Summary
Wir präsentieren ein Protokoll für den Assay von Transposase-zugänglichem Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ATAC-seq) speziell an Adipozyten mittels Zellkernsortierung mit Fettgewebe, das aus transgenen Reportermäusen mit nukleärer Fluoreszenzmarkierung isoliert wurde.
Abstract
Der Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatzsequenzierung (ATAC-seq) ist eine robuste Technik, die eine genomweite Profilierung der Chromatinzugänglichkeit ermöglicht. Diese Technik hat sich als nützlich erwiesen, um die regulatorischen Mechanismen der Genexpression in einer Reihe von biologischen Prozessen zu verstehen. Obwohl ATAC-seq für verschiedene Arten von Proben modifiziert wurde, gab es keine wirksamen Modifikationen der ATAC-seq-Methoden für Fettgewebe. Zu den Herausforderungen bei Fettgeweben gehören die komplexe zelluläre Heterogenität, der hohe Lipidgehalt und die hohe mitochondriale Kontamination. Um diese Probleme zu überwinden, haben wir ein Protokoll entwickelt, das eine Adipozyten-spezifische ATAC-seq ermöglicht, indem wir fluoreszenzaktivierte Zellkernsortierung mit Fettgewebe aus der transgenen Reporter-Nukle-Markierung und der Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP)-Maus verwenden. Dieses Protokoll erzeugt qualitativ hochwertige Daten mit minimaler Verschwendung von Sequenzierungslesevorgängen und reduziert gleichzeitig die Menge an Nukleus-Input und Reagenzien. Dieser Artikel enthält detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die ATAC-seq-Methode, die für die Verwendung von Adipozytenkernen validiert ist, die aus dem Fettgewebe der Maus isoliert wurden. Dieses Protokoll wird bei der Untersuchung der Chromatindynamik in Adipozyten bei verschiedenen biologischen Stimulationen helfen, was neue biologische Erkenntnisse ermöglicht.
Introduction
Das Fettgewebe, das darauf spezialisiert ist, überschüssige Energie in Form von Lipidmolekülen zu speichern, ist ein Schlüsselorgan für die Stoffwechselregulation. Die strikte Kontrolle der Adipozytenbildung und -erhaltung ist für die Funktion des Fettgewebes und die Energiehomöostase des gesamten Körpers von entscheidender Bedeutung1. Viele transkriptionelle Regulatoren spielen eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der Differenzierung, Plastizität und Funktion von Adipozyten. Einige dieser Regulatoren sind an Stoffwechselstörungen beim Menschen beteiligt 2,3. Jüngste Fortschritte bei Hochdurchsatz-Sequenzierungstechniken für die Genexpression und epigenomische Analyse haben die Entdeckung der molekularen Regulatoren der Adipozytenbiologie weiter erleichtert4. Molekulare Profiling-Studien mit Fettgewebe sind aufgrund der Heterogenität dieser Gewebe schwierig durchzuführen. Fettgewebe besteht hauptsächlich aus Adipozyten, die für die Fettspeicherung verantwortlich sind, enthält aber auch verschiedene andere Zelltypen wie Fibroblasten, Endothelzellen und Immunzellen5. Darüber hinaus wird die zelluläre Zusammensetzung des Fettgewebes als Reaktion auf pathophysiologische Veränderungen wie Temperatur und Ernährungszustand dramatisch verändert6. Um diese Probleme zu lösen, haben wir zuvor eine transgene Reportermaus mit dem Namen Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) entwickelt, die GFP-markierte Ribosomen und mCherry-markierte biotinylierte Zellkerne in einer Cre-Rekombinase-abhängigen Weise produziert7. Das Dual-Labeling-System ermöglicht die zelltypspezifische Transkriptom- und Epigenomanalyse mit Geweben. Unter Verwendung von NuTRAP-Mäusen, die mit adipozytenspezifischen Adiponectin-Cre-Linien (Adipoq-NuTRAP) gekreuzt wurden, haben wir zuvor Genexpressionsprofile und Chromatinzustände aus reinen Adipozytenpopulationen in vivo charakterisiert und bestimmt, wie sie während der Adipositas verändert werden 7,8. Zuvor konnten wir mit NuTRAP-Mäusen, die mit braunen und beigen Adipozyten-spezifischen Ucp1-Cre-Linien (Ucp1-NuTRAP) gekreuzt wurden, den epigenomischen Umbau der seltenen thermogenen Adipozytenpopulation, der beigen Adipozyten, als Reaktion auf Temperaturänderungen charakterisieren9.
ATAC-seq ist eine weit verbreitete analytische Methode zur Beurteilung der genomweiten Zugänglichkeit von Chromatinen. Die hyperreaktive Tn5-Transposase, die in ATAC-seq verwendet wird, ermöglicht die Identifizierung offener Chromatinregionen durch Markierung von Sequenzierungsadaptern im Chromatin-zugänglichen Bereich von Zellkernen10. ATAC-seq ist eine einfache Methode, liefert jedoch robuste Ergebnisse und ist auch bei Proben mit geringem Input hocheffizient. Es hat sich damit zu einer der beliebtesten epigenomischen Profiling-Methoden entwickelt und zum Verständnis der regulatorischen Mechanismen der Genexpression in verschiedenen biologischen Kontexten beigetragen. Seit der Erstellung des ursprünglichen ATAC-seq-Protokolls wurden verschiedene von ATAC-seq abgeleitete Techniken weiterentwickelt, um das Protokoll für verschiedene Arten von Proben zu modifizieren und zu optimieren. Zum Beispiel ist Fast-ATAC für die Analyse von Blutzellproben11 konzipiert, Omni-ATAC ist ein optimiertes Protokoll für gefrorene Gewebeproben12 und MiniATAC-seq ist wirksam für die Analyse von Embryonen im Frühstadium13. Die Anwendung der ATAC-seq-Methode auf Adipozyten, insbesondere aus Gewebeproben, ist jedoch immer noch eine Herausforderung. Neben der Heterogenität des Fettgewebes kann sein hoher Lipidgehalt effiziente Rekombinationsreaktionen durch die Tn5-Transposase auch nach der Zellkernisolierung beeinträchtigen. Darüber hinaus führt der hohe mitochondriale Gehalt in Adipozyten, insbesondere in braunen und beigen Adipozyten, zu einer hohen mitochondrialen DNA-Kontamination und zu verschwendeten Sequenzierwerten. In dieser Arbeit wird ein Protokoll für Adipozyten-spezifisches ATAC-seq unter Verwendung von Adipoq-NuTRAP-Mäusen beschrieben (Abbildung 1). Durch die Nutzung der fluoreszenzmarkierten Kernsortierung ermöglicht dieses Protokoll die Sammlung reiner Populationen von Adipozytenkernen fern von anderen störenden Zelltypen und die effiziente Entfernung von Lipiden, Mitochondrien und Gewebetrümmern. Daher kann dieses Protokoll zelltypspezifische, qualitativ hochwertige Daten generieren und die Verschwendung von mitochondrialen Reads minimieren, während im Vergleich zum Standardprotokoll eine geringere Menge an Input und Reagenzien verwendet wird.
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Protocol
Tierpflege und Tierversuche wurden nach Verfahren durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Indiana University School of Medicine genehmigt wurden.
1. Vorbereitungen vor Beginn des Experiments
- Gewebevorbereitung
- Für die Markierung des Adipozytenkerns kreuzen Sie NuTRAP-Mäuse mit Adipozyten-spezifischen Adiponectin-Cre-Linien (Adipoq-Cre), um Adipoq-NuTRAP-Mäuse zu erzeugen, die sowohl für Adipoq-Cre als auch für NuTRAP hemizygot sind.
- Das interessierende Fettgewebe der Adipoq-NuTRAP-Mäuse wird wie zuvor beschrieben14 präpariert.
- Frieren Sie das Gewebe in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie es bis zur Verwendung bei −80 °C.
Anmerkungen: Jedes Fettpolster kann als Ganzes aufbewahrt werden, und das gefrorene Gewebe kann später für Experimente auf Trockeneis in kleinere Stücke (~50 mg) geschnitten werden. Alternativ kann das Fettgewebe geschnitten, aliquotiert und zur Lagerung in Röhrchen eingefroren werden (~50 mg pro Röhrchen). Gefrorene Proben dürfen nach dem Einfrieren bis zur Verwendung niemals aufgetaut werden.
- Vorbereitung des Puffers
Anmerkungen: Halten Sie die Puffer während des gesamten Experiments auf Eis.- Präparationspuffer (NPB): 250 mM Saccharose, 10 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mMMgCl2 und 0,1 % NP40. Bereiten Sie 7 ml NPB pro Probe vor. Fügen Sie dem NPB vor Gebrauch frischen 100-fachen Proteasehemmer-Cocktail (letzte 1x), DTT (letzte 1 mM) und Hoechst (letzte 1 μg/ml) hinzu.
HINWEIS: Es wird empfohlen, frische NPB zuzubereiten, aber es kann bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden. - 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 0,1% NP-40 (PBS-N) herstellen.
- Präparationspuffer (NPB): 250 mM Saccharose, 10 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mMMgCl2 und 0,1 % NP40. Bereiten Sie 7 ml NPB pro Probe vor. Fügen Sie dem NPB vor Gebrauch frischen 100-fachen Proteasehemmer-Cocktail (letzte 1x), DTT (letzte 1 mM) und Hoechst (letzte 1 μg/ml) hinzu.
2. Isolierung des Zellkerns
- Dounce-Homogenisatoren aus Glas mit einem Glas Dounce pro Probe auf Eis kühlen. Geben Sie dann 7 ml der NPB-Mischung in jedes Glas Dounce.
HINWEIS: Es wird empfohlen, in jedem Experiment bis zu acht Proben zu verwenden. Die Arbeit mit mehr als acht Proben würde alle Schritte erheblich verzögern und insbesondere die Qualität des Zellkerns während der Sortierung verschlechtern. - Geben Sie das gefrorene Fettgewebe (50-100 mg) in das Glas Decounce und schneiden Sie es sofort mit einer langen Schere in einige kleinere Stücke. Schlagen Sie 10x mit einem losen Stößel für alle Proben und dann 10x mit einem festen Stößel.
Anmerkungen: Fettgewebe ist weich, daher sollte es ausreichen, es in ein paar kleine Stücke zu schneiden. Für seltene Proben können kleinere Stücke (10-20 mg) verwendet werden, obwohl die Anzahl der gesammelten Adipozytenkerne variieren kann. - Filtern Sie durch ein 100-μm-Sieb in ein neues 50-ml-Röhrchen. Füllen Sie die filtrierten Homogenate durch Gießen in ein neues 15-ml-Röhrchen. Bei 200 × g für 10 min bei 4 °C in einer Schwenkbecherzentrifuge schleudern. Entfernen Sie den Überstand so weit wie möglich.
Anmerkungen: Saugen Sie zuerst mit einem Vakuum ab und entfernen Sie dann das restliche Volumen mit einer Mikropipette. - Resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl PBS-N durch sanftes, aber gründliches Klopfen mit den Fingern.
Anmerkungen: Vermeiden Sie das Pipettieren, da dies die Kerne beschädigen kann. - Durch ein 40-μm-Sieb durch sanftes Pipettieren in ein neues 50-ml-Röhrchen filtrieren. Spülen Sie das Sieb mit 250 μl PBS-N. Die filtrierte Kernresuspension wird mit einer Mikropipette in ein fluoreszenzaktiviertes Zellsortierröhrchen (FACS) überführt.
HINWEIS: Falls verfügbar, können Röhrchen und Zellsiebe für kleinere Volumina verwendet werden, um Probenverluste zu minimieren.
3. Nukleus-Sortierung
- Vorbereitung des Sammelröhrchens
- Geben Sie 500 μl PBS-N in neue 1,5-ml-Röhrchen und drehen Sie sie einige Male um, um alle Innenflächen mit dem Puffer zu benetzen.
- Drehen Sie die Röhrchen kurz, um die gesamte Flüssigkeit herunterzubringen, und kühlen Sie sie dann auf Eis, bis sie sortiert sind.
- FACS (Abbildung 2)
- Verwenden Sie den Anschnitt FSC-A/FSC-H für Einzelstücke und FSC-A/SSC-A für die Entfernung von kleinem oder großem Schmutz.
- Gate für die mCherry/GFP-positive Adipozyten-Kernpopulation.
- Sammeln Sie 10.000 Kerne in jedem der in Schritt 3.1 vorbereiteten Sammelröhrchen.
- Präparation des Zellkerns nach der Sortierung
- Geben Sie 500 μl PBS-N in jedes Sammelröhrchen und drehen Sie es einige Male um, um es zu mischen.
- Schleudern Sie die Sammelröhrchen bei 200 × g für 10 min bei 4 °C in einer Schwenkbecherzentrifuge. Entfernen Sie den Überstand vollständig.
Anmerkungen: Verwenden Sie zuerst einen Staubsauger, um Blasen zu entfernen, gießen Sie den Überstand ab und verwenden Sie Papiertücher, um die restliche Flüssigkeit vollständig zu entfernen. Das Pellet ist an dieser Stelle unsichtbar. Bereiten Sie die Tn5-Mastermischung während des Zentrifugationsschritts wie unten beschrieben vor.
4. Tn5-Tagmentation (Tabelle 1)
- Um 25 μl Tn5-Mastermischung herzustellen, mischen Sie 12,5 μl 2x Tagmentations-DNA-Puffer (TD-Puffer), 1,25 μl Tn5-Transposase (TDE I-Enzym) und 11,25 μl nukleasefreies Wasser.
- Fügen Sie jedem Zellkernpellet 25 μl Tn5-Mastermischung hinzu und resuspendieren Sie es durch vorsichtiges Pipettieren. Bei 600 U/min für 30 min bei 37 °C mit einem Thermomischer inkubieren.
5. DNA-Aufreinigung
HINWEIS: Für das folgende Verfahren wird das in der Materialtabelle erwähnte PCR-Aufreinigungskit verwendet. Alle anderen ähnlichen DNA-Aufreinigungsmethoden können verwendet werden.
- 25 μl nukleasefreies Wasser werden zu den 25 μl der nach Schritt 4.2 erhaltenen Mischung der Tn5-Kernresuspension hinzugefügt. Das Endvolumen beträgt 50 μl pro Probe.
- Fügen Sie 250 μl Puffer PB hinzu.
- Fügen Sie 5 μl 3 M Natriumacetat (NaOAc) (pH 5,2) hinzu.
- Übertragen Sie das Gemisch in eine Säule (im Lieferumfang des Referenzkits enthalten) und zentrifugieren Sie es 1 Minute lang bei Raumtemperatur (RT) bei 17.900 × g .
- Verwerfen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Schleudersäule wieder in dasselbe Auffangröhrchen ein. Fügen Sie 750 μl Puffer-PE mit absolutem Ethanol (EtOH) hinzu und zentrifugieren Sie bei 17.900 × g für 1 Minute bei RT.
- Entsorgen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Schleudersäule wieder in dasselbe Auffangröhrchen ein. Zentrifugieren Sie bei 17.900 × g für 1 min bei RT und entsorgen Sie das Auffangröhrchen mit dem Durchfluss.
- Um die DNA-Fragmente zu eluieren, wird die Säule mit einem neuen 1,5-ml-Röhrchen ausgestattet, 10 μl EB-Puffer hinzugefügt und 3 Minuten bei RT belassen. Bei 17.900 × g für 1 min bei RT zentrifugieren.
HINWEIS: Die Proben können tagelang bei 4 °C oder wochenlang bei −20 °C gelagert werden.
6. PCR-Amplifikation (Tabelle 2)
HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten Primer sind in Tabelle 3 aufgeführt.
- Um transponierte DNA-Fragmente zu amplifizieren, bereiten Sie eine PCR-Mastermischung vor, ohne einen einzigartigen Ad2.n-Barcode-Primer (Primer #2) hinzuzufügen. Verwenden Sie 38 μl der PCR-Mastermischung pro Probe: 11 μl nukleasefreies Wasser, 2 μl 25 μM Ad1_noMX Primer (Primer #1) und 25 μl 2x PCR Master Mix.
- Geben Sie 38 μl der PCR-Mastermischung in ein 0,2-ml-PCR-Röhrchen.
- Fügen Sie 10 μL der eluierten DNA-Fragmente aus Schritt 5.7 hinzu.
- Fügen Sie 2 μL des 25 μM Primers #2 hinzu, der für jede Probe spezifisch sein muss.
- Führen Sie die PCR gemäß den in Tabelle 2 angegebenen Zyklusbedingungen durch.
7. Quantitativer Echtzeit-PCR-Test (qPCR) (Tabelle 4)
HINWEIS: Dieser Schritt zielt darauf ab, die zusätzlichen Zyklen zu bestimmen, die zur Amplifikation der DNA erforderlich sind. Es ist optional, aber sehr zu empfehlen, insbesondere für neue Experimente.
- Bereiten Sie die qPCR-Mastermischung ohne Zugabe von Primer #2 vor. Verwenden Sie 9,975 μl der qPCR-Mastermischung pro Probe: 4,41 μl nukleasefreies Wasser, 0,25 μl 25 μM Primer #1, 5 μl 2x PCR Master Mix und 0,09 μl 100x SYBR Green I.
Anmerkungen: Um 100x SYBR Green I zuzubereiten, verdünnen Sie die 10.000x Brühe mit nukleasefreiem Wasser. Da das Volumen von 100x SYBR Green I, das für die qPCR-Mastermischung verwendet wird, vernachlässigbar ist, ist es einfacher, eine zusätzliche Mastermischung aus verdünntem 100x SYBR Green I herzustellen (z. B. für 8-10 Proben). - Geben Sie 9,975 μl der qPCR-Mastermischung in jede Vertiefung einer qPCR-Platte.
- Geben Sie 0,25 μl 25 μM Primer #2 in jede Vertiefung.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie den gleichen Primer #2 hinzufügen, der mit dem übereinstimmt, was in Schritt 6.4 zu jeder spezifischen Probe hinzugefügt wurde. - 5 μl der PCR-Reaktion, die nach der PCR-Amplifikation in Schritt 6.5 erhalten wurde, werden hinzugefügt und durch Pipettieren gemischt.
HINWEIS: Die verbleibenden 45 μl der PCR-Reaktion werden für die zweite PCR-Amplifikation verwendet. - Führen Sie die qPCR gemäß den in Tabelle 5 angegebenen Zyklusbedingungen durch.
- Überprüfen Sie die Amplifikationskurven und ermitteln Sie die Anzahl der zusätzlich benötigten PCR-Zyklen, indem Sie die Anzahl der Zyklen schätzen, die ~35 % des Maximums erreicht haben (Abbildung 3A).
HINWEIS: In der Regel sind für 10.000 Zellkerne fünf bis acht zusätzliche PCR-Zyklen erforderlich.
8. Zusätzliche PCR-Amplifikation
- Führen Sie die PCR mit allen verbleibenden 45 μl der PCR-Reaktion gemäß den Berechnungen aus Schritt 7.6 (Tabelle 6) durch.
HINWEIS: Jede Probe kann eine unterschiedliche Anzahl von Amplifikationszyklen erfordern.
9. Zweite DNA-Aufreinigung mit dem PCR-Aufreinigungskit
- Verwenden Sie die gleichen Verfahren wie in Abschnitt 5, aber eluieren Sie die amplifizierten DNA-Fragmente mit 20 μl Puffer-EB.
10. Auswahl der Größe des DNA-Fragments
Anmerkungen: Verwenden Sie reversible Festphasen-Immobilisierungsperlen, wie unten beschrieben. Alle anderen ähnlichen DNA-Aufreinigungsperlen können gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet werden. Die SPRI-Wulstsuspension sollte vor der Verwendung bei RT mit Rotation vollständig resuspendiert und ausgeglichen werden.
- Übertragen Sie die eluierte DNA in ein neues PCR-Röhrchen und fügen Sie 80 μl Puffer-EB hinzu, um ein Endvolumen von 100 μl zu erhalten.
- Fügen Sie 55 μl SPRI-Kügelchen (0,55-faches Probenvolumen) hinzu und mischen Sie durch Pipettieren. 5 min bei RT inkubieren und dann 5 min lang auf einem Mini-Magnetständer für PCR-8-Röhrchenstreifen trennen.
- Übertragen Sie 150 μl des Überstands in ein neues PCR-Röhrchen. Fügen Sie 95 μl SPRI-Kügelchen hinzu und mischen Sie sie durch Pipettieren.
HINWEIS: Der Überstand enthält DNA von ca. 500 bp oder weniger. - Inkubieren Sie 5 Minuten lang bei RT und trennen Sie sich dann 5 Minuten lang auf dem Mini-Magnetständer. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
- Waschen Sie die Perlen 1 Minute lang mit 200 μl 70% EtOH. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal für insgesamt drei Wäschen.
Anmerkungen: Bewegen Sie PCR-Röhrchen während des Waschgangs nicht vom Magnetständer. - Schleudern Sie die Röhrchen nach dem letzten Waschgang 1 Minute lang bei 1.000 × g herunter und pipettieren Sie das restliche EtOH aus. Trocknen Sie das Pellet bei geöffnetem Deckel bei 37 °C für 2 min auf einer PCR-Maschine.
Anmerkungen: Die Perlenpellets sollten nach dem Trocknen nur einige kleinere Risse aufweisen. Vermeiden Sie ein übermäßiges Austrocknen. - Das Pellet wird durch Pipettieren mit 20 μl Puffer EB resuspendiert und 5 Minuten bei RT inkubiert. Trennen Sie es 5 Minuten lang auf dem Mini-Magnetständer und übertragen Sie dann 18 μl des Überstands, der die endgültige Bibliothek enthält, in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.
HINWEIS Die Bibliothek kann während einer Qualitätsprüfung bei −20 °C gelagert werden.
11. DNA-Quantifizierung mit einem Fluorometer
- Um die Mastermischung herzustellen, verdünnen Sie 200x dsDNA High Sensitivity (HS) Reagenz mit dsDNA HS Puffer auf eine Endkonzentration von 1x.
- Für Standards geben Sie 190 μl der 1x-Mastermischung und 10 μl Standard 1 oder Standard 2 in eine Fluorometerröhre.
HINWEIS: Gleichen Sie die Standards bei RT im Dunkeln aus, bevor Sie mit der Quantifizierung beginnen. - Für die Bibliotheksproben geben Sie 198 μl der 1x-Mastermischung und 2 μl jeder Probe in ein separates Fluorometerrohr.
Anmerkungen: Wenn die Probenmengen begrenzt sind, kann das Probenvolumen auf 1 μl reduziert und das 1x-Master-Mischungsvolumen auf 199 μl erhöht werden. - Wirbeln oder schütteln Sie die Fluorometerröhren und lassen Sie sie 5 Minuten lang bei RT im Dunkeln stehen. Messen Sie die DNA-Konzentration mit dem dsDNA HS-Assay des Fluorometers.
12. Qualitätsprüfung der Bibliothek durch hochempfindliche Elektrophoresesysteme
- Nehmen Sie die ATAC-seq-Bibliothek und verdünnen Sie sie mit nukleasefreiem Wasser bis zu einer Endkonzentration von 1-5 ng/μl.
- Analysieren Sie die Größenverteilung der ATAC-seq-Bibliotheken mit hochempfindlichen, automatisierten Elektrophoresesystemen gemäß den Protokollen des Herstellers.
13. Qualitätsprüfung der ATAC-seq-Bibliothek mittels gezielter qPCR
- Nehmen Sie 5-10 ng der ATAC-seq-Bibliothek und verdünnen Sie sie mit 50 μl nukleasefreiem Wasser.
- Führen Sie die qPCR mit Primern durch, die auf die Promotoren und Enhancer abzielen, von denen bekannt ist, dass sie in Adipozyten aktiv sind, entsprechend den in Tabelle 7 angegebenen Zyklusbedingungen.
- Verwenden Sie Negativkontrollprimer, die auf geschlossene/stille genomische Regionen abzielen (Tabelle 7).
- Berechnen Sie die Anreicherung des Promotors/Enhancers gegenüber den Negativkontrollen (Tabelle 8).
HINWEIS: Es wird eine ≥10-20-fache Anreicherung mit erfolgreichen Proben erwartet.
14. Sequenzierung
- Übermitteln Sie die ATAC-seq-Bibliotheken zur Sequenzierung. Verwenden Sie Paired-End-Sequenzierung (2 x 34 bp, 2 x 50 bp oder länger) mit durchschnittlichen Lesezahlen von 10 bis 30 Millionen Lesevorgängen pro Probe.
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Representative Results
Um Fettgewebe mit diesem ATAC-seq-Protokoll zu analysieren, haben wir Adipoq-NuTRAP-Mäuse generiert, die mit Chow-Diäten gefüttert wurden. Anschließend isolierten wir Adipozytenkerne aus epididymalem weißem Fettgewebe (eWAT), inguinalem weißem Fettgewebe (iWAT) und braunem Fettgewebe (BAT) mittels Durchflusszytometrie. Die isolierten Kerne wurden für die Tagmentierung verwendet, gefolgt von DNA-Aufreinigung, PCR-Amplifikation, Qualitätsprüfungsschritten, Sequenzierung und Datenanalyse, wie oben beschrieben. Das Ziel dieses repräsentativen Experiments war es, die Chromatinzugänglichkeit von reinen Adipozytenpopulationen, die aus verschiedenen Fettdepots isoliert wurden, zu profilieren.
Wir beobachteten, dass die mCherry-markierten und GFP-markierten Adipozytenkerne mittels Durchflusszytometrie deutlich von den Zellkernen anderer Zelltypen zu unterscheiden waren, die aus dem Fettgewebe einer Adipoq-NuTRAP-Maus isoliert wurden (Abbildung 2A-C). Je nach Art des Fettdepots gab es Unterschiede in den Adipozytenfraktionen: ~50 % bei eWAT, ~30 % bei iWAT und ~65 % bei BAT (Abbildung 2D)7. Wir sammelten 10.000 Kerne innerhalb von 2-10 min pro Probe und verwendeten sie für die ATAC-seq-Verfahren. Wir führten insgesamt 10-13 PCR-Zyklen durch (fünf Zyklen der ersten PCR und fünf bis acht Zyklen der zweiten PCR, Abbildung 3A). Wenn die Proben mehr als insgesamt 15 PCR-Zyklen erfordern, kann dies auf Proben von geringer Qualität hinweisen (Abbildung 3B). Die Größenverteilungsanalyse der ATAC-seq-Bibliotheken zeigte mehrere Peaks, die der nukleosomenfreien Region (NFR) und Mono-, Di- und Mehrkernosomen entsprechen (Abbildung 4A-C), mit durchschnittlichen Größen von ~500-800 bp. Proben von schlechter Qualität zeigten in der Regel überwiegend NFR ohne oder mit wenigen nukleosomalen Peaks (Abbildung 4D). Die Qualitätskontrolltests durch die qRT-PCR-Analyse zeigten eine 10-20-fache Anreicherung mit den positiven genomischen Elementen in der Nähe von Adipozyten-Markergenen wie Adipoq, Fabp4, Plin1 und Pnpla2, während bei der Negativkontrolle keine Anreicherung gezeigt wurde (Abbildung 5). Wir beobachteten auch eine Anreicherung mit dem thermogenen Gen Ucp1 spezifisch in BAT, aber nicht in eWAT oder iWAT (Abbildung 5).
Nach der Sequenzierung und Analyse identifizierten wir ~55.000 Peaks aus drei verschiedenen Fettdepots (eWAT, iWAT und BAT). Die mitochondrialen Reads betrugen <2 %, und der Anteil unter den Peaks betrug ~18 %-44 % (Abbildung 6A, B). Proben von schlechter Qualität können signifikant höhere Mitochondrien-Reads und/oder einen geringeren Anteil an Reads in den Peak-Regionen aufweisen. Die visuelle Inspektion der Spuren der ATAC-seq-Bibliothek ergab mehrere starke Peaks mit hohen Signal-Rausch-Verhältnissen in der Nähe von Adipozyten-Markergenen wie Adipoq, Plin1 und Fabp4 aus allen Fettdepots (Abbildung 7A-C). Wir beobachteten auch starke ATAC-seq-Peaks am Ucp1-Locus des braunen Adipozytenherstellers in der BAT-Probe, aber diese Peaks wurden in den eWAT- oder iWAT-Proben nicht beobachtet (Abbildung 7D). All diese Daten deuten auf erfolgreiche ATAC-seq-Daten hin, die aus Adipozytenkernen generiert wurden.
Abbildung 1: Schematisches Flussdiagramm von adipozytenspezifischem ATAC-seq unter Verwendung von NuTRAP-Mäusen. Die Schritte, die für dieses Protokoll einzigartig sind, sind in den rot schattierten Feldern hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentatives FACS-Gating, das die Isolierung von mCherry/GFP-markierten Adipozytenkernen aus dem Fettgewebe einer Adipoq-NuTRAP-Maus veranschaulicht. (A-C) Durchflusszytometrische Analyse isolierter Zellkerne aus eWAT, iWAT und BAT einer Adipoq-NuTRAP-Maus. (D) Quantitative Analyse von Zellkernen aus Adipozyten und Nicht-Adipozyten im eWAT, iWAT und BAT einer Adipoq-NuTRAP-Maus. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM (n = 3). Diese Daten zur Kernzählung stammen von Roh et al.7. Abkürzungen: FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung; GFP = grün fluoreszierendes Protein; eWAT = Nebenhoden weißes Fettgewebe; iWAT = inguinales weißes Fettgewebe; BVT = braunes Fettgewebe; NuTRAP = nukleäre Markierung und translatierende Ribosomenaffinitätsreinigung; Adipoq-NuTRAP = NuTRAP-Maus, gekreuzt mit Adipozyten-spezifischer Adiponectin-Cre-Linie; FSC-A = Vorwärts-Streu-Peak-Fläche; FSC-H = Vorwärtsstreu-Peak-Höhe; SSC-A = seitliche Streupeakfläche; FITC-A = Fluorescein-Isothiocyanat-Peak-Fläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative Amplifikationskurven der qRT-PCR . (A) Probe von guter Qualität, die sieben zusätzliche Amplifikationszyklen benötigt. (B) Probe von schlechter Qualität, die ≥15 zusätzliche Zyklen benötigt. Abkürzung: qRT-PCR = quantitative reverse transkription PCR. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Größenverteilungsprofile der ATAC-seq-Bibliotheken. (A-C) Qualitativ hochwertige und (D) minderwertige Bibliotheken werden als repräsentative Ergebnisse dargestellt. Abkürzungen: ATAC-seq = Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierung; FU = Fluoreszenzeinheiten; bp = Basenpaare; NFR = nukleosomenfreie Region; eWAT = Nebenhoden weißes Fettgewebe; iWAT = inguinales weißes Fettgewebe; BAT = braunes Fettgewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Qualitätskontrolle qPCR-Analyse der ATAC-seq-Bibliotheken. Anreicherungen für Promotoren und Enhancer in der Nähe der allgemeinen Adipozytenmarker Adipoq, Fabp4, Plin1 und Pnpla2 oder des braunen Adipozytenmarkers Ucp1. Abkürzungen: ATAC-seq = Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierung; NC = Negativkontrolle; eWAT = Nebenhoden weißes Fettgewebe; iWAT = inguinales weißes Fettgewebe; BAT = braunes Fettgewebe. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM (n = 2). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Mitochondrien-Reads und -Fraktionen unter den Peaks der ATAC-seq-Bibliotheken. (A) Mitochondrien-Ablesungen (%) und (B) Fraktionen unter den Peaks (%) aus eWAT, iWAT und BAT. Abkürzungen: ATAC-seq = Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierung; eWAT = Nebenhoden weißes Fettgewebe; iWAT = inguinales weißes Fettgewebe; BAT = braunes Fettgewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: ATAC-seq-Signalspuren an den Loci repräsentativer Gene. (A-C) Allgemeine Adipozyten-Markergene. (B) Brauner Adipozyten-spezifischer Marker. Abkürzungen: ATAC-seq = Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierung; eWAT = Nebenhoden weißes Fettgewebe; iWAT = inguinales weißes Fettgewebe; BAT = braunes Fettgewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Bestandteile der Tn5-Mastermischung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Komponenten der PCR-Mastermischung und anfängliche PCR-Zyklusbedingungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 3: Liste der Barcode-Primer für die PCR-Amplifikation. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 4: Bestandteile der qPCR-Mastermischung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 5: qPCR-Zyklusbedingungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 6: Zweite PCR-Zyklusbedingungen für zusätzliche Amplifikation. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 7: Primersequenzen und gezielte qPCR-Zyklusbedingungen für die Qualitätsprüfung der ATAC-seq-Bibliothek. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 8: Auswertung der qPCR-Ergebnisse für die Qualitätsprüfung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
In dieser Arbeit haben wir ein optimiertes ATAC-seq-Protokoll vorgestellt, um die adipozytenspezifische Chromatinzugänglichkeit in vivo zu untersuchen. Dieses ATAC-seq-Protokoll unter Verwendung der Adipoq-NuTRAP-Maus generierte erfolgreich adipozytenspezifische Chromatin-Zugänglichkeitsprofile. Der wichtigste Faktor für erfolgreiche und reproduzierbare ATAC-seq-Experimente ist die Kernqualität. Es ist wichtig, das präparierte Fettgewebe sofort in flüssigem Stickstoff einzufrieren und bis zur Verwendung sicher bei −80 °C ohne Auftauen zu lagern. Es ist auch wichtig, eine Schädigung des Adipozytenkerns während der Zellkernisolierung und -sortierung zu verhindern. Die Proben müssen während des gesamten Prozesses der Zellkernisolierung durch langsame Zentrifugation und minimales Pipettieren schonend gehandhabt werden.
Ein sorgfältiges Gating während der Zellkernsortierung ist entscheidend, um die mCherry/GFP-markierten Adipozytenkerne selektiv zu isolieren (Abbildung 1). Es ist wichtig, eine klare Trennung zwischen den mCherry/GFP-positiven und negativen Populationen zu gewährleisten. Ebenso sind schonende Handhabung und schnelle Sortierung notwendig, um die Beschaffenheit des Chromatins in den Zellkernen zu erhalten. Wenn die Fluoreszenz schwach ist, die Sortierung zu lange dauert und/oder die Adipozytenfraktionen außerhalb der erwarteten Bereiche liegen, deutet dies darauf hin, dass es Probleme mit den Proben oder Probleme während der Kernisolierung geben kann. Dieses Protokoll kann je nach Versuchssituation modifiziert werden. Erstens kann die Anzahl der Kerne, die für den ATAC-seq benötigt werden, auf 1.000 oder bis zu 100.000 sinken. Bei weniger als 5.000 Zellkernen würde die Verwendung eines weiter reduzierten Volumens (0,6 μl) des TDE I-Enzyms eine Übermarkierung verhindern. Bei einer Anzahl von Kernen größer oder gleich 50.000 kann das Volumen der Tn5-Mastermischung auf 50 μl verdoppelt werden, was dem gleichen Volumen entspricht, wie es im ursprünglichen Protokoll10 verwendet wurde.
Zweitens können andere Zellkernmarkierungssysteme, wie z. B. INTACT-Mäuse (Isolierung von Kernen, die in bestimmten Zelltypen markiert sind), anstelle von NuTRAP-Mäusen verwendet werden16. Da INTACT-Mäuse GFP-markiertes SUN1-Kernmembranprotein exprimieren, können GFP-markierte Kerne durch Sortierung isoliert und für ATAC-seq verwendet werden, wobei die gleichen Methoden verwendet werden, die in diesem Protokoll beschrieben sind. Alle anderen nuklearen Kennzeichnungsmethoden können ebenfalls übernommen werden. Schließlich können auch in vitro kultivierte Adipozyten für ATAC-seq nach diesem Protokoll verwendet werden. Dazu werden Zellen, die auf Schalen/Tellern gezüchtet wurden, mit NPB gesammelt und dann den gleichen nachgelagerten Verfahren unterzogen - mit der Ausnahme, dass die Sortierung nur auf der Grundlage von Größe, Komplexität und Hoechst erfolgen sollte, nicht nach mCherry/GFP, wie zuvor beschrieben15.
Dieses adipozytenspezifische ATAC-seq-Protokoll, das die NuTRAP-Technik verwendet, stellt eine Einschränkung dar, da es ohne Fluoreszenzmarkierung nicht funktioniert. Daher funktioniert die Analyse menschlicher Proben mit dieser Technik nicht. Es ist jedoch weiterhin möglich, ATAC-seq mit Adipozyten durchzuführen, die durch Gewebeverdauung und Flotationsmethoden isoliert wurden. Es ist zu beachten, dass die Arbeit mit humanen Floater-Adipozyten einige Einschränkungen aufweist, wie z. B. die Kontamination durch andere Zelltypen bei der Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und den Verlust großer Adipozyten bei der Zentrifugation mit höherer Geschwindigkeit. Dieses Protokoll kann auf jeden Zelltyp angewendet werden, für den spezifische Cre-Linien verfügbar sind, was eine effiziente zelltypspezifische Chromatinprofilierung auch bei begrenzten Zelleingaben ermöglicht17. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses verbesserte ATAC-seq-Protokoll für Forscher hilfreich sein wird, die zusätzlich zu den hier besprochenen Adipozyten die Chromatinzugänglichkeit von bestimmten Zelltypen in heterogenen Geweben ex vivo bewerten möchten.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine relevanten oder materiellen finanziellen Interessen im Zusammenhang mit der in diesem Artikel beschriebenen Forschung haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch den IUSM Showalter Research Trust Fund (an H.C.R.), ein Pilot- und Machbarkeitsstipendium des IUSM Center for Diabetes and Metabolic Diseases (an H.C.R.), das National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK129289 an H.C.R.) und den American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 an H.C.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio?5 |
References
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