Summary
Мы представляем протокол анализа транспозаз-доступного хроматина с высокопроизводительным секвенированием (ATAC-seq), в частности, на адипоцитах с использованием сортировки ядер с жировыми тканями, выделенными от трансгенных репортерных мышей с ядерной флуоресцентной маркировкой.
Abstract
Анализ на транспозаз-доступный хроматин с высокопроизводительным секвенированием (ATAC-seq) — это надежный метод, который позволяет профилировать доступность хроматина в масштабах всего генома. Этот метод был полезен для понимания регуляторных механизмов экспрессии генов в ряде биологических процессов. Несмотря на то, что ATAC-seq был модифицирован для различных типов образцов, эффективных модификаций методов ATAC-seq для жировых тканей не было. Проблемы с жировыми тканями включают сложную клеточную гетерогенность, большое содержание липидов и высокое загрязнение митохондрий. Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали протокол, который позволяет адипоцит-специфическому ATAC-seq с использованием флуоресцентно-активированной сортировки ядра жировыми тканями трансгенной репортерной мыши Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). Этот протокол позволяет получать высококачественные данные с минимальными потерями при чтении секвенирования при одновременном уменьшении количества входных данных ядра и реагентов. В этой статье приведены подробные пошаговые инструкции по методу ATAC-seq, валидированному для использования ядер адипоцитов, выделенных из жировых тканей мышей. Этот протокол поможет в исследовании динамики хроматина в адипоцитах при различных биологических стимуляциях, что позволит получить новые биологические идеи.
Introduction
Жировая ткань, которая специализируется на хранении избыточной энергии в виде липидных молекул, является ключевым органом для регуляции обмена веществ. Строгий контроль образования и поддержания адипоцитов жизненно важен для функции жировой ткани и энергетического гомеостаза всего организма1. Многие транскрипционные регуляторы играют решающую роль в контроле дифференцировки, пластичности и функции адипоцитов; Некоторые из этих регуляторов участвуют в метаболических нарушениях у людей 2,3. Последние достижения в области высокопроизводительных методов секвенирования экспрессии генов и эпигеномного анализа еще больше облегчили открытие молекулярных регуляторов биологии адипоцитов4. Исследования молекулярного профилирования с использованием жировых тканей сложно проводить из-за гетерогенности этих тканей. Жировая ткань состоит в основном из адипоцитов, которые отвечают за накопление жира, но также содержит различные другие типы клеток, такие как фибробласты, эндотелиальные клетки и иммунные клетки5. Кроме того, клеточный состав жировой ткани резко изменяется в ответ на патофизиологические изменения, такие как температура и состояние питания6. Чтобы преодолеть эти проблемы, мы ранее разработали трансгенную мышь-репортер, названную Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), которая продуцирует RFP-меченные GFP рибосомы и биотинилированные ядра, меченные mCherry, Cre-рекомбиназ-зависимым образом7. Система двойного мечения позволяет проводить специфический для типа клеток транскриптомный и эпигеномный анализ тканей. Используя мышей NuTRAP, скрещенных с адипоцит-специфическими линиями адипонектина-Cre (Adipoq-NuTRAP), мы ранее охарактеризовали профили экспрессии генов и состояния хроматина из чистых популяций адипоцитов in vivo и определили, как они изменяются при ожирении 7,8. Ранее скрещивание мышей NuTRAP с коричневыми и бежевыми адипоцитарно-специфическими линиями Ucp1-Cre (Ucp1-NuTRAP) позволило охарактеризовать эпигеномное ремоделирование редкой термогенной популяции адипоцитов, бежевых адипоцитов, в ответ на изменения температуры9.
ATAC-seq является широко используемым аналитическим методом для оценки доступности хроматина в масштабах всего генома. Гиперреактивная транспозаза Tn5, используемая в ATAC-seq, позволяет идентифицировать открытые области хроматина путем маркировки адаптеров секвенирования в доступной для хроматина области ядер10. ATAC-seq — это простой метод, но он обеспечивает надежные результаты и высокую эффективность даже при использовании образцов с низким вводом. Таким образом, он стал одним из самых популярных методов эпигеномного профилирования и способствовал пониманию регуляторных механизмов экспрессии генов в различных биологических контекстах. С тех пор, как был создан оригинальный протокол ATAC-seq, были доработаны различные методы, производные от ATAC-seq, для модификации и оптимизации протокола для различных типов образцов. Например, Fast-ATAC предназначен для анализа образцовклеток крови 11, Omni-ATAC является оптимизированным протоколом для замороженных образцовтканей 12, а MiniATAC-seq эффективен для анализа эмбрионов на ранних стадиях13. Тем не менее, применение метода ATAC-seq к адипоцитам, особенно из образцов тканей, по-прежнему является сложной задачей. В дополнение к гетерогенности жировой ткани, ее высокое содержание липидов может мешать эффективным рекомбинационным реакциям транспозазы Tn5 даже после выделения ядра. Кроме того, высокое содержание митохондрий в адипоцитах, особенно в коричневых и бежевых адипоцитах, вызывает высокое загрязнение митохондриальной ДНК и нерациональное чтение секвенирования. В этой статье описывается протокол для специфического для адипоцитов ATAC-seq с использованием мышей Adipoq-NuTRAP (рис. 1). Используя преимущества сортировки ядер, меченных флуоресценцией, этот протокол позволяет собирать чистые популяции ядер адипоцитов вдали от других смешанных типов клеток и эффективно удалять липиды, митохондрии и тканевый мусор. Следовательно, этот протокол может генерировать высококачественные данные для конкретных типов клеток и минимизировать отходы от митохондриальных считываний, используя при этом меньшее количество входных данных и реагентов по сравнению со стандартным протоколом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Уход за животными и эксперименты проводились в соответствии с процедурами, утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинской школы Университета Индианы.
1. Подготовка к началу эксперимента
- Подготовка тканей
- Для мечения ядра адипоцитов скрещивайте мышей NuTRAP со специфическими для адипоцитов линиями адипонектина-Cre (Adipoq-Cre) для получения мышей Adipoq-NuTRAP, которые являются гемизиготными как для Adipoq-Cre, так и для NuTRAP.
- Препарируйте интересующие жировые ткани мышей Adipoq-NuTRAP, как описано ранее14.
- Заморозьте ткани в жидком азоте и храните их при температуре -80 °C до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая жировая прокладка может храниться целиком, а замороженные ткани могут быть позже разрезаны на сухом льду на более мелкие кусочки (~ 50 мг) для экспериментов. В качестве альтернативы, жировые ткани могут быть разрезаны, алицитированы и заморожены в пробирках для хранения (~ 50 мг на пробирку). Замороженные образцы никогда не размораживаются после замораживания до использования.
- Подготовка буфера
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите буферы на льду на протяжении всего эксперимента.- Приготовьте буфер для подготовки ядра (NPB): 250 мМ сахарозы, 10 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2 и 0,1% NP40. Приготовьте 7 мл NPB на образец. Перед использованием добавьте в NPB свежий коктейль ингибитора протеазы 100x (последний 1x), DTT (конечный 1 мМ) и Hoechst (конечный 1 мкг / мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется готовить свежий NPB, но его можно хранить при температуре 4 ° C до 1 месяца. - Приготовьте 1x фосфатно-буферный физиологический раствор с 0,1% NP-40 (PBS-N).
- Приготовьте буфер для подготовки ядра (NPB): 250 мМ сахарозы, 10 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2 и 0,1% NP40. Приготовьте 7 мл NPB на образец. Перед использованием добавьте в NPB свежий коктейль ингибитора протеазы 100x (последний 1x), DTT (конечный 1 мМ) и Hoechst (конечный 1 мкг / мл).
2. Изоляция ядра
- Гомогенизаторы Dounce для охлаждения, по одному стакану Dounce на образец, на льду. Затем добавьте 7 мл смеси NPB в каждый стакан Dounce.
ПРИМЕЧАНИЕ: В каждом эксперименте рекомендуется использовать до восьми образцов. Работа с более чем восемью образцами значительно задержит все этапы, и это может особенно ухудшить качество ядра во время сортировки. - Положите замороженную жировую ткань (50-100 мг) в стакан Dounce и сразу же разрежьте его на несколько более мелких кусочков с помощью длинных ножниц. Погладьте 10 раз рыхлым пестиком для всех образцов, а затем 10 раз тугим пестиком.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жировые ткани мягкие, поэтому достаточно разрезать их на несколько небольших кусочков. Для редких образцов можно использовать более мелкие кусочки (10-20 мг), хотя количество собранных ядер адипоцитов может варьироваться. - Отфильтруйте через сетчатый фильтр 100 мкм в новую пробирку объемом 50 мл. Перелейте отфильтрованные гомогенаты в новую пробирку объемом 15 мл. Отжим при 200 × г в течение 10 мин при 4 °C в центрифуге с поворотным ведром. Удалите надосадочную жидкость настолько, насколько это возможно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала аспирируйте с помощью пылесоса, а затем удалите оставшийся объем с помощью микропипетки. - Ресуспендируйте гранулу в 500 мкл PBS-N легким, но тщательным постукиванием пальцами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пипетки, так как это может повредить ядра. - Отфильтруйте через сетчатое фильтр 40 мкм в новую пробирку объемом 50 мл с помощью щадящего пипетирования. Промойте сетчатый фильтр 250 мкл PBS-N. Перенесите отфильтрованную ядерную ресуспендию в пробирку для сортировки клеток, активируемой флуоресценцией (FACS), с помощью микропипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии пробирки и сетчатые фильтры можно использовать для небольших объемов, чтобы свести к минимуму потери образца.
3. Сортировка ядра
- Подготовка сборной пробирки
- Добавьте 500 мкл PBS-N в новые пробирки объемом 1,5 мл и несколько раз переверните, чтобы смочить все внутренние поверхности буфером.
- Коротко раскрутите трубки, чтобы сбить всю жидкость, а затем охладите их на льду до сортировки.
- СУИМ (рис. 2)
- Используйте стробирование FSC-A/FSC-H для синглетов и FSC-A/SSC-A для удаления мелкого или крупного мусора.
- Ворота для популяции ядра адипоцитов mCherry/GFP.
- Соберите по 10 000 ядер в каждую из пробирок для сбора, приготовленных на шаге 3.1.
- Подготовка ядра после сортировки
- Добавьте 500 мкл PBS-N в каждую сборную пробирку и несколько раз перемешайте.
- Отжимают сборные пробирки при 200 × г в течение 10 мин при 4 °С в центрифуге с поворотным ведром. Полностью удалите надосадочную жидкость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала используйте пылесос, чтобы удалить пузырьки, слейте надосадочную жидкость и используйте бумажные салфетки, чтобы полностью удалить оставшуюся жидкость. В этот момент гранула невидима. Приготовьте основную смесь Tn5 на этапе центрифугирования, как описано ниже.
4. Тагментация Tn5 (таблица 1)
- Чтобы приготовить 25 мкл основной смеси Tn5, смешайте 12,5 мкл 2-кратного буфера ДНК с тагментацией (буфер TD), 1,25 мкл транспозазы Tn5 (фермент TDE I) и 11,25 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
- Добавьте 25 мкл основной смеси Tn5 к каждой грануле ядра и ресуспендируйте путем осторожного пипетирования. Инкубировать при 600 об/мин в течение 30 мин при 37 °C с помощью термомиксера.
5. Очистка ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ: В следующей процедуре используется набор для очистки ПЦР, указанный в таблице материалов. Можно использовать любые другие подобные методы очистки ДНК.
- Добавьте 25 мкл безнуклеазной воды к 25 мкл смеси ресуспензии ядер Tn5, полученной после стадии 4.2. Конечный объем составляет 50 мкл на образец.
- Добавьте 250 мкл буферного PB.
- Добавьте 5 мкл 3 М ацетата натрия (NaOAc) (рН 5,2).
- Переложите смесь в колонку (поставляется с указанным набором) и центрифугу при 17 900 × г в течение 1 мин при комнатной температуре (RT).
- Откажитесь от проточной части и поместите спиновую колонну обратно в ту же сборную трубу. Добавьте 750 мкл буферного полиэтилена, содержащего абсолютный этанол (EtOH), и центрифугу при 17 900 × г в течение 1 мин при RT.
- Откажитесь от проточной части и поместите спиновую колонну обратно в ту же сборную трубку. Центрифугу при 17 900 × г в течение 1 мин при ЛТ и выбросьте сборную пробирку с проточным отверстием.
- Чтобы разбавить фрагменты ДНК, оборудуйте колонку новой пробиркой объемом 1,5 мл, добавьте 10 мкл буфера EB и оставьте в режиме RT на 3 мин. Центрифуга при 17 900 × г в течение 1 мин при ЛТ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить при температуре 4 °C в течение нескольких дней или при температуре -20 °C в течение нескольких недель.
6. ПЦР-амплификация (табл. 2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Праймеры, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице 3.
- Для амплификации транспонированных фрагментов ДНК приготовьте мастер-смесь для ПЦР без добавления уникального праймера штрих-кодирования Ad2.n (праймер #2). Используйте 38 мкл основной смеси для ПЦР на образец: 11 мкл воды, не содержащей нуклеазы, 2 мкл праймера Ad1_noMX 25 мкМ (праймер #1) и 25 мкл 2x мастер-смеси для ПЦР.
- Добавьте 38 мкл основной смеси для ПЦР в пробирку для ПЦР объемом 0,2 мл.
- Добавьте 10 мкл элюированных фрагментов ДНК из шага 5.7.
- Добавьте 2 мкл 25 мкМ праймера #2, который должен быть специфичным для каждого образца.
- Запустите ПЦР в соответствии с условиями циклирования, указанными в таблице 2.
7. Количественный ПЦР-тест в реальном времени (кПЦР) (таблица 4)
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг направлен на определение дополнительных циклов, необходимых для амплификации ДНК. Это необязательно, но настоятельно рекомендуется, особенно для новых экспериментов.
- Приготовьте мастер-смесь для кПЦР без добавления праймера #2. Используйте 9,975 мкл основной смеси для кПЦР на образец: 4,41 мкл воды, не содержащей нуклеаз, 0,25 мкл 25 мкМ праймера #1, 5 мкл 2x PCR Master Mix и 0,09 мкл 100x SYBR Green I.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы приготовить 100x SYBR Green I, разбавьте 10 000x бульон водой, не содержащей нуклеаз. Поскольку объем 100x SYBR Green I, используемый для мастер-смеси qPCR, незначителен, легче сделать дополнительную мастер-смесь из разбавленной 100x SYBR Green I (например, для 8-10 образцов). - Добавьте 9,975 мкл основной смеси для кПЦР в каждую лунку планшета для кПЦР.
- Добавьте 0,25 мкл грунтовки #2 25 мкМ в каждую лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно добавьте один и тот же праймер #2, чтобы он соответствовал тому, что было добавлено к каждому конкретному образцу на шаге 6.4. - Добавьте 5 мкл реакции ПЦР, полученной после амплификации ПЦР на этапе 6,5, и перемешайте пипеткой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшиеся 45 мкл реакции ПЦР будут использованы для второй амплификации ПЦР. - Запустите кПЦР в соответствии с условиями циклирования, указанными в таблице 5.
- Проверьте кривые амплификации и определите количество необходимых дополнительных циклов ПЦР, оценив количество циклов, достигших ~ 35% от максимума (рис. 3A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, для 10 000 ядер требуется от пяти до восьми дополнительных циклов ПЦР.
8. Дополнительная ПЦР-амплификация
- Запустите ПЦР, используя все оставшиеся 45 мкл реакции ПЦР в соответствии с расчетами из шага 7.6 (таблица 6).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого образца может потребоваться разное количество циклов усиления.
9. Вторая очистка ДНК с использованием набора для очистки ПЦР
- Используйте те же процедуры, что и в разделе 5, но разбавьте амплифицированные фрагменты ДНК 20 мкл буфера EB.
10. Выбор размера фрагмента ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте твердофазные обратимые иммобилизующие шарики, как описано ниже. Любые другие подобные шарики для очистки ДНК можно использовать в соответствии с инструкциями производителя. Перед использованием суспензия шарика SPRI должна быть полностью ресуспендирована и уравновешена при RT с вращением.
- Перенесите элюированную ДНК в новую пробирку для ПЦР и добавьте 80 мкл буферного ЭБ, чтобы получить окончательный объем 100 мкл.
- Добавьте 55 мкл шариков SPRI (0,55x объем образца) и перемешайте пипеткой. Инкубировать в течение 5 мин при ЛТ, а затем отделить на мини-магнитной подставке для ПЦР 8-пробирочные полоски в течение 5 мин.
- Перенесите 150 мкл надосадочной жидкости в новую ПЦР-пробирку. Добавьте 95 мкл шариков SPRI и перемешайте пипеткой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Надосадочная жидкость содержит ДНК примерно 500.н. или меньше. - Инкубируйте в течение 5 минут при RT, а затем отделите на мини-магнитной подставке в течение 5 минут. Тщательно выбросьте надосадочную жидкость.
- Промойте шарики в течение 1 минуты с 200 мкл 70% EtOH. Повторите два раза в общей сложности три стирки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не перемещайте пробирки для ПЦР с магнитной подставки во время стирки. - После окончательной промывки открутите пробирки при дозе 1000 × г в течение 1 минуты и удалите оставшийся EtOH. Высушите гранулы с открытой крышкой при температуре 37 °C в течение 2 минут на ПЦР-машине.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы бисера должны иметь только некоторые незначительные трещины после высыхания. Избегайте пересушивания. - Ресуспендируют гранулу с 20 мкл буферного ЭБ путем пипетки и инкубируют в течение 5 мин при ЛТ. Отделите на мини-магнитной подставке в течение 5 минут, а затем перенесите 18 мкл надосадочной жидкости, содержащей конечную библиотеку, в новую пробирку объемом 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Библиотека может храниться при температуре -20 °C при выполнении проверки качества.
11. Количественное определение ДНК с помощью флуорометра
- Чтобы приготовить основную смесь, разбавьте 200-кратный высокочувствительный реагент дцДНК (HS) буфером dsDNA HS до конечной концентрации 1x.
- Для стандартов добавьте 190 мкл 1x основной смеси и 10 мкл стандарта 1 или стандарта 2 в трубку флуорометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Уравновесьте стандарты в RT в темноте, прежде чем начинать количественную оценку. - Для библиотечных образцов добавьте 198 мкл 1x основной смеси и 2 мкл каждого образца в отдельную пробирку флуорометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если количество образца ограничено, объем образца может быть уменьшен до 1 мкл, а объем 1x основной смеси может быть увеличен до 199 мкл. - Встряхните или встряхните трубки флуорометра и оставьте их на 5 минут при RT в темноте. Измерьте концентрацию ДНК с помощью анализа dsDNA HS флуорометра.
12. Проверка качества библиотеки высокочувствительными системами электрофореза
- Возьмите библиотеку ATAC-seq и разбавьте водой, не содержащей нуклеаз, до конечной концентрации 1-5 нг/мкл.
- Проанализируйте распределение библиотек ATAC-seq по размерам с помощью высокочувствительных автоматизированных систем электрофореза в соответствии с протоколами производителя.
13. Проверка качества библиотеки ATAC-seq с помощью таргетной кПЦР
- Возьмите 5-10 нг библиотеки ATAC-seq и разбавьте 50 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
- Запустите кПЦР с использованием праймеров, нацеленных на промоторы и энхансеры, которые, как известно, активны в адипоцитах, в соответствии с условиями цикла, указанными в таблице 7.
- Используйте отрицательные контрольные праймеры, нацеленные на закрытые/молчаливые области генома (таблица 7).
- Рассчитайте обогащение промотора/энхансеров по сравнению с отрицательным контролем (таблица 8).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается ≥10-20-кратное обогащение с успешными образцами.
14. Последовательность действий
- Отправьте библиотеки ATAC-seq для виртуализации. Используйте парное секвенирование (2 x 34.н., 2 x 50.н. или более) со средним числом считываний 10–30 миллионов чтений на выборку.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для анализа жировой ткани с использованием этого протокола ATAC-seq мы создали мышей Adipoq-NuTRAP, которых кормили диетами чау-чау; Затем мы выделили ядра адипоцитов из белой жировой ткани придатка яичка (eWAT), паховой белой жировой ткани (iWAT) и коричневой жировой ткани (BAT) с помощью проточной цитометрии. Выделенные ядра использовали для тагментации с последующей очисткой ДНК, амплификацией ПЦР, этапами проверки качества, секвенированием и анализом данных, как описано выше. Цель этого репрезентативного эксперимента состояла в том, чтобы профилировать доступность хроматина чистых популяций адипоцитов, выделенных из разных жировых депо.
Мы наблюдали, что ядра адипоцитов, меченные mCherry и GFP, были четко отличимы от ядер других типов клеток, выделенных из жировых тканей мыши Adipoq-NuTRAP с помощью проточной цитометрии (рис. 2A-C). Выявлены различия во фракциях адипоцитов в зависимости от типа жирового депо: ~50% в eWAT, ~30% в iWAT и ~65% в BAT (рис. 2D)7. Мы собрали 10 000 ядер в течение 2-10 минут на образец и использовали их для процедур ATAC-seq. Мы провели в общей сложности 10-13 циклов ПЦР (пять циклов первой ПЦР и пять-восемь циклов второй ПЦР, рис. 3А). Если для образцов требуется более 15 циклов ПЦР, это может указывать на низкое качество образцов (рис. 3B). Анализ распределения по размерам библиотек ATAC-seq показал множественные пики, соответствующие безнуклеосомной области (NFR) и моно-, ди- и многонуклеосомам (рис. 4A-C) со средними размерами ~ 500-800.н. Образцы низкого качества обычно показывали в основном NFR без нуклеосомных пиков или с небольшим количеством (рис. 4D). Тесты проверки качества с помощью анализа qRT-PCR показали 10-20-кратное обогащение положительными геномными элементами вблизи генов-маркеров адипоцитов, таких как Adipoq, Fabp4, Plin1 и Pnpla2, в то время как при отрицательном контроле обогащение не было показано (рис. 5). Мы также наблюдали обогащение термогенным геном Ucp1, специфично для BAT, но не для eWAT или iWAT (рис. 5).
После секвенирования и анализа мы идентифицировали ~ 55 000 пиков в сочетании с тремя различными жировыми депо (eWAT, iWAT и BAT). Показания митохондрий составляли <2%, а доля под пиками составляла ~ 18% -44% (рис. 6A, B). Образцы низкого качества могут иметь значительно более высокие показания митохондрий и/или меньшую долю считываний в пиковых областях. Визуальный осмотр треков библиотеки ATAC-seq выявил несколько сильных пиков с высоким отношением сигнал/шум вблизи генов-маркеров адипоцитов, таких как Adipoq, Plin1 и Fabp4, из всех жировых депо (рис. 7A-C). Мы также наблюдали сильные пики ATAC-seq в локусе Ucp1 производителя коричневых адипоцитов в образце BAT, но эти пики не наблюдались в образцах eWAT или iWAT (рис. 7D). Все эти данные указывают на успешные данные ATAC-seq, полученные из ядер адипоцитов.
Рисунок 1: Схематическая блок-схема специфического для адипоцитов ATAC-seq с использованием мышей NuTRAP. Шаги, уникальные для этого протокола, выделены красными затененными полями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативное стробирование FACS, иллюстрирующее выделение ядер адипоцитов, меченных mCherry/GFP, из жировых тканей мыши Adipoq-NuTRAP. (А-С) Проточный цитометрический анализ изолированных ядер из eWAT, iWAT и BAT мыши Adipoq-NuTRAP. (D) Количественный анализ ядер адипоцитов и неадипоцитов в eWAT, iWAT и BAT мыши Adipoq-NuTRAP. Данные являются средними ± SEM (n = 3). Эти данные о количестве ядер взяты из Roh et al.7. Сокращения: FACS = сортировка клеток, активируемая флуоресценцией; GFP = зеленый флуоресцентный белок; eWAT = белая жировая ткань придатка яичка; iWAT = паховая белая жировая ткань; BAT = бурая жировая ткань; NuTRAP = ядерная маркировка и трансляция очистки аффинности рибосом; Adipoq-NuTRAP = мышь NuTRAP, скрещенная со специфической для адипоцитов линией адипонектин-Cre; FSC-A = площадь пика прямого рассеяния; FSC-H = высота пика прямого рассеяния; SSC-A = площадь пика бокового рассеяния; FITC-A = площадь пика изотиоцианата флуоресцеина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные кривые амплификации по данным qRT-PCR . (A) Образец хорошего качества, требующий семи дополнительных циклов амплификации. (B) Образец низкого качества, требующий ≥15 дополнительных циклов. Аббревиатура: qRT-PCR = количественная ПЦР с обратной транскрипцией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Профили распределения по размерам библиотек ATAC-seq. (A-C) Хорошие и (D) некачественные библиотеки показаны в качестве репрезентативных результатов. Сокращения: ATAC-seq = анализ транспозаза-доступного хроматина с высокопроизводительным секвенированием; FU = единицы флуоресценции; bp = пары оснований; NFR = область, свободная от нуклеосом; eWAT = белая жировая ткань придатка яичка; iWAT = паховая белая жировая ткань; BAT = бурая жировая ткань. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Контроль качества qPCR-анализ библиотек ATAC-seq. Обогащение промоторами и энхансерами рядом с общими маркерами адипоцитов Adipoq, Fabp4, Plin1 и Pnpla2 или коричневым маркером адипоцитов Ucp1. Сокращения: ATAC-seq = анализ транспозаза-доступного хроматина с высокопроизводительным секвенированием; NC = отрицательный контроль; eWAT = белая жировая ткань придатка яичка; iWAT = паховая белая жировая ткань; BAT = бурая жировая ткань. Данные являются средними ± SEM (n = 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Митохондрии считывают и дроби под пиками библиотек ATAC-seq. (A) Митохондрии считывают (%) и (B) фракции под пиками (%) из eWAT, iWAT и BAT. Сокращения: ATAC-seq = анализ транспозаза-доступного хроматина с высокопроизводительным секвенированием; eWAT = белая жировая ткань придатка яичка; iWAT = паховая белая жировая ткань; BAT = бурая жировая ткань. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Сигнальные треки ATAC-seq в локусах репрезентативных генов. (А-С) Общие гены-маркеры адипоцитов. (B) Коричневый маркер, специфичный для адипоцитов. Сокращения: ATAC-seq = анализ транспозаза-доступного хроматина с высокопроизводительным секвенированием; eWAT = белая жировая ткань придатка яичка; iWAT = паховая белая жировая ткань; BAT = бурая жировая ткань. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Компоненты основной смеси Tn5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Компоненты мастер-смеси ПЦР и исходные условия цикла ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 3: Список праймеров со штрих-кодом для ПЦР-амплификации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 4: Компоненты мастер-смеси для кПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 5: Условия цикла кПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 6: Условия второго цикла ПЦР для дополнительной амплификации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 7: Последовательности праймеров и целевые циклические условия кПЦР для проверки качества библиотеки ATAC-seq. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 8: Анализ результатов кПЦР для проверки качества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье мы представили оптимизированный протокол ATAC-seq для оценки доступности специфического хроматина для адипоцитов in vivo. Этот протокол ATAC-seq с использованием мыши Adipoq-NuTRAP успешно сгенерировал профили доступности хроматина, специфичные для адипоцитов. Наиболее важным фактором для успешных и воспроизводимых экспериментов ATAC-seq является качество ядра. Крайне важно немедленно заморозить рассеченные жировые ткани в жидком азоте и безопасно хранить их при температуре -80 °C, не размораживая до использования. Также важно предотвратить повреждение ядра адипоцитов во время выделения и сортировки ядра. Образцы должны обрабатываться осторожно с помощью низкоскоростного центрифугирования и минимального пипетирования в течение всего процесса выделения ядер.
Тщательное стробирование во время сортировки ядер имеет решающее значение для селективной изоляции ядер адипоцитов, меченных mCherry/GFP (рис. 1). Важно обеспечить четкое разделение между mCherry/GFP-положительными и отрицательными популяциями. Точно так же бережное обращение и быстрая сортировка необходимы для сохранения природы хроматина в ядрах. Если флуоресценция слабая, сортировка занимает слишком много времени и/или фракции адипоцитов выходят за пределы ожидаемых диапазонов, это указывает на то, что могут возникнуть проблемы с образцами или проблемы во время процедур выделения ядер. Этот протокол может быть изменен в зависимости от экспериментальных обстоятельств. Во-первых, количество ядер, необходимых для ATAC-seq, может уменьшиться до 1000 или до 100 000. Если ядер менее 5000, использование дополнительного уменьшенного объема (0,6 мкл) фермента TDE I предотвратит чрезмерное тагирование. Для чисел ядер, равных или превышающих 50 000, объем основной смеси Tn5 может быть удвоен до 50 мкл, что является тем же объемом, который используется в исходном протоколе10.
Во-вторых, вместо мышей NuTRAP16 можно использовать другие системы мечения ядер, такие как мыши INTACT (выделение ядер, помеченных определенными типами клеток). Поскольку мыши INTACT экспрессируют GFP-меченный белок ядерной мембраны SUN1, ядра, меченные GFP, могут быть выделены путем сортировки и использованы для ATAC-seq с использованием тех же методов, описанных в этом протоколе. Любые другие методы ядерной маркировки также могут быть приняты. Наконец, адипоциты, культивируемые in vitro, также могут быть использованы для ATAC-seq в соответствии с этим протоколом. Для этого клетки, выращенные на тарелках/тарелках, соскабливают, собирают с использованием NPB, а затем подвергают тем же последующим процедурам, за исключением того, что сортировка должна производиться только на основе размера, сложности и Hoechst, а не mCherry/GFP, как описано ранее15.
Этот специфический для адипоцитов протокол ATAC-seq с использованием метода NuTRAP представляет собой ограничение, поскольку он не работает без флуоресцентной маркировки; Таким образом, анализ человеческих образцов не будет работать с этой техникой. Тем не менее, все еще возможно проводить ATAC-seq с адипоцитами, выделенными методами тканевого переваривания и флотации. Следует отметить, что работа с плавающими адипоцитами человека имеет некоторые ограничения, такие как контаминация другими типами клеток при использовании низкоскоростного центрифугирования и потеря крупных адипоцитов при использовании более скоростного центрифугирования. Этот протокол может быть применен к любому типу клеток, для которого доступны конкретные линии Cre, что позволяет эффективно профилировать хроматин, специфичный для конкретного типа клеток, даже при ограниченном количестве входовклеток 17. В заключение, этот улучшенный протокол ATAC-seq будет полезен исследователям, желающим оценить доступность хроматина из определенных типов клеток в гетерогенных тканях ex vivo, в дополнение к адипоцитам, которые мы обсуждали здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет соответствующих или существенных финансовых интересов, связанных с исследованием, описанным в этой статье.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Исследовательским целевым фондом IUSM Showalter (H.C.R.), пилотным и технико-экономическим грантом Центра диабета и метаболических заболеваний IUSM (H.C.R.), Национальным институтом диабета, болезней органов пищеварения и почек (R01DK129289 для H.C.R.) и премией младших преподавателей Американской диабетической ассоциации (7-21-JDF-056 для H.C.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio?5 |
References
- Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
- Farmer, S. R.
- Bielczyk-Maczynska, E. White adipocyte plasticity in physiology and disease. Cells. 8 (12), 1507 (2019).
- Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies. Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).
- Esteve Rafols, M. Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity. Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).
- Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications. Experimental and Molecular Medicine. 48, e215 (2016).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Roh, H. C., et al. Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPARγ activity and elevated TGFβ-SMAD signaling. Molecular Metabolism. 42, 101086 (2020).
- Roh, H. C., et al. Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity. Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).
- Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Wu, J., et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA. Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- So, J., et al. Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility. Molecular Metabolism. 66, 101619 (2022).
- Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing. STAR Protocols. 2 (3), 100805 (2021).
- Heyward, F. D., et al. Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin's hunger-suppressing effects. bioRxiv. , (2022).
