Summary
O objetivo deste protocolo é determinar os níveis autofágicos em câncer de pâncreas e células acinares pancreáticas através da imunofluorescência da LC3 e quantificação do ponto da CL3.
Abstract
A autofagia é um processo catabólico especializado que degrada seletivamente componentes citoplasmáticos, incluindo proteínas e organelas danificadas. A autofagia permite que as células respondam fisiologicamente aos estímulos de estresse e, assim, mantenham a homeostase celular. As células cancerosas podem modular seus níveis de autofagia para se adaptar a condições adversas como hipóxia, deficiência de nutrientes ou danos causados pela quimioterapia. O adenocarcinoma ductal do pâncreas é um dos tipos mais mortais de câncer. As células cancerosas do pâncreas apresentam alta atividade autofágica devido à suprarregulação transcricional e ativação pós-traducional das proteínas autofágicas.
Aqui, a linhagem celular PANC-1 foi usada como modelo de células cancerosas humanas pancreáticas, e a linhagem celular acinar pancreática AR42J foi usada como modelo fisiológico de células de mamíferos altamente diferenciadas. Este estudo utilizou a imunofluorescência da proteína de cadeia leve 3 associada a microtúbulos (CL3) como um indicador do estado de ativação da autofagia. A LC3 é uma proteína autofágica que, em condições basais, apresenta um padrão difuso de distribuição no citoplasma (conhecido como CL3-I nessa condição). A indução da autofagia desencadeia a conjugação da LC3 à fosfatidiletanolamina na superfície dos autofagossomos recém-formados para formar a LC3-II, uma proteína ligada à membrana que auxilia na formação e expansão dos autofagossomos. Para quantificar o número de estruturas autofágicas marcadas, utilizou-se o software de código aberto FIJI com o auxílio da ferramenta "3D Objects Counter".
A medida dos níveis autofágicos tanto em condições fisiológicas quanto em células cancerosas permite estudar a modulação da autofagia sob diversas condições, como hipóxia, tratamento quimioterápico ou knockdown de certas proteínas.
Introduction
A macroautofagia (comumente referida como autofagia) é um processo catabólico especializado que degrada seletivamente componentes citoplasmáticos, incluindo proteínas e organelas danificadas 1,2. A autofagia permite que as células respondam fisiologicamente aos estímulos de estresse e, assim, mantenham a homeostase celular3. Durante a autofagia, uma dupla vesícula de membrana é formada: o autofagossomo. O autofagossomo contém as moléculas de carga e as conduz ao lisossomo para degradação 1,4.
Os autofagossomos são decorados pela proteína autofágica associada à proteína microtubular de cadeia leve 3 (CL3)5. Quando a autofagia não é induzida, a CL3 é difundida no citoplasma e no núcleo na conformação da LC3-I. Por outro lado, quando a autofagia é induzida, a CL3 é conjugada com uma fosfatidiletanolamina na membrana das estruturas autofágicas6. Essa nova conformação da LC3 é conhecida como LC3-II1. O desvio de conformação da CL3 provoca alterações em sua localização celular e sua migração por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio e poliacrilamida (SDS-PAGE), que pode ser detectada por técnicas como imunofluorescência e western blot 5,7. Dessa forma, a conjugação da CL3 é um evento chave no processo autofágico que pode ser usado para medir a atividade autofágica.
A célula acinar pancreática é uma célula altamente diferenciada que, em condições saudáveis, apresenta baixa taxa de autofagia. Entretanto, em diferentes condições fisiológicas ou sob estimulação farmacológica, podem ativar a autofagia. Portanto, a determinação dos níveis autofágicos nessa linhagem celular é útil para estudar os potenciais efeitos diretos ou indiretos de diferentes agentes farmacológicos ou biológicos sobre aautofagia8,9.
O adenocarcinoma ductal de pâncreas é um dos tipos de câncer mais letais, dado seu diagnóstico tardio e sua alta resistência àquimioterapia10. As células cancerosas do pâncreas apresentam alta atividade autofágica devido à suprarregulação transcricional e ativação pós-traducional de proteínas relacionadas à autofagia11. As células do câncer de pâncreas podem ajustar seus níveis de autofagia em resposta a condições desfavoráveis como hipóxia, privação de nutrientes ou dano induzido por quimioterapia11. Assim, analisar os níveis de autofagia em células de câncer de pâncreas pode ajudar a entender como elas se adaptam a diferentes ambientes e avaliar a eficácia de tratamentos moduladores da autofagia.
Este estudo mostra um método para realizar a imunofluorescência CL3 em dois modelos celulares pancreáticos distintos. O primeiro modelo, células PANC-1, serviu de modelo para adenocarcinoma ductal pancreático. Essas células foram tratadas com gemcitabina, um agente quimioterápico que já demonstrou induzir autofagia, especificamente em células de câncer de pâncreas portadoras do gene oncogênico Kirsten rat sarcoma virus (KRAS)12,13. O segundo modelo, células AR42J, serviu como um modelo mais fisiológico de células pancreáticas exócrinas. Essas células foram diferenciadas com dexametasona para se tornarem mais semelhantes às células pancreáticas acinares14. Nessas células, a autofagia foi induzida farmacologicamente pelo uso da PP242, que é um potente inibidor da mTOR15. Neste estudo, demonstramos a aplicabilidade do protocolo descrito com dois modelos pancreáticos diferentes e sua capacidade de discriminar estados de baixa e alta autofagia.
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Protocol
1. Preparação celular
- Mergulhe as tampas redondas de 12 mm em etanol absoluto e coloque-as verticalmente nos poços de uma placa de 24 poços.
- Retire a tampa e exponha a placa de poço múltiplo à radiação ultravioleta por 15 min.
- Posicione as tampas horizontalmente e lave-as com o DMEM (Modified Eagle Medium) da Dulbecco.
- Semear um baixo número de passagem de células pancreáticas. O valor deve ser ajustado para se obter 50%-75% de confluência no dia da fixação16.
NOTA: Recomenda-se semear 2,5 × 10 4 células PANC-1 ou 4 ×10 4 células AR42J por poço para fixar as células após 3 dias. - Cultivar as células em DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina em estufa a 37 °C sob atmosfera umidificada com 5% de dióxido de carbono (CO2).
NOTA: Para células PANC-1, recomenda-se incubar as células por 2 dias entre a semeadura celular e as etapas seguintes. Após esse tempo, as células podem ser transfectadas, tratadas ou fixadas. Este protocolo exemplifica o tratamento com gemcitabina em células PANC-1 não transfectadas e a diferenciação e tratamento com PP242 para células AR42J não transfectadas.
2. Tratamento das células
- Tratamento com gencitabina para células PANC-1
- Preparar uma solução de 1 μg/μL de gemcitabina em DMEM 2 dias após a semeadura. Tratar cada poço com 2,6 μL da solução de gemcitabina de 1 μg/μL para obter uma diluição final de 20 μM.
- Incubar as células por 24 h na incubadora.
- Diferenciação AR42J e tratamento PP242
- Preparar uma solução de 4 μg/ml de dexametasona em DMEM.
- Tratar cada poço com 4,9 μL de 4 μg/mL de solução de dexametasona para obter uma diluição final de 100 nM.
- Incubar as células por 48 h na incubadora.
- Retirar o meio e tratar cada poço com 0,5 μL de 1 mM PP242 para obter uma diluição final de 1 μM.
- Incubar as células por 2 h na incubadora.
3. Fixação e permeabilização das células
- Preparar uma placa de 24 poços com metanol frio e uma placa de 6 poços com solução salina tamponada com fosfato frio (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO4, 2 mM KH2PO4). Mantenha-os no gelo.
- Pegue cada tampa com uma pinça, lave-a duas vezes em PBS e incube por 6 min em metanol.
4. Bloqueio das células
- Lave cada lamínula duas vezes em PBS e incube por 1 h em soro fetal bovino a 10% em PBS (solução de bloqueio).
Observação : nesta etapa, o protocolo pode ser pausado. As tampas podem ser armazenadas durante a noite na geladeira na solução de bloqueio, e o protocolo pode ser continuado no dia seguinte.
5. Incubar as lamínulas com o anticorpo primário
- Prepare uma solução 1:1.000 de anti-LC3 na solução de bloqueio e mantenha-a no gelo.
- Coloque um pedaço de filme de vedação de laboratório sobre a tampa de vários poços.
- Coloque uma gota (25 μL) por lamínula de solução anti-LC3 sobre a película de vedação.
- Pegue cada tampa com uma pinça e coloque-a sobre a gota primária de anticorpos, tomando cuidado para que o lado celular esteja em contato com a solução.
- Prepare uma câmara úmida colocando um pedaço de papel úmido em uma caixa de plástico de fundo plano.
- Coloque a placa de vários poços na câmara de umidade, cubra-a com papel alumínio e incube durante a noite na geladeira.
6. Incubar as lamínulas com o anticorpo secundário
- Remova a placa de vários poços da câmara de umidade e coloque as lamínulas de volta na placa de vários poços.
- Realizar três lavagens com PBS.
- Preparar uma solução de anticoelho fluorescentemente marcado com uma diluição de 1:800 na solução de bloqueio e mantê-la no gelo protegido da luz.
- Coloque uma peça de película de vedação sobre a tampa de vários poços.
- Colocar uma gota (25 μL) por lamínula de solução anticoelho sobre a película de vedação.
- Pegue cada tampa com uma pinça e coloque-a sobre a gota primária de anticorpos, tomando cuidado para que o lado celular esteja em contato com a solução.
- Incubar a placa de poço múltiplo na câmara de umidade por 2 h à temperatura ambiente (TR) protegida da luz.
7. Coloração das células com 4′ ,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)
- Remova a placa de vários poços da câmara de umidade e coloque as lamínulas de volta na placa de vários poços.
- Realizar três lavagens com PBS.
- Preparar uma solução de 300 nM de DAPI em PBS (protegido da luz).
- Incubar cada lamínula com a solução DAPI durante 10 min.
- Realizar três lavagens com PBS. Mantenha a placa de vários poços protegida da luz.
8. Montagem
- Prepare dois copos com água e um pedaço de papel.
- Colocar uma gota (10 μL) por lamínula de uma solução de aduto de poliálcool vinílico-bis(trimetilalumínio)-1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano (PVA-DABCO) numa lâmina.
NOTA: PVA-DABCO é preparado combinando 0,25 M DABCO, 10% P/V PVA, 20% glicerol e 50% Tris HCl (1,5 M, pH 8,8) em água ultrapura. - Pegue cada tampa com uma pinça, lave-a em cada copo de água, seque-a no papel e coloque-a sobre a gota de PVA-DABCO (com as células em contato com a solução).
- Deixe secar durante a noite, protegido da luz.
9. Visualização em microscopia confocal e captura de imagens
- Visualize as lamínulas em um microscópio confocal invertido usando uma objetiva de cerca de 63x17.
- Capture imagens representativas das células marcadas.
10. Quantificação dos pontos da CL3
- Arraste e solte cada arquivo de imagem contendo os canais capturados, como ".czi", na tela do ImageJ (FIJI) para abrir. Clique em Ok na caixa de diálogo e feche a janela Console .
- Na guia Imagem , selecione Cor > Canais divididos.
- Feche as imagens correspondentes aos canais diferentes da imagem LC3.
- Na guia Imagem , selecione Ajustar > Equilíbrio de Cores
- Mova o controle deslizante Máximo para a esquerda até que a imagem esteja saturada para visualizar os contornos da célula.
- Desenhe o contorno da célula com a ferramenta Seleção à mão livre .
- Clique no botão Redefinir para redefinir o ajuste de cor.
- Na guia Editar , selecione Recortar para cortar o item selecionado.
- Feche a imagem sem salvá-la.
- Na guia Editar , selecione Colar.
- No menu Analisar , escolha a ferramenta Contador de objetos 3D.
- Defina o limite. No exemplo fornecido neste estudo, o limite é definido em 2.000.
- Defina o filtro de tamanho. Neste estudo, situa-se entre 50 e 500.
- Certifique-se de que as caixas Objetos e Resumo estejam marcadas.
- Clique em Ok. O número de pontos será descrito como Objetos Detectados no Resumo.
Figura 1: Diagrama esquemático do protocolo de imunofluorescência da CL3. Diagrama esquemático que representa o protocolo geral fornecido para a imunofluorescência da CL3. Figura criada com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
Este protocolo realiza a imunofluorescência da CL3 em linhagens celulares pancreáticas para determinar os níveis de autofagia em diferentes condições. O resultado deste experimento foi a obtenção de imagens celulares dos canais vermelho e azul, correspondentes a CL3 e DAPI. As imagens de CL3 indicam a distribuição celular dessa proteína, enquanto o DAPI mostra a localização nuclear. A Figura 2A mostra uma imagem representativa da imunofluorescência da CL3 e sua fusão com a coloração DAPI em células PANC-1 sob condições basais ou de tratamento com gemcitabina. Um conjunto de imagens da coloração da CL3 foi analisado utilizando a ferramenta 3D Objects Counter em FIJI. Com esse software, quantificou-se a quantidade de pontos CL3 por célula. O gráfico de barras na Figura 2B mostra os resultados da quantificação de pontos da CL3 em células PANC-1 sob condições basais versus tratamento com gemcitabina. Neste gráfico, os pontos da CL3 aumentaram significativamente sob o tratamento com gencitabina, com o número de pontos da CL3 indicando diretamente a atividade autofágica. Também demonstramos anteriormente que a gencitabina desencadeia autofagia em células cancerosaspancreáticas12. De modo geral, o método apresentado neste artigo permite detectar o nível de aumento da ativação da autofagia induzida pela gencitabina nessas células.
Enquanto este protocolo se concentra no uso de imunofluorescência LC3 para determinar a atividade autofágica em células de câncer de pâncreas, ele poderia potencialmente ser aplicado a outras linhagens celulares, incluindo modelos fisiologicamente mais relevantes. Para testar a eficácia do método na avaliação de respostas fisiológicas, foi utilizada a linhagem celular AR42J. Embora essas células sejam derivadas de um tumor pancreático exócrino de ratos, elas podem ser diferenciadas em células exócrinas com estimulação glicocorticoide, tornando-as um modelo pancreático adequado 8,14,18. As células AR42J foram diferenciadas com tratamento com dexametasona 100 nM por 48 h, seguido de tratamento com o inibidor de mTOR PP242 para induzir autofagia15. Os resultados obtidos estão apresentados na Figura 3, que mostra um aumento significativo no número de pontos de CL3 por célula sob o tratamento com PP242.
Até o momento, demonstramos que o método apresentado é eficaz para avaliar a atividade autofágica tanto em células cancerosas quanto em um modelo mais fisiológico. No entanto, é importante ressaltar que pequenos desvios em relação ao protocolo apresentado podem resultar em resultados ininterpretáveis.
A Figura 4A mostra uma imagem representativa de um experimento subótimo, no qual muitas células foram semeadas nas lamínulas e confluência excessiva foi obtida. Esse tipo de experimento pode ser ininterpretável por diversas razões. Primeiramente, os tipos celulares citados neste trabalho são derivados do pâncreas exócrino, onde as células estão agrupadas em ácinos. Sob uma confluência excessiva, essas células tendem a se acumular e crescer umas sobre as outras (como a célula 1 e a célula 2 na Figura 4A, que estão acima da célula 3 e da célula 4). Esse fenômeno torna praticamente impossível saber a qual célula pertencem os pontos da CL3, tornando muito difícil estimar o número de pontos por célula. Por outro lado, células em alta confluência tendem a ser estressadas, o que desencadeia autofagia. Como resultado, as diferenças nos níveis autofágicos entre as células controle e tratadas podem diminuir devido a um aumento na atividade autofágica de fundo.
Na Figura 4B, uma imagem representativa de outro tipo de experimento subótimo é mostrada em que as células foram fixadas com paraformaldeído em vez de metanol. Embora esse método de fixação seja geralmente eficaz para preservar uma variedade de proteínas, ele não é adequado para CL3, pois a imagem resultante não reflete com precisão sua verdadeira distribuição. Esse erro técnico pode impossibilitar encontrar diferenças entre níveis autofágicos baixos e altos.
Geralmente, as linhagens celulares podem ser tratadas, transfectadas ou fixadas 1 dia após a semeadura. No entanto, é crucial mencionar que, no caso das células PANC-1, é necessário aguardar 2 dias após a semeadura para garantir a aderência completa das células às lamínulas de vidro antes de prosseguir com as etapas subsequentes do experimento. A Figura 4C mostra uma imagem representativa de um experimento em que as células foram tratadas com gemcitabina apenas 1 dia após a semeadura. A partir da figura, pode-se observar que as células deste experimento tinham uma forma arredondada. Essa morfologia diminuiu a relação entre o citoplasma e o núcleo, dificultando o entendimento da distribuição intracelular da CL3 e a discriminação entre níveis autofágicos baixos e altos. É importante notar que o AR42J não tem esse problema, e eles estão prontos para serem tratados ou corrigidos no dia seguinte à semeadura.
Outro resultado subótimo pode ser obtido quando o tempo de fixação do metanol é variado. Tempos menores de fixação podem causar fixação incompleta, como representado na Figura 4D, onde as células foram fixadas por 3 min. A fixação incompleta pode interferir na adequada marcação imunológica da CL3, levando a imagens pouco claras e quantificação subótima.
Figura 2: Imunofluorescência da CL3 em células PANC-1 em condições basais ou gemcitabina e quantificação de pontos da CL3. As células PANC-1 foram tratadas com gemcitabina 20 μM por 24 h ou deixadas sem tratamento e, em seguida, imunomarcadas com anti-LC3. (A) Imagens representativas de cada condição são mostradas. Barra de escala: 10 μm. (B) O gráfico de barras representa as médias e os erros padrão das médias (EPM) dos pontos da CL3 por célula para cada condição. N = 10 células por condição de três experimentos independentes. p < 0,001 pelo teste t de Student. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imunofluorescência da CL3 em células AR42J em condições basais ou PP242 e quantificação de pontos da CL3. As células AR42J foram diferenciadas com dexametasona 100 nM por 48 h e, em seguida, tratadas com 1 μM PP242 por 2 h ou não tratadas, seguidas de imunomarcação com anti-LC3. (A) Imagens representativas de cada condição são mostradas. Barra de escala: 10 μm. (B) O gráfico de barras representa as médias e os erros padrão das médias (EPM) dos pontos da CL3 por célula para cada condição. N = 10 células por condição de três experimentos independentes. ** p < 0,01 pelo teste t de Student. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Experimentos subótimos. Imagens representativas da imunofluorescência LC3 em experimentos subótimos são mostradas. Barra de escala: 10 μm. (A) Excesso de confluência: 7 × 104 células PANC-1 foram semeadas, tratadas com gemcitabina e imunomarcadas com anti-LC3. Quatro células são marcadas para mostrar que a célula 1 e a célula 2 estão acima da célula 3 e da célula 4. (B) Fixação de PFA: as células PANC-1 foram tratadas com gemcitabina, fixadas com PFA e imunomarcadas com anti-LC3. (C) Estiramento incompleto: as células PANC-1 foram tratadas com gemcitabina no dia seguinte à semeadura e imunomarcadas com anti-LC3. (D) Fixação incompleta: as células PANC-1 foram tratadas com gemcitabina, fixadas com metanol por 3 min e imunomarcadas com anti-LC3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método descrito neste protocolo permite visualizar a distribuição endógena da CL3 na célula e quantificar os níveis autofágicos sob diferentes condições. Outro método semelhante utilizado para analisar a distribuição da CL3 e determinar a ativação da autofagia envolve a transfecção de LC3 marcada com fluorescência (como RFP-LC3)19. A transfecção RFP-LC3 tem as vantagens de não necessitar de fixação (o que permite a aplicação deste método em imagens de célulasvivas20), ser mais barata e não depender da reatividade do anticorpo LC3. Por outro lado, a imunofluorescência da CL3 tem a vantagem de fornecer uma imagem da CL3 endógena, evitando, assim, possíveis problemas relacionados à superexpressão da CL3, como a formação de agregados proteicos independentes daautofagia21. Além disso, esse método não depende da facilidade de transfecção das células, ou seja, é aplicável a diversas linhagens celulares. No entanto, dependendo do anticorpo LC3 que é usado e sua reatividade, existem algumas linhas celulares em que ele pode não funcionar. Alguns anticorpos podem funcionar bem para certas espécies, mas não para outras, mesmo quando são teoricamente compatíveis com espécies diferentes. No caso do anticorpo utilizado neste protocolo (LC3B D11), descobrimos que ele funciona perfeitamente para células humanas (PANC-1, HEK293T, HeLa) e células de rato (AR42J). No entanto, não funciona para células de camundongo (células MEF), pois observamos coloração nuclear inespecífica. Vale ressaltar que a quantificação dos pontos de CL3, sejam endógenos ou superexpressos, tem limitações na distinção entre alterações na ativação da autofagia, o que pode indicar o aumento da produção de CL3-II, e alterações na degradação da CL3-II, o que pode indicar um estado de fluxo autofágico. Métodos adicionais podem ser usados para avaliar de forma abrangente a atividade da autofagia. Por exemplo, o uso da expressão de RFP-GFP-LC3 pode fornecer uma avaliação precisa ao distinguir entre CL3-II dentro ou fora do lisossomo22,23.
Como mostrado na Figura 4, existem algumas etapas críticas no protocolo que não devem ser modificadas, uma vez que sua modificação pode levar a resultados subótimos. Primeiro, é importante definir o número correto de células a serem semeadas. Quando não há células suficientes semeadas, elas tendem a não resistir à transfecção ou aos tratamentos e permanecem arredondadas. Pelo contrário, quando as células são semeadas em excesso, elas tendem a crescer em cima das células vizinhas, tornando desafiador se concentrar em células individuais e distinguir entre seus pontos LC3. Notavelmente, em situações em que as células estão próximas, mas não se sobrepõem, como mostrado na Figura 4A, pode ser útil usar a imunomarcação com marcadores de membrana específicos, como EGFR, para distinguir entre os marcadores positivos pertencentes a cada célula24. Entretanto, é importante ressaltar que alguns marcadores como a E-caderina e a EpCAM não são adequados para esse fim em células PANC-1 devido à sua reduzida expressão de membrana, que resulta do típico processo de transição epitélio-mesenquimal associado a esse tipo celular25,26,27. Em segundo lugar, ao trabalhar especificamente com células PANC-1, é essencial aguardar pelo menos 1 dia entre a semeadura e as etapas subsequentes do experimento. Por outro lado, quando não se espera o momento certo, as células podem ser arredondadas, dificultando a interpretação dos resultados. Em terceiro lugar, a fixação é uma etapa crítica neste protocolo. Como mostramos, o método só funciona com uma fixação adequada de metanol. A fixação do paraformaldeído não funciona corretamente para a imunomarcação da LC3, enquanto o tempo de fixação do metanol não deve ser modificado, uma vez que tempos mais curtos podem levar a uma fixação incompleta. Testamos tempos de fixação de metanol até 1 h e não observamos diferenças na marcação da CL3. No entanto, desaconselhamos o uso de tempos de fixação prolongados, pois a fixação com metanol pode levar à perda de proteínas celulares solúveis e moléculas fluorescentes livres28. Portanto, recomenda-se aderir ao tempo de fixação padrão para garantir resultados precisos e confiáveis.
Algumas modificações podem ser aceitas no protocolo descrito. Por exemplo, uma placa de 12 poços pode ser usada em vez da placa de 24 poços, bem como o crescimento das células sobre lamínulas redondas de 15 mm em vez de lamínulas de 12 mm. Nesse caso, deve-se considerar que o número de células a serem semeadas, bem como os volumes de reagentes utilizados, serão maiores do que os descritos neste protocolo. Neste caso, 4 × 10 4 PANC-1 e 6,5 × 104 AR42J devem ser semeados. Além disso, a solução de bloqueio usada pode ser substituída por outras, como a BSA a 1% em PBS, o que levaria a resultados semelhantes. Da mesma forma, o tempo de bloqueio poderia ser aumentado até 24 h sem alterar significativamente os resultados. Os tempos de incubação e a concentração do anticorpo podem ser ajustados e podem mudar, por exemplo, se outro anticorpo LC3 for usado. Embora a solução de PVA-DABCO seja preparada neste estudo, soluções de montagem comercial também podem ser usadas. Por outro lado, o método de quantificação pode ser modificado. Por exemplo, a aplicação de alguns filtros ou máscaras às imagens é possível, e uma ferramenta alternativa pode ser usada para quantificação de pontos.
Neste trabalho, direcionamos a aplicação da imunofluorescência da CL3 para estudar o comportamento de células de câncer de pâncreas. Nessas células, a autofagia é ativada basalmente e pode ser modulada em resposta a diversas situações estressantes, como quimioterapia, hipóxia ou deficiência de nutrientes11,12. A determinação da autofagia nessas células pode ser aplicável ao estudo da resposta celular à quimioterapia, radioterapia ou outros tratamentos que modulam a autofagia. Como mostrado na Figura 3, o método apresentado pode ser aplicado em modelos fisiológicos. Embora, neste trabalho, tenhamos focado na quantificação dos níveis autofágicos, a imunofluorescência da CL3 também pode permitir a avaliação da colocalização entre CL3 e diversas proteínas. Pode servir, por exemplo, como uma abordagem mecanicista para marcar proteínas em diferentes pontos do processo autofágico e avaliar se a colocalização com LC3 é afetada por alguns tratamentos ou pela downregulation de algumas proteínas. Dessa forma, poder-se-ia determinar, por exemplo, se algum inibidor da autofagia interrompe o fluxo autofágico antes ou após a conjugação da CL3. Finalmente, o método também pode ser adaptado a amostras de tecido para determinar a ativação da autofagia em modelos animais ou amostras de biópsia humana.
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Disclosures
Não foram declarados conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por bolsas da Universidade de Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), do Conselho Nacional de Pesquisa Científica e Tecnologia (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; e PUE 22920170100033) e da Agência Nacional de Promoção Científica e Tecnológica (PICT 2019-01664).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
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