, qui est un puissant inhibiteur de mTOR15. Dans cette étude, nous démontrons l’applicabilité du protocole décrit avec deux modèles pancréatiques différents et sa capacité à discriminer entre les états d’autophagie basse et élevée.
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Protocol
1. Préparation cellulaire
- Trempez des lamelles de couverture rondes de 12 mm dans de l’éthanol absolu et placez-les verticalement dans les puits d’une plaque de 24 puits.
- Retirez le couvercle et exposez la plaque multipuits aux rayons ultraviolets pendant 15 min.
- Positionnez les lamelles horizontalement et lavez-les avec le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco.
- Ensemencer un faible nombre de passages de cellules pancréatiques. Le montant doit être ajusté pour obtenir une confluence de 50% à 75% le jour de la fixation16.
NOTE: Il est recommandé d’ensemencer 2,5 × 10 4 PANC-1 ou 4 × 104 cellules AR42J par puits pour fixer les cellules après 3 jours. - Culture des cellules dans du DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine dans un incubateur à 37 °C sous atmosphère humidifiée contenant 5 % de dioxyde de carbone (CO2).
REMARQUE: Pour les cellules PANC-1, il est recommandé d’incuber les cellules pendant 2 jours entre l’ensemencement cellulaire et les étapes suivantes. Passé ce délai, les cellules peuvent être transfectées, traitées ou fixées. Ce protocole illustre le traitement à la gemcitabine dans les cellules PANC-1 non transfectées et le traitement de différenciation et de PP242 pour les cellules AR42J non transfectées.
2. Traitement des cellules
- Traitement à la gemcitabine pour les cellules PANC-1
- Préparer une solution de 1 μg/μL de gemcitabine dans du DMEM 2 jours après l’ensemencement. Traiter chaque puits avec 2,6 μL de la solution de gemcitabine à 1 μg/μL pour obtenir une dilution finale de 20 μM.
- Incuber les cellules pendant 24 h dans l’incubateur.
- Différenciation AR42J et traitement PP242
- Préparer une solution de 4 μg/mL de dexaméthasone dans du DMEM.
- Traiter chaque puits avec 4,9 μL de solution de dexaméthasone à 4 μg/mL pour obtenir une dilution finale de 100 nM.
- Incuber les cellules pendant 48 h dans l’incubateur.
- Retirer le milieu et traiter chaque puits avec 0,5 μL de 1 mM PP242 pour obtenir une dilution finale de 1 μM.
- Incuber les cellules pendant 2 h dans l’incubateur.
3. Fixation et perméabilisation des cellules
- Préparer une plaque de 24 puits avec du méthanol froid et une plaque de 6 puits avec une solution saline tamponnée au phosphate froid (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4, 2 mMKH2PO4). Entretenez-les sur la glace.
- Prenez chaque capiton avec une pince à épiler, lavez-le deux fois dans du PBS et incuber pendant 6 minutes dans du méthanol.
4. Blocage des cellules
- Laver chaque lamelle deux fois dans du PBS et incuber pendant 1 h dans du sérum fœtal bovin à 10% dans du PBS (solution bloquante).
Remarque : Dans cette étape, le protocole peut être suspendu. Les lamelles de couverture peuvent être conservées pendant la nuit au réfrigérateur dans la solution de blocage, et le protocole peut être poursuivi le lendemain.
5. Incubation des lamelles de couverture avec l’anticorps primaire
- Préparez une solution 1:1 000 d’anti-CL3 dans la solution bloquante et maintenez-la sur de la glace.
- Placez un morceau de film d’étanchéité de laboratoire sur le couvercle multipuits.
- Déposer une goutte (25 μL) par capseau de solution anti-LC3 sur le film d’étanchéité.
- Prenez chaque capseau avec une pince à épiler et placez-le sur la goutte d’anticorps primaire, en veillant à ce que le côté cellulaire soit en contact avec la solution.
- Préparez une chambre humide en plaçant un morceau de papier humide dans une boîte en plastique à fond plat.
- Placez l’assiette multipuits dans la chambre d’humidité, recouvrez-la de papier d’aluminium et incuber toute la nuit au réfrigérateur.
6. Incubation des lamelles de couverture avec l’anticorps secondaire
- Retirez la plaque multipuits de la chambre d’humidité et replacez les lamelles de couverture dans la plaque multipuits.
- Effectuez trois lavages avec PBS.
- Préparer une solution d’anti-lapin marquée par fluorescence avec une dilution de 1:800 dans la solution de blocage et la maintenir sur de la glace à l’abri de la lumière.
- Placez un morceau de film d’étanchéité sur le couvercle multipuits.
- Déposer une goutte (25 μL) par capseau de solution anti-lapin sur le film d’étanchéité.
- Prenez chaque capseau avec une pince à épiler et placez-le sur la goutte d’anticorps primaire, en veillant à ce que le côté cellulaire soit en contact avec la solution.
- Incuber la plaque multipuits dans la chambre d’humidité pendant 2 h à température ambiante (RT) à l’abri de la lumière.
7. Coloration des cellules avec 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)
- Retirez la plaque multipuits de la chambre d’humidité et replacez les lamelles de couverture dans la plaque multipuits.
- Effectuez trois lavages avec PBS.
- Préparer une solution 300 nM de DAPI en PBS (protégé de la lumière).
- Incuber chaque capuchon avec la solution DAPI pendant 10 min.
- Effectuez trois lavages avec PBS. Entretenez la plaque multipuits à l’abri de la lumière.
8. Montage
- Préparez deux béchers avec de l’eau et un morceau de papier.
- Déposer une goutte (10 μL) par lamelle de couverture d’une solution d’adduit à l’alcool polyvinylique-bis(triméthylaluminium)-1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (PVA-DABCO) sur une lame.
REMARQUE : PVA-DABCO est préparé en combinant 0,25 M de DABCO, 10 % P/V PVA, 20 % de glycérol et 50 % de Tris HCl (1,5 M, pH 8,8) dans de l’eau ultrapure. - Prenez chaque capuchon avec une pince à épiler, lavez-le dans chaque bécher d’eau, séchez-le dans le papier et placez-le sur la goutte PVA-DABCO (avec les cellules en contact avec la solution).
- Laissez-le sécher toute la nuit, à l’abri de la lumière.
9. Visualisation par microscopie confocale et capture d’images
- Visualisez les lames de couverture dans un microscope confocale inversé à l’aide d’un objectif d’environ 63x17.
- Capturez des images représentatives des cellules étiquetées.
10. Quantifier les points CL3
- Faites glisser et déposez chaque fichier image contenant les canaux capturés, tels que « .czi », dans l’écran ImageJ (FIJI) pour l’ouvrir. Cliquez sur OK dans la boîte de dialogue et fermez la fenêtre de la console .
- Dans l’onglet Image , sélectionnez Couleur > Fractionner les couches.
- Fermez les images correspondant aux canaux autres que l’image LC3.
- Dans l’onglet Image , sélectionnez Ajuster > balance des couleurs
- Déplacez le curseur Maximum vers la gauche jusqu’à ce que l’image soit saturée pour visualiser les contours de la cellule.
- Dessinez le contour de la cellule à l’aide de l’outil Sélection à main levée .
- Cliquez sur le bouton Réinitialiser pour réinitialiser le réglage des couleurs.
- Dans l’onglet Modifier , sélectionnez Couper pour couper l’élément sélectionné.
- Fermez l’image sans l’enregistrer.
- Dans l’onglet Modifier , sélectionnez Coller.
- Dans le menu Analyser , choisissez l’outil Compteur d’objets 3D.
- Définissez le seuil. Dans l’exemple fourni dans cette étude, le seuil est fixé à 2 000.
- Définissez le filtre de taille. Dans cette étude, il est fixé entre 50 et 500.
- Assurez-vous que les cases Objets et Résumé sont cochées.
- Cliquez sur Ok. Le nombre de points sera décrit comme Objets détectés dans le résumé.
Figure 1 : Schéma du protocole d’immunofluorescence CL3. Diagramme schématique qui représente le protocole général fourni pour l’immunofluorescence CL3. Figure créée avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Representative Results
Ce protocole effectue une immunofluorescence de CL3 dans des lignées cellulaires pancréatiques pour déterminer les niveaux d’autophagie dans différentes conditions. Le résultat de cette expérience a été l’obtention d’images cellulaires à partir des canaux rouge et bleu, correspondant à la CL3 et au DAPI. Les images CL3 indiquent la distribution cellulaire de cette protéine, tandis que le DAPI montre la localisation nucléaire. La figure 2A montre une image représentative de l’immunofluorescence de la CL3 et de sa fusion avec la coloration DAPI dans les cellules PANC-1 dans des conditions de traitement basal ou gemcitabine. Un ensemble d’images de coloration LC3 a été analysé à l’aide de l’outil 3D Objects Counter dans FIJI. À l’aide de ce logiciel, la quantité de points CL3 par cellule a été quantifiée. Le diagramme à barres de la figure 2B montre les résultats de la quantification des points CL3 dans les cellules PANC-1 dans des conditions de traitement basal versus gemcitabine. Dans ce graphique, les points CL3 ont augmenté de manière significative sous traitement par gemcitabine, le nombre de points CL3 indiquant directement l’activité autophagique. Nous avons également démontré précédemment que la gemcitabine déclenche l’autophagie dans les cellules cancéreuses du pancréas12. Globalement, la méthode présentée dans cet article permet de détecter le niveau d’augmentation de l’activation de l’autophagie induite par la gemcitabine dans ces cellules.
Bien que ce protocole se concentre sur l’utilisation de l’immunofluorescence CL3 pour déterminer l’activité autophagique dans les cellules cancéreuses du pancréas, il pourrait potentiellement être appliqué à d’autres lignées cellulaires, y compris des modèles plus pertinents sur le plan physiologique. Pour tester l’efficacité de la méthode dans l’évaluation des réponses physiologiques, la lignée cellulaire AR42J a été utilisée. Bien que ces cellules soient dérivées d’une tumeur du pancréas exocrine chez le rat, elles peuvent être différenciées en cellules exocrines avec stimulation glucocorticoïde, ce qui en fait un modèle pancréatique approprié 8,14,18. Les cellules AR42J ont été différenciées avec un traitement à la dexaméthasone 100 nM pendant 48 h, suivi d’un traitement avec l’inhibiteur de mTOR PP242 pour induire l’autophagie15. Les résultats obtenus sont présentés à la figure 3, qui montre une augmentation significative du nombre de points CL3 par cellule sous le traitement PP242.
Jusqu’à présent, nous avons démontré que la méthode présentée est efficace pour évaluer l’activité autophagique dans les cellules cancéreuses et un modèle plus physiologique. Cependant, il est important de noter que des écarts mineurs par rapport au protocole présenté pourraient entraîner des résultats ininterprétables.
La figure 4A montre une image représentative d’une expérience sous-optimale dans laquelle trop de cellules ont été ensemencées sur les lamelles de couverture et une confluence excessive a été obtenue. Ce genre d’expérience pourrait être ininterprétable pour diverses raisons. Tout d’abord, les types cellulaires mentionnés dans ce travail sont dérivés du pancréas exocrine, où les cellules sont regroupées en acini. Sous une confluence excessive, ces cellules ont tendance à s’empiler et à se développer les unes sur les autres (comme la cellule 1 et la cellule 2 de la figure 4A, qui sont au-dessus de la cellule 3 et de la cellule 4). Ce phénomène rend pratiquement impossible de savoir à quelle cellule appartiennent les points LC3, ce qui rend très difficile l’estimation du nombre de points par cellule. D’autre part, les cellules à forte confluence ont tendance à être stressées, ce qui déclenche l’autophagie. En conséquence, les différences dans les niveaux autophagiques entre les cellules témoins et traitées pourraient diminuer en raison d’une augmentation de l’activité autophagique de fond.
Dans la figure 4B, une image représentative d’un autre type d’expérience sous-optimale est montrée dans laquelle les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde au lieu de méthanol. Bien que cette méthode de fixation soit généralement efficace pour préserver une variété de protéines, elle ne convient pas à la CL3, car l’image résultante ne reflète pas avec précision sa distribution réelle. Cette erreur technique pourrait rendre impossible de trouver des différences entre les niveaux autophagiques bas et élevés.
Généralement, les lignées cellulaires peuvent être traitées, transfectées ou fixées 1 jour après l’ensemencement. Néanmoins, il est crucial de mentionner que, dans le cas des cellules PANC-1, il est nécessaire d’attendre 2 jours après l’ensemencement pour s’assurer de l’adhérence complète des cellules aux lamelles de verre avant de procéder aux étapes suivantes de l’expérience. La figure 4C montre une image représentative d’une expérience dans laquelle les cellules ont été traitées avec de la gemcitabine seulement 1 jour après l’ensemencement. À partir de la figure, on peut observer que les cellules de cette expérience avaient une forme ronde. Cette morphologie a diminué la relation entre le cytoplasme et le noyau, ce qui rend difficile la compréhension de la distribution intracellulaire de la CL3 et la distinction entre les niveaux autophagiques faibles et élevés. Il est important de noter que AR42J n’a pas ce problème, et ils sont prêts à être traités ou fixés le lendemain de l’ensemencement.
Un autre résultat sous-optimal pourrait être obtenu lorsque le moment de la fixation du méthanol est variable. Des temps de fixation plus courts peuvent entraîner une fixation incomplète, comme le montre la figure 4D, où les cellules ont été fixées pendant 3 minutes. Une fixation incomplète peut interférer avec un immunomarquage LC3 approprié, conduisant à des images peu claires et à une quantification sous-optimale.
Figure 2 : Immunofluorescence CL3 dans les cellules PANC-1 dans des conditions basales ou gemcitabines et quantification des points CL3. Les cellules PANC-1 ont été soit traitées avec 20 μM de gemcitabine pendant 24 heures, soit laissées non traitées puis immunomarquées avec un anti-LC3. (A) Des images représentatives de chaque condition sont montrées. Barre d’échelle: 10 μm. (B) Le graphique à barres représente les moyennes et les erreurs-types des moyennes (MEB) des points CL3 par cellule pour chaque condition. N = 10 cellules par condition à partir de trois expériences indépendantes. p < 0,001 par le test t d’un étudiant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Immunofluorescence LC3 dans les cellules AR42J dans des conditions basales ou PP242 et quantification des points CL3. Les cellules AR42J ont été différenciées avec 100 nM de dexaméthasone pendant 48 h, puis traitées avec 1 μM PP242 pendant 2 h ou laissées non traitées, suivies d’un immunomarquage avec anti-LC3. (A) Des images représentatives de chaque condition sont montrées. Barre d’échelle: 10 μm. (B) Le graphique à barres représente les moyennes et les erreurs-types des moyennes (MEB) des points CL3 par cellule pour chaque condition. N = 10 cellules par condition à partir de trois expériences indépendantes. ** p < 0,01 par le test t d’un étudiant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Expériences sous-optimales. Des images représentatives de l’immunofluorescence CL3 dans des expériences sous-optimales sont montrées. Barre d’échelle : 10 μm. (A) Confluence excessive : 7 × 104 cellules PANC-1 ont été ensemencées, traitées à la gemcitabine et immunomarquées avec des anti-CL3. Quatre cellules sont marquées pour montrer que la cellule 1 et la cellule 2 sont au-dessus de la cellule 3 et de la cellule 4. (B) Fixation de PFA : Les cellules PANC-1 ont été traitées avec de la gemcitabine, fixées avec du PFA et immunomarquées avec des anti-CL3. (C) Étirement incomplet : les cellules PANC-1 ont été traitées avec de la gemcitabine le lendemain de l’ensemencement et immunomarquées avec des anti-CL3. (D) Fixation incomplète : les cellules PANC-1 ont été traitées avec de la gemcitabine, fixées avec du méthanol pendant 3 minutes et immunomarquées avec des anti-LC3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La méthode décrite dans ce protocole permet de visualiser la distribution endogène de la CL3 dans la cellule et de quantifier les niveaux autophagiques dans différentes conditions. Une autre méthode similaire utilisée pour analyser la distribution de la CL3 et déterminer l’activation de l’autophagie implique la transfection de CL3 marquée par fluorescence (telle que RFP-LC3)19. La transfection RFP-LC3 présente l’avantage de ne pas avoir besoin de fixation (ce qui permet d’appliquer cette méthode en imagerie de cellules vivantes20), d’être moins chère et de ne pas dépendre de la réactivité des anticorps LC3. D’autre part, l’immunofluorescence de la CL3 a l’avantage de fournir une image de la CL3 endogène, évitant ainsi d’éventuels problèmes liés à la surexpression de la CL3, tels que la formation d’agrégats protéiques indépendants de l’autophagie21. De plus, cette méthode ne dépend pas de la facilité de transfection des cellules, ce qui signifie qu’elle est applicable à diverses lignées cellulaires. Cependant, en fonction de l’anticorps LC3 utilisé et de sa réactivité, il existe certaines lignées cellulaires dans lesquelles il pourrait ne pas fonctionner. Certains anticorps peuvent bien fonctionner pour certaines espèces, mais pas pour d’autres, même lorsqu’ils sont théoriquement compatibles avec différentes espèces. Dans le cas de l’anticorps utilisé dans ce protocole (LC3B D11), nous avons constaté qu’il fonctionne parfaitement pour les cellules humaines (PANC-1, HEK293T, HeLa) et les cellules de rat (AR42J). Cependant, cela ne fonctionne pas pour les cellules de souris (cellules MEF), car nous avons observé une coloration nucléaire non spécifique. Il convient de noter que la quantification des taches de CL3, qu’elles soient endogènes ou surexprimées, a des limites pour distinguer les changements dans l’activation de l’autophagie, qui peuvent indiquer une production accrue de CL3-II, et les changements dans la dégradation de la CL3-II, qui peuvent indiquer un état de flux autophagique. Des méthodes supplémentaires peuvent être utilisées pour évaluer de manière exhaustive l’activité de l’autophagie. Par exemple, l’utilisation de l’expression RFP-GFP-LC3 peut fournir une évaluation précise en distinguant la CL3-II à l’intérieur ou à l’extérieur du lysosome22,23.
Comme le montre la figure 4, certaines étapes critiques du protocole ne doivent pas être modifiées, étant donné que leur modification peut entraîner des résultats sous-optimaux. Tout d’abord, il est important de définir le nombre correct de cellules à ensemencer. Lorsqu’il n’y a pas assez de cellules ensemencées, elles ont tendance à ne pas résister à la transfection ou aux traitements et restent arrondies. Au contraire, lorsque les cellules sont ensemencées en excès, elles ont tendance à se développer au-dessus des cellules voisines, ce qui rend difficile de se concentrer sur les cellules individuelles et de distinguer leurs points LC3. Notamment, dans les situations où les cellules sont à proximité mais ne se chevauchent pas, comme le montre la figure 4A, il peut être utile d’utiliser l’immunomarquage avec des marqueurs membranaires spécifiques, tels que l’EGFR, pour distinguer les marqueurs positifs appartenant à chaque cellule24. Cependant, il est important de noter que certains marqueurs comme E-cadhérine et EpCAM ne conviennent pas à cette fin dans les cellules PANC-1 en raison de leur expression membranaire réduite, qui résulte du processus typique de transition épithéliale-mésenchymateuse associé à ce type cellulaire25,26,27. Deuxièmement, lorsque vous travaillez spécifiquement avec des cellules PANC-1, il est essentiel d’attendre au moins 1 jour entre l’ensemencement et les étapes suivantes de l’expérience. Inversement, lorsque l’on n’attend pas le bon moment, les cellules peuvent être arrondies, ce qui rend difficile l’interprétation des résultats. Troisièmement, la fixation est une étape critique de ce protocole. Comme nous l’avons montré, la méthode ne fonctionne qu’avec une fixation adéquate au méthanol. La fixation du paraformaldéhyde ne fonctionne pas correctement pour l’immunomarquage CL3, tandis que le temps de fixation du méthanol ne doit pas être modifié, étant donné que des temps plus courts pourraient conduire à une fixation incomplète. Nous avons testé des temps de fixation du méthanol jusqu’à 1 h et n’avons pas observé de différences dans le marquage de la CL3. Néanmoins, nous déconseillons l’utilisation de temps de fixation prolongés, car la fixation au méthanol peut entraîner la perte de protéines cellulaires solubles et de molécules fluorescentes libres28. Par conséquent, il est recommandé de respecter le temps de fixation standard pour garantir des résultats précis et fiables.
Certaines modifications peuvent être acceptées dans le protocole décrit. Par exemple, une plaque de 12 puits peut être utilisée à la place de la plaque de 24 puits, ainsi que la croissance des cellules sur des lamelles de couverture rondes de 15 mm au lieu de lamelles de couverture de 12 mm. Dans ce cas, il faut considérer que le nombre de cellules à ensemencer, ainsi que les volumes de réactifs utilisés, seront supérieurs à ceux décrits dans ce protocole. Dans ce cas, 4 × 10 4 PANC-1 et 6.5 × 104 AR42J doivent être ensemencés. De plus, la solution de blocage utilisée peut être remplacée par d’autres, comme 1% BSA dans PBS, ce qui conduirait à des résultats similaires. De la même manière, le temps de blocage pourrait être augmenté jusqu’à 24 h sans modifier de manière significative les résultats. Les temps d’incubation et la concentration des anticorps peuvent être ajustés et peuvent changer, par exemple, si un autre anticorps CL3 est utilisé. Bien que la solution PVA-DABCO soit préparée dans cette étude, des solutions de montage commercial peuvent également être utilisées. En revanche, la méthode de quantification peut être modifiée. Par exemple, l’application de filtres ou de masques aux images est possible, et un outil alternatif peut être utilisé pour la quantification des points.
Dans ce travail, nous avons dirigé l’application de l’immunofluorescence de la CL3 pour étudier le comportement des cellules cancéreuses du pancréas. Dans ces cellules, l’autophagie est activée de manière basale et peut être modulée en réponse à diverses situations stressantes, telles que la chimiothérapie, l’hypoxie ou une carenceen nutriments 11,12. La détermination de l’autophagie dans ces cellules peut être applicable à l’étude de la réponse cellulaire à la chimiothérapie, à la radiothérapie ou à d’autres traitements qui modulent l’autophagie. Comme le montre la figure 3, la méthode présentée peut être appliquée dans des modèles physiologiques. Bien que, dans ce travail, nous nous soyons concentrés sur la quantification des niveaux autophagiques, l’immunofluorescence de la CL3 pourrait également permettre l’évaluation de la colocalisation entre la LC3 et diverses protéines. Il peut servir, par exemple, d’approche mécaniste pour marquer les protéines à différents points du processus autophagique et évaluer si la colocalisation avec la CL3 est affectée par certains traitements ou par la régulation négative de certaines protéines. De cette façon, on pourrait déterminer, par exemple, si un inhibiteur de l’autophagie interrompt le flux autophagique avant ou après la conjugaison de la CL3. Enfin, la méthode peut également être adaptée à des échantillons de tissus pour déterminer l’activation de l’autophagie dans des modèles animaux ou des échantillons de biopsie humaine.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Université de Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), du Conseil national pour la recherche scientifique et la technologie (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; et PUE 22920170100033) et de l’Agence nationale pour la promotion scientifique et technologique (PICT 2019-01664).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
References
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