Summary
نقدم بروتوكولا لفحص الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية (ATAC-seq) على وجه التحديد على الخلايا الشحمية باستخدام فرز النواة مع الأنسجة الدهنية المعزولة من الفئران المراسلة المعدلة وراثيا مع وضع العلامات الفلورية النووية.
Abstract
يعد فحص الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع التسلسل عالي الإنتاجية (ATAC-seq) تقنية قوية تتيح تنميط إمكانية الوصول إلى الكروماتين على مستوى الجينوم. كانت هذه التقنية مفيدة لفهم الآليات التنظيمية للتعبير الجيني في مجموعة من العمليات البيولوجية. على الرغم من تعديل ATAC-seq لأنواع مختلفة من العينات ، لم تكن هناك تعديلات فعالة لطرق ATAC-seq للأنسجة الدهنية. تشمل التحديات التي تواجه الأنسجة الدهنية عدم التجانس الخلوي المعقد ، ومحتوى الدهون الكبير ، والتلوث العالي للميتوكوندريا. للتغلب على هذه المشاكل ، قمنا بتطوير بروتوكول يسمح ب ATAC-seq الخاص بالخلايا الشحمية من خلال استخدام فرز النواة المنشطة بالفلورة مع الأنسجة الدهنية من المراسل المعدل وراثيا وضع العلامات النووية وترجمة فأر تنقية تقارب الريبوسوم (NuTRAP). ينتج هذا البروتوكول بيانات عالية الجودة مع الحد الأدنى من قراءات التسلسل المهدرة مع تقليل كمية مدخلات النواة والكواشف. تقدم هذه الورقة إرشادات مفصلة خطوة بخطوة لطريقة ATAC-seq التي تم التحقق من صحتها لاستخدام نوى الخلايا الشحمية المعزولة من الأنسجة الدهنية للفئران. سيساعد هذا البروتوكول في التحقيق في ديناميكيات الكروماتين في الخلايا الشحمية عند المحفزات البيولوجية المتنوعة ، مما سيسمح برؤى بيولوجية جديدة.
Introduction
الأنسجة الدهنية ، المتخصصة في تخزين الطاقة الزائدة في شكل جزيئات دهنية ، هي عضو رئيسي لتنظيم التمثيل الغذائي. يعد التحكم الصارم في تكوين الخلايا الشحمية وصيانتها أمرا حيويا لوظيفة الأنسجة الدهنية وتوازن طاقة الجسم بالكامل1. تلعب العديد من منظمات النسخ دورا مهما في التحكم في تمايز الخلايا الشحمية واللدونة والوظيفة. بعض هذه المنظمات متورطة في اضطرابات التمثيل الغذائي لدى البشر 2,3. سهلت التطورات الحديثة في تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية للتعبير الجيني والتحليل فوق الجيني اكتشاف المنظمين الجزيئيين لبيولوجيا الخلايا الشحمية4. من الصعب إجراء دراسات التنميط الجزيئي باستخدام الأنسجة الدهنية بسبب عدم تجانس هذه الأنسجة. تتكون الأنسجة الدهنية بشكل أساسي من الخلايا الشحمية ، المسؤولة عن تخزين الدهون ، ولكنها تحتوي أيضا على أنواع مختلفة من الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا الليفية والخلايا البطانية والخلايا المناعية5. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تغيير التركيب الخلوي للأنسجة الدهنية بشكل كبير استجابة للتغيرات الفيزيولوجية المرضية مثل درجة الحرارة والحالة التغذوية6. للتغلب على هذه المشاكل ، قمنا سابقا بتطوير فأر مراسل معدل وراثيا ، يسمى الوسم النووي وترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (NuTRAP) ، والذي ينتج الريبوسومات الموسومة ب GFP ونوى البيوتينيل الموسومة ب mCherry بطريقة تعتمد على Crerecombinase 7. يمكن نظام وضع العلامات المزدوجة المرء من إجراء تحليل نسخي وفوق جيني خاص بنوع الخلية مع الأنسجة. باستخدام فئران NuTRAP المتقاطعة مع خطوط adiponectin-Cre الخاصة بالخلايا الشحمية (Adipoq-NuTRAP) ، قمنا سابقا بتمييز ملفات تعريف التعبير الجيني وحالات الكروماتين من مجموعات الخلايا الدهنية النقية في الجسم الحي وحددنا كيفية تغييرها أثناء السمنة 7,8. في السابق ، عبرت الفئران NuTRAP مع خطوط Ucp1-Cre الخاصة بالخلايا الشحمية البنية والبيج (Ucp1-NuTRAP) سمحت لنا بتوصيف إعادة تشكيل epigenomic لسكان الخلايا الدهنية الحرارية النادرة ، الخلايا الشحمية البيج ، استجابة للتغيرات في درجات الحرارة9.
ATAC-seq هي طريقة تحليلية مستخدمة على نطاق واسع لتقييم إمكانية الوصول إلى الكروماتين على مستوى الجينوم. يسمح ترانسبوزاز Tn5 شديد التفاعل المستخدم في ATAC-seq بتحديد مناطق الكروماتين المفتوحة عن طريق وضع علامات على محولات التسلسل في المنطقة التي يمكن الوصول إليها من الكروماتين في النوى10. ATAC-seq هي طريقة بسيطة ، لكنها توفر نتائج قوية وكفاءة عالية حتى مع عينات منخفضة المدخلات. وبالتالي ، فقد أصبحت واحدة من أكثر طرق التنميط فوق الجيني شيوعا وساهمت في فهم الآليات التنظيمية للتعبير الجيني في سياقات بيولوجية متنوعة. منذ إنشاء بروتوكول ATAC-seq الأصلي ، تم تطوير العديد من التقنيات المشتقة من ATAC لتعديل وتحسين البروتوكول لأنواع مختلفة من العينات. على سبيل المثال ، تم تصميم Fast-ATAC لتحليل عينات خلايا الدم11 ، و Omni-ATAC هو بروتوكول محسن لعينات الأنسجة المجمدة12 ، و MiniATAC-seq فعال لتحليل الأجنة في المراحل المبكرة13. ومع ذلك ، فإن تطبيق طريقة ATAC-seq على الخلايا الشحمية ، وخاصة من عينات الأنسجة ، لا يزال يمثل تحديا. بالإضافة إلى عدم تجانس الأنسجة الدهنية ، قد يتداخل محتواها العالي من الدهون مع تفاعلات إعادة التركيب الفعالة بواسطة ترانسبوزاز Tn5 حتى بعد عزل النواة. علاوة على ذلك ، فإن المحتوى العالي من الميتوكوندريا في الخلايا الشحمية ، خاصة في الخلايا الشحمية البنية والبيج ، يسبب تلوثا عاليا للحمض النووي للميتوكوندريا وقراءات تسلسل مهدرة. تصف هذه الورقة بروتوكولا ل ATAC-seq الخاص بالخلايا الشحمية باستخدام فئران Adipoq-NuTRAP (الشكل 1). من خلال الاستفادة من فرز النواة المسمى بالفلورة ، يسمح هذا البروتوكول بجمع مجموعات نقية من نوى الخلايا الشحمية بعيدا عن أنواع الخلايا المربكة الأخرى والإزالة الفعالة للدهون والميتوكوندريا وحطام الأنسجة. وبالتالي ، يمكن لهذا البروتوكول إنشاء بيانات عالية الجودة خاصة بنوع الخلية وتقليل النفايات من قراءات الميتوكوندريا أثناء استخدام كمية أقل من المدخلات والكواشف مقارنة بالبروتوكول القياسي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء رعاية الحيوان والتجريب وفقا للإجراءات المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في كلية الطب بجامعة إنديانا.
1. الاستعدادات قبل بدء التجربة
- تحضير الأنسجة
- لوضع العلامات على نواة الخلايا الشحمية ، قم بعبور الفئران NuTRAP مع خطوط adiponectin-Cre الخاصة بالخلايا الشحمية (Adipoq-Cre) لتوليد فئران Adipoq-NuTRAP ، والتي تكون نصف متماثلة لكل من Adipoq-Cre و NuTRAP.
- تشريح الأنسجة الدهنية ذات الأهمية من الفئران Adipoq-NuTRAP كما هو موضح سابقا14.
- قم بتجميد الأنسجة في النيتروجين السائل ، وقم بتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
ملاحظة: يمكن تخزين كل وسادة دهنية ككل ، ويمكن قطع الأنسجة المجمدة لاحقا على الثلج الجاف إلى قطع أصغر (~ 50 مجم) لإجراء التجارب. بدلا من ذلك ، يمكن قطع الأنسجة الدهنية وتجميدها وتجميدها في أنابيب للتخزين (~ 50 مجم لكل أنبوب). لا يسمح أبدا للعينات المجمدة بالذوبان بعد التجميد حتى الاستخدام.
- إعداد العازلة
ملاحظة: احتفظ بالمخازن المؤقتة على الجليد طوال التجربة.- تحضير المخزن المؤقت لإعداد النواة (NPB): 250 mM السكروز ، 10 mM HEPES (درجة الحموضة 7.5) ، 10 mM KCl ، 1.5 mM MgCl2 ، و 0.1٪ NP40. تحضير 7 مل من NPB لكل عينة. أضف كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني 100x (النهائي 1x) ، DTT (النهائي 1 mM) ، و Hoechst (النهائي 1 ميكروغرام / مل) إلى NPB قبل الاستخدام.
ملاحظة: يوصى بإعداد NPB طازج ، ولكن يمكن تخزينه في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر. - تحضير 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات مع 0.1٪ NP-40 (PBS-N).
- تحضير المخزن المؤقت لإعداد النواة (NPB): 250 mM السكروز ، 10 mM HEPES (درجة الحموضة 7.5) ، 10 mM KCl ، 1.5 mM MgCl2 ، و 0.1٪ NP40. تحضير 7 مل من NPB لكل عينة. أضف كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني 100x (النهائي 1x) ، DTT (النهائي 1 mM) ، و Hoechst (النهائي 1 ميكروغرام / مل) إلى NPB قبل الاستخدام.
2. عزل النواة
- زجاج التبريد ترتد المجانسات ، مع كوب واحد ترتد لكل عينة ، على الجليد. ثم أضف 7 مل من مزيج NPB إلى كل كوب Dounce.
ملاحظة: يوصى باستخدام ما يصل إلى ثماني عينات في كل تجربة. إن العمل مع أكثر من ثماني عينات من شأنه أن يؤخر بشكل كبير جميع الخطوات ، وقد يقلل بشكل خاص من جودة النواة أثناء الفرز. - ضع الأنسجة الدهنية المجمدة (50-100 ملغ) في الزجاج Dounce ، وقم بتقطيعها على الفور إلى بضع قطع أصغر باستخدام مقص طويل. السكتة الدماغية 10x مع مدقة فضفاضة لجميع العينات ، ثم 10x مع مدقة ضيقة.
ملاحظة: الأنسجة الدهنية ناعمة ، لذا يجب أن يكون تقطيعها إلى بضع قطع صغيرة كافيا. بالنسبة للعينات النادرة ، يمكن استخدام قطع أصغر (10-20 مجم) ، على الرغم من أن عدد نواة الخلايا الشحمية التي تم جمعها قد يختلف. - قم بالتصفية من خلال مصفاة 100 ميكرومتر في أنبوب جديد سعة 50 مل. انقل التجانسات المفلترة إلى أنبوب جديد سعة 15 مل عن طريق الصب. تدور عند 200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي متأرجح. إزالة طاف قدر الإمكان.
ملاحظة: نضح أولا باستخدام فراغ، ثم قم بإزالة وحدة التخزين المتبقية باستخدام ماصة ميكروية. - أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من PBS-N عن طريق النقر بإصبع لطيف ولكن شامل.
ملاحظة: تجنب سحب الخاصات، لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف النوى. - قم بالتصفية من خلال مصفاة 40 ميكرومتر في أنبوب جديد سعة 50 مل باستخدام ماصة لطيفة. شطف مصفاة مع 250 ميكرولتر من PBS-N. انقل إعادة التعليق النووي المصفى إلى أنبوب فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) باستخدام ماصة ميكروية.
ملاحظة: إذا كان ذلك متاحا ، يمكن استخدام الأنابيب ومصافي الخلايا لأحجام أصغر لتقليل فقد العينة.
3. فرز النواة
- إعداد أنبوب التجميع
- أضف 500 ميكرولتر من PBS-N إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 مل ، واقلبها عدة مرات لتبليل جميع الأسطح الداخلية بالتخزين المؤقت.
- قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة لإسقاط كل السائل ، ثم قم بتبريدها على الجليد حتى الفرز.
- FACS (الشكل 2)
- استخدم بوابة FSC-A / FSC-H للمفردات و FSC-A / SSC-A لإزالة الحطام الصغير أو الكبير.
- بوابة لسكان نواة الخلايا الشحمية الإيجابية mCherry / GFP.
- اجمع 10000 نواة في كل أنبوب من أنابيب التجميع المعدة في الخطوة 3.1.
- تحضير نواة ما بعد الفرز
- أضف 500 ميكرولتر من PBS-N إلى كل أنبوب تجميع ، واقلبه عدة مرات للخلط.
- قم بتدوير أنابيب التجميع عند 200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي متأرجح. تماما إزالة طاف.
ملاحظة: استخدم مكنسة كهربائية أولا لإزالة الفقاعات ، واسكب المادة الطافية ، واستخدم مناديل ورقية لإزالة السائل المتبقي تماما. الحبيبات غير مرئية في هذه المرحلة. قم بإعداد الخليط الرئيسي Tn5 أثناء خطوة الطرد المركزي كما هو موضح أدناه.
4. علامات Tn5 (الجدول 1)
- لتحضير 25 ميكرولتر من الخليط الرئيسي Tn5 ، امزج 12.5 ميكرولتر من محلول الحمض النووي للعلامات 2x (TD buffer) ، و 1.25 ميكرولتر من Tn5 transposase (إنزيم TDE I) ، و 11.25 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز.
- أضف 25 ميكرولتر من الخليط الرئيسي Tn5 إلى كل نواة بيليه ، وأعد تعليقها عن طريق السحب اللطيف. احتضان في 600 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية باستخدام خلاط حراري.
5. تنقية الحمض النووي
ملاحظة: يستخدم الإجراء التالي مجموعة تنقية PCR المذكورة في جدول المواد. يمكن استخدام أي طرق أخرى مماثلة لتنقية الحمض النووي.
- أضف 25 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز إلى 25 ميكرولتر من خليط إعادة تعليق نواة Tn5 الذي تم الحصول عليه بعد الخطوة 4.2. الحجم النهائي هو 50 ميكرولتر لكل عينة.
- أضف 250 ميكرولتر من PB المخزن المؤقت.
- أضف 5 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم 3 M (NaOAc) (درجة الحموضة 5.2).
- انقل الخليط إلى عمود (مرفق مع المجموعة المرجعية) ، وأجهزة الطرد المركزي عند 17900 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- تخلص من التدفق ، وضع عمود الدوران مرة أخرى في نفس أنبوب التجميع. أضف 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت PE المحتوي على الإيثانول المطلق (EtOH) ، وأجهزة الطرد المركزي عند 17,900 × جم لمدة 1 دقيقة في RT.
- تخلص من التدفق ، وضع عمود الدوران مرة أخرى في نفس أنبوب التجميع. أجهزة الطرد المركزي في 17900 × غرام لمدة 1 دقيقة في RT ، وتجاهل أنبوب التجميع مع التدفق.
- لاستئصال شظايا الحمض النووي ، جهز العمود بأنبوب جديد سعة 1.5 مل ، وأضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB ، واتركه في RT لمدة 3 دقائق. أجهزة الطرد المركزي في 17900 × غرام لمدة 1 دقيقة في RT.
ملاحظة: يمكن تخزين العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية لعدة أيام أو عند -20 درجة مئوية لأسابيع.
6. تضخيم PCR (الجدول 2)
ملاحظة: يتم سرد الاشعال المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 3.
- لتضخيم شظايا الحمض النووي المنقولة ، قم بإعداد خليط PCR الرئيسي دون إضافة برايمر تشفير شريطي Ad2.n فريد (التمهيدي # 2). استخدم 38 ميكرولتر من الخليط الرئيسي PCR لكل عينة: 11 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، 2 ميكرولتر من 25 ميكرومتر Ad1_noMX التمهيدي (التمهيدي #1) ، و 25 ميكرولتر من 2x PCR Master Mix.
- أضف 38 ميكرولتر من خليط PCR الرئيسي في أنبوب PCR سعة 0.2 مل.
- أضف 10 ميكرولتر من شظايا الحمض النووي المستخلصة من الخطوة 5.7.
- أضف 2 ميكرولتر من 25 ميكرومتر التمهيدي # 2 ، والذي يجب أن يكون محددا لكل عينة.
- قم بتشغيل PCR وفقا لظروف ركوب الدراجات الموضحة في الجدول 2.
7. اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) (الجدول 4)
ملاحظة: تهدف هذه الخطوة إلى تحديد الدورات الإضافية اللازمة لتضخيم الحمض النووي. إنه اختياري ولكن يوصى به بشدة ، خاصة للتجارب الجديدة.
- تحضير خليط qPCR الرئيسي دون إضافة التمهيدي # 2. استخدم 9.975 ميكرولتر من الخليط الرئيسي qPCR لكل عينة: 4.41 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، 0.25 ميكرولتر من 25 ميكرومتر التمهيدي # 1 ، 5 ميكرولتر من 2x PCR Master Mix ، و 0.09 ميكرولتر 100x SYBR Green I.
ملاحظة: لتحضير 100x SYBR Green I ، قم بتخفيف مخزون 10000x بالماء الخالي من النيوكلياز. نظرا لأن حجم 100x SYBR Green الذي استخدمته للخليط الرئيسي qPCR لا يكاد يذكر ، فمن الأسهل عمل خليط رئيسي إضافي من 100x SYBR Green I المخفف (على سبيل المثال ، ل 8-10 عينات). - أضف 9.975 ميكرولتر من الخليط الرئيسي qPCR في كل بئر من لوحة qPCR.
- أضف 0.25 ميكرولتر من 25 ميكرومتر التمهيدي # 2 في كل بئر.
ملاحظة: تأكد من إضافة نفس التمهيدي # 2 لمطابقة ما تمت إضافته إلى كل عينة محددة في الخطوة 6.4. - أضف 5 ميكرولتر من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي تم الحصول عليه بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الخطوة 6.5 ، واخلطه عن طريق الماصة.
ملاحظة: سيتم استخدام 45 ميكرولتر المتبقية من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني. - قم بتشغيل qPCR وفقا لظروف ركوب الدراجات الموضحة في الجدول 5.
- تحقق من منحنيات التضخيم ، وحدد عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل الإضافية المطلوبة من خلال تقدير عدد الدورات التي وصلت ~ 35٪ من الحد الأقصى (الشكل 3 أ).
ملاحظة: عادة ، تتطلب 10000 نواة من خمس إلى ثماني دورات PCR إضافية.
8. تضخيم PCR إضافي
- قم بتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام كل ال 45 ميكرولتر المتبقية من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل وفقا للحسابات من الخطوة 7.6 (الجدول 6).
ملاحظة: قد تتطلب كل عينة عددا مختلفا من دورات التضخيم.
9. تنقية الحمض النووي الثانية باستخدام مجموعة تنقية PCR
- استخدم نفس الإجراءات كما في القسم 5 ، ولكن قم بإزالة شظايا الحمض النووي المضخمة ب 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB.
10. اختيار حجم جزء الحمض النووي
ملاحظة: استخدم حبات تثبيت عكسية ذات طور صلب ، كما هو موضح أدناه. يمكن استخدام أي حبات أخرى مماثلة لتنقية الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يجب إعادة تعليق تعليق حبة SPRI بالكامل وموازنتها عند RT مع الدوران قبل الاستخدام.
- انقل الحمض النووي المستخلص إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الجديد ، وأضف 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB لعمل حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر.
- أضف 55 ميكرولتر من حبات SPRI (حجم عينة 0.55x) ، واخلطها عن طريق الماصة. احتضان لمدة 5 دقائق في RT ، ثم افصله على حامل مغناطيسي صغير لشرائط PCR ذات 8 أنابيب لمدة 5 دقائق.
- نقل 150 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب PCR جديد. أضف 95 ميكرولتر من حبات SPRI ، واخلطها عن طريق الماصة.
ملاحظة: يحتوي العنصر الطافي على حمض نووي يبلغ حوالي 500 نقطة أساس أو أصغر. - احتضان لمدة 5 دقائق في RT ، ثم افصلها على الحامل المغناطيسي الصغير لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية بعناية.
- اغسل الخرز لمدة 1 دقيقة مع 200 ميكرولتر من 70٪ EtOH. كرر مرتين لمدة ثلاث غسلات في المجموع.
ملاحظة: لا تحرك أنابيب PCR من الحامل المغناطيسي أثناء الغسيل. - بعد الغسيل النهائي ، قم بتدوير الأنابيب عند 1000 × جم لمدة دقيقة واحدة ، وقم بسحب EtOH المتبقي. جفف الحبيبات مع فتح الغطاء عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة على جهاز PCR.
ملاحظة: يجب أن تعرض كريات الخرز بعض الشقوق الطفيفة فقط بمجرد تجفيفها. تجنب الإفراط في التجفيف. - أعد تعليق الحبيبات ب 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB عن طريق السحب ، واحتضانها لمدة 5 دقائق في RT. افصلها على الحامل المغناطيسي الصغير لمدة 5 دقائق ، ثم انقل 18 ميكرولتر من المادة الطافية التي تحتوي على المكتبة النهائية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
ملاحظة يمكن تخزين المكتبة في -20 درجة مئوية أثناء إجراء فحص الجودة.
11. قياس كمية الحمض النووي باستخدام مقياس الفلور
- لتحضير الخليط الرئيسي ، قم بتخفيف كاشف 200x dsDNA عالي الحساسية (HS) باستخدام المخزن المؤقت dsDNA HS إلى تركيز نهائي قدره 1x.
- بالنسبة للمعايير ، أضف 190 ميكرولتر من الخليط الرئيسي 1x و 10 ميكرولتر من المعيار 1 أو المعيار 2 إلى أنبوب مقياس الفلور.
ملاحظة: قم بموازنة المعايير في RT في الظلام قبل البدء في القياس الكمي. - بالنسبة لعينات المكتبة ، أضف 198 ميكرولتر من الخليط الرئيسي 1x و 2 ميكرولتر من كل عينة إلى أنبوب مقياس فلوري منفصل.
ملاحظة: إذا كانت كميات العينة محدودة ، فيمكن تقليل حجم العينة إلى 1 ميكرولتر ، ويمكن زيادة حجم الخليط الرئيسي 1x إلى 199 ميكرولتر. - دوامة أو هز أنابيب الفلورومتر ، واتركها تجلس لمدة 5 دقائق في RT في الظلام. قم بقياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقايسة dsDNA HS لمقياس الفلورومتر.
12. فحص جودة المكتبة بواسطة أنظمة الرحلان الكهربائي عالية الحساسية
- خذ مكتبة ATAC-seq ، وقم بتخفيفها بالماء الخالي من النيوكلياز إلى تركيز نهائي يبلغ 1-5 نانوغرام / ميكرولتر.
- تحليل توزيع حجم مكتبات ATAC-seq باستخدام أنظمة الرحلان الكهربائي الآلية عالية الحساسية التي تتبع بروتوكولات الشركة المصنعة.
13. فحص جودة مكتبة ATAC-seq باستخدام qPCR المستهدف
- خذ 5-10 نانوغرام من مكتبة ATAC-seq ، وقم بتخفيفها ب 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز.
- قم بتشغيل qPCR باستخدام الباشيلي الذي يستهدف المروجين والمعززات المعروفة بأنها نشطة في الخلايا الشحمية وفقا لظروف الدورة المشار إليها في الجدول 7.
- استخدم بادئات التحكم السلبية التي تستهدف المناطق الجينومية المغلقة / الصامتة (الجدول 7).
- احسب إثراء المروج / المعززات على الضوابط السلبية (الجدول 8).
ملاحظة: من المتوقع أن نرى ≥10-20 ضعفا مع عينات ناجحة.
14. التسلسل
- أرسل مكتبات ATAC-seq للتسلسل. استخدم تسلسل النهاية المزدوجة (2 × 34 نقطة أساس ، 2 × 50 نقطة أساس أو أكثر) بمتوسط أرقام قراءة يتراوح بين 10 و 30 مليون قراءة لكل عينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتحليل الأنسجة الدهنية باستخدام بروتوكول ATAC-seq هذا ، قمنا بإنشاء فئران Adipoq-NuTRAP التي تم تغذيتها على وجبات الطعام. ثم قمنا بعزل نوى الخلايا الشحمية من الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية (eWAT) والأنسجة الدهنية البيضاء الأربية (iWAT) والأنسجة الدهنية البنية (BAT) باستخدام قياس التدفق الخلوي. تم استخدام النوى المعزولة لوضع العلامات ، تليها تنقية الحمض النووي ، وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وخطوات فحص الجودة ، والتسلسل ، وتحليل البيانات ، كما هو موضح أعلاه. كان الغرض من هذه التجربة التمثيلية هو تحديد إمكانية الوصول إلى الكروماتين لمجموعات الخلايا الشحمية النقية المعزولة من مستودعات الدهون المختلفة.
لاحظنا أن نوى الخلايا الشحمية التي تحمل علامة mCherry و GFP يمكن تمييزها بوضوح عن نوى أنواع الخلايا الأخرى المعزولة من الأنسجة الدهنية لفأر Adipoq-NuTRAP باستخدام قياس التدفق الخلوي (الشكل 2A-C). كانت هناك اختلافات في كسور الخلايا الشحمية اعتمادا على نوع المستودع الدهني: ~ 50٪ في eWAT ، ~ 30٪ في iWAT ، و ~ 65٪ في BAT (الشكل 2D) 7. جمعنا 10000 نواة في غضون 2-10 دقائق لكل عينة واستخدمناها في إجراءات ATAC-seq. أجرينا ما مجموعه 10-13 دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل (خمس دورات من تفاعل البوليميراز المتسلسل الأول وخمس إلى ثماني دورات من تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني ، الشكل 3 أ). إذا كانت العينات تتطلب أكثر من إجمالي 15 دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، فقد يشير ذلك إلى عينات منخفضة الجودة (الشكل 3 ب). أظهر تحليل توزيع الحجم لمكتبات ATAC-seq قمم متعددة تتوافق مع المنطقة الخالية من النيوكليوسومات (NFR) والنيوكليوسومات الأحادية والثنائية والمتعددة (الشكل 4A-C) ، بمتوسط أحجام ~ 500-800 bp. أظهرت العينات ذات الجودة الرديئة عادة في الغالب NFR مع عدم وجود قمم نووية أو عدد قليل منها (الشكل 4D). أظهرت اختبارات فحص الجودة بواسطة تحليل qRT-PCR إثراء 10-20 ضعفا بالعناصر الجينومية الإيجابية بالقرب من جينات علامات الخلايا الشحمية مثل Adipoq و Fabp4 و Plin1 و Pnpla2 ، بينما لم يظهر أي إثراء مع التحكم السلبي (الشكل 5). لاحظنا أيضا التخصيب باستخدام الجين الحراري Ucp1 على وجه التحديد في BAT ولكن ليس في eWAT أو iWAT (الشكل 5).
بعد التسلسل والتحليل ، حددنا ~ 55000 قمة مجتمعة من ثلاثة مستودعات دهنية مختلفة (eWAT و iWAT و BAT). كانت قراءات الميتوكوندريا <2٪ ، وكان الكسر تحت القمم ~ 18٪ -44٪ (الشكل 6 أ ، ب). قد تحتوي العينات ذات الجودة الرديئة على قراءات ميتوكوندريا أعلى بكثير و / أو جزء أقل من القراءات في مناطق الذروة. كشف الفحص البصري لمسارات مكتبة ATAC-seq عن قمم قوية متعددة ذات نسب إشارة إلى ضوضاء عالية بالقرب من جينات علامات الخلايا الشحمية ، مثل Adipoq و Plin1 و Fabp4 ، من جميع المستودعات الدهنية (الشكل 7A-C). لاحظنا أيضا قمم ATAC-seq قوية في موضع صانع الخلايا الشحمية البنية Ucp1 في عينة BAT ، ولكن لم يتم ملاحظة هذه القمم في عينات eWAT أو iWAT (الشكل 7D). تشير كل هذه البيانات إلى بيانات ATAC-seq الناجحة الناتجة عن نوى الخلايا الشحمية.
الشكل 1: مخطط انسيابي تخطيطي ل ATAC-seq الخاص بالخلايا الشحمية باستخدام فئران NuTRAP. يتم تمييز الخطوات الفريدة لهذا البروتوكول في المربعات المظللة باللون الأحمر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: بوابة FACS التمثيلية التي توضح عزل نوى الخلايا الشحمية الموسومة ب mCherry / GFP من الأنسجة الدهنية لفأر Adipoq-NuTRAP. (أ-ج) تحليل التدفق الخلوي للنوى المعزولة من eWAT و iWAT و BAT لفأر Adipoq-NuTRAP. د: التحليل الكمي للنوى المأخوذة من الخلايا الشحمية وغير الشحمية في eWAT و iWAT و BAT لفأر Adipoq-NuTRAP. البيانات هي متوسط ± SEM (ن = 3). بيانات عدد النوى هذه مأخوذة من Roh et al.7. الاختصارات: FACS = فرز الخلايا المنشط بالفلورة ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر ؛ eWAT = الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية. iWAT = الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية ؛ BAT = الأنسجة الدهنية البنية. NuTRAP = وضع العلامات النووية وترجمة تنقية تقارب الريبوسوم ؛ Adipoq-NuTRAP = فأر NuTRAP متقاطع مع خط adiponectin-Cre الخاص بالخلايا الشحمية ؛ FSC-A = منطقة ذروة التشتت الأمامية ؛ FSC-H = ارتفاع ذروة التشتت الأمامي ؛ SSC-A = منطقة ذروة التشتت الجانبية ؛ FITC-A = منطقة ذروة الفلوريسئين إيزوثيوسيانات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: منحنيات التضخيم التمثيلي من qRT-PCR . (أ) عينة جيدة النوعية تحتاج إلى سبع دورات تضخيم إضافية. ب: عينة رديئة النوعية تحتاج إلى ≥15 دورة إضافية. اختصار: qRT-PCR = النسخ العكسي الكمي PCR. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: ملفات تعريف توزيع الحجم لمكتبات ATAC-seq. (أ-ج) يتم عرض المكتبات ذات النوعية الجيدة و (د) ذات الجودة الرديئة كنتائج تمثيلية. الاختصارات: ATAC-seq = مقايسة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية ؛ FU = وحدات مضان ؛ BP = أزواج القاعدة ؛ NFR = منطقة خالية من النيوكليوسوم ؛ eWAT = الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية. iWAT = الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية ؛ BAT = الأنسجة الدهنية البنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحليل qPCR لمراقبة الجودة لمكتبات ATAC-seq. إثراء المروجين والمعززات بالقرب من علامات الخلايا الدهنية العامة Adipoq و Fabp4 و Plin1 و Pnpla2 أو علامة الخلايا الدهنية البنية Ucp1. الاختصارات: ATAC-seq = مقايسة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية ؛ NC = السيطرة السلبية ؛ eWAT = الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية. iWAT = الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية ؛ BAT = الأنسجة الدهنية البنية. البيانات هي متوسط ± SEM (ن = 2). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: قراءات الميتوكوندريا والكسور تحت قمم مكتبات ATAC-seq. (أ) تقرأ الميتوكوندريا (٪) و (ب) الكسور تحت القمم (٪) من eWAT و iWAT و BAT. الاختصارات: ATAC-seq = مقايسة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية ؛ eWAT = الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية. iWAT = الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية ؛ BAT = الأنسجة الدهنية البنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تتبع إشارة ATAC-seq في مواضع الجينات التمثيلية. (A-C) جينات علامة الخلايا الشحمية العامة. ب: علامة خاصة بالخلايا الشحمية البنية. الاختصارات: ATAC-seq = مقايسة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية ؛ eWAT = الأنسجة الدهنية البيضاء البربخية. iWAT = الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية ؛ BAT = الأنسجة الدهنية البنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: مكونات الخليط الرئيسي Tn5. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: مكونات الخليط الرئيسي PCR وظروف دورة PCR الأولية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 3: قائمة البادئات المشفرة لتضخيم PCR. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 4: مكونات الخليط الرئيسي qPCR. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 5: ظروف ركوب الدراجات qPCR. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 6: ظروف دورة PCR الثانية لتضخيم إضافي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 7: تسلسلات التمهيدي وظروف دورة qPCR المستهدفة لفحص جودة مكتبة ATAC-seq. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 8: تحليل نتائج qPCR لفحص الجودة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الورقة ، قدمنا بروتوكول ATAC-seq محسن لتقييم إمكانية الوصول إلى الكروماتين الخاص بالخلايا الشحمية في الجسم الحي. نجح بروتوكول ATAC-seq هذا باستخدام ماوس Adipoq-NuTRAP في إنشاء ملفات تعريف إمكانية الوصول إلى الكروماتين الخاصة بالخلايا الشحمية. العامل الأكثر أهمية لتجارب ATAC-seq الناجحة والقابلة للتكرار هو جودة النواة. من الأهمية بمكان تجميد الأنسجة الدهنية المقطعة على الفور في النيتروجين السائل وتخزينها بأمان عند -80 درجة مئوية دون إذابة حتى الاستخدام. من المهم أيضا منع تلف نواة الخلايا الشحمية أثناء عزل النواة وفرزها. يجب التعامل مع العينات برفق عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة والحد الأدنى من السحب أثناء عملية عزل النوى بأكملها.
يعد البوابات الدقيقة أثناء فرز النوى أمرا بالغ الأهمية لعزل نوى الخلايا الشحمية الموسومة ب mCherry / GFP بشكل انتقائي (الشكل 1). من المهم ضمان فصل واضح بين السكان الإيجابيين والسلبيين ل mCherry / GFP. وبالمثل ، فإن المعالجة اللطيفة والفرز السريع ضروريان للحفاظ على طبيعة الكروماتين في النوى. إذا كان التألق ضعيفا ، ويستغرق الفرز وقتا طويلا ، و / أو تكون كسور الخلايا الشحمية خارج النطاقات المتوقعة ، فهذا يشير إلى أنه قد تكون هناك مشكلات في العينات أو مشاكل أثناء إجراءات عزل النوى. يمكن تعديل هذا البروتوكول حسب الظروف التجريبية. أولا ، يمكن أن ينخفض عدد النوى المطلوبة ل ATAC-seq إلى 1,000 أو ما يصل إلى 100,000. إذا كان هناك أقل من 5000 نواة ، فإن استخدام حجم مخفض آخر (0.6 ميكرولتر) من إنزيم TDE I سيمنع الإفراط في وضع العلامات. بالنسبة لعدد النوى التي تساوي أو تزيد عن 50000 ، يمكن مضاعفة حجم الخليط الرئيسي Tn5 إلى 50 ميكرولتر ، وهو نفس الحجم المستخدم في البروتوكول الأصلي10.
ثانيا ، يمكن استخدام أنظمة وضع العلامات على النواة الأخرى ، مثل INTACT (عزل النوى الموسومة في أنواع معينة من الخلايا) الفئران ، بدلا من الفئران NuTRAP16. نظرا لأن الفئران السليمة تعبر عن بروتين الغشاء النووي SUN1 الموسوم ب GFP ، يمكن عزل النوى الموسومة ب GFP عن طريق الفرز واستخدامها في ATAC-seq باستخدام نفس الطرق الموضحة في هذا البروتوكول. يمكن أيضا اعتماد أي طرق أخرى لوضع العلامات النووية. أخيرا ، يمكن أيضا استخدام الخلايا الشحمية المستزرعة في المختبر ل ATAC-seq باتباع هذا البروتوكول. لهذا ، يتم كشط الخلايا المزروعة على الأطباق / الأطباق ، وجمعها باستخدام NPB ، ثم إخضاعها لنفس الإجراءات النهائية - باستثناء أن الفرز يجب أن يتم فقط بناء على الحجم والتعقيد و Hoechst ، وليس mCherry / GFP كما هو موضح سابقا15.
يشكل بروتوكول ATAC-seq الخاص بالخلايا الشحمية باستخدام تقنية NuTRAP قيدا لأنه لا يعمل بدون وضع العلامات الفلورية. وبالتالي ، فإن تحليل العينات البشرية لن يعمل مع هذه التقنية. ومع ذلك ، لا يزال من الممكن إجراء ATAC-seq مع الخلايا الشحمية المعزولة عن طريق هضم الأنسجة وطرق التعويم. وتجدر الإشارة إلى أن العمل مع الخلايا الشحمية البشرية العائمة له بعض القيود ، مثل التلوث بأنواع الخلايا الأخرى عند استخدام الطرد المركزي منخفض السرعة وفقدان الخلايا الشحمية الكبيرة عند استخدام الطرد المركزي عالي السرعة. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أي نوع خلية تتوفر له خطوط Cre محددة ، مما يسمح بتنميط كروماتين فعال خاص بنوع الخلية حتى مع مدخلات خلية محدودة17. في الختام ، سيكون بروتوكول ATAC-seq المحسن هذا مفيدا للباحثين الراغبين في تقييم إمكانية الوصول إلى الكروماتين من أنواع معينة من الخلايا داخل الأنسجة غير المتجانسة خارج الجسم الحي ، بالإضافة إلى الخلايا الشحمية التي ناقشناها هنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية ذات صلة أو مادية تتعلق بالبحث الموصوف في هذه الورقة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل الصندوق الاستئماني لأبحاث IUSM Showalter (إلى HCR) ، وهو مركز IUSM لمرض السكري وأمراض التمثيل الغذائي التجريبي ومنحة الجدوى (إلى HCR) ، والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (R01DK129289 إلى HCR) ، وجائزة أعضاء هيئة التدريس المبتدئين لجمعية السكري الأمريكية (7-21-JDF-056 إلى HCR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio?5 |
References
- Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
- Farmer, S. R.
- Bielczyk-Maczynska, E. White adipocyte plasticity in physiology and disease. Cells. 8 (12), 1507 (2019).
- Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies. Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).
- Esteve Rafols, M. Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity. Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).
- Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications. Experimental and Molecular Medicine. 48, e215 (2016).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Roh, H. C., et al. Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPARγ activity and elevated TGFβ-SMAD signaling. Molecular Metabolism. 42, 101086 (2020).
- Roh, H. C., et al. Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity. Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).
- Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Wu, J., et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA. Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- So, J., et al. Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility. Molecular Metabolism. 66, 101619 (2022).
- Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing. STAR Protocols. 2 (3), 100805 (2021).
- Heyward, F. D., et al. Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin's hunger-suppressing effects. bioRxiv. , (2022).
