Avaliação dos Níveis de Autofagia em Dois Diferentes Modelos de Células Pancreáticas Utilizando Imunofluorescência LC3

Resumo

O objetivo deste protocolo é determinar os níveis autofágicos em câncer de pâncreas e células acinares pancreáticas através da imunofluorescência da LC3 e quantificação do ponto da CL3.

Resumo

A autofagia é um processo catabólico especializado que degrada seletivamente componentes citoplasmáticos, incluindo proteínas e organelas danificadas. A autofagia permite que as células respondam fisiologicamente aos estímulos de estresse e, assim, mantenham a homeostase celular. As células cancerosas podem modular seus níveis de autofagia para se adaptar a condições adversas como hipóxia, deficiência de nutrientes ou danos causados pela quimioterapia. O adenocarcinoma ductal do pâncreas é um dos tipos mais mortais de câncer. As células cancerosas do pâncreas apresentam alta atividade autofágica devido à suprarregulação transcricional e ativação pós-traducional das proteínas autofágicas.

Aqui, a linhagem celular PANC-1 foi usada como modelo de células cancerosas humanas pancreáticas, e a linhagem celular acinar pancreática AR42J foi usada como modelo fisiológico de células de mamíferos altamente diferenciadas. Este estudo utilizou a imunofluorescência da proteína de cadeia leve 3 associada a microtúbulos (CL3) como um indicador do estado de ativação da autofagia. A LC3 é uma proteína autofágica que, em condições basais, apresenta um padrão difuso de distribuição no citoplasma (conhecido como CL3-I nessa condição). A indução da autofagia desencadeia a conjugação da LC3 à fosfatidiletanolamina na superfície dos autofagossomos recém-formados para formar a LC3-II, uma proteína ligada à membrana que auxilia na formação e expansão dos autofagossomos. Para quantificar o número de estruturas autofágicas marcadas, utilizou-se o software de código aberto FIJI com o auxílio da ferramenta "3D Objects Counter".

A medida dos níveis autofágicos tanto em condições fisiológicas quanto em células cancerosas permite estudar a modulação da autofagia sob diversas condições, como hipóxia, tratamento quimioterápico ou knockdown de certas proteínas.

Introdução

A macroautofagia (comumente referida como autofagia) é um processo catabólico especializado que degrada seletivamente componentes citoplasmáticos, incluindo proteínas e organelas danificadas ^1,2. A autofagia permite que as células respondam fisiologicamente aos estímulos de estresse e, assim, mantenham a homeostase celular³. Durante a autofagia, uma dupla vesícula de membrana é formada: o autofagossomo. O autofagossomo contém as moléculas de carga e as conduz ao lisossomo para degradação ^1,4.

Os autof....

Protocolo

1. Preparação celular

1. Mergulhe as tampas redondas de 12 mm em etanol absoluto e coloque-as verticalmente nos poços de uma placa de 24 poços.
2. Retire a tampa e exponha a placa de poço múltiplo à radiação ultravioleta por 15 min.
3. Posicione as tampas horizontalmente e lave-as com o DMEM (Modified Eagle Medium) da Dulbecco.
4. Semear um baixo número de passagem de células pancreáticas. O valor deve ser ajustado para se obter 50%-75% de confluência no dia da fixação¹⁶.
   NOTA: Recomenda-se semear 2,5 × 10 4 células PANC-1 ou 4 ×^{10 4} células AR42J por poço para fixar as células após 3 d....

Resultados

Este protocolo realiza a imunofluorescência da CL3 em linhagens celulares pancreáticas para determinar os níveis de autofagia em diferentes condições. O resultado deste experimento foi a obtenção de imagens celulares dos canais vermelho e azul, correspondentes a CL3 e DAPI. As imagens de CL3 indicam a distribuição celular dessa proteína, enquanto o DAPI mostra a localização nuclear. A Figura 2A mostra uma imagem representativa da imunofluorescência da CL3 e sua fusão com a coloração DAPI em .......

Discussão

O método descrito neste protocolo permite visualizar a distribuição endógena da CL3 na célula e quantificar os níveis autofágicos sob diferentes condições. Outro método semelhante utilizado para analisar a distribuição da CL3 e determinar a ativação da autofagia envolve a transfecção de LC3 marcada com fluorescência (como RFP-LC3)¹⁹. A transfecção RFP-LC3 tem as vantagens de não necessitar de fixação (o que permite a aplicação deste método em imagens de células^vivas20), ser.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10x Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Corning	46-013-CM
12 mm lamínulas redondas	HDA	CBR_OBJ_6467
24 Well- Placa de cultura de células	Sorfa	220300
Etanol absoluto	Biopack	2207.10.00
Alexa Fluor 594 IgG anti-coelho de burro (H + L)	Invitrogen	R37119
Microscópio Confocal de Varredura a Laser	Zeiss	LSM 800
Dexametasona	Sigma Aldrich	D4902
DMEN	Sartorius	01-052-1A
Soro Fetal	Bovino NATOCOR	Lintc-634
Gemcitabina	Eli Lilly	VL7502
LC3B (D11) XP Tecnologia	de Sinalização de Células	3868S
Metanol	Anedra	6197
Parafilme "M" (Filme de Vedação de Laboratório)	Bemis/Curwood	PM-996
Solução Pen-Strep	Sartorius	03-031-1B
PP242	Santa Cruz Biotecnologia	SC-301606
Tripsina EDTA	Gibco	11570626

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