Summary
Het doel van dit protocol is om autofagische niveaus in alvleesklierkanker en pancreasacinaire cellen te bepalen door middel van LC3-immunofluorescentie en LC3-puntkwantificering.
Abstract
Autofagie is een gespecialiseerd katabolisch proces dat selectief cytoplasmatische componenten afbreekt, waaronder eiwitten en beschadigde organellen. Autofagie stelt cellen in staat om fysiologisch te reageren op stressprikkels en zo cellulaire homeostase te behouden. Kankercellen kunnen hun autofagieniveaus moduleren om zich aan te passen aan ongunstige omstandigheden zoals hypoxie, tekort aan voedingsstoffen of schade veroorzaakt door chemotherapie. Ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier is een van de dodelijkste vormen van kanker. Alvleesklierkankercellen hebben een hoge autofagie-activiteit als gevolg van de transcriptionele upregulatie en posttranslationele activering van autofagie-eiwitten.
Hier werd de PANC-1-cellijn gebruikt als een model van menselijke kankercellen van de alvleesklier en de AR42J pancreas-acinaire cellijn werd gebruikt als een fysiologisch model van sterk gedifferentieerde zoogdiercellen. Deze studie gebruikte de immunofluorescentie van microtubule-geassocieerde eiwit lichtketen 3 (LC3) als een indicator van de status van autofagie-activering. LC3 is een autofagie-eiwit dat in basale omstandigheden een diffuus distributiepatroon vertoont in het cytoplasma (bekend als LC3-I in deze aandoening). Autofagie-inductie activeert de conjugatie van LC3 tot fosfatidylethanolamine op het oppervlak van nieuw gevormde autofagosomen om LC3-II te vormen, een membraangebonden eiwit dat helpt bij de vorming en uitbreiding van autofagosomen. Om het aantal gelabelde autofagische structuren te kwantificeren, werd de open-source software FIJI gebruikt met behulp van de "3D Objects Counter" -tool.
De meting van de autofagische niveaus, zowel in fysiologische omstandigheden als in kankercellen, stelt ons in staat om de modulatie van autofagie te bestuderen onder verschillende omstandigheden zoals hypoxie, chemotherapiebehandeling of de knockdown van bepaalde eiwitten.
Introduction
Macroautofagie (gewoonlijk autofagie genoemd) is een gespecialiseerd katabolisch proces dat selectief cytoplasmatische componenten afbreekt, waaronder eiwitten en beschadigde organellen 1,2. Autofagie stelt cellen in staat om fysiologisch te reageren op stressprikkels en zo cellulaire homeostase3 te behouden. Tijdens autofagie wordt een dubbel membraanblaasje gevormd: het autofagosoom. Het autofagosoom bevat de ladingmoleculen en drijft ze naar het lysosoom voor afbraak 1,4.
Autofagosomen worden versierd door het autofagische eiwit microtubule-geassocieerde eiwit lichtketen 3 (LC3)5. Wanneer autofagie niet wordt geïnduceerd, wordt LC3 diffuus in het cytoplasma en de kern in de LC3-I-conformatie. Aan de andere kant, wanneer autofagie wordt geïnduceerd, wordt LC3 geconjugeerd met een fosfatidylethanolamine in het membraan van de autofagische structuren6. Deze nieuwe LC3-conformatie staat bekend als LC3-II1. De LC3-conformatieverschuiving veroorzaakt veranderingen in de cellulaire lokalisatie en de migratie van dodecylnatriumsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE), die kan worden gedetecteerd door technieken zoals immunofluorescentie en western blot 5,7. Op deze manier is LC3-conjugatie een belangrijke gebeurtenis in het autofagische proces die kan worden gebruikt om autofagische activiteit te meten.
De pancreasacinaire cel is een sterk gedifferentieerde cel die, onder gezonde omstandigheden, een lage mate van autofagie heeft. In verschillende fysiologische omstandigheden of onder farmacologische stimulatie kunnen ze echter autofagie activeren. Daarom is de bepaling van autofagische niveaus in deze cellijn nuttig voor het bestuderen van de potentiële directe of indirecte effecten van verschillende farmacologische of biologische agentia op autofagie 8,9.
Ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier is een van de dodelijkste vormen van kanker, gezien de late diagnose en de hoge chemotherapieresistentie10. Alvleesklierkankercellen hebben een hoge autofagie-activiteit als gevolg van de transcriptionele upregulatie en posttranslationele activering van autofagie-gerelateerde eiwitten11. Alvleesklierkankercellen kunnen hun autofagieniveaus aanpassen als reactie op ongunstige omstandigheden zoals hypoxie, tekort aan voedingsstoffen of door chemotherapie veroorzaakte schade11. Daarom kan het analyseren van de autofagieniveaus in alvleesklierkankercellen helpen begrijpen hoe ze zich aanpassen aan verschillende omgevingen en de effectiviteit van autofagiemodulerende behandelingen evalueren.
Deze studie toont een methode om LC3-immunofluorescentie uit te voeren in twee verschillende pancreascellulaire modellen. Het eerste model, PANC-1-cellen, diende als model voor ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier. Deze cellen werden behandeld met gemcitabine, een chemotherapeuticum waarvan eerder is aangetoond dat het autofagie induceert, met name in alvleesklierkankercellen die het oncogene Kirsten rat sarcoma virus-gen (KRAS)12,13 dragen. Het tweede model, AR42J-cellen, diende als een meer fysiologisch model van exocriene pancreascellen. Deze cellen werden gedifferentieerd met dexamethason om meer op acinaire pancreascellen te gaan lijken14. In deze cellen werd autofagie farmacologisch geïnduceerd door het gebruik van PP242, een krachtige mTOR-remmer15. In deze studie tonen we de toepasbaarheid aan van het protocol beschreven met twee verschillende pancreasmodellen en het vermogen om onderscheid te maken tussen toestanden van lage en hoge autofagie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celvoorbereiding
- Week 12 mm ronde coverslips in absolute ethanol en plaats ze verticaal in de putjes van een plaat met 24 putten.
- Verwijder het deksel en stel de multi-well plaat gedurende 15 minuten bloot aan ultraviolette straling.
- Plaats de coverslips horizontaal en was ze met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
- Zaai een laag doorgangsaantal pancreascellen. Het bedrag moet worden aangepast om 50% -75% confluentie te verkrijgen op de dag van fixatie16.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 2,5 × 10 4 PANC-1 of 4 × 104 AR42J-cellen per put te zaaien om de cellen na 3 dagen te fixeren. - Kweek de cellen in DMEM met 10% foetaal runderserum, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine in een couveuse bij 37 °C onder een bevochtigde atmosfeer met 5% koolstofdioxide (CO2).
OPMERKING: Voor PANC-1-cellen wordt aanbevolen om de cellen gedurende 2 dagen tussen het zaaien van de cel en de volgende stappen te incuberen. Na deze tijd kunnen de cellen worden getransfecteerd, behandeld of gefixeerd. Dit protocol illustreert de behandeling met gemcitabine in niet-getransfecteerde PANC-1-cellen en de differentiatie- en PP242-behandeling voor niet-getransfecteerde AR42J-cellen.
2. Behandeling van de cellen
- Gemcitabine behandeling voor PANC-1 cellen
- Bereid een oplossing van 1 μg/μL gemcitabine in DMEM 2 dagen na het zaaien. Behandel elk putje met 2,6 μL van de 1 μg/μL gemcitabine oplossing om een uiteindelijke verdunning van 20 μM te verkrijgen.
- Incubeer de cellen gedurende 24 uur in de incubator.
- AR42J-differentiatie en PP242-behandeling
- Bereid een oplossing van 4 μg/ml dexamethason in DMEM.
- Behandel elk putje met 4,9 μL 4 μg/ml dexamethasonoplossing om een uiteindelijke verdunning van 100 nM te verkrijgen.
- Incubeer de cellen gedurende 48 uur in de incubator.
- Verwijder het medium en behandel elk putje met 0,5 μL van 1 mM PP242 om een uiteindelijke verdunning van 1 μM te verkrijgen.
- Incubeer de cellen gedurende 2 uur in de incubator.
3. Fixeren en permeabiliseren van de cellen
- Bereid een 24-well plaat met koude methanol en een 6-well plaat met koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4, 2mM KH2PO4). Houd ze op ijs.
- Neem elke coverslip met een pincet, was deze twee keer in PBS en incubeer gedurende 6 minuten in methanol.
4. De cellen blokkeren
- Was elke coverslip tweemaal in PBS en incubeer gedurende 1 uur in 10% foetaal runderserum in PBS (blokkeringsoplossing).
OPMERKING: In deze stap wordt het protocol mogelijk gepauzeerd. De coverslips kunnen 's nachts in de koelkast in de blokkeeroplossing worden bewaard en het protocol kan de volgende dag worden voortgezet.
5. De coverslips incuberen met het primaire antilichaam
- Bereid een 1:1.000 oplossing van anti-LC3 in de blokkerende oplossing en houd deze op ijs.
- Plaats een stuk laboratoriumafdichtingsfolie over het deksel met meerdere putten.
- Plaats één druppel (25 μL) per afdekplaat anti-LC3-oplossing over de afdichtingsfilm.
- Neem elke coverslip met een pincet en plaats deze over de primaire antilichaamdruppel, zorg ervoor dat de celzijde in contact is met de oplossing.
- Bereid een vochtige kamer voor door een vochtig stuk papier in een plastic doos met platte bodem te plaatsen.
- Plaats de multi-well plaat in de vochtigheidskamer, bedek deze met folie en incubeer een nacht in de koelkast.
6. De coverslips incuberen met het secundaire antilichaam
- Verwijder de multi-well plaat uit de vochtigheidskamer en plaats de coverslips terug in de multi-well plaat.
- Voer drie wasbeurten uit met PBS.
- Bereid een oplossing van fluorescerend gelabeld anti-konijn met een verdunning van 1:800 in de blokkerende oplossing en houd deze op ijs beschermd tegen licht.
- Plaats een afdichtfoliestuk over het meerpotige deksel.
- Plaats een druppel (25 μL) per dekslip van anti-konijnenoplossing over de afdichtingsfolie.
- Neem elke coverslip met een pincet en plaats deze over de primaire antilichaamdruppel, zorg ervoor dat de celzijde in contact is met de oplossing.
- Incubeer de multi-well plaat in de vochtigheidskamer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT) beschermd tegen licht.
7. Kleuring van de cellen met 4′, 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI)
- Verwijder de multi-well plaat uit de vochtigheidskamer en plaats de coverslips terug in de multi-well plaat.
- Voer drie wasbeurten uit met PBS.
- Bereid een 300 nM-oplossing van DAPI in PBS (beschermd tegen licht).
- Incubeer elke coverslip met de DAPI-oplossing gedurende 10 minuten.
- Voer drie wasbeurten uit met PBS. Behoud de multi-well plaat beschermd tegen licht.
8. Montage
- Maak twee bekers klaar met water en een stuk papier.
- Plaats één druppel (10 μL) per coverslip van een polyvinylalcohol-Bis(trimethylaluminum)-1,4-diazabicyclo[2.2.2]octaanadductoplossing (PVA-DABCO) op een dia.
OPMERKING: PVA-DABCO wordt bereid door 0,25 M DABCO, 10% W/V PVA, 20% glycerol en 50% Tris HCl (1,5 M, pH 8,8) te combineren in ultrapuur water. - Neem elke dekslip met een pincet, was het in elk waterbekerglas, droog het af in het papier en plaats het over de PVA-DABCO-druppel (met de cellen in contact met de oplossing).
- Laat het een nacht drogen, beschermd tegen licht.
9. Confocale microscopie bekijken en beelden vastleggen
- Visualiseer de coverslips in een omgekeerde confocale microscoop met een objectief van ongeveer 63x17.
- Leg representatieve afbeeldingen van de gelabelde cellen vast.
10. Kwantificeren van de LC3-stippen
- Sleep elk afbeeldingsbestand met de vastgelegde kanalen, zoals ".czi", naar het ImageJ (FIJI) -scherm om te openen. Klik op OK in het dialoogvenster en sluit het consolevenster.
- Selecteer op het tabblad Afbeelding de optie Kleur > Gesplitste kanalen.
- Sluit de afbeeldingen die overeenkomen met de andere kanalen dan de LC3-afbeelding.
- Selecteer op het tabblad Afbeelding de optie > kleurbalans aanpassen
- Verplaats de schuifregelaar Maximum naar links totdat de afbeelding verzadigd is om de celcontouren te visualiseren.
- Teken de celomtrek met het gereedschap Selectie uit de vrije hand .
- Klik op de knop Reset om de kleuraanpassing opnieuw in te stellen.
- Selecteer op het tabblad Bewerken de optie Knippen om het geselecteerde item te knippen.
- Sluit de afbeelding zonder deze op te slaan.
- Selecteer op het tabblad Bewerken de optie Plakken.
- Kies in het menu Analyseren het gereedschap 3D-objectenteller.
- Stel de drempel in. In het voorbeeld van deze studie is de drempel vastgesteld op 2.000.
- Stel het groottefilter in. In deze studie ligt het tussen de 50 en 500.
- Zorg ervoor dat de vakken Objecten en Samenvatting zijn gemarkeerd.
- Klik op Ok. Het aantal punten wordt beschreven als objecten gedetecteerd in de samenvatting.
Figuur 1: Schematisch diagram van het LC3 immunofluorescentieprotocol. Schematisch diagram dat het algemene protocol voor LC3-immunofluorescentie weergeeft. Figuur gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol voert immunofluorescentie van LC3 uit in pancreascellijnen om de autofagieniveaus in verschillende omstandigheden te bepalen. Het resultaat van dit experiment was de obtentie van cellulaire beelden van de rode en blauwe kanalen, overeenkomend met LC3 en DAPI. De LC3-beelden geven de cellulaire verdeling van dit eiwit aan, terwijl de DAPI de nucleaire lokalisatie toont. Figuur 2A toont een representatief beeld van de immunofluorescentie van LC3 en de samensmelting met DAPI-kleuring in PANC-1-cellen onder basale of gemcitabinebehandelingsomstandigheden. Een reeks afbeeldingen van LC3-kleuring werd geanalyseerd met behulp van de tool 3D Objects Counter in FIJI. Met behulp van deze software werd het aantal LC3-stippen per cel gekwantificeerd. Het staafdiagram in figuur 2B toont de resultaten van LC3-puntkwantificering in PANC-1-cellen onder basale versus gemcitabinebehandelingsomstandigheden. In deze grafiek namen de LC3-stippen aanzienlijk toe onder gemcitabinebehandeling, waarbij het aantal LC3-stippen direct de autofagische activiteit aangeeft. We hebben ook eerder aangetoond dat gemcitabine autofagie veroorzaakt in alvleesklierkankercellen12. Over het algemeen maakt de in dit artikel gepresenteerde methode de detectie mogelijk van het niveau van toename van autofagie-activering geïnduceerd door gemcitabine in deze cellen.
Hoewel dit protocol zich richt op het gebruik van LC3-immunofluorescentie om autofagische activiteit in pancreaskankercellen te bepalen, kan het mogelijk worden toegepast op andere cellijnen, waaronder meer fysiologisch relevante modellen. Om de werkzaamheid van de methode bij het beoordelen van fysiologische reacties te testen, werd de AR42J-cellijn gebruikt. Hoewel deze cellen zijn afgeleid van een exocriene pancreastumor bij ratten, kunnen ze worden gedifferentieerd in exocriene cellen met glucocorticoïde stimulatie, waardoor ze een geschikt pancreasmodelzijn 8,14,18. De AR42J-cellen werden gedifferentieerd met 100 nM dexamethasonbehandeling gedurende 48 uur, gevolgd door behandeling met de mTOR-remmer PP242 om autofagie15 te induceren. De verkregen resultaten zijn weergegeven in figuur 3, die een significante toename van het aantal LC3-stippen per cel onder de PP242-behandeling laat zien.
Tot nu toe hebben we aangetoond dat de gepresenteerde methode effectief is voor het beoordelen van autofagische activiteit in zowel kankercellen als een meer fysiologisch model. Het is echter belangrijk op te merken dat kleine afwijkingen van het gepresenteerde protocol kunnen leiden tot niet-interpreteerbare resultaten.
Figuur 4A toont een representatief beeld van een suboptimaal experiment waarbij te veel cellen op de coverslips werden gezaaid en overmatige samenvloeiing werd verkregen. Dit soort experimenten kan om verschillende redenen niet te interpreteren zijn. Ten eerste zijn de cellulaire typen die in dit werk worden genoemd, afgeleid van de exocriene alvleesklier, waar de cellen zijn gegroepeerd in acini. Bij een overmatige samenvloeiing hebben deze cellen de neiging zich op te stapelen en op elkaar te groeien (zoals cel 1 en cel 2 in figuur 4A, die zich boven cel 3 en cel 4 bevinden). Dit fenomeen maakt het praktisch onmogelijk om te weten tot welke cel de LC3-stippen behoren, waardoor het erg moeilijk is om het aantal stippen per cel te schatten. Aan de andere kant hebben cellen met een hoge confluentie de neiging om gestrest te zijn, wat autofagie veroorzaakt. Als gevolg hiervan kunnen de verschillen in autofagische niveaus tussen de controle- en behandelde cellen afnemen als gevolg van een toename van de autofagische activiteit op de achtergrond.
In figuur 4B wordt een representatief beeld getoond van een ander soort suboptimaal experiment waarin de cellen werden gefixeerd met paraformaldehyde in plaats van methanol. Hoewel deze fixatiemethode over het algemeen effectief is voor het behoud van een verscheidenheid aan eiwitten, is deze niet geschikt voor LC3, omdat het resulterende beeld de ware verdeling niet nauwkeurig weergeeft. Deze technische fout kan het onmogelijk maken om verschillen te vinden tussen lage en hoge autofagische niveaus.
Over het algemeen kunnen cellijnen 1 dag na het zaaien worden behandeld, getransfecteerd of gefixeerd. Niettemin is het cruciaal om te vermelden dat, in het geval van PANC-1-cellen, het noodzakelijk is om 2 dagen na het zaaien te wachten om ervoor te zorgen dat de cellen volledig aan de glazen dekplaten hechten voordat u doorgaat met de volgende stappen van het experiment. Figuur 4C toont een representatief beeld van een experiment waarbij de cellen slechts 1 dag na het zaaien werden behandeld met gemcitabine. Uit de figuur kan worden opgemaakt dat de cellen in dit experiment een ronde vorm hadden. Deze morfologie verminderde de relatie tussen het cytoplasma en de kern, waardoor het moeilijk werd om de intracellulaire verdeling van LC3 te begrijpen en onderscheid te maken tussen lage en hoge autofagische niveaus. Het is belangrijk op te merken dat AR42J dit probleem niet heeft en dat ze klaar zijn om te worden behandeld of gefixeerd op de dag na het zaaien.
Een ander suboptimaal resultaat kan worden verkregen wanneer de tijd van methanolfixatie wordt gevarieerd. Kortere fixatietijden kunnen onvolledige fixatie veroorzaken, zoals weergegeven in figuur 4D, waarbij de cellen gedurende 3 minuten werden gefixeerd. Onvolledige fixatie kan interfereren met de juiste LC3-immunolabeling, wat leidt tot onduidelijke beelden en suboptimale kwantificering.
Figuur 2: LC3 immunofluorescentie in PANC-1 cellen onder basale of gemcitabine condities en LC3 dot kwantificering. De PANC-1-cellen werden ofwel behandeld met 20 μM gemcitabine gedurende 24 uur of onbehandeld gelaten en vervolgens immunogelabeld met anti-LC3. (A) Representatieve beelden van elke aandoening worden getoond. Schaalbalk: 10 μm. (B) Het staafdiagram geeft de gemiddelden en standaardfouten weer van de gemiddelden (SEM) van de LC3-stippen per cel voor elke aandoening. N = 10 cellen per aandoening uit drie onafhankelijke experimenten. p < 0,001 door een Student t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: LC3-immunofluorescentie in AR42J-cellen onder basale of PP242-omstandigheden en LC3-puntkwantificering. De AR42J-cellen werden gedifferentieerd met 100 nM dexamethason gedurende 48 uur en vervolgens behandeld met 1 μM PP242 gedurende 2 uur of onbehandeld, gevolgd door immunolabeling met anti-LC3. (A) Representatieve beelden van elke aandoening worden getoond. Schaalbalk: 10 μm. (B) Het staafdiagram geeft de gemiddelden en standaardfouten weer van de gemiddelden (SEM) van de LC3-stippen per cel voor elke aandoening. N = 10 cellen per aandoening uit drie onafhankelijke experimenten. ** p < 0,01 door een Student t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Suboptimale experimenten. Representatieve beelden van LC3-immunofluorescentie in suboptimale experimenten worden getoond. Schaalbalk: 10 μm. (A) Overmatige samenvloeiing: 7 × 104 PANC-1-cellen werden gezaaid, behandeld met gemcitabine en immunogelabeld met anti-LC3. Vier cellen zijn gemarkeerd om aan te geven dat cel 1 en cel 2 zich boven cel 3 en cel 4 bevinden. (B) PFA-fixatie: PANC-1-cellen werden behandeld met gemcitabine, gefixeerd met PFA en immunogelabeld met anti-LC3. (C) Onvolledige rek: PANC-1-cellen werden de dag na het zaaien behandeld met gemcitabine en immunogelabeld met anti-LC3. (D) Onvolledige fixatie: PANC-1-cellen werden behandeld met gemcitabine, gefixeerd met methanol gedurende 3 minuten en immunogelabeld met anti-LC3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methode die in dit protocol wordt beschreven, maakt het mogelijk om de endogene LC3-verdeling in de cel te visualiseren en de autofagische niveaus onder verschillende omstandigheden te kwantificeren. Een andere vergelijkbare methode die wordt gebruikt om de LC3-verdeling te analyseren en autofagie-activering te bepalen, omvat fluorescentie-gelabelde LC3-transfectie (zoals RFP-LC3)19. RFP-LC3-transfectie heeft de voordelen dat er geen fixatie nodig is (waardoor deze methode kan worden toegepast in live cell imaging20), goedkoper is en niet afhankelijk is van LC3-antilichaamreactiviteit. Aan de andere kant heeft de immunofluorescentie van LC3 het voordeel dat het een beeld geeft van het endogene LC3, waardoor mogelijke problemen met betrekking tot LC3-overexpressie worden vermeden, zoals de vorming van eiwitaggregaten die onafhankelijk zijn van autofagie21. Bovendien is deze methode niet afhankelijk van het gemak van het transfecteren van de cellen, wat betekent dat het van toepassing is op verschillende cellijnen. Afhankelijk van het LC3-antilichaam dat wordt gebruikt en de reactiviteit ervan, zijn er echter enkele cellulaire lijnen waarin het mogelijk niet werkt. Sommige antilichamen kunnen goed werken voor bepaalde soorten, maar niet voor andere, zelfs als ze theoretisch compatibel zijn met verschillende soorten. In het geval van het antilichaam dat in dit protocol wordt gebruikt (LC3B D11), hebben we ontdekt dat het perfect werkt voor menselijke cellen (PANC-1, HEK293T, HeLa) en rattencellen (AR42J). Het werkt echter niet voor muizencellen (MEF-cellen), omdat we niet-specifieke nucleaire kleuring hebben waargenomen. Het is vermeldenswaard dat de kwantificering van LC3-vlekken, endogene of overexpressie, beperkingen heeft bij het onderscheiden van veranderingen in autofagie-activering, wat kan wijzen op de verhoogde productie van LC3-II, en veranderingen in LC3-II-afbraak, wat kan wijzen op een autofagische fluxtoestand. Aanvullende methoden kunnen worden gebruikt om de autofagie-activiteit uitgebreid te beoordelen. Het gebruik van RFP-GFP-LC3-expressie kan bijvoorbeeld een nauwkeurige beoordeling bieden door onderscheid te maken tussen LC3-II binnen of buiten het lysosoom22,23.
Zoals te zien is in figuur 4, zijn er enkele kritieke stappen in het protocol die niet mogen worden gewijzigd, aangezien hun wijziging tot suboptimale resultaten kan leiden. Ten eerste is het belangrijk om het juiste aantal cellen in te stellen dat moet worden gezaaid. Wanneer er niet genoeg cellen worden gezaaid, hebben ze de neiging om transfectie of behandelingen niet te weerstaan en afgerond te blijven. Integendeel, wanneer cellen in overmaat worden gezaaid, hebben ze de neiging om bovenop de naburige cellen te groeien, waardoor het een uitdaging is om zich te concentreren op individuele cellen en onderscheid te maken tussen hun LC3-stippen. Met name in situaties waarin cellen dicht bij elkaar staan maar elkaar niet overlappen zoals afgebeeld in figuur 4A, kan het nuttig zijn om immunostaining te gebruiken met specifieke membraanmarkers, zoals EGFR, om onderscheid te maken tussen de positieve markers die bij elke celhoren 24. Het is echter belangrijk op te merken dat bepaalde markers zoals E-cadherine en EpCAM niet geschikt zijn voor dit doel in PANC-1-cellen vanwege hun verminderde membraanexpressie, die het gevolg is van het typische epitheliale-mesenchymale overgangsproces geassocieerd met dit celtype25,26,27. Ten tweede, wanneer specifiek met PANC-1-cellen wordt gewerkt, is het essentieel om ten minste 1 dag te wachten tussen het zaaien en de volgende stappen van het experiment. Omgekeerd, wanneer men niet wacht op het juiste moment, kunnen de cellen worden afgerond, waardoor het moeilijk is om de resultaten te interpreteren. Ten derde is fixatie een cruciale stap in dit protocol. Zoals we hebben aangetoond, werkt de methode alleen met een adequate methanolfixatie. Paraformaldehydefixatie werkt niet correct voor LC3-immunolabeling, terwijl de methanolfixatietijd niet mag worden gewijzigd, aangezien kortere tijden kunnen leiden tot een onvolledige fixatie. We testten methanolfixatietijden tot 1 uur en zagen geen verschillen in LC3-etikettering. Toch raden we het gebruik van verlengde fixatietijden af, omdat methanolfixatie kan leiden tot het verlies van oplosbare cellulaire eiwitten en vrije fluorescerende moleculen28. Daarom wordt aanbevolen om zich te houden aan de standaard fixatietijd om nauwkeurige en betrouwbare resultaten te garanderen.
Sommige wijzigingen kunnen worden geaccepteerd in het beschreven protocol. Er kan bijvoorbeeld een 12-putplaat worden gebruikt in plaats van de 24-putplaat, evenals de cellen over 15 mm ronde coverslips in plaats van 12 mm coverslips. In dit geval moet ervan worden uitgegaan dat het aantal te zaaien cellen en de gebruikte hoeveelheden reagentia groter zullen zijn dan die welke in dit protocol worden beschreven. In dit geval moeten 4 × 10 4 PANC-1 en 6,5 × 104 AR42J worden gezaaid. Bovendien kan de gebruikte blokkeringsoplossing worden vervangen door andere, zoals 1% BSA in PBS, en dit zou tot vergelijkbare resultaten leiden. Op dezelfde manier kon de blokkeringstijd tot 24 uur worden verlengd zonder de resultaten aanzienlijk te veranderen. De incubatietijden en -concentratie van antilichamen kunnen worden aangepast en kunnen bijvoorbeeld veranderen als een ander LC3-antilichaam wordt gebruikt. Hoewel de PVA-DABCO-oplossing in deze studie wordt voorbereid, kunnen ook commerciële montageoplossingen worden gebruikt. Aan de andere kant kan de kwantificeringsmethode worden gewijzigd. Het is bijvoorbeeld mogelijk om enkele filters of maskers op de afbeeldingen toe te passen en een alternatief hulpmiddel kan worden gebruikt voor het kwantificeren van punten.
In dit werk hebben we de toepassing van de immunofluorescentie van LC3 gericht om het gedrag van alvleesklierkankercellen te bestuderen. In deze cellen wordt autofagie basaal geactiveerd en kan worden gemoduleerd als reactie op verschillende stressvolle situaties, zoals chemotherapie, hypoxie of tekort aan voedingsstoffen11,12. De bepaling van autofagie in deze cellen kan van toepassing zijn op het bestuderen van de cellulaire respons op chemotherapie, radiotherapie of andere behandelingen die autofagie moduleren. Zoals te zien is in figuur 3, kan de gepresenteerde methode worden toegepast in fysiologische modellen. Hoewel we ons in dit werk hebben gericht op de kwantificering van autofagische niveaus, kan de immunofluorescentie van LC3 ook de evaluatie van de colocalisatie tussen LC3 en diverse eiwitten mogelijk maken. Het kan bijvoorbeeld dienen als een mechanistische benadering om eiwitten op verschillende punten in het autofagische proces te markeren en te evalueren of de colocalisatie met LC3 wordt beïnvloed door sommige behandelingen of door de downregulatie van sommige eiwitten. Op deze manier kan bijvoorbeeld worden bepaald of een autofagieremmer de autofagische flux voor of na LC3-conjugatie onderbreekt. Ten slotte kan de methode ook worden aangepast aan weefselmonsters om autofagie-activering in diermodellen of menselijke biopsiemonsters te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er werden geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Universiteit van Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), de Nationale Raad voor Wetenschappelijk Onderzoek en Technologie (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; en PUE 22920170100033) en het Nationaal Agentschap voor Wetenschappelijke en Technologische Promotie (PICT 2019-01664).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
References
- Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).
- Kitada, M., Koya, D. Autophagy in metabolic disease and ageing. Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).
- Ktistakis, N. T., Tooze, S. A.
- Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E.
- Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).
- Mizushima, N., Yoshimori, T. How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).
- Vanasco, V., et al. Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).
- Williams, J. A. Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini. Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).
- Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T.
- Li, J., et al. Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer. Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).
- Ropolo, A., et al. A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS. Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).
- Pardo, R., et al. Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells. Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).
- Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells. Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
- Segeritz, C. -P., Vallier, L. Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. , Academic Press. Cambridge, MA. 151-172 (2017).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Grasso, D., et al. a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).
- Ropolo, A., et al. The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).
- Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond. Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. Methods for the detection of autophagy in mammalian cells. Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).
- Yoshii, S. R., Mizushima, N.
- Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers. 13 (18), 4504 (2021).
- Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT. Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).
- Kim, S. K., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model. Cancers. 12 (5), 1305 (2020).
- Meng, Y., et al. Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
