Summary
Målet med detta protokoll är att bestämma autofagiska nivåer i bukspottskörtelcancer och acinarceller i bukspottskörteln genom LC3-immunofluorescens och LC3-punktkvantifiering.
Abstract
Autofagi är en specialiserad katabol process som selektivt bryter ned cytoplasmatiska komponenter, inklusive proteiner och skadade organeller. Autofagi tillåter celler att fysiologiskt reagera på stressstimuli och därmed upprätthålla cellulär homeostas. Cancerceller kan modulera sina autofaginivåer för att anpassa sig till negativa tillstånd som hypoxi, näringsbrist eller skador orsakade av kemoterapi. Duktalt pankreas adenokarcinom är en av de dödligaste typerna av cancer. Pankreascancerceller har hög autofagiaktivitet på grund av transkriptionell uppreglering och posttranslationell aktivering av autofagiproteiner.
Här användes PANC-1-cellinjen som en modell av humana cancerceller i bukspottskörteln, och AR42J-acinarcellinjen i bukspottskörteln användes som en fysiologisk modell av mycket differentierade däggdjursceller. Denna studie använde immunofluorescensen av mikrotubuliassocierat protein light chain 3 (LC3) som en indikator på statusen för autofagiaktivering. LC3 är ett autofagiprotein som under basala förhållanden visar ett diffust fördelningsmönster i cytoplasman (känd som LC3-I i detta tillstånd). Autofagiinduktion utlöser konjugeringen av LC3 till fosfatidyletanolamin på ytan av nybildade autofagosomer för att bilda LC3-II, ett membranbundet protein som hjälper till att bilda och expandera autofagosomer. För att kvantifiera antalet märkta autofagiska strukturer användes programvaran FIJI med öppen källkod med hjälp av verktyget "3D Objects Counter".
Måttet på autofagiska nivåer både i fysiologiska förhållanden och i cancerceller gör det möjligt för oss att studera moduleringen av autofagi under olika förhållanden såsom hypoxi, kemoterapibehandling eller knockdown av vissa proteiner.
Introduction
Makroautofagi (vanligen kallad autofagi) är en specialiserad katabol process som selektivt bryter ned cytoplasmatiska komponenter, inklusive proteiner och skadade organeller 1,2. Autofagi tillåter celler att fysiologiskt reagera på stressstimuli och därmed upprätthålla cellulär homeostas3. Under autofagi bildas en dubbelmembranvesikel: autofagosomen. Autofagosomen innehåller lastmolekylerna och driver dem till lysosomen för nedbrytning 1,4.
Autofagosomer dekoreras av det autofagiska proteinmikrotubuliassocierade proteinet light chain 3 (LC3)5. När autofagi inte induceras diffunderas LC3 i cytoplasman och kärnan i LC3-I-konformationen. Å andra sidan, när autofagi induceras, konjugeras LC3 med en fosfatidyletanolamin i membranet i de autofagiska strukturerna6. Denna nya LC3-konformation är känd som LC3-II1. LC3-konformationsskiftet orsakar förändringar i dess cellulära lokalisering och dess dodecylnatriumsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) migration, som kan detekteras med tekniker som immunofluorescens och western blot 5,7. På detta sätt är LC3-konjugering en nyckelhändelse i den autofagiska processen som kan användas för att mäta autofagisk aktivitet.
Acinarcellen i bukspottskörteln är en mycket differentierad cell som under friska förhållanden har en låg autofagi. Men under olika fysiologiska förhållanden eller under farmakologisk stimulering kan de aktivera autofagi. Därför är bestämningen av autofagiska nivåer i denna cellinje användbar för att studera de potentiella direkta eller indirekta effekterna av olika farmakologiska eller biologiska agens på autofagi 8,9.
Duktalt adenokarcinom i bukspottskörteln är en av de dödligaste typerna av cancer, med tanke på dess sena diagnos och dess höga kemoterapiresistens10. Pankreascancerceller har hög autofagiaktivitet på grund av transkriptionell uppreglering och posttranslationell aktivering av autofagirelaterade proteiner11. Pankreascancerceller kan justera sina autofaginivåer som svar på ogynnsamma förhållanden som hypoxi, näringsbrist eller kemoterapiinducerad skada11. Därför kan analys av autofaginivåerna i bukspottskörtelcancerceller hjälpa till att förstå hur de anpassar sig till olika miljöer och utvärdera effektiviteten av autofagimodulerande behandlingar.
Denna studie visar en metod för att utföra LC3-immunofluorescens i två distinkta pankreascellulära modeller. Den första modellen, PANC-1-celler, fungerade som en modell för pankreas duktalt adenokarcinom. Dessa celler behandlades med gemcitabin, ett kemoterapimedel som tidigare har visat sig inducera autofagi, särskilt i bukspottskörtelcancerceller som bär den onkogena Kirsten rat sarkomvirusgenen (KRAS)12,13. Den andra modellen, AR42J-celler, fungerade som en mer fysiologisk modell av exokrina bukspottskörtelceller. Dessa celler differentierades med dexametason för att bli mer lik acinar pankreasceller14. I dessa celler inducerades autofagi farmakologiskt genom användning av PP242, som är en potent mTOR-hämmare15. I denna studie demonstrerar vi tillämpligheten av protokollet som beskrivs med två olika bukspottkörtelmodeller och dess förmåga att skilja mellan tillstånd av låg och hög autofagi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av celler
- Blötlägg 12 mm runda täckglas i absolut etanol och placera dem vertikalt i brunnarna på en 24-brunnsplatta.
- Ta bort locket och utsätt flerbrunnsplattan för ultraviolett strålning i 15 minuter.
- Placera täckglasen horisontellt och tvätta dem med Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM).
- Frö ett lågt passageantal bukspottskörtelceller. Beloppet bör justeras för att erhålla 50% -75% sammanflöde på fixeringsdagen16.
OBS: Det rekommenderas att sådd 2,5 × 10 4 PANC-1 eller 4 × 104 AR42J-celler per brunn för att fixera cellerna efter 3 dagar. - Odla cellerna i DMEM innehållande 10% fetalt bovint serum, 100 E/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin i en inkubator vid 37 °C i en fuktad atmosfär med 5% koldioxid (CO2).
OBS: För PANC-1-celler rekommenderas att inkubera cellerna i 2 dagar mellan cellsådd och följande steg. Efter denna tid kan cellerna transfekteras, behandlas eller fixeras. Detta protokoll exemplifierar behandlingen med gemcitabin i icke-transfekterade PANC-1-celler och differentieringen och PP242-behandlingen för icke-transfekterade AR42J-celler.
2. Behandling av cellerna
- Gemcitabinbehandling för PANC-1-celler
- Bered en lösning av 1 μg/μl gemcitabin i DMEM 2 dagar efter sådd. Behandla varje brunn med 2,6 μl gemcitabinlösning på 1 μg/μl för att uppnå en slutlig utspädning på 20 μM.
- Inkubera cellerna i 24 timmar i inkubatorn.
- AR42J-differentiering och PP242-behandling
- Bered en lösning av 4 μg/ml dexametason i DMEM.
- Behandla varje brunn med 4,9 μl 4 μg/ml dexametasonlösning för att erhålla en slutlig spädning på 100 nM.
- Inkubera cellerna i 48 timmar i inkubatorn.
- Avlägsna mediet och behandla varje brunn med 0,5 μL 1 mM PP242 för att erhålla en slutlig utspädning på 1 μM.
- Inkubera cellerna i 2 timmar i inkubatorn.
3. Fixering och permeabilisering av cellerna
- Bered en platta med 24 brunnar med kall metanol och en platta med 6 brunnar med kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mMNa2HPO4, 2 mM KH2PO4). Håll dem på is.
- Ta varje täckglas med pincett, tvätta det två gånger i PBS och inkubera i 6 minuter i metanol.
4. Blockerar cellerna
- Tvätta varje täckglas två gånger i PBS och inkubera i 1 timme i 10% fetalt bovint serum i PBS (blockeringslösning).
I det här steget kan protokollet vara pausat. Täckglasen kan förvaras över natten i kylskåpet i blockeringslösningen, och protokollet kan fortsättas nästa dag.
5. Inkubera täckglasen med den primära antikroppen
- Förbered en 1:1 000 lösning av anti-LC3 i blockeringslösningen och håll den på is.
- Placera en bit laboratorietätningsfilm över locket med flera brunnar.
- Placera en droppe (25 μl) per täckglas anti-LC3-lösning över förseglingsfilmen.
- Ta varje täckglas med pincett och placera det över det primära antikroppsdroppen, se till att cellsidan är i kontakt med lösningen.
- Förbered en fuktig kammare genom att placera ett fuktigt papper i en plastlåda med platt botten.
- Placera flerbrunnsplattan i fuktighetskammaren, täck den med folie och inkubera över natten i kylen.
6. Inkubera täckglasen med den sekundära antikroppen
- Ta bort flerbrunnsplattan från fuktkammaren och sätt tillbaka täckglasen i flerbrunnsplattan.
- Utför tre tvättar med PBS.
- Förbered en lösning av fluorescerande märkt anti-kanin med en utspädning av 1:800 i blockeringslösningen och behåll den på is skyddad mot ljus.
- Placera en tätningsfilmbit över locket med flera brunnar.
- Placera en droppe (25 μl) per täckglas av antikaninlösning över tätningsfilmen.
- Ta varje täckglas med pincett och placera det över det primära antikroppsdroppen, se till att cellsidan är i kontakt med lösningen.
- Inkubera flerbrunnsplattan i fuktkammaren i 2 timmar vid rumstemperatur (RT) skyddad från ljus.
7. Färgning av cellerna med 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI)
- Ta bort flerbrunnsplattan från fuktkammaren och sätt tillbaka täckglasen i flerbrunnsplattan.
- Utför tre tvättar med PBS.
- Bered en 300 nM lösning av DAPI i PBS (skyddad från ljus).
- Inkubera varje täckglas med DAPI-lösningen i 10 minuter.
- Utför tre tvättar med PBS. Håll flerbrunnsplattan skyddad mot ljus.
8. Montage
- Förbered två bägare med vatten och ett papper.
- Placera en droppe (10 μl) per täckglas av en polyvinylalkohol-Bis (trimetylaluminium)-1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktanadduktlösning (PVA-DABCO) på ett objektglas.
OBS: PVA-DABCO framställs genom att kombinera 0,25 M DABCO, 10 % W/V PVA, 20 % glycerol och 50 % Tris HCl (1,5 M, pH 8,8) i ultrarent vatten. - Ta varje täckglas med pincett, tvätta det i varje vattenbägare, torka av det i papperet och placera det över PVA-DABCO-droppen (med cellerna i kontakt med lösningen).
- Låt det torka över natten, skyddat från ljus.
9. Konfokalmikroskopi visning och bildtagning
- Visualisera täckglasen i ett inverterat konfokalmikroskop med ett mål på cirka 63x17.
- Ta representativa bilder av de märkta cellerna.
10. Kvantifiering av LC3-punkterna
- Dra och släpp varje bildfil som innehåller de fångade kanalerna, till exempel ".czi", till skärmen ImageJ (FIJI) för att öppna. Klicka på Ok i dialogrutan och stäng konsolfönstret .
- På fliken Bild väljer du Färg > Dela kanaler.
- Stäng bilderna som motsvarar andra kanaler än LC3-bilden.
- På fliken Bild väljer du Justera > färgbalans
- Flytta skjutreglaget Maximum åt vänster tills bilden är mättad för att visualisera cellkonturerna.
- Rita cellens kontur med markeringsverktyget på frihand .
- Klicka på knappen Återställ för att återställa färgjusteringen.
- På fliken Redigera väljer du Klipp ut för att klippa ut det markerade objektet.
- Stäng bilden utan att spara den.
- På fliken Redigera väljer du Klistra in.
- I menyn Analysera väljer du verktyget 3D-objekträknare.
- Ställ in tröskeln. I exemplet i denna studie är tröskelvärdet satt till 2 000.
- Ställ in storleksfiltret. I denna studie är den inställd mellan 50 och 500.
- Se till att rutorna Objekt och Sammanfattning är markerade.
- Klicka på Ok. Antalet punkter beskrivs som objekt som upptäckts i sammanfattningen.
Figur 1: Schematiskt diagram över LC3-immunofluorescensprotokollet. Schematiskt diagram som representerar det allmänna protokollet för LC3-immunofluorescens. Figur skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll utför immunofluorescens av LC3 i pankreas cellinjer för att bestämma autofaginivåerna under olika förhållanden. Resultatet av detta experiment var obtentionen av cellulära bilder från de röda och blå kanalerna, motsvarande LC3 och DAPI. LC3-bilderna indikerar den cellulära fördelningen av detta protein, medan DAPI visar kärnlokaliseringen. Figur 2A visar en representativ bild av immunofluorescensen av LC3 och dess sammanslagning med DAPI-färgning i PANC-1-celler under basala eller gemcitabinbehandlingsbetingelser. En uppsättning bilder av LC3-färgning analyserades med hjälp av verktyget 3D Objects Counter i FIJI. Med hjälp av denna programvara kvantifierades mängden LC3-punkter per cell. Stapeldiagrammet i figur 2B visar resultaten av LC3-punktkvantifiering i PANC-1-celler under basala kontra gemcitabinbehandlingsförhållanden. I denna graf ökade LC3-punkterna signifikant under gemcitabinbehandling, med antalet LC3-punkter som direkt indikerar den autofagiska aktiviteten. Vi har också tidigare visat att gemcitabin utlöser autofagi i bukspottskörtelcancerceller12. Sammantaget möjliggör metoden som presenteras i denna artikel detektering av nivån av ökning av autofagiaktivering inducerad av gemcitabin i dessa celler.
Medan detta protokoll fokuserar på att använda LC3-immunofluorescens för att bestämma autofagisk aktivitet i bukspottskörtelcancerceller, kan det potentiellt tillämpas på andra cellinjer, inklusive mer fysiologiskt relevanta modeller. För att testa metodens effektivitet vid bedömning av fysiologiska svar användes AR42J-cellinjen. Även om dessa celler härrör från en exokrin bukspottkörteltumör hos råtta, kan de differentieras till exokrina celler med glukokortikoidstimulering, vilket gör dem till en lämplig bukspottskörtelmodell 8,14,18. AR42J-cellerna differentierades med 100 nM dexametasonbehandling under 48 timmar, följt av behandling med mTOR-hämmaren PP242 för att inducera autofagi15. De erhållna resultaten presenteras i figur 3, som visar en signifikant ökning av antalet LC3-punkter per cell under PP242-behandlingen.
Hittills har vi visat att den presenterade metoden är effektiv för att bedöma autofagisk aktivitet i både cancerceller och en mer fysiologisk modell. Det är dock viktigt att notera att mindre avvikelser från det presenterade protokollet kan leda till otolkbara resultat.
Figur 4A visar en representativ bild från ett suboptimalt experiment där för många celler såddes på täckglasen och överdriven sammanflöde erhölls. Denna typ av experiment kan vara otolkbar av olika skäl. För det första är de cellulära typerna som nämns i detta arbete härledda från den exokrina bukspottkörteln, där cellerna är grupperade i acini. Under en överdriven sammanflöde tenderar dessa celler att stapla upp och växa ovanpå varandra (såsom cell 1 och cell 2 i figur 4A, som ligger ovanför cell 3 och cell 4). Detta fenomen gör det praktiskt taget omöjligt att veta vilken cell LC3-punkterna tillhör, vilket gör det mycket svårt att uppskatta antalet punkter per cell. Å andra sidan tenderar celler med hög sammanflöde att stressas, vilket utlöser autofagi. Som ett resultat kan skillnaderna i autofagiska nivåer mellan kontroll- och behandlade celler minska på grund av en ökning av den autofagiska bakgrundsaktiviteten.
I figur 4B visas en representativ bild från en annan typ av suboptimalt experiment där cellerna fixerades med paraformaldehyd istället för metanol. Även om denna fixeringsmetod i allmänhet är effektiv för att bevara en mängd olika proteiner, är den inte lämplig för LC3, eftersom den resulterande bilden inte korrekt återspeglar dess sanna fördelning. Detta tekniska misstag kan göra det omöjligt att hitta skillnader mellan låga och höga autofagiska nivåer.
I allmänhet kan cellinjer behandlas, transfekteras eller fixeras 1 dag efter sådd. Ändå är det viktigt att nämna att när det gäller PANC-1-celler är det nödvändigt att vänta i 2 dagar efter sådd för att säkerställa fullständig vidhäftning av cellerna till glasöverdragen innan man fortsätter med de efterföljande stegen i experimentet. Figur 4C visar en representativ bild från ett experiment där cellerna behandlades med gemcitabin bara 1 dag efter sådd. Från figuren kan det observeras att cellerna i detta experiment hade en rund form. Denna morfologi minskade förhållandet mellan cytoplasman och kärnan, vilket gjorde det svårt att förstå den intracellulära fördelningen av LC3 och att skilja mellan låga och höga autofagiska nivåer. Det är viktigt att notera att AR42J inte har detta problem, och de är redo att behandlas eller fixas dagen efter sådden.
Ett annat suboptimalt resultat kan erhållas när tiden för metanolfixering varierar. Kortare fixeringstider kan orsaka ofullständig fixering, såsom visas i figur 4D, där cellerna fixerades i 3 minuter. Ofullständig fixering kan störa korrekt LC3-immunmärkning, vilket leder till oklara bilder och suboptimal kvantifiering.
Figur 2: LC3-immunofluorescens i PANC-1-celler under basala eller gemcitabinförhållanden och LC3-punktkvantifiering. PANC-1-cellerna behandlades antingen med 20 μM gemcitabin i 24 timmar eller lämnades obehandlade och immunmärktes sedan med anti-LC3. (A) Representativa bilder av varje villkor visas. Skalstapel: 10 μm. (B) Stapeldiagrammet representerar medelvärden och standardfel för medelvärdet (SEM) för LC3-punkterna per cell för varje tillstånd. N = 10 celler per tillstånd från tre oberoende experiment. p < 0,001 av en elevs t-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: LC3-immunofluorescens i AR42J-celler under basala eller PP242-förhållanden och LC3-punktkvantifiering. AR42J-cellerna differentierades med 100 nM dexametason i 48 timmar och behandlades sedan antingen med 1 μM PP242 i 2 timmar eller lämnades obehandlade, följt av immunmärkning med anti-LC3. (A) Representativa bilder av varje villkor visas. Skalstapel: 10 μm. (B) Stapeldiagrammet representerar medelvärden och standardfel för medelvärdet (SEM) för LC3-punkterna per cell för varje tillstånd. N = 10 celler per tillstånd från tre oberoende experiment. ** p < 0,01 av en elevs t-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Suboptimala experiment. Representativa bilder av LC3-immunofluorescens i suboptimala experiment visas. Skalstapel: 10 μm. (A) Överskott av sammanflöde: 7 × 104 PANC-1-celler såddes, behandlades med gemcitabin och immunmärktes med anti-LC3. Fyra celler är markerade för att visa att cell 1 och cell 2 är ovanför cell 3 och cell 4. (B) PFA-fixering: PANC-1-celler behandlades med gemcitabin, fixerades med PFA och immunmärktes med anti-LC3. (C) Ofullständig sträckning: PANC-1-celler behandlades med gemcitabin dagen efter sådd och immunmärktes med anti-LC3. (D) Ofullständig fixering: PANC-1-celler behandlades med gemcitabin, fixerades med metanol i 3 minuter och immunmärktes med anti-LC3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som beskrivs i detta protokoll gör det möjligt att visualisera den endogena LC3-fördelningen i cellen och kvantifiera de autofagiska nivåerna under olika förhållanden. En annan liknande metod som används för att analysera LC3-fördelningen och bestämma autofagiaktivering involverar fluorescensmärkt LC3-transfektion (såsom RFP-LC3)19. RFP-LC3-transfektion har fördelarna med att inte behöva fixeras (vilket gör det möjligt att tillämpa denna metod i levande cellavbildning20), vara billigare och inte beroende av LC3-antikroppsreaktivitet. Å andra sidan har immunofluorescensen av LC3 fördelen att ge en bild av den endogena LC3, vilket undviker eventuella problem relaterade till LC3-överuttryck, såsom bildandet av proteinaggregat som är oberoende av autofagi21. Dessutom beror denna metod inte på hur lätt det är att transfektera cellerna, vilket betyder att den är tillämplig på olika cellinjer. Beroende på LC3-antikroppen som används och dess reaktivitet finns det dock vissa cellulära linjer där det kanske inte fungerar. Vissa antikroppar kan fungera bra för vissa arter men inte för andra, även när de är teoretiskt kompatibla med olika arter. När det gäller antikroppen som används i detta protokoll (LC3B D11) har vi funnit att den fungerar perfekt för humana celler (PANC-1, HEK293T, HeLa) och råttceller (AR42J). Det fungerar dock inte för musceller (MEF-celler), eftersom vi observerade ospecifik kärnfärgning. Det är värt att notera att kvantifieringen av LC3-fläckar, oavsett om de är endogena eller överuttryckta, har begränsningar när det gäller att skilja mellan förändringar i autofagiaktivering, vilket kan indikera ökad produktion av LC3-II, och förändringar i LC3-II-nedbrytning, vilket kan indikera ett autofagiskt flödestillstånd. Ytterligare metoder kan användas för att omfattande bedöma autofagiaktivitet. Till exempel kan användningen av RFP-GFP-LC3-uttryck ge en korrekt bedömning genom att skilja mellan LC3-II inuti eller utanför lysosomen22,23.
Som visas i figur 4 finns det några kritiska steg i protokollet som inte får ändras, eftersom deras modifiering kan leda till suboptimala resultat. För det första är det viktigt att ställa in rätt antal celler som ska seedas. När inte tillräckligt med celler sås tenderar de inte att motstå transfektion eller behandlingar och förbli rundade. Tvärtom, när celler sås i överskott tenderar de att växa ovanpå de närliggande cellerna, vilket gör det utmanande att fokusera på enskilda celler och skilja mellan deras LC3-prickar. I situationer där celler är i närheten men inte överlappar varandra som visas i figur 4A kan det vara till hjälp att använda immunfärgning med specifika membranmarkörer, såsom EGFR, för att skilja mellan de positiva markörerna som tillhör varje cell24. Det är dock viktigt att notera att vissa markörer som E-cadherin och EpCAM inte är lämpliga för detta ändamål i PANC-1-celler på grund av deras reducerade membranuttryck, vilket är resultatet av den typiska epitelial-mesenkymala övergångsprocessen associerad med denna celltyp25,26,27. För det andra, när man arbetar specifikt med PANC-1-celler, är det viktigt att vänta minst 1 dag mellan sådden och de efterföljande stegen i experimentet. Omvänt, när man inte väntar på rätt tid, kan cellerna avrundas, vilket gör det svårt att tolka resultaten. För det tredje är fixering ett kritiskt steg i detta protokoll. Som vi har visat fungerar metoden endast med en adekvat metanolfixering. Paraformaldehydfixering fungerar inte korrekt för LC3-immunmärkning, medan metanolfixeringstiden inte bör modifieras, eftersom kortare tider kan leda till en ofullständig fixering. Vi testade metanolfixeringstider upp till 1 h och observerade inte skillnader i LC3-märkning. Vi avråder dock från användning av förlängda fixeringstider, eftersom metanolfixering kan leda till förlust av lösliga cellulära proteiner och fria fluorescerande molekyler28. Därför rekommenderas att följa standardfixeringstiden för att säkerställa exakta och pålitliga resultat.
Vissa ändringar kan accepteras i det beskrivna protokollet. Till exempel kan en 12-brunnsplatta användas istället för 24-brunnsplattan, liksom att odla cellerna över 15 mm runda täckglas istället för 12 mm täckglas. I detta fall bör det anses att antalet celler som ska seedas, liksom volymerna av reagens som används, kommer att vara större än de som beskrivs i detta protokoll. I detta fall bör 4 × 10 4 PANC-1 och 6,5 × 104 AR42J seedas. Dessutom kan den använda blockeringslösningen ersättas med andra, som 1% BSA i PBS, och detta skulle leda till liknande resultat. På samma sätt kunde blockeringstiden ökas upp till 24 timmar utan att väsentligt förändra resultaten. Antikroppsinkubationstiderna och koncentrationen kan justeras och kan förändras, till exempel om en annan LC3-antikropp används. Även om PVA-DABCO-lösning bereds i denna studie kan kommersiella montagelösningar också användas. Å andra sidan kan kvantifieringsmetoden modifieras. Det är till exempel möjligt att tillämpa vissa filter eller masker på bilderna, och ett alternativt verktyg kan användas för punktkvantifiering.
I detta arbete riktade vi tillämpningen av immunofluorescensen av LC3 för att studera beteendet hos bukspottskörtelcancerceller. I dessa celler aktiveras autofagi i grunden och kan moduleras som ett svar på olika stressiga situationer, såsom kemoterapi, hypoxi eller näringsbrist11,12. Bestämningen av autofagi i dessa celler kan vara tillämplig för att studera det cellulära svaret på kemoterapi, strålbehandling eller andra behandlingar som modulerar autofagi. Som visas i figur 3 kan den presenterade metoden tillämpas i fysiologiska modeller. Även om vi i detta arbete fokuserade på kvantifiering av autofagiska nivåer, kan immunofluorescensen av LC3 också möjliggöra utvärdering av samlokaliseringen mellan LC3 och olika proteiner. Det kan till exempel fungera som ett mekanistiskt tillvägagångssätt för att markera proteiner vid olika punkter i den autofagiska processen och utvärdera om samlokaliseringen med LC3 påverkas av vissa behandlingar eller av nedreglering av vissa proteiner. På detta sätt kan det till exempel bestämmas om någon autofagihämmare avbryter det autofagiska flödet före eller efter LC3-konjugering. Slutligen kan metoden också anpassas till vävnadsprover för att bestämma autofagiaktivering i djurmodeller eller humana biopsiprover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklarerades.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från University of Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), National Council for Scientific Research and Technology (CONICET) (PIP 2021-2023 GI − 11220200101549CO; och PUE 22920170100033) och National Agency for Scientific and Technological Promotion (PICT 2019-01664).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
References
- Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).
- Kitada, M., Koya, D. Autophagy in metabolic disease and ageing. Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).
- Ktistakis, N. T., Tooze, S. A.
- Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E.
- Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).
- Mizushima, N., Yoshimori, T. How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).
- Vanasco, V., et al. Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).
- Williams, J. A. Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini. Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).
- Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T.
- Li, J., et al. Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer. Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).
- Ropolo, A., et al. A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS. Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).
- Pardo, R., et al. Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells. Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).
- Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells. Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
- Segeritz, C. -P., Vallier, L. Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. , Academic Press. Cambridge, MA. 151-172 (2017).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Grasso, D., et al. a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).
- Ropolo, A., et al. The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).
- Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond. Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. Methods for the detection of autophagy in mammalian cells. Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).
- Yoshii, S. R., Mizushima, N.
- Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers. 13 (18), 4504 (2021).
- Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT. Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).
- Kim, S. K., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model. Cancers. 12 (5), 1305 (2020).
- Meng, Y., et al. Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
