Summary
We presenteren een protocol voor assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing (ATAC-seq) specifiek op adipocyten met behulp van kernsortering met vetweefsels geïsoleerd uit transgene reportermuizen met nucleaire fluorescentielabeling.
Abstract
Assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is een robuuste techniek die genoombrede chromatinetoegankelijkheidsprofilering mogelijk maakt. Deze techniek is nuttig geweest voor het begrijpen van de regulerende mechanismen van genexpressie in een reeks biologische processen. Hoewel ATAC-seq is aangepast voor verschillende soorten monsters, zijn er geen effectieve wijzigingen geweest van ATAC-seq-methoden voor vetweefsels. Uitdagingen met vetweefsels zijn de complexe cellulaire heterogeniteit, het grote lipidegehalte en de hoge mitochondriale besmetting. Om deze problemen op te lossen, hebben we een protocol ontwikkeld dat adipocyt-specifieke ATAC-seq mogelijk maakt door gebruik te maken van fluorescentie-geactiveerde kernsortering met vetweefsels van de transgene reporter Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) muis. Dit protocol produceert gegevens van hoge kwaliteit met minimale verspilde sequencing-reads, terwijl de hoeveelheid nucleusinvoer en reagentia wordt verminderd. Dit artikel bevat gedetailleerde stapsgewijze instructies voor de ATAC-seq-methode die is gevalideerd voor het gebruik van adipocytkernen geïsoleerd uit vetweefsel van muizen. Dit protocol zal helpen bij het onderzoek naar chromatinedynamica in adipocyten op verschillende biologische stimulaties, wat nieuwe biologische inzichten mogelijk zal maken.
Introduction
Vetweefsel, dat gespecialiseerd is voor het opslaan van overtollige energie in de vorm van lipidemoleculen, is een belangrijk orgaan voor metabole regulatie. De strikte controle van de vorming en het onderhoud van adipocyten is van vitaal belang voor de vetweefselfunctie en de energiehomeostase van het hele lichaam1. Veel transcriptionele regulatoren spelen een cruciale rol bij de controle van adipocytendifferentiatie, plasticiteit en functie; Sommige van deze regulatoren zijn betrokken bij metabole stoornissen bij de mens 2,3. Recente ontwikkelingen in high-throughput sequencingtechnieken voor genexpressie en epigenomische analyse hebben de ontdekking van de moleculaire regulatoren van adipocytenbiologie verder vergemakkelijkt4. Moleculaire profileringsstudies met behulp van vetweefsels zijn een uitdaging om uit te voeren vanwege de heterogeniteit van deze weefsels. Vetweefsel bestaat voornamelijk uit adipocyten, die verantwoordelijk zijn voor vetopslag, maar bevat ook verschillende andere celtypen, zoals fibroblasten, endotheelcellen en immuuncellen5. Bovendien is de cellulaire samenstelling van vetweefsel dramatisch veranderd als reactie op pathofysiologische veranderingen zoals temperatuur en voedingsstatus6. Om deze problemen te overwinnen, hebben we eerder een transgene reportermuis ontwikkeld, genaamd Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), die GFP-gelabelde ribosomen en mCherry-gelabelde biotinyleerde kernen produceert op een Cre-recombinase-afhankelijke manier7. Het dual-labeling systeem maakt het mogelijk om celtype-specifieke transcriptomische en epigenomische analyse uit te voeren met weefsels. Met behulp van NuTRAP-muizen gekruist met adipocyt-specifieke adiponectine-Cre-lijnen (Adipoq-NuTRAP), hebben we eerder genexpressieprofielen en chromatinetoestanden van pure adipocytenpopulaties in vivo gekarakteriseerd en bepaald hoe ze worden veranderd tijdens obesitas 7,8. Eerder stelden NuTRAP-muizen gekruist met bruine en beige adipocyt-specifieke Ucp1-Cre-lijnen (Ucp1-NuTRAP) ons in staat om de epigenomische remodellering van de zeldzame thermogene adipocytenpopulatie, beige adipocyten, te karakteriseren als reactie op temperatuurveranderingen9.
ATAC-seq is een veelgebruikte analysemethode om de toegankelijkheid van genoombrede chromatine te beoordelen. De hyperreactieve Tn5-transposase die in ATAC-seq wordt gebruikt, maakt de identificatie van open chromatinegebieden mogelijk door sequencingadapters te taggen in het chromatine-toegankelijke gebied vankernen 10. ATAC-seq is een eenvoudige methode, maar biedt robuuste resultaten en is zeer efficiënt, zelfs met monsters met een lage invoer. Het is dus een van de meest populaire epigenomische profileringsmethoden geworden en heeft bijgedragen aan het begrip van de regulerende mechanismen van genexpressie binnen diverse biologische contexten. Sinds het oorspronkelijke ATAC-seq protocol is gemaakt, zijn er verschillende ATAC-seq-afgeleide technieken verder ontwikkeld om het protocol voor verschillende soorten samples aan te passen en te optimaliseren. Fast-ATAC is bijvoorbeeld ontworpen voor het analyseren van bloedcelmonsters11, Omni-ATAC is een geoptimaliseerd protocol voor ingevroren weefselmonsters 12 en MiniATAC-seq is effectief voor embryo-analyse in een vroeg stadium13. Het toepassen van de ATAC-seq-methode op adipocyten, vooral uit weefselmonsters, is echter nog steeds een uitdaging. Naast de heterogeniteit van vetweefsel kan het hoge lipidegehalte interfereren met efficiënte recombinatiereacties door Tn5-transposase, zelfs na kernisolatie. Bovendien veroorzaakt het hoge mitochondriale gehalte in adipocyten, met name in bruine en beige adipocyten, een hoge mitochondriale DNA-contaminatie en verspilde sequencing-reads. Dit artikel beschrijft een protocol voor adipocyt-specifieke ATAC-seq met behulp van Adipoq-NuTRAP-muizen (figuur 1). Door gebruik te maken van fluorescentie-gelabelde kernsortering, maakt dit protocol het mogelijk om zuivere populaties van adipocytenkernen weg te verzamelen van andere verstorende celtypen en de efficiënte verwijdering van lipiden, mitochondriën en weefselresten. Daarom kan dit protocol celtypespecifieke gegevens van hoge kwaliteit genereren en verspilling van mitochondriale metingen minimaliseren, terwijl een verminderde hoeveelheid invoer en reagentia wordt gebruikt in vergelijking met het standaardprotocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierverzorging en experimenten werden uitgevoerd volgens procedures die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Indiana University School of Medicine.
1. Voorbereidingen voor het begin van het experiment
- Weefselvoorbereiding
- Voor het labelen van adipocytenkernen kruist u NuTRAP-muizen met adipocyt-specifieke adiponectine-Cre-lijnen (Adipoq-Cre) om Adipoq-NuTRAP-muizen te genereren, die hemizygoot zijn voor zowel Adipoq-Cre als NuTRAP.
- Ontleed de vetweefsels van belang van de Adipoq-NuTRAP-muizen zoals eerder beschreven14.
- Vries de weefsels in met vloeibare stikstof en bewaar ze bij −80 °C tot gebruik.
OPMERKING: Elk vetkussen kan als geheel worden opgeslagen en de bevroren weefsels kunnen later op droogijs in kleinere stukjes (~ 50 mg) worden gesneden voor experimenten. Als alternatief kunnen de vetweefsels worden gesneden, gealiquoteerd en ingevroren in buizen voor opslag (~ 50 mg per buis). Bevroren monsters mogen na het invriezen nooit ontdooien tot gebruik.
- Buffervoorbereiding
OPMERKING: Houd de buffers gedurende het hele experiment op ijs.- Bereid kernvoorbereidingsbuffer (NPB) voor: 250 mM sucrose, 10 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 en 0,1% NP40. Bereid 7 ml NPB per monster. Voeg voor gebruik verse 100x proteaseremmercocktail (laatste 1x), DTT (laatste 1 mM) en Hoechst (laatste 1 μg/ml) toe aan de NPB.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om verse NPB te bereiden, maar het kan maximaal 1 maand bij 4 °C worden bewaard. - Bereid 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,1% NP-40 (PBS-N).
- Bereid kernvoorbereidingsbuffer (NPB) voor: 250 mM sucrose, 10 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 en 0,1% NP40. Bereid 7 ml NPB per monster. Voeg voor gebruik verse 100x proteaseremmercocktail (laatste 1x), DTT (laatste 1 mM) en Hoechst (laatste 1 μg/ml) toe aan de NPB.
2. Kernisolatie
- Koel glas Dounce homogenisatoren, met één glas Dounce per monster, op ijs. Voeg vervolgens 7 ml van de NPB-mix toe aan elk glas Dounce.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om maximaal acht monsters in elk experiment te gebruiken. Het werken met meer dan acht monsters zou alle stappen aanzienlijk vertragen en het kan vooral de kernkwaliteit tijdens het sorteren verlagen. - Doe het bevroren vetweefsel (50-100 mg) in de glazen Dounce en knip het onmiddellijk in een paar kleinere stukjes met een lange schaar. Streel 10x met een losse stamper voor alle monsters, en dan 10x met een strakke stamper.
OPMERKING: Vetweefsels zijn zacht, dus het snijden in een paar kleine stukjes zou voldoende moeten zijn. Voor zeldzame monsters kunnen kleinere stukken (10-20 mg) worden gebruikt, hoewel het aantal verzamelde adipocytenkernen kan variëren. - Filtreer door een zeef van 100 μm in een nieuwe buis van 50 ml. Verplaats de gefilterde homogenaten naar een nieuwe buis van 15 ml door te gieten. Draai gedurende 10 minuten bij 200 × g bij 4 °C in een centrifuge met zwenkemmer. Verwijder het supernatant zoveel mogelijk.
OPMERKING: Zuig eerst een vacuüm en verwijder vervolgens het resterende volume met behulp van een micropipette. - Resuspendeerde de pellet in 500 μL PBS-N door zachtjes maar grondig met de vinger te tikken.
OPMERKING: Vermijd pipetteren, omdat dit de kernen kan beschadigen. - Filtreer door een zeef van 40 μm in een nieuwe buis van 50 ml met behulp van voorzichtig pipetteren. Spoel de zeef af met 250 μL PBS-N. Breng de gefilterde nucleaire resuspensie over naar een fluorescentie-geactiveerde celsorteerbuis (FACS) met behulp van een micropipette.
OPMERKING: Indien beschikbaar kunnen buizen en celzeven worden gebruikt voor kleinere volumes om monsterverlies te minimaliseren.
3. Kernsortering
- Voorbereiding van de opvangbuis
- Voeg 500 μL PBS-N toe aan nieuwe buizen van 1,5 ml en keer een paar keer om om alle binnenoppervlakken nat te maken met de buffer.
- Draai de buizen kort om alle vloeistof naar beneden te brengen en koel ze vervolgens op ijs totdat ze zijn gesorteerd.
- FACS (figuur 2)
- Gebruik de FSC-A/FSC-H gating voor singlets en FSC-A/SSC-A voor het verwijderen van klein of groot vuil.
- Poort voor de mCherry/GFP-positieve adipocytenkernpopulatie.
- Verzamel 10.000 kernen in elk van de verzamelbuizen die in stap 3.1 zijn voorbereid.
- Nasorteerkernvoorbereiding
- Voeg 500 μL PBS-N toe aan elke verzamelbuis en keer een paar keer om om te mengen.
- Draai de opvangbuizen gedurende 10 minuten bij 4 °C op 200 × g in een centrifuge met zwenkemmer. Verwijder het supernatant volledig.
OPMERKING: Gebruik eerst een vacuüm om bubbels te verwijderen, giet het supernatant af en gebruik papieren doekjes om de resterende vloeistof volledig te verwijderen. De pellet is op dit punt onzichtbaar. Bereid het Tn5-hoofdmengsel voor tijdens de centrifugatiestap zoals hieronder beschreven.
4. Tn5 Tagmentatie (tabel 1)
- Om 25 μL Tn5-hoofdmengsel te bereiden, mengt u 12,5 μL 2x tagmentatie-DNA-buffer (TD-buffer), 1,25 μL Tn5-transposase (TDE I-enzym) en 11,25 μL nucleasevrij water.
- Voeg 25 μL Tn5-hoofdmengsel toe aan elke kernpellet en resuspensie door voorzichtig pipetteren. Incubeer bij 600 tpm gedurende 30 minuten bij 37 °C met behulp van een thermomixer.
5. DNA-zuivering
OPMERKING: De volgende procedure maakt gebruik van de PCR-zuiveringskit die wordt vermeld in de materiaaltabel. Alle andere soortgelijke DNA-zuiveringsmethoden kunnen worden gebruikt.
- Voeg 25 μl nucleasevrij water toe aan de 25 μl van het mengsel van Tn5-kernresuspensie verkregen na stap 4.2. Het uiteindelijke volume is 50 μL per monster.
- Voeg 250 μL buffer PB toe.
- Voeg 5 μL 3 M natriumacetaat (NaOAc) (pH 5,2) toe.
- Breng het mengsel over in een kolom (meegeleverd met de referentiekit) en centrifugeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (RT) bij 17.900 × g .
- Gooi de doorstroming weg en plaats de spinkolom terug in dezelfde opvangbuis. Voeg 750 μL buffer PE met absolute ethanol (EtOH) toe en centrifugeer gedurende 1 min bij RT bij 17.900 × g .
- Gooi de doorstroming weg en plaats de spinkolom terug in dezelfde opvangbuis. Centrifugeer bij 17.900 × g gedurende 1 minuut bij RT en gooi de opvangbuis met de doorstroming weg.
- Om de DNA-fragmenten te elueren, rust u de kolom uit met een nieuwe buis van 1,5 ml, voegt u 10 μL buffer EB toe en laat u 3 minuten op RT staan. Centrifugeer bij 17.900 × g gedurende 1 min bij RT.
OPMERKING: De monsters kunnen dagenlang bij 4 °C of wekenlang bij −20 °C worden bewaard.
6. PCR-versterking (tabel 2)
OPMERKING: De primers die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn vermeld in tabel 3.
- Om getransponeerde DNA-fragmenten te versterken, bereidt u PCR-mastermengsel voor zonder een unieke Ad2.n-barcodeprimer (primer # 2) toe te voegen. Gebruik 38 μL van het PCR-mastermengsel per monster: 11 μL nucleasevrij water, 2 μL van 25 μM Ad1_noMX primer (primer #1) en 25 μL van 2x PCR Master Mix.
- Voeg 38 μL van het PCR-mastermengsel toe aan een PCR-buis van 0,2 ml.
- Voeg 10 μL van de geëlueerde DNA-fragmenten uit stap 5.7 toe.
- Voeg 2 μL van 25 μM primer #2 toe, die specifiek moet zijn voor elk monster.
- Voer de PCR uit volgens de fietsomstandigheden die zijn aangegeven in tabel 2.
7. Real-time kwantitatieve PCR-test (qPCR) (tabel 4)
OPMERKING: Deze stap is bedoeld om de extra cycli te bepalen die nodig zijn om het DNA te versterken. Het is optioneel maar sterk aanbevolen, vooral voor nieuwe experimenten.
- Bereid qPCR master mengsel zonder primer #2 toe te voegen. Gebruik 9,975 μL van het qPCR-mastermengsel per monster: 4,41 μL nucleasevrij water, 0,25 μL 25 μM primer #1, 5 μL 2x PCR Master Mix en 0,09 μL 100x SYBR Green I.
OPMERKING: Om 100x SYBR Green I te bereiden, verdunt u de 10.000x bouillon met nucleasevrij water. Omdat het volume van 100x SYBR Green dat ik gebruikte voor het qPCR-mastermengsel verwaarloosbaar is, is het gemakkelijker om een extra mastermengsel van verdund 100x SYBR Green I te maken (bijvoorbeeld voor 8-10 monsters). - Voeg 9,975 μL van het qPCR-mastermengsel toe aan elke put van een qPCR-plaat.
- Voeg 0,25 μL van 25 μM primer #2 toe aan elke put.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u dezelfde primer #2 toevoegt om overeen te komen met wat er in stap 6.4 aan elk specifiek monster is toegevoegd. - Voeg 5 μL van de PCR-reactie verkregen na de PCR-amplificatie in stap 6.5 toe en meng door pipetteren.
OPMERKING: De resterende 45 μL van de PCR-reactie zal worden gebruikt voor de tweede PCR-amplificatie. - Voer de qPCR uit volgens de fietsomstandigheden die zijn aangegeven in tabel 5.
- Controleer de versterkingscurven en identificeer het aantal extra PCR-cycli dat nodig is door het aantal cycli te schatten dat ~ 35% van het maximum bereikte (figuur 3A).
OPMERKING: Doorgaans vereisen 10.000 kernen vijf tot acht extra PCR-cycli.
8. Extra PCR-versterking
- Voer de PCR uit met alle resterende 45 μL van de PCR-reactie volgens de berekeningen van stap 7.6 (tabel 6).
OPMERKING: Elk monster kan een ander aantal versterkingscycli vereisen.
9. Tweede DNA-zuivering met behulp van de PCR-zuiveringskit
- Gebruik dezelfde procedures als in rubriek 5, maar elueer de versterkte DNA-fragmenten met 20 μL buffer EB.
10. Selectie van DNA-fragmentgrootte
OPMERKING: Gebruik vaste fase omkeerbare immobilisatiekralen, zoals hieronder beschreven. Alle andere soortgelijke DNA-zuiveringskralen kunnen worden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. De SPRI kraalsuspensie moet volledig worden geresuspendeerd en in evenwicht worden gebracht bij RT met rotatie vóór gebruik.
- Breng het geëlueerde DNA over naar een nieuwe PCR-buis en voeg 80 μL buffer EB toe om een eindvolume van 100 μL te maken.
- Voeg 55 μL SPRI-kralen (0,55x monstervolume) toe en meng door pipetteren. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT en scheid vervolgens gedurende 5 minuten op een mini-magnetische standaard voor PCR 8-buisstrips.
- Breng 150 μL van het supernatant over in een nieuwe PCR-buis. Voeg 95 μL SPRI-kralen toe en meng door te pipetteren.
OPMERKING: Het supernatant bevat DNA van ongeveer 500 bp of kleiner. - Incubeer gedurende 5 minuten bij RT en scheid vervolgens gedurende 5 minuten op de mini-magnetische standaard. Gooi het supernatant voorzichtig weg.
- Was de kralen gedurende 1 minuut met 200 μL van 70% EtOH. Herhaal dit twee keer voor drie wasbeurten in totaal.
OPMERKING: Verplaats PCR-buizen niet van de magnetische standaard tijdens de wasbeurten. - Draai na de laatste wasbeurt de buizen gedurende 1 minuut op 1.000 × g naar beneden en pipetteer de resterende EtOH eruit. Droog de pellet met het deksel open bij 37 °C gedurende 2 minuten op een PCR-machine.
OPMERKING: De kralenkorrels mogen na droging slechts enkele kleine scheurtjes vertonen. Vermijd overdroging. - Resuspendeer de pellet met 20 μL buffer EB door pipetteren en incubeer gedurende 5 minuten bij RT. Scheid gedurende 5 minuten op de minimagnetische standaard en breng vervolgens 18 μL van het supernatant met de uiteindelijke bibliotheek over naar een nieuwe buis van 1,5 ml.
OPMERKING: De bibliotheek kan worden opgeslagen bij −20 °C tijdens het uitvoeren van een kwaliteitscontrole.
11. DNA-kwantificering met behulp van een fluorometer
- Om het hoofdmengsel te bereiden, verdunt u 200x dsDNA High Sensitivity (HS) reagens met dsDNA HS-buffer tot een eindconcentratie van 1x.
- Voeg voor normen 190 μL van het 1x mastermengsel en 10 μL van standaard 1 of standaard 2 toe aan een fluorometerbuis.
OPMERKING: Breng de normen bij RT in het donker in evenwicht voordat u met de kwantificering begint. - Voeg voor de bibliotheekmonsters 198 μL van het 1x mastermengsel en 2 μL van elk monster toe aan een afzonderlijke fluorometerbuis.
OPMERKING: Als de monsterhoeveelheden beperkt zijn, kan het monstervolume worden teruggebracht tot 1 μl en kan het volume van het hoofdmengsel van 1x worden verhoogd tot 199 μl. - Vortex of schud de fluorometerbuizen en laat ze 5 minuten bij RT in het donker zitten. Meet de DNA-concentratie met behulp van de dsDNA HS-test van de fluorometer.
12. Kwaliteitscontrole van de bibliotheek door hooggevoelige elektroforesesystemen
- Neem de ATAC-seq-bibliotheek en verdun met nucleasevrij water tot een uiteindelijke concentratie van 1-5 ng / μL.
- Analyseer de grootteverdeling van de ATAC-seq-bibliotheken met behulp van zeer gevoelige, geautomatiseerde elektroforesesystemen volgens de protocollen van de fabrikant.
13. Kwaliteitscontrole van de ATAC-seq bibliotheek door gebruik te maken van gerichte qPCR
- Neem 5-10 ng van de ATAC-seq-bibliotheek en verdun met 50 μL nucleasevrij water.
- Voer de qPCR uit met behulp van primers gericht op de promotors en versterkers waarvan bekend is dat ze actief zijn in adipocyten volgens de cyclusomstandigheden die zijn aangegeven in tabel 7.
- Gebruik negatieve controleprimers gericht op gesloten/stille genomische regio's (tabel 7).
- Bereken de verrijking van de promotor/versterkers ten opzichte van de negatieve controles (tabel 8).
OPMERKING: Er wordt verwacht dat het ≥10-20-voudige verrijkingen zal zien met succesvolle monsters.
14. Sequencing
- Dien de ATAC-seq-bibliotheken in voor sequencing. Gebruik paired-end sequencing (2 x 34 bp, 2 x 50 bp of langer) met gemiddelde leesgetallen van 10-30 miljoen reads per sample.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om vetweefsel te analyseren met behulp van dit ATAC-seq-protocol, genereerden we Adipoq-NuTRAP-muizen die chow-diëten kregen; Vervolgens isoleerden we adipocytkernen uit epididymaal wit vetweefsel (eWAT), inguinaal wit vetweefsel (iWAT) en bruin vetweefsel (BAT) met behulp van flowcytometrie. De geïsoleerde kernen werden gebruikt voor tagmentatie, gevolgd door DNA-zuivering, PCR-amplificatie, kwaliteitscontrolestappen, sequencing en data-analyse, zoals hierboven beschreven. Het doel van dit representatieve experiment was om de chromatinetoegankelijkheid van zuivere adipocytenpopulaties geïsoleerd uit verschillende vetdepots te profileren.
We zagen dat de mCherry-gelabelde en GFP-gelabelde adipocytkernen duidelijk te onderscheiden waren van de kernen van andere celtypen geïsoleerd uit de vetweefsels van een Adipoq-NuTRAP-muis met behulp van flowcytometrie (figuur 2A-C). Er waren verschillen in de adipocytenfracties afhankelijk van het type vetdepot: ~50% in eWAT, ~30% in iWAT en ~65% in BAT (Figuur 2D)7. We verzamelden 10.000 kernen binnen 2-10 minuten per monster en gebruikten ze voor de ATAC-seq-procedures. We hebben in totaal 10-13 PCR-cycli uitgevoerd (vijf cycli van de eerste PCR en vijf tot acht cycli van de tweede PCR, Figuur 3A). Als de monsters in totaal meer dan 15 PCR-cycli vereisen, kan dit wijzen op monsters van lage kwaliteit (figuur 3B). De grootteverdelingsanalyse van de ATAC-seq-bibliotheken toonde meerdere pieken die overeenkomen met het nucleosoomvrije gebied (NFR) en mono-, di- en multinucleosomen (figuur 4A-C), met gemiddelde groottes van ~ 500-800 bp. Monsters van slechte kwaliteit vertoonden meestal NFR met geen of weinig nucleosomale pieken (figuur 4D). De kwaliteitscontroletests door de qRT-PCR-analyse toonden 10-20-voudige verrijkingen met de positieve genomische elementen in de buurt van adipocytenmarkergenen zoals Adipoq, Fabp4, Plin1 en Pnpla2, terwijl er geen verrijking werd aangetoond met de negatieve controle (figuur 5). We zagen ook verrijking met het thermogene gen Ucp1 specifiek in BBT, maar niet in eWAT of iWAT (figuur 5).
Na de sequencing en analyse identificeerden we ~ 55.000 pieken gecombineerd uit drie verschillende vetdepots (eWAT, iWAT en BAT). De mitochondriale metingen waren <2% en de fractie onder de pieken was ~18%-44% (figuur 6A, B). Monsters van slechte kwaliteit kunnen significant hogere mitochondriale metingen en / of een lagere fractie van de metingen in de piekgebieden hebben. Visuele inspectie van de ATAC-seq-bibliotheektracks onthulde meerdere sterke pieken met hoge signaal-ruisverhoudingen in de buurt van adipocytenmarkergenen, zoals Adipoq, Plin1 en Fabp4, van alle vetdepots (figuur 7A-C). We zagen ook sterke ATAC-seq-pieken bij de ucp1-locus van de bruine adipocytenmaker in het BAT-monster, maar deze pieken werden niet waargenomen in de eWAT- of iWAT-monsters (figuur 7D). Al deze gegevens wijzen op succesvolle ATAC-seq-gegevens die zijn gegenereerd uit adipocytkernen.
Figuur 1: Een schematisch stroomdiagram van adipocyt-specifieke ATAC-seq met behulp van NuTRAP-muizen. De stappen die uniek zijn voor dit protocol worden gemarkeerd in de rood gearceerde vakken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve FACS-gating ter illustratie van de isolatie van mCherry/GFP-gelabelde adipocytkernen uit de vetweefsels van een Adipoq-NuTRAP-muis. (A-C) Flowcytometrie-analyse van geïsoleerde kernen uit de eWAT, iWAT en BAT van een Adipoq-NuTRAP-muis. D) Kwantitatieve analyse van kernen van adipocyten en niet-adipocyten in de eWAT, iWAT en BBT van een Adipoq-NuTRAP-muis. De gegevens zijn gemiddeld ± SEM (n = 3). Deze kerntellingsgegevens zijn afkomstig van Roh et al.7. Afkortingen: FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering; GFP = groen fluorescerend eiwit; eWAT = epididymaal wit vetweefsel; iWAT = inguinaal wit vetweefsel; BBT = bruin vetweefsel; NuTRAP = nucleaire tagging en translating ribosoom affiniteitszuivering; Adipoq-NuTRAP = NuTRAP muis gekruist met adipocyt-specifieke adiponectine-Cre lijn; FSC-A = voorwaarts verstrooid-piekgebied; FSC-H = voorwaartse verstrooiing-piekhoogte; SSC-A = zijwaarts verstrooid-piekgebied; FITC-A = fluoresceïne-isothiocyanaat-piekgebied. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve versterkingscurven van qRT-PCR . (A) Monster van goede kwaliteit dat zeven extra versterkingscycli nodig heeft. (B) Monster van slechte kwaliteit waarvoor ≥15 extra cycli nodig zijn. Afkorting: qRT-PCR = kwantitatieve reverse transcriptie PCR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Grootteverdelingsprofielen van de ATAC-seq-bibliotheken. (A-C) bibliotheken van goede kwaliteit en (D) bibliotheken van slechte kwaliteit worden weergegeven als representatieve resultaten. Afkortingen: ATAC-seq = assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing; FU = fluorescentie-eenheden; bp = baseparen; NFR = nucleosoomvrij gebied; eWAT = epididymaal wit vetweefsel; iWAT = inguinaal wit vetweefsel; BBT = bruin vetweefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Kwaliteitscontrole qPCR analyse van de ATAC-seq bibliotheken. Verrijkingen voor promotors en versterkers in de buurt van de algemene adipocytenmarkers Adipoq, Fabp4, Plin1 en Pnpla2 of de bruine adipocytenmarker Ucp1. Afkortingen: ATAC-seq = assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing; NC = negatieve controle; eWAT = epididymaal wit vetweefsel; iWAT = inguinaal wit vetweefsel; BBT = bruin vetweefsel. De gegevens zijn gemiddeld ± SEM (n = 2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Mitochondriën lezen en breuken onder de pieken van de ATAC-seq bibliotheken. (A) Mitochondriën lezen (%) en (B) fracties onder de pieken (%) van eWAT, iWAT en BAT. Afkortingen: ATAC-seq = assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing; eWAT = epididymaal wit vetweefsel; iWAT = inguinaal wit vetweefsel; BBT = bruin vetweefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: ATAC-seq signaalsporen op de loci van representatieve genen. (A-C) Algemene adipocytenmarkergenen. (B) Bruine adipocyt-specifieke marker. Afkortingen: ATAC-seq = assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing; eWAT = epididymaal wit vetweefsel; iWAT = inguinaal wit vetweefsel; BBT = bruin vetweefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Componenten van het Tn5-hoofdmengsel. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Componenten van het PCR-hoofdmengsel en initiële PCR-cycluscondities. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: Lijst van de primers met streepjescode voor PCR-versterking. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 4: Componenten van het qPCR-mastermengsel. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 5: qPCR fietscondities. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 6: Tweede PCR-cycluscondities voor extra versterking. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 7: Primersequenties en gerichte qPCR-cycluscondities voor de kwaliteitscontrole van de ATAC-seq-bibliotheek. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 8: Analyse van de qPCR-resultaten voor de kwaliteitscontrole. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel hebben we een geoptimaliseerd ATAC-seq-protocol gepresenteerd om de toegankelijkheid van adipocytspecifiek chromatine in vivo te beoordelen. Dit ATAC-seq-protocol met behulp van de Adipoq-NuTRAP-muis heeft met succes adipocyt-specifieke chromatine-toegankelijkheidsprofielen gegenereerd. De meest kritische factor voor succesvolle en reproduceerbare ATAC-seq experimenten is de kwaliteit van de kern. Het is van cruciaal belang om de ontleedde vetweefsels onmiddellijk in te vriezen in vloeibare stikstof en ze veilig op te slaan bij −80 °C zonder te ontdooien tot gebruik. Het is ook belangrijk om schade aan de adipocytenkern te voorkomen tijdens het isoleren en sorteren van de kern. De monsters moeten voorzichtig worden behandeld via centrifugatie bij lage snelheid en minimale pipettering tijdens het hele proces van kernisolatie.
Zorgvuldige gating tijdens het sorteren van kernen is cruciaal om de mCherry/GFP-gelabelde adipocytkernen selectief te isoleren (figuur 1). Het is belangrijk om te zorgen voor een duidelijke scheiding tussen de mCherry/GFP-positieve en negatieve populaties. Evenzo zijn voorzichtige hantering en snelle sortering noodzakelijk om de aard van het chromatine in de kernen te behouden. Als de fluorescentie zwak is, het sorteren te lang duurt en/of de adipocytenfracties buiten het verwachte bereik liggen, geeft dit aan dat er problemen kunnen zijn met de monsters of problemen tijdens de nuclei-isolatieprocedures. Dit protocol kan worden aangepast afhankelijk van de experimentele omstandigheden. Ten eerste kan het aantal kernen dat nodig is voor de ATAC-seq dalen tot 1.000 of tot 100.000. Als er minder dan 5.000 kernen zijn, zou het gebruik van een verder verminderd volume (0,6 μl) van het TDE I-enzym over-tagmentatie voorkomen. Voor aantallen kernen gelijk aan of groter dan 50.000 kan het volume van het Tn5-hoofdmengsel worden verdubbeld tot 50 μL, hetzelfde volume als gebruikt in het oorspronkelijke protocol10.
Ten tweede kunnen andere nucleusetiketteringssystemen, zoals INTACT-muizen (isolatie van kernen gelabeld in specifieke celtypen) muizen, worden gebruikt in plaats van NuTRAP-muizen16. Aangezien INTACT-muizen GFP-gelabeld SUN1-kernmembraaneiwit tot expressie brengen, kunnen GFP-gelabelde kernen worden geïsoleerd door sortering en gebruikt voor ATAC-seq met behulp van dezelfde methoden die in dit protocol worden beschreven. Alle andere nucleaire etiketteringsmethoden kunnen ook worden overgenomen. Ten slotte kunnen in vitro gekweekte adipocyten ook worden gebruikt voor ATAC-seq volgens dit protocol. Hiervoor worden cellen die op schalen / borden worden gekweekt, geschraapt, verzameld met NPB en vervolgens onderworpen aan dezelfde stroomafwaartse procedures - behalve dat sorteren alleen moet worden gedaan op basis van grootte, complexiteit en Hoechst, niet mCherry / GFP zoals eerder beschreven15.
Dit adipocyt-specifieke ATAC-seq-protocol met behulp van de NuTRAP-techniek vormt een beperking omdat het niet werkt zonder fluorescerende etikettering; Het analyseren van menselijke monsters zal dus niet werken met deze techniek. Het is echter nog steeds mogelijk om ATAC-seq uit te voeren met adipocyten geïsoleerd door weefselverterings- en flotatiemethoden. Opgemerkt moet worden dat het werken met menselijke floater adipocyten enkele beperkingen heeft, zoals besmetting door andere celtypen bij het gebruik van centrifugatie met lage snelheid en het verlies van grote adipocyten bij het gebruik van centrifugatie met hogere snelheid. Dit protocol kan worden toegepast op elk celtype waarvoor specifieke Cre-lijnen beschikbaar zijn, waardoor efficiënte celtypespecifieke chromatineprofilering mogelijk is, zelfs met beperkte celingangen17. Kortom, dit verbeterde ATAC-seq-protocol zal nuttig zijn voor onderzoekers die de toegankelijkheid van chromatine van specifieke celtypen in heterogene weefsels ex vivo willen evalueren, naast de adipocyten die we hier hebben besproken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen relevante of materiële financiële belangen hebben met betrekking tot het onderzoek dat in dit artikel wordt beschreven.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het IUSM Showalter Research Trust Fund (naar H.C.R.), een IUSM Center for Diabetes and Metabolic Diseases Pilot and Feasibility grant (naar H.C.R.), het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK129289 naar H.C.R.), en de American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 naar H.C.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio?5 |
References
- Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
- Farmer, S. R.
- Bielczyk-Maczynska, E. White adipocyte plasticity in physiology and disease. Cells. 8 (12), 1507 (2019).
- Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies. Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).
- Esteve Rafols, M. Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity. Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).
- Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications. Experimental and Molecular Medicine. 48, e215 (2016).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Roh, H. C., et al. Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPARγ activity and elevated TGFβ-SMAD signaling. Molecular Metabolism. 42, 101086 (2020).
- Roh, H. C., et al. Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity. Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).
- Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Wu, J., et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA. Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- So, J., et al. Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility. Molecular Metabolism. 66, 101619 (2022).
- Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing. STAR Protocols. 2 (3), 100805 (2021).
- Heyward, F. D., et al. Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin's hunger-suppressing effects. bioRxiv. , (2022).
