Summary
该协议的目标是通过LC3免疫荧光和LC3点定量确定胰腺癌和胰腺腺泡细胞中的自噬水平。
Abstract
自噬是一种特殊的分解代谢过程，可选择性降解细胞质成分，包括蛋白质和受损细胞器。自噬允许细胞对压力刺激做出生理反应，从而维持细胞稳态。癌细胞可能会调节其自噬水平以适应不良条件，如缺氧、营养缺乏或化疗造成的损害。导管胰腺腺癌是最致命的癌症类型之一。胰腺癌细胞由于自噬蛋白的转录上调和翻译后激活而具有高自噬活性。
这里，PANC-1细胞系被用作胰腺人癌细胞的模型，AR42J胰腺腺泡细胞系被用作高度分化的哺乳动物细胞的生理模型。本研究使用微管相关蛋白轻链3（LC3）的免疫荧光作为自噬激活状态的指标。LC3是一种自噬蛋白，在基础条件下，在细胞质中显示出弥漫分布模式（在这种情况下称为LC3-I）。自噬诱导触发LC3与新形成的自噬体表面的磷脂酰乙醇胺的结合，形成LC3-II，这是一种有助于自噬体形成和扩增的膜结合蛋白。为了量化标记的自噬结构的数量，在“3D对象计数器”工具的帮助下使用了开源软件FIJI。
生理条件和癌细胞中自噬水平的测量使我们能够研究在缺氧、化疗或敲低某些蛋白质等不同条件下自噬的调节。
Introduction
巨自噬（通常称为自噬）是一种特殊的分解代谢过程，可选择性降解细胞质成分，包括蛋白质和受损细胞器1，2。自噬允许细胞对应激刺激做出生理反应，从而维持细胞稳态3。在自噬过程中，形成双膜囊泡：自噬体。自噬体包含货物分子并驱动它们到溶酶体进行降解1，4。
自噬体由自噬蛋白微管相关蛋白轻链3（LC3）5修饰。当不诱导自噬时，LC3以LC3-I构象扩散在细胞质和细胞核中。另一方面，当诱导自噬时，LC3与自噬结构6中的磷脂酰乙醇胺偶联。这种新的LC3构象被称为LC3-II1。LC3构象转移导致其细胞定位及其十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）迁移发生变化，这可以通过免疫荧光和蛋白质印迹5，7等技术检测到。通过这种方式，LC3偶联是自噬过程中的关键事件，可用于测量自噬活性。
胰腺腺泡细胞是一种高度分化的细胞，在健康条件下，自噬率较低。然而，在不同的生理条件下或在药物刺激下，它们可以激活自噬。因此，测定该细胞系中的自噬水平有助于研究不同药理学或生物制剂对自噬的潜在直接或间接影响8，9。
导管胰腺腺癌是最致命的癌症类型之一，因为它诊断较晚，化疗耐药性高10。由于自噬相关蛋白的转录上调和翻译后活化，胰腺癌细胞具有高自噬活性11。胰腺癌细胞可能会调整其自噬水平，以应对缺氧、营养剥夺或化疗引起的损伤等不利条件11。因此，分析胰腺癌细胞中的自噬水平可以帮助了解它们如何适应不同的环境，并评估自噬调节治疗的有效性。
这项研究展示了一种在两种不同的胰腺细胞模型中进行LC3免疫荧光的方法。第一个模型PANC-1细胞作为胰腺导管腺癌的模型。这些细胞用吉西他滨处理，吉西他滨是一种化疗药物，以前已被证明可以诱导自噬，特别是在携带致癌Kirsten大鼠肉瘤病毒基因（KRAS）的胰腺癌细胞中12，13。第二种模型AR42J细胞作为胰腺外分泌细胞的更生理模型。这些细胞用地塞米松分化，使其与腺泡胰腺细胞更相似14。在这些细胞中，通过使用PP242（一种有效的mTOR抑制剂15）在药理学上诱导自噬。在这项研究中，我们证明了用两种不同的胰腺模型描述的方案的适用性及其区分低自噬和高自噬状态的能力。
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Protocol
1. 细胞制备
- 将12毫米圆形盖玻片浸泡在无水乙醇中，并将它们垂直放置在24孔板的孔中。
- 取下盖子，将多孔板暴露在紫外线辐射下15分钟。
- 水平放置盖玻片，并用Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）清洗它们。
- 播种低传代数的胰腺细胞。应调整量，以在固定当天获得50%-75%的汇合度16。
注意：建议每孔接种2.5×104 PANC-1或4个×104 AR42J 细胞，以在3天后固定细胞。 - 在含有 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的 DMEM 中培养细胞，在 37 °C 的培养箱中，在含有 5% 二氧化碳 （CO2） 的潮湿气氛下。
注意：对于PANC-1细胞，建议在细胞接种和以下步骤之间孵育细胞2天。在此之后，可以转染，处理或固定细胞。该方案举例说明了在非转染的PANC-1细胞中使用吉西他滨的处理以及非转染的AR42J细胞的分化和PP242处理。
2. 处理细胞
- 吉西他滨治疗PANC-1细胞
- 接种后2天在DMEM中制备1μg/ μL吉西他滨溶液。用 2.6 μL 1 μg/μL 吉西他滨溶液处理每个孔，以达到 20 μM 的最终稀释度。
- 将细胞在培养箱中孵育24小时。
- AR42J 分化和 PP242 处理
- 在DMEM中制备4μg/ mL地塞米松的溶液。
- 用 4.9 μL 4 μg/mL 地塞米松溶液处理每个孔，以获得 100 nM 的最终稀释度。
- 将细胞在培养箱中孵育48小时。
- 除去培养基，并用 0.5 μL 的 1 mM PP242 处理每个孔，以获得 1 μM 的最终稀释液。
- 将细胞在培养箱中孵育2小时。
3. 固定和透化细胞
- 用冷甲醇制备 24 孔板和带有冷磷酸盐缓冲盐水的 6 孔板（PBS;137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na 2 HPO 4、2 mM KH2PO4）。将它们放在冰上。
- 用镊子取每个盖玻片，在PBS中洗涤两次，并在甲醇中孵育6分钟。
4. 阻塞细胞
- 在PBS中洗涤每个盖玻片两次，并在PBS（封闭溶液）中的10%胎牛血清中孵育1小时。
注意：在此步骤中，协议可能会暂停。盖玻片可以在封闭溶液中的冰箱中存放过夜，第二天可以继续该方案。
5. 用一抗孵育盖玻片
- 在封闭溶液中制备1：1，000的抗LC3溶液，并将其保持在冰上。
- 在多孔盖上放置一块实验室密封膜。
- 将抗LC3溶液的每张盖玻片一滴（25μL）放在密封膜上。
- 用镊子取每个盖玻片，并将其放在一抗液滴上，注意细胞侧与溶液接触。
- 通过将一张潮湿的纸放入平底塑料盒中来准备潮湿的房间。
- 将多孔板放入湿度室中，用箔纸盖住，并在冰箱中孵育过夜。
6. 用二抗孵育盖玻片
- 从湿度室中取出多孔板，然后将盖玻片放回多孔板中。
- 用PBS进行三次洗涤。
- 在封闭溶液中制备荧光标记的抗兔溶液，稀释度为1：800，并将其保存在避光的冰上。
- 将密封膜片放在多孔盖上。
- 将每张抗兔溶液盖玻片滴（25μL）放在密封膜上。
- 用镊子取每个盖玻片，并将其放在一抗液滴上，注意细胞侧与溶液接触。
- 将多孔板在室温（RT）避光下孵育2小时。
7. 用 4′ ，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 染色细胞
- 从湿度室中取出多孔板，然后将盖玻片放回多孔板中。
- 用PBS进行三次洗涤。
- 在PBS中制备300 nM的DAPI溶液（避光）。
- 用DAPI溶液孵育每个盖玻片10分钟。
- 用PBS进行三次洗涤。保持多孔板避光。
8. 蒙太奇
- 准备两个装有水和一张纸的烧杯。
- 将聚乙烯醇-双（三甲基铝）-1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷加合物（PVA-DABCO）溶液的每个盖玻片滴（10μL）放在载玻片上。
注意：PVA-DABCO是通过在超纯水中混合0.25M DABCO，10%W / V PVA，20%甘油和50%Tris HCl（1.5M，pH 8.8）制备的。 - 用镊子取每个盖玻片，在每个水杯中清洗，在纸上干燥，然后将其放在PVA-DABCO液滴上（细胞与溶液接触）。
- 让它干燥过夜，避光。
9. 共聚焦显微镜观察和图像捕获
- 使用约63x17的物镜在倒置共聚焦显微镜中可视化盖玻片。
- 捕获标记细胞的代表性图像。
10. 量化LC3点
- 将包含捕获通道的每个图像文件（例如“.czi”）拖放到 ImageJ （FIJI） 屏幕中以打开。单击对话框中的“ 确定 ”，然后关闭 “控制台 ”窗口。
- 从 “图像 ”选项卡中，选择 “颜色”>“拆分通道”。
- 关闭LC3图像以外的通道对应的图像。
- 从“图像”选项卡中，选择“调整>色彩平衡”
- 将“ 最大值 ”滑块向左移动，直到图像饱和以可视化单元格轮廓。
- 使用 手绘选择 工具绘制单元格轮廓。
- 单击重置按钮 以重置颜色 调整。
- 从“ 编辑 ”选项卡中，选择“剪切”以 剪切 所选项目。
- 关闭图像而不保存。
- 从 编辑 选项卡中，选择 粘贴。
- 在 分析 菜单中，选择工具 3D 对象计数器。
- 设置阈值。在本研究提供的示例中，阈值设置为 2，000。
- 设置大小筛选器。在这项研究中，它设定在 50 到 500 之间。
- 确保标记了“对象”和“摘要”框。
- 单击确定。点的数量将被描述为摘要中检测到的对象。
图 1：LC3 免疫荧光方案示意图。 表示LC3免疫荧光的一般方案的示意图。用 BioRender.com 创建的图。 请点击此处查看此图的大图。
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Representative Results
该方案在胰腺细胞系中对LC3进行免疫荧光，以确定不同条件下的自噬水平。该实验的结果是从对应于LC3和DAPI的红色和蓝色通道获得细胞图像。LC3图像显示该蛋白的细胞分布，而DAPI显示核定位。 图2A 显示了在基础或吉西他滨处理条件下LC3的免疫荧光及其与PANC-1细胞中DAPI染色合并的代表性图像。使用斐济的 3D对象计数器 工具分析了一组LC3染色图像。使用该软件，量化了每个细胞的LC3点的数量。图 2B 中的条形图显示了在基础与吉西他滨处理条件下PANC-1细胞中LC3点定量的结果。在该图中，吉西他滨处理下LC3点显著增加，LC3点的数量直接表明自噬活性。我们之前还证明吉西他滨触发胰腺癌细胞的自噬12。总体而言，本文中介绍的方法允许检测吉西他滨在这些细胞中诱导的自噬激活水平。
虽然该协议侧重于使用LC3免疫荧光来确定胰腺癌细胞中的自噬活性，但它可能应用于其他细胞系，包括更多生理相关的模型。为了测试该方法在评估生理反应方面的功效，使用了AR42J细胞系。虽然这些细胞来源于大鼠外分泌胰腺肿瘤，但它们可以通过糖皮质激素刺激分化为外分泌细胞，从而使它们成为合适的胰腺模型8，14，18。AR42J细胞用100nM地塞米松处理分化48小时，然后用mTOR抑制剂PP242处理以诱导自噬15。获得的结果如图3所示，该图显示了PP242处理下每个细胞的LC3点数量显着增加。
到目前为止，我们已经证明所提出的方法对于评估癌细胞和更生理模型的自噬活性是有效的。然而，重要的是要注意，与所提出的协议的微小偏差可能会导致无法解释的结果。
图4A 显示了来自次优实验的代表性图像，其中在盖玻片上接种了过多的细胞，并且获得了过度的汇合。由于各种原因，这种实验可能无法解释。首先，这项工作中提到的细胞类型来自外分泌胰腺，其中细胞被分组在腺泡中。在过度汇合的情况下，这些细胞倾向于堆积并相互叠加生长（例如 图 4A 中的单元格 1 和单元格 2，它们位于单元格 3 和单元格 4 上方）。这种现象使得几乎不可能知道LC3点属于哪个细胞，因此很难估计每个细胞的点数。另一方面，高汇合度的细胞往往会受到压力，从而触发自噬。结果，由于背景自噬活性的增加，对照细胞和处理细胞之间自噬水平的差异可能会减小。
在图4B中，显示了来自另一种次优实验的代表性图像，其中细胞用多聚甲醛而不是甲醇固定。虽然这种固定方法通常对保存多种蛋白质有效，但它不适用于LC3，因为所得图像不能准确反映其真实分布。这种技术错误可能使发现低自噬水平和高自噬水平之间的差异变得不可能。
通常，细胞系可以在接种后 1 天进行处理、转染或固定。然而，重要的是要提到，在PANC-1细胞的情况下，有必要在接种后等待2天，以确保细胞完全粘附在玻璃盖玻片上，然后再进行实验的后续步骤。 图4C 显示了实验的代表性图像，其中细胞在接种后仅1天就用吉西他滨处理。从图中可以看出，本实验中的细胞呈圆形。这种形态降低了细胞质和细胞核之间的关系，使得难以理解LC3的细胞内分布并区分低和高自噬水平。重要的是要注意AR42J没有这个问题，它们已准备好在播种后的第二天进行处理或固定。
当甲醇固定时间变化时，可以获得另一种次优结果。较短的固定时间可能导致不完全固定，如图 4D所示，其中细胞固定3分钟。不完全固定会干扰LC3免疫标记的正确性，导致图像不清晰和定量欠佳。
图 2：基础或吉西他滨条件下 PANC-1 细胞中的 LC3 免疫荧光以及 LC3 点定量。 PANC-1细胞要么用20μM吉西他滨处理24小时，要么不处理，然后用抗LC3免疫标记。（A）显示每种情况的代表性图像。比例尺：10 μm。 （B）条形图表示每个条件的每个单元格的LC3点的平均值和标准误差（SEM）。N = 来自三个独立实验的每个条件 10 个细胞。 p < 0.001 通过学生的 t 检验。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：基础或 PP242 条件下 AR42J 细胞中的 LC3 免疫荧光和 LC3 点定量。 AR42J细胞用100nM地塞米松分化48小时，然后用1μM PP242处理2小时或未处理，然后用抗LC3免疫标记。（A）显示每种情况的代表性图像。比例尺：10 μm。 （B）条形图表示每个条件的每个单元格的LC3点的平均值和标准误差（SEM）。N = 来自三个独立实验的每个条件 10 个细胞。** p < 0.01 通过学生的 t 检验。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：次优实验。 显示了次优实验中LC3免疫荧光的代表性图像。比例尺：10 μm。 （A）过量汇合：7 × 10接种4 个PANC-1细胞，用吉西他滨处理，并用抗LC3免疫标记。标记了四个单元格，以显示单元格 1 和单元格 2 位于单元格 3 和单元格 4 的上方。（B）PFA固定：PANC-1细胞用吉西他滨处理，用PFA固定，并用抗LC3免疫标记。（C）不完全拉伸：PANC-1细胞在接种后第二天用吉西他滨处理，并用抗LC3免疫标记。（D）不完全固定：PANC-1细胞用吉西他滨处理，用甲醇固定3分钟，并用抗LC3免疫标记。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
该协议中描述的方法允许可视化细胞中的内源性LC3分布并量化不同条件下的自噬水平。另一种用于分析LC3分布和确定自噬激活的类似方法涉及荧光标记的LC3转染（如RFP-LC3）19。RFP-LC3转染的优点是不需要固定（允许将该方法应用于活细胞成像20），更便宜，并且不依赖于LC3抗体反应性。另一方面，LC3的免疫荧光具有提供内源性LC3图像的优点，从而避免了与LC3过表达相关的可能问题，例如独立于自噬21的蛋白质聚集体的形成。此外，这种方法不依赖于转染细胞的难易程度，这意味着它适用于不同的细胞系。然而，根据所使用的LC3抗体及其反应性，在某些细胞系中它可能不起作用。一些抗体可能对某些物种有效，但对其他物种无效，即使它们在理论上与不同物种相容。对于该方案中使用的抗体（LC3B D11），我们发现它非常适合人类细胞（PANC-1，HEK293T，HeLa）和大鼠细胞（AR42J）。然而，它不适用于小鼠细胞（MEF细胞），因为我们观察到非特异性核染色。值得注意的是，LC3斑点的定量，无论是内源性的还是过表达的，在区分自噬激活的变化（可能表明LC3-II的产生增加）和LC3-II降解的变化（可能表明自噬通量状态）方面存在局限性。其他方法可用于全面评估自噬活性。例如，使用 RFP-GFP-LC3 表达可以通过区分溶酶体22，23 内部或外部的 LC3-II 来提供准确的评估。
如图4所示，协议中的一些关键步骤不得修改，因为它们的修改可能导致次优结果。首先，设置要接种的正确细胞数很重要。当接种的细胞不足时，它们往往不会抵抗转染或处理并保持圆形。相反，当细胞过量接种时，它们往往会在相邻细胞的顶部生长，这使得专注于单个细胞并区分它们的LC3点变得具有挑战性。值得注意的是，在细胞非常接近但不重叠的情况下，如图4A所示，使用特定膜标志物（例如EGFR）进行免疫染色以区分属于每个细胞24的阳性标志物可能会有所帮助。然而，重要的是要注意，某些标志物如E-钙粘蛋白和EpCAM不适合PANC-1细胞中的这一目的，因为它们的膜表达降低，这是由与该细胞类型相关的典型上皮 - 间充质过渡过程引起的25，26，27。其次，当专门处理PANC-1细胞时，必须在接种和实验的后续步骤之间至少等待1天。相反，当人们没有等待正确的时间时，单元格可能会被四舍五入，从而难以解释结果。第三，固定是该协议中的关键步骤。正如我们已经展示的，该方法仅在适当的甲醇固定下有效。多聚甲醛固定不能正常工作，因为较短的时间可能导致不完全固定，因此不应修改甲醇固定时间。我们测试了长达1小时的甲醇固定时间，没有观察到LC3标记的差异。尽管如此，我们建议不要使用延长固定时间，因为甲醇固定会导致可溶性细胞蛋白和游离荧光分子的丢失28。因此，建议坚持标准固定时间，以确保精确可靠的结果。
在所描述的协议中可以接受一些修改。例如，可以使用12孔板代替24孔板，以及在15 mm圆形盖玻片而不是12 mm盖玻片上生长细胞。在这种情况下，应该考虑到要接种的细胞数量以及所用试剂的体积将大于本协议中描述的细胞数量。在这种情况下，应接种 4 × 104 PANC-1 和 6.5 × 104 AR42J。此外，用过的阻断解决方案可以用其他溶液代替，例如PBS中的1%BSA，这将导致类似的结果。同样，阻塞时间可以增加到24小时而不会显着改变结果。抗体孵育时间和浓度可能会调整，并且可能会发生变化，例如，如果使用另一种LC3抗体。虽然本研究制备了PVA-DABCO解决方案，但也可以使用商业蒙太奇解决方案。另一方面，可以修改定量方法。例如，可以对图像应用一些过滤器或蒙版，并且可以使用替代工具进行点量化。
在这项工作中，我们指导了LC3免疫荧光的应用来研究胰腺癌细胞的行为。在这些细胞中，自噬是基础激活的，并且可能作为对各种压力情况的反应进行调节，例如化疗，缺氧或营养缺乏11，12。这些细胞中自噬的测定可能适用于研究细胞对化疗、放疗或其他调节自噬的治疗的反应。如图 3所示，所提出的方法可以应用于生理模型。虽然，在这项工作中，我们专注于自噬水平的定量，但LC3的免疫荧光也可能允许评估LC3和多种蛋白质之间的共定位。例如，它可以作为一种机制方法，在自噬过程中的不同点标记蛋白质，并评估与LC3的共定位是否受到某些处理或某些蛋白质下调的影响。通过这种方式，可以确定，例如，某些自噬抑制剂是否在LC3偶联之前或之后中断自噬通量。最后，该方法还可以适用于组织样品，以确定动物模型或人活检样品中的自噬活化。
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Disclosures
没有宣布利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了布宜诺斯艾利斯大学（UBACyT 2018-2020 20020170100082BA）、国家科学研究与技术委员会（CONICET）（PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO;和PUE 22920170100033）和国家科学技术促进局（PICT 2019-01664）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
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