Summary
Presentiamo un protocollo per il dosaggio della cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alto rendimento (ATAC-seq) specificamente sugli adipociti utilizzando la selezione del nucleo con tessuti adiposi isolati da topi reporter transgenici con marcatura a fluorescenza nucleare.
Abstract
Il saggio per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alta produttività (ATAC-seq) è una tecnica robusta che consente la profilazione dell'accessibilità della cromatina a livello di genoma. Questa tecnica è stata utile per comprendere i meccanismi regolatori dell'espressione genica in una serie di processi biologici. Sebbene ATAC-seq sia stato modificato per diversi tipi di campioni, non ci sono state modifiche efficaci dei metodi ATAC-seq per i tessuti adiposi. Le sfide con i tessuti adiposi includono la complessa eterogeneità cellulare, il grande contenuto lipidico e l'elevata contaminazione mitocondriale. Per superare questi problemi, abbiamo sviluppato un protocollo che consente l'ATAC-seq adipocyte-specific utilizzando la selezione del nucleo attivata dalla fluorescenza con tessuti adiposi dal topo transgenico reporter Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). Questo protocollo produce dati di alta qualità con letture di sequenziamento minime sprecate, riducendo al contempo la quantità di input del nucleo e reagenti. Questo articolo fornisce istruzioni dettagliate passo-passo per il metodo ATAC-seq convalidato per l'uso di nuclei di adipociti isolati da tessuti adiposi di topo. Questo protocollo aiuterà nello studio della dinamica della cromatina negli adipociti su diverse stimolazioni biologiche, che consentiranno nuove intuizioni biologiche.
Introduction
Il tessuto adiposo, specializzato per immagazzinare l'energia in eccesso sotto forma di molecole lipidiche, è un organo chiave per la regolazione metabolica. Lo stretto controllo della formazione e del mantenimento degli adipociti è vitale per la funzione del tessuto adiposo e l'omeostasi energetica di tutto il corpo1. Molti regolatori trascrizionali svolgono un ruolo critico nel controllo della differenziazione, della plasticità e della funzione degli adipociti; Alcuni di questi regolatori sono implicati nei disordini metabolici nell'uomo 2,3. I recenti progressi nelle tecniche di sequenziamento ad alto rendimento per l'espressione genica e l'analisi epigenomica hanno ulteriormente facilitato la scoperta dei regolatori molecolari della biologia degli adipociti4. Gli studi di profilazione molecolare che utilizzano tessuti adiposi sono difficili da condurre a causa dell'eterogeneità di questi tessuti. Il tessuto adiposo è costituito principalmente da adipociti, che sono responsabili dell'accumulo di grasso, ma contiene anche vari altri tipi di cellule, come fibroblasti, cellule endoteliali e cellule immunitarie5. Inoltre, la composizione cellulare del tessuto adiposo è drasticamente alterata in risposta a cambiamenti fisiopatologici come la temperatura e lo stato nutrizionale6. Per superare questi problemi, abbiamo precedentemente sviluppato un topo reporter transgenico, chiamato Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), che produce ribosomi con GFP e nuclei biotinilati marcati con mCherry in modo dipendente dalla ricombinasi Cre7. Il sistema di doppia marcatura consente di eseguire analisi trascrittomiche ed epigenomiche specifiche per tipo cellulare con i tessuti. Utilizzando topi NuTRAP incrociati con linee adiponectina-Cre specifiche per adipociti (Adipoq-NuTRAP), abbiamo precedentemente caratterizzato i profili di espressione genica e gli stati di cromatina da popolazioni di adipociti puri in vivo e determinato come sono alterati durante l'obesità 7,8. In precedenza, topi NuTRAP incrociati con linee Ucp1-Cre specifiche per adipociti marroni e beige (Ucp1-NuTRAP) ci hanno permesso di caratterizzare il rimodellamento epigenomico della rara popolazione di adipociti termogenici, gli adipociti beige, in risposta ai cambiamenti di temperatura9.
ATAC-seq è un metodo analitico ampiamente utilizzato per valutare l'accessibilità della cromatina a livello di genoma. La trasposasi Tn5 iper-reattiva utilizzata in ATAC-seq consente l'identificazione di regioni aperte della cromatina marcando adattatori di sequenziamento nella regione accessibile alla cromatina dei nuclei10. ATAC-seq è un metodo semplice, ma fornisce risultati robusti ed è altamente efficiente anche con campioni a basso input. È diventato, quindi, uno dei metodi di profilazione epigenomica più popolari e ha contribuito alla comprensione dei meccanismi regolatori dell'espressione genica all'interno di diversi contesti biologici. Da quando è stato creato il protocollo ATAC-seq originale, varie tecniche derivate da ATAC-seq sono state ulteriormente sviluppate per modificare e ottimizzare il protocollo per vari tipi di campioni. Ad esempio, Fast-ATAC è progettato per analizzare campioni di cellule del sangue11, Omni-ATAC è un protocollo ottimizzato per campioni di tessuto congelato 12 e MiniATAC-seq è efficace per l'analisi embrionale in fase iniziale13. Tuttavia, l'applicazione del metodo ATAC-seq agli adipociti, in particolare da campioni di tessuto, è ancora impegnativa. Oltre all'eterogeneità del tessuto adiposo, il suo elevato contenuto lipidico può interferire con efficaci reazioni di ricombinazione da parte della trasposasi Tn5 anche dopo l'isolamento del nucleo. Inoltre, l'elevato contenuto mitocondriale negli adipociti, in particolare negli adipociti marroni e beige, causa un'elevata contaminazione del DNA mitocondriale e letture di sequenziamento sprecate. Questo documento descrive un protocollo per ATAC-seq adipocyte-specific utilizzando topi Adipoq-NuTRAP (Figura 1). Sfruttando la selezione dei nuclei marcati con fluorescenza, questo protocollo consente la raccolta di popolazioni pure di nuclei di adipociti lontano da altri tipi di cellule confondenti e l'efficiente rimozione di lipidi, mitocondri e detriti tissutali. Quindi, questo protocollo può generare dati di alta qualità specifici del tipo di cellula e ridurre al minimo gli sprechi dalle letture mitocondriali utilizzando una quantità ridotta di input e reagenti rispetto al protocollo standard.
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Protocol
La cura e la sperimentazione degli animali sono state eseguite secondo procedure approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Indiana University School of Medicine.
1. Preparativi prima di iniziare l'esperimento
- Preparazione dei tessuti
- Per la marcatura del nucleo adipocitario, incrociare topi NuTRAP con linee adiponectina-Cre specifiche per adipociti (Adipoq-Cre) per generare topi Adipoq-NuTRAP, che sono emizigoti sia per Adipoq-Cre che per NuTRAP.
- Sezionare i tessuti adiposi di interesse dai topi Adipoq-NuTRAP come descritto in precedenza14.
- Congelare i tessuti in azoto liquido e conservarli a -80 °C fino all'uso.
NOTA: Ogni cuscinetto adiposo può essere conservato nel suo insieme e i tessuti congelati possono essere successivamente tagliati su ghiaccio secco in pezzi più piccoli (~ 50 mg) per esperimenti. In alternativa, i tessuti grassi possono essere tagliati, aliquotati e congelati in provette per la conservazione (~ 50 mg per provetta). I campioni congelati non possono mai scongelarsi dopo il congelamento fino all'uso.
- Preparazione del buffer
NOTA: tenere i buffer sul ghiaccio per tutta la durata dell'esperimento.- Preparare il tampone di preparazione del nucleo (NPB): 250 mM di saccarosio, 10 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 e 0,1% NP40. Preparare 7 ml di NPB per campione. Aggiungere al NPB il cocktail di inibitori della proteasi 100x fresco (finale 1x), DTT (finale 1 mM) e Hoechst (finale 1 μg/ml) all'NPB.
NOTA: Si consiglia di preparare NPB fresco, ma può essere conservato a 4 °C per un massimo di 1 mese. - Preparare 1x soluzione salina tamponata con fosfato con 0,1% NP-40 (PBS-N).
- Preparare il tampone di preparazione del nucleo (NPB): 250 mM di saccarosio, 10 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 e 0,1% NP40. Preparare 7 ml di NPB per campione. Aggiungere al NPB il cocktail di inibitori della proteasi 100x fresco (finale 1x), DTT (finale 1 mM) e Hoechst (finale 1 μg/ml) all'NPB.
2. Isolamento del nucleo
- Raffreddare gli omogeneizzatori Dounce in vetro, con un bicchiere Dounce per campione, su ghiaccio. Quindi, aggiungere 7 ml della miscela NPB a ciascun bicchiere Dounce.
NOTA: si consiglia di utilizzare fino a otto campioni in ogni esperimento. Lavorare con più di otto campioni ritarderebbe significativamente tutti i passaggi e potrebbe in particolare ridurre la qualità del nucleo durante la selezione. - Mettere il tessuto adiposo congelato (50-100 mg) nel bicchiere Dounce, e tagliarlo immediatamente in alcuni pezzi più piccoli usando un lungo paio di forbici. Colpisci 10x con un pestello sciolto per tutti i campioni, e poi 10x con un pestello stretto.
NOTA: I tessuti adiposi sono morbidi, quindi tagliarli in pochi piccoli pezzi dovrebbe essere sufficiente. Per campioni rari, possono essere utilizzati pezzi più piccoli (10-20 mg), sebbene il numero di nucleo adipocitario raccolto possa variare. - Filtrare attraverso un filtro da 100 μm in un nuovo tubo da 50 ml. Spostare gli omogenati filtrati in un nuovo tubo da 15 mL versando. Centrifugare a 200 × g per 10 minuti a 4 °C in una centrifuga a secchio oscillante. Rimuovere il surnatante il più possibile.
NOTA: aspirare prima con un aspiratore e quindi rimuovere il volume rimanente utilizzando una micropipetta. - Risospendere il pellet in 500 μL di PBS-N picchiettando delicatamente ma accuratamente.
NOTA: evitare il pipettaggio, poiché ciò potrebbe danneggiare i nuclei. - Filtrare attraverso un filtro da 40 μm in un nuovo tubo da 50 mL utilizzando un pipettaggio delicato. Risciacquare il filtro con 250 μL di PBS-N. Trasferire la risospensione nucleare filtrata in un tubo di selezione cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) utilizzando una micropipetta.
NOTA: Se disponibili, i tubi e i filtri per celle possono essere utilizzati per volumi più piccoli per ridurre al minimo la perdita di campione.
3. Ordinamento del nucleo
- Preparazione del tubo di raccolta
- Aggiungere 500 μL di PBS-N ai nuovi tubi da 1,5 mL e capovolgere alcune volte per bagnare tutte le superfici interne con il tampone.
- Girare brevemente i tubi per far scendere tutto il liquido, quindi raffreddarli sul ghiaccio fino alla selezione.
- FACS (Figura 2)
- Utilizzare il gating FSC-A/FSC-H per canottiere e FSC-A/SSC-A per la rimozione di detriti piccoli o grandi.
- Gate per la popolazione del nucleo adipocitario mCherry/GFP-positivo.
- Raccogliere 10.000 nuclei in ciascuna delle provette di raccolta preparate al punto 3.1.
- Preparazione del nucleo post-smistamento
- Aggiungere 500 μL di PBS-N a ciascuna provetta di raccolta e capovolgere alcune volte per mescolare.
- Centrifugare i tubi di raccolta a 200 × g per 10 minuti a 4 °C in una centrifuga a benna oscillante. Rimuovere completamente il surnatante.
NOTA: utilizzare prima un aspirapolvere per rimuovere le bolle, versare il surnatante e utilizzare salviette di carta per rimuovere completamente il liquido rimanente. Il pellet è invisibile a questo punto. Preparare la miscela madre Tn5 durante la fase di centrifugazione come descritto di seguito.
4. Tagmentazione Tn5 (Tabella 1)
- Per preparare 25 μL di miscela madre Tn5, mescolare 12,5 μL di tampone DNA di tagmentazione 2x (tampone TD), 1,25 μL di trasposasi Tn5 (enzima TDE I) e 11,25 μL di acqua priva di nucleasi.
- Aggiungere 25 μL di miscela madre Tn5 a ciascun pellet di nucleo e risospendere mediante pipettaggio delicato. Incubare a 600 giri/min per 30 minuti a 37 °C utilizzando un termomiscelatore.
5. Purificazione del DNA
NOTA: La seguente procedura utilizza il kit di purificazione PCR menzionato nella tabella dei materiali. È possibile utilizzare qualsiasi altro metodo di purificazione del DNA simile.
- Aggiungere 25 μL di acqua esente da nucleasi ai 25 μL della miscela di risospensione del nucleo Tn5 ottenuta dopo la fase 4.2. Il volume finale è di 50 μL per campione.
- Aggiungere 250 μL di tampone PB.
- Aggiungere 5 μL di acetato di sodio 3 M (NaOAc) (pH 5,2).
- Trasferire la miscela in una colonna (fornita con il kit di riferimento) e centrifugare a 17.900 × g per 1 minuto a temperatura ambiente (RT).
- Eliminate il flusso e riposizionate la colonna di rotazione nello stesso tubo di raccolta. Aggiungere 750 μL di PE tampone contenente etanolo assoluto (EtOH) e centrifugare a 17.900 × g per 1 minuto a RT.
- Scartare il flusso e riposizionare la colonna di rotazione nello stesso tubo di raccolta. Centrifugare a 17.900 × g per 1 minuto a RT ed eliminare il tubo di raccolta con il flusso passante.
- Per eluire i frammenti di DNA, dotare la colonna di un nuovo tubo da 1,5 ml, aggiungere 10 μL di EB tampone e lasciare a RT per 3 minuti. Centrifugare a 17.900 × g per 1 minuto a RT.
NOTA: I campioni possono essere conservati a 4 °C per giorni o a -20 °C per settimane.
6. Amplificazione PCR (Tabella 2)
NOTA: I primer utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella 3.
- Per amplificare i frammenti di DNA trasposti, preparare la miscela master PCR senza aggiungere un primer per codici a barre Ad2.n unico (primer #2). Utilizzare 38 μL della miscela master PCR per campione: 11 μL di acqua priva di nucleasi, 2 μL di primer Ad1_noMX da 25 μM (primer #1) e 25 μL di 2x PCR Master Mix.
- Aggiungere 38 μL della miscela principale PCR in una provetta da 0,2 mL di PCR.
- Aggiungere 10 μL dei frammenti di DNA eluito del punto 5.7.
- Aggiungere 2 μL di primer #2 da 25 μM, che deve essere specifico per ogni campione.
- Eseguire la PCR secondo le condizioni ciclistiche indicate nella Tabella 2.
7. Test di PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) (Tabella 4)
NOTA: Questo passaggio mira a determinare i cicli aggiuntivi necessari per amplificare il DNA. È facoltativo ma altamente raccomandato, soprattutto per i nuovi esperimenti.
- Preparare la miscela master qPCR senza aggiungere primer #2. Utilizzare 9,975 μL della miscela master qPCR per campione: 4,41 μL di acqua priva di nucleasi, 0,25 μL di primer #1 da 25 μM, 5 μL di 2x PCR Master Mix e 0,09 μL 100x SYBR Green I.
NOTA: Per preparare 100x SYBR Green I, diluire il brodo 10.000x con acqua priva di nucleasi. Poiché il volume di 100x SYBR Green che ho usato per la miscela master qPCR è trascurabile, è più facile fare una miscela master aggiuntiva di 100x SYBR Green I diluito (ad esempio, per 8-10 campioni). - Aggiungere 9,975 μL della miscela principale qPCR in ciascun pozzetto di una piastra qPCR.
- Aggiungere 0,25 μL di primer #2 da 25 μM in ciascun pozzetto.
NOTA: Assicurarsi di aggiungere lo stesso primer #2 per abbinare ciò che è stato aggiunto a ciascun campione specifico nel passaggio 6.4. - Aggiungere 5 μL della reazione PCR ottenuta dopo l'amplificazione della PCR nella fase 6.5 e mescolare mediante pipettaggio.
NOTA: I restanti 45 μL della reazione PCR saranno utilizzati per la seconda amplificazione PCR. - Eseguire la qPCR secondo le condizioni di ciclo indicate nella Tabella 5.
- Controllare le curve di amplificazione e identificare il numero di cicli PCR aggiuntivi necessari stimando il numero di cicli che hanno raggiunto ~ 35% del massimo (Figura 3A).
NOTA: In genere, 10.000 nuclei richiedono da cinque a otto cicli PCR aggiuntivi.
8. Amplificazione PCR aggiuntiva
- Eseguire la PCR utilizzando tutti i restanti 45 μL della reazione PCR secondo i calcoli del punto 7.6 (Tabella 6).
NOTA: Ogni campione potrebbe richiedere un numero diverso di cicli di amplificazione.
9. Seconda purificazione del DNA utilizzando il kit di purificazione PCR
- Utilizzare le stesse procedure della sezione 5, ma eluire i frammenti di DNA amplificati con 20 μL di EB tampone.
10. Selezione della dimensione del frammento di DNA
NOTA: utilizzare sfere di immobilizzazione reversibili in fase solida, come descritto di seguito. Qualsiasi altra perla di purificazione del DNA simile può essere utilizzata secondo le istruzioni del produttore. La sospensione del tallone SPRI deve essere completamente risospesa e bilanciata a RT con rotazione prima dell'uso.
- Trasferire il DNA eluito in una nuova provetta PCR e aggiungere 80 μL di EB tampone per ottenere un volume finale di 100 μL.
- Aggiungere 55 μL di sfere SPRI (volume di campione 0,55x) e mescolare mediante pipettaggio. Incubare per 5 minuti a RT, quindi separare su un mini supporto magnetico per strisce PCR a 8 tubi per 5 minuti.
- Trasferire 150 μL del surnatante in una nuova provetta PCR. Aggiungere 95 μL di perline SPRI e mescolare mediante pipettaggio.
NOTA: Il surnatante contiene DNA di circa 500 bp o inferiore. - Incubare per 5 minuti a RT, quindi separare sul mini supporto magnetico per 5 minuti. Scartare il surnatante con attenzione.
- Lavare le perline per 1 minuto con 200 μL di 70% di EtOH. Ripetere due volte per tre lavaggi in totale.
NOTA: Non spostare i tubi PCR dal supporto magnetico durante i lavaggi. - Dopo il lavaggio finale, ruotare i tubi a 1.000 × g per 1 minuto e pipetare l'EtOH rimanente. Asciugare il pellet con il coperchio aperto a 37 °C per 2 minuti su una macchina PCR.
NOTA: I pellet di perline dovrebbero mostrare solo alcune piccole crepe una volta asciugate. Evitare l'eccessiva asciugatura. - Risospendere il pellet con 20 μL di EB tampone mediante pipettaggio e incubare per 5 minuti a RT. Separare sul mini supporto magnetico per 5 minuti, quindi trasferire 18 μL del surnatante contenente la libreria finale in un nuovo tubo da 1,5 ml.
NOTA La libreria può essere memorizzata a -20 °C durante l'esecuzione di un controllo di qualità.
11. Quantificazione del DNA mediante fluorometro
- Per preparare la miscela principale, diluire il reagente 200x dsDNA ad alta sensibilità (HS) con tampone dsDNA HS fino a una concentrazione finale di 1x.
- Per gli standard, aggiungere 190 μL della miscela master 1x e 10 μL dello standard 1 o dello standard 2 a un tubo fluorometrico.
NOTA: Equilibrare gli standard di RT al buio prima di iniziare la quantificazione. - Per i campioni della libreria, aggiungere 198 μL della miscela master 1x e 2 μL di ciascun campione in un tubo fluorometrico separato.
NOTA: se le quantità del campione sono limitate, il volume del campione può essere ridotto a 1 μL e il volume della miscela master 1x può essere aumentato a 199 μL. - Vortice o scuotere i tubi del fluorometro e lasciarli riposare per 5 minuti a RT al buio. Misurare la concentrazione di DNA utilizzando il saggio dsDNA HS del fluorometro.
12. Controllo della qualità della biblioteca mediante sistemi di elettroforesi ad alta sensibilità
- Prendere la libreria ATAC-seq e diluire con acqua priva di nucleasi fino a una concentrazione finale di 1-5 ng/μL.
- Analizza la distribuzione dimensionale delle librerie ATAC-seq utilizzando sistemi di elettroforesi automatizzati ad alta sensibilità che seguono i protocolli del produttore.
13. Controllo di qualità della libreria ATAC-seq utilizzando qPCR mirata
- Prelevare 5-10 ng della libreria ATAC-seq e diluire con 50 μL di acqua priva di nucleasi.
- Eseguire la qPCR utilizzando primer mirati ai promotori e agli enhancer noti per essere attivi negli adipociti in base alle condizioni cicliche indicate nella Tabella 7.
- Utilizzare primer di controllo negativo mirati a regioni genomiche chiuse/silenziose (Tabella 7).
- Calcolare l'arricchimento del promotore/potenziatore rispetto ai controlli negativi (Tabella 8).
NOTA: Si prevede di vedere arricchimenti di ≥10-20 volte con campioni di successo.
14. Sequenziamento
- Inviare le librerie ATAC-seq per la sequenziazione. Utilizzare il sequenziamento paired-end (2 x 34 bp, 2 x 50 bp o più) con numeri di lettura medi di 10-30 milioni di letture per campione.
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Representative Results
Per analizzare il tessuto adiposo utilizzando questo protocollo ATAC-seq, abbiamo generato topi Adipoq-NuTRAP che sono stati alimentati con diete chow; abbiamo quindi isolato i nuclei degli adipociti dal tessuto adiposo bianco epididimo (eWAT), dal tessuto adiposo bianco inguinale (iWAT) e dal tessuto adiposo bruno (BAT) utilizzando la citometria a flusso. I nuclei isolati sono stati utilizzati per la marcatura, seguita dalla purificazione del DNA, dall'amplificazione PCR, dalle fasi di controllo della qualità, dal sequenziamento e dall'analisi dei dati, come descritto sopra. Lo scopo di questo esperimento rappresentativo era quello di profilare l'accessibilità della cromatina di popolazioni di adipociti puri isolati da diversi depositi di grasso.
Abbiamo osservato che i nuclei adipocitari marcati con mCherry e GFP erano chiaramente distinguibili dai nuclei di altri tipi di cellule isolati dai tessuti adiposi di un topo Adipoq-NuTRAP utilizzando la citometria a flusso (Figura 2A-C). C'erano differenze nelle frazioni adipocitarie a seconda del tipo di deposito adiposo: ~50% in eWAT, ~30% in iWAT e ~65% in BAT (Figura 2D)7. Abbiamo raccolto 10.000 nuclei entro 2-10 minuti per campione e li abbiamo utilizzati per le procedure ATAC-seq. Abbiamo eseguito un totale di 10-13 cicli di PCR (cinque cicli della prima PCR e da cinque a otto cicli della seconda PCR, Figura 3A). Se i campioni richiedono più di un totale di 15 cicli di PCR, ciò potrebbe indicare campioni di bassa qualità (Figura 3B). L'analisi della distribuzione dimensionale delle librerie ATAC-seq ha dimostrato picchi multipli corrispondenti alla regione libera da nucleosomi (NFR) e mono, di e multi-nucleosomi (Figura 4A-C), con dimensioni medie di ~ 500-800 bp. I campioni di scarsa qualità hanno tipicamente mostrato per lo più NFR con nessun o pochi picchi nucleosomici (Figura 4D). I test di controllo di qualità dell'analisi qRT-PCR hanno mostrato arricchimenti di 10-20 volte con gli elementi genomici positivi vicino ai geni marcatori degli adipociti come Adipoq, Fabp4, Plin1 e Pnpla2, mentre nessun arricchimento è stato mostrato con il controllo negativo (Figura 5). Abbiamo anche osservato l'arricchimento con il gene termogenico Ucp1 specificamente in BAT ma non in eWAT o iWAT (Figura 5).
Dopo il sequenziamento e l'analisi, abbiamo identificato ~ 55.000 picchi combinati da tre diversi depositi adiposi (eWAT, iWAT e BAT). Le letture mitocondriali erano del <2% e la frazione sotto i picchi era ~ 18% -44% (Figura 6A, B). I campioni di scarsa qualità possono avere letture mitocondriali significativamente più elevate e / o una frazione inferiore di letture nelle regioni di picco. L'ispezione visiva delle tracce della libreria ATAC-seq ha rivelato picchi multipli forti con elevati rapporti segnale-rumore vicino ai geni marcatori degli adipociti, come Adipoq, Plin1 e Fabp4, da tutti i depositi adiposi (Figura 7A-C). Abbiamo anche osservato forti picchi ATAC-seq nel locus Ucp1 del produttore di adipociti bruni nel campione BAT, ma questi picchi non sono stati osservati nei campioni eWAT o iWAT (Figura 7D). Tutti questi dati indicano il successo dei dati ATAC-seq generati dai nuclei degli adipociti.
Figura 1: Un diagramma di flusso schematico di ATAC-seq adipocyte-specific utilizzando topi NuTRAP. I passaggi specifici di questo protocollo sono evidenziati nelle caselle ombreggiate rosse. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Gating rappresentativo FACS che illustra l'isolamento di nuclei di adipociti marcati mCherry/GFP dai tessuti adiposi di un topo Adipoq-NuTRAP. (A-C) Analisi citometrica a flusso di nuclei isolati da eWAT, iWAT e BAT di un topo Adipoq-NuTRAP. (D) Analisi quantitativa di nuclei da adipociti e non adipociti in eWAT, iWAT e BAT di un topo Adipoq-NuTRAP. I dati sono medi ± SEM (n = 3). Questi dati sul conteggio dei nuclei provengono da Roh et al.7. Abbreviazioni: FACS = selezione cellulare attivata da fluorescenza; GFP = proteina fluorescente verde; eWAT = tessuto adiposo bianco epididimale; iWAT = tessuto adiposo bianco inguinale; BAT = tessuto adiposo bruno; NuTRAP = marcatura nucleare e purificazione dell'affinità ribosomiale traslante; Adipoq-NuTRAP = topo NuTRAP incrociato con la linea adiponectina-Cre adipociti-specifica; FSC-A = area di picco di dispersione in avanti; FSC-H = altezza del picco di dispersione in avanti; SSC-A = area laterale del picco di dispersione; FITC-A = area del picco dell'isotiocianato di fluoresceina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Curve di amplificazione rappresentative da qRT-PCR . (A) Campione di buona qualità che richiede sette cicli di amplificazione aggiuntivi. (B) Campione di scarsa qualità che necessita di ≥15 cicli aggiuntivi. Abbreviazione: qRT-PCR = quantitative reverse transcription PCR. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Profili di distribuzione dimensionale delle librerie ATAC-seq. (A-C) Le librerie di buona qualità e (D) di scarsa qualità sono mostrate come risultati rappresentativi. Abbreviazioni: ATAC-seq = saggio per cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alta produttività; FU = unità di fluorescenza; bp = coppie di basi; NFR = regione libera da nucleosomi; eWAT = tessuto adiposo bianco epididimale; iWAT = tessuto adiposo bianco inguinale; BAT = tessuto adiposo bruno. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Analisi qPCR del controllo qualità delle librerie ATAC-seq. Arricchimenti per promotori e potenziatori vicino ai marcatori adipocitari generali Adipoq, Fabp4, Plin1 e Pnpla2 o al marcatore adipocitario bruno Ucp1. Abbreviazioni: ATAC-seq = saggio per cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alta produttività; NC = controllo negativo; eWAT = tessuto adiposo bianco epididimale; iWAT = tessuto adiposo bianco inguinale; BAT = tessuto adiposo bruno. I dati sono medi ± SEM (n = 2). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Letture e frazioni dei mitocondri sotto i picchi delle librerie ATAC-seq . (A) I mitocondri leggono (%) e (B) frazioni sotto i picchi (%) da eWAT, iWAT e BAT. Abbreviazioni: ATAC-seq = saggio per cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alta produttività; eWAT = tessuto adiposo bianco epididimale; iWAT = tessuto adiposo bianco inguinale; BAT = tessuto adiposo bruno. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Tracce del segnale ATAC-seq nei loci dei geni rappresentativi. (A-C) Geni marcatori adipocitari generali. (B) Marcatore bruno adipocita-specifico. Abbreviazioni: ATAC-seq = saggio per cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alta produttività; eWAT = tessuto adiposo bianco epididimale; iWAT = tessuto adiposo bianco inguinale; BAT = tessuto adiposo bruno. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: Componenti della miscela madre Tn5. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Componenti della miscela master PCR e condizioni iniziali del ciclo PCR. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 3: Elenco dei primer con codice a barre per l'amplificazione PCR. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 4: Componenti della miscela madre qPCR. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 5: condizioni di ciclo qPCR. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 6: Condizioni di ciclo della seconda PCR per un'ulteriore amplificazione. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 7: Sequenze di primer e condizioni di ciclo qPCR mirate per il controllo di qualità della libreria ATAC-seq. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 8: Analisi dei risultati della qPCR per il controllo di qualità. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
In questo articolo, abbiamo presentato un protocollo ATAC-seq ottimizzato per valutare l'accessibilità della cromatina adipocita-specifica in vivo. Questo protocollo ATAC-seq che utilizza il mouse Adipoq-NuTRAP ha generato con successo profili di accessibilità della cromatina adipociti-specifici. Il fattore più critico per esperimenti ATAC-seq di successo e riproducibili è la qualità del nucleo. È fondamentale congelare immediatamente i tessuti adiposi sezionati in azoto liquido e conservarli in modo sicuro a -80 °C senza scongelarli fino all'uso. È anche importante prevenire il danno al nucleo adipocitario durante l'isolamento e la selezione del nucleo. I campioni devono essere maneggiati delicatamente tramite centrifugazione a bassa velocità e pipettaggio minimo durante l'intero processo di isolamento dei nuclei.
Un attento gating durante la selezione dei nuclei è fondamentale per isolare selettivamente i nuclei adipocitari marcati con mCherry/GFP (Figura 1). È importante garantire una chiara separazione tra le popolazioni mCherry/GFP-positive e negative. Allo stesso modo, la manipolazione delicata e la selezione rapida sono necessarie per preservare la natura della cromatina nei nuclei. Se la fluorescenza è debole, la selezione richiede troppo tempo e/o le frazioni adipocitarie sono fuori dagli intervalli previsti, ciò indica che potrebbero esserci problemi con i campioni o problemi durante le procedure di isolamento dei nuclei. Questo protocollo può essere modificato a seconda delle circostanze sperimentali. In primo luogo, il numero di nuclei necessari per l'ATAC-seq può scendere a 1.000 o fino a 100.000. Se ci sono meno di 5.000 nuclei, l'uso di un volume ulteriormente ridotto (0,6 μL) dell'enzima TDE I impedirebbe l'over-tagmentation. Per un numero di nuclei uguale o superiore a 50.000, il volume della miscela principale Tn5 può essere raddoppiato a 50 μL, che è lo stesso volume utilizzato nel protocollo originale10.
In secondo luogo, altri sistemi di etichettatura dei nuclei, come i topi INTACT (isolamento dei nuclei etichettati in specifici tipi di cellule), possono essere utilizzati al posto dei topi NuTRAP16. Poiché i topi INTATTI esprimono la proteina di membrana nucleare SUN1 marcata con GFP, i nuclei marcati con GFP possono essere isolati mediante ordinamento e utilizzati per ATAC-seq utilizzando gli stessi metodi descritti in questo protocollo. È possibile adottare anche altri metodi di etichettatura nucleare. Infine, in vitro-coltura gli adipociti possono essere utilizzati anche per ATAC-seq seguendo questo protocollo. Per questo, le cellule coltivate su piatti/piatti vengono raschiate, raccolte utilizzando NPB e quindi sottoposte alle stesse procedure a valle, tranne per il fatto che la selezione dovrebbe essere effettuata solo in base alle dimensioni, alla complessità e all'Hoechst, non a mCherry/GFP come descritto in precedenza15.
Questo protocollo ATAC-seq adipocyte-specific che utilizza la tecnica NuTRAP pone un limite in quanto non funziona senza etichettatura fluorescente; Pertanto, l'analisi di campioni umani non funzionerà con questa tecnica. Tuttavia, è ancora possibile eseguire ATAC-seq con adipociti isolati mediante metodi di digestione e flottazione dei tessuti. Va notato che lavorare con adipociti floater umani ha alcune limitazioni, come la contaminazione da altri tipi di cellule quando si utilizza la centrifugazione a bassa velocità e la perdita di adipociti di grandi dimensioni quando si utilizza la centrifugazione ad alta velocità. Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi tipo di cellula per la quale sono disponibili specifiche linee Cre, consentendo un'efficiente profilazione della cromatina specifica del tipo di cellula anche con input cellulari limitati17. In conclusione, questo protocollo ATAC-seq migliorato sarà utile ai ricercatori che desiderano valutare l'accessibilità della cromatina da specifici tipi di cellule all'interno di tessuti eterogenei ex vivo, oltre agli adipociti che abbiamo discusso qui.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari rilevanti o materiali relativi alla ricerca descritta in questo articolo.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dallo IUSM Showalter Research Trust Fund (a H.C.R.), un centro IUSM per il diabete e le malattie metaboliche Pilot and Feasibility grant (a H.C.R.), il National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK129289 a H.C.R.), e l'American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 a H.C.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio?5 |
References
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