L’objectif de ce protocole est de déterminer les niveaux autophagiques dans le cancer du pancréas et les cellules acineuses pancréatiques par immunofluorescence CL3 et quantification des points CL3.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Évaluation des niveaux d’autophagie dans deux modèles de cellules pancréatiques différents à l’aide de l’immunofluorescence LC3
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’autophagie est un processus catabolique spécialisé qui dégrade sélectivement les composants cytoplasmiques, y compris les protéines et les organites endommagés. L’autophagie permet aux cellules de répondre physiologiquement aux stimuli de stress et, ainsi, de maintenir l’homéostasie cellulaire. Les cellules cancéreuses peuvent moduler leurs niveaux d’autophagie pour s’adapter à des conditions défavorables telles que l’hypoxie, une carence en nutriments ou des dommages causés par la chimiothérapie. L’adénocarcinome pancréatique canalaire est l’un des types de cancer les plus mortels. Les cellules cancéreuses du pancréas ont une activité d’autophagie élevée en raison de la régulation transcriptionnelle à la hausse et de l’activation post-traductionnelle des protéines d’autophagie.
Ici, la lignée cellulaire PANC-1 a été utilisée comme modèle de cellules cancéreuses humaines pancréatiques, et la lignée cellulaire acineuse pancréatique AR42J a été utilisée comme modèle physiologique de cellules de mammifères hautement différenciées. Cette étude a utilisé l’immunofluorescence de la chaîne légère 3 (CL3) de la protéine associée aux microtubules comme indicateur de l’état de l’activation de l’autophagie. LC3 est une protéine d’autophagie qui, dans des conditions basales, présente un schéma diffus de distribution dans le cytoplasme (connu sous le nom de LC3-I dans cette condition). L’induction de l’autophagie déclenche la conjugaison de la CL3 à la phosphatidyléthanolamine à la surface des autophagosomes nouvellement formés pour former la LC3-II, une protéine liée à la membrane qui aide à la formation et à l’expansion des autophagosomes. Pour quantifier le nombre de structures autophagiques étiquetées, le logiciel open source FIJI a été utilisé à l’aide de l’outil « 3D Objects Counter ».
La mesure des niveaux autophagiques à la fois dans les conditions physiologiques et dans les cellules cancéreuses nous permet d’étudier la modulation de l’autophagie dans diverses conditions telles que l’hypoxie, le traitement de chimiothérapie ou l’élimination de certaines protéines.
Introduction
La macroautophagie (communément appelée autophagie) est un processus catabolique spécialisé qui dégrade sélectivement les composants cytoplasmiques, y compris les protéines et les organites endommagés 1,2. L’autophagie permet aux cellules de répondre physiologiquement aux stimuli de stress et, ainsi, de maintenir l’homéostasie cellulaire3. Au cours de l’autophagie, une vésicule à double membrane se forme : l’autophagosome. L’autophagosome contient les molécules de cargaison et les conduit au lysosome pour la dégradation 1,4.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
1. Préparation cellulaire
- Trempez des lamelles de couverture rondes de 12 mm dans de l’éthanol absolu et placez-les verticalement dans les puits d’une plaque de 24 puits.
- Retirez le couvercle et exposez la plaque multipuits aux rayons ultraviolets pendant 15 min.
- Positionnez les lamelles horizontalement et lavez-les avec le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco.
- Ensemencer un faible nombre de passages de cellules pancréatiques. Le montant doit être ajusté pour obtenir une confluence de 50% à 75% le jour de la fixation16.
NOTE: Il est recommandé d’ensemencer 2,5 × 10 4 PANC....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Ce protocole effectue une immunofluorescence de CL3 dans des lignées cellulaires pancréatiques pour déterminer les niveaux d’autophagie dans différentes conditions. Le résultat de cette expérience a été l’obtention d’images cellulaires à partir des canaux rouge et bleu, correspondant à la CL3 et au DAPI. Les images CL3 indiquent la distribution cellulaire de cette protéine, tandis que le DAPI montre la localisation nucléaire. La figure 2A montre une image représentative de l’immunofluorescen.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
La méthode décrite dans ce protocole permet de visualiser la distribution endogène de la CL3 dans la cellule et de quantifier les niveaux autophagiques dans différentes conditions. Une autre méthode similaire utilisée pour analyser la distribution de la CL3 et déterminer l’activation de l’autophagie implique la transfection de CL3 marquée par fluorescence (telle que RFP-LC3)19. La transfection RFP-LC3 présente l’avantage de ne pas avoir besoin de fixation (ce qui permet d’appliquer cette méthode e.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Université de Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), du Conseil national pour la recherche scientifique et la technologie (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; et PUE 22920170100033) et de l’Agence nationale pour la promotion scientifique et technologique (PICT 2019-01664).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 10x Saline tamponnée au phosphate (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| Lamelles rondes de 12 mm | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Plaque de culture cellulaire à puits | Sorfa | 220300 | |
| Éthanol absolu | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Âne anti-lapin IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Microscope confocal à balayage laser | Zeiss | LSM 800 | |
| Dexaméthasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Sérum de veau | fœtal NATOCOR ; | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb Cell | Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm « M » (Film d’étanchéité de laboratoire) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsine EDTA | Gibco | 11570626 |
Références
- Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146(2018).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO Journal. 36<....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
