Summary
אנו מציגים פרוטוקול לבדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף בתפוקה גבוהה (ATAC-seq) במיוחד על אדיפוציטים באמצעות מיון גרעין עם רקמות שומן שבודדו מעכברי כתב טרנסגניים עם תיוג פלואורסצנטי גרעיני.
Abstract
בדיקה עבור כרומטין נגיש טרנספוזאז עם ריצוף תפוקה גבוהה (ATAC-seq) היא טכניקה חזקה המאפשרת פרופיל נגישות כרומטין ברחבי הגנום. טכניקה זו שימושית להבנת מנגנוני הבקרה של ביטוי גנים במגוון תהליכים ביולוגיים. למרות ATAC-seq כבר שונה עבור סוגים שונים של דגימות, לא היו שינויים יעילים של שיטות ATAC-seq עבור רקמות שומן. אתגרים עם רקמות שומן כוללים הטרוגניות תאית מורכבת, תכולת שומנים גדולה וזיהום מיטוכונדריאלי גבוה. כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו פרוטוקול המאפשר ATAC-seq ספציפי לאדיפוציט על ידי שימוש במיון גרעין המופעל על ידי פלואורסצנטיות עם רקמות שומן מעכבר הכתב המהונדס Nuclear Taggging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). פרוטוקול זה מפיק נתונים באיכות גבוהה עם קריאות רצף מבוזבזות מינימליות תוך הפחתת כמות הקלט והריאגנטים של הגרעין. מאמר זה מספק הוראות מפורטות שלב אחר שלב עבור שיטת ATAC-seq שאומתה לשימוש בגרעיני אדיפוציט שבודדו מרקמות שומן עכבר. פרוטוקול זה יסייע בחקירת דינמיקת הכרומטין באדיפוציטים על גירויים ביולוגיים מגוונים, אשר יאפשרו תובנות ביולוגיות חדשות.
Introduction
רקמת שומן, המתמחה באחסון אנרגיה עודפת בצורה של מולקולות שומנים, היא איבר מפתח לוויסות מטבולי. הבקרה הקפדנית על היווצרות ותחזוקה של אדיפוציטים חיונית לתפקוד רקמת השומן ולהומאוסטזיס אנרגיה של כל הגוף1. רגולטורי שעתוק רבים ממלאים תפקיד קריטי בבקרת התמיינות האדיפוציטים, הפלסטיות והתפקוד; חלק מהרגולטורים הללו מעורבים בהפרעות מטבוליות בבני אדם 2,3. ההתקדמות האחרונה בטכניקות ריצוף בתפוקה גבוהה לביטוי גנים וניתוח אפיגנומי הקלה עוד יותר על גילוי הרגולטורים המולקולריים של ביולוגיה אדיפוציטית4. מחקרי פרופיל מולקולרי המשתמשים ברקמות שומן מאתגרים לביצוע בשל ההטרוגניות של רקמות אלה. רקמת השומן מורכבת בעיקר מאדיפוציטים, האחראים על אחסון שומן, אך מכילה גם סוגי תאים שונים אחרים, כגון פיברובלסטים, תאי אנדותל ותאי חיסון5. בנוסף, ההרכב התאי של רקמת השומן משתנה באופן דרמטי בתגובה לשינויים פתופיזיולוגיים כגון טמפרטורה ומצב תזונתי6. כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו בעבר עכבר כתב מהונדס, בשם Nuclear Taggging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), המייצר ריבוזומים המתויגים על ידי GFP וגרעינים ביוטינילטים המתויגים על ידי mCherry באופן תלוי Cre רקומבינאז7. מערכת התיוג הכפול מאפשרת לבצע אנליזה שעתוק ואפיגנומי ספציפיים לסוג התא עם רקמות. באמצעות עכברי NuTRAP שחצו קווי אדיפונקטין-Cre ספציפיים לאדיפוציט (Adipoq-NuTRAP), אפיינו בעבר פרופילי ביטוי גנים ומצבי כרומטין מאוכלוסיות אדיפוציטים טהורות in vivo וקבענו כיצד הם משתנים במהלך השמנת יתר 7,8. בעבר, עכברי NuTRAP שחצו קווי Ucp1-Cre ספציפיים לאדיפוציט חום ובז' (Ucp1-NuTRAP) אפשרו לנו לאפיין את העיצוב מחדש האפיגנומי של אוכלוסיית האדיפוציטים התרמוגניים הנדירים, אדיפוציטים בצבע בז', בתגובה לשינויי טמפרטורה9.
ATAC-seq היא שיטה אנליטית נפוצה להערכת נגישות הכרומטין ברחבי הגנום. טרנספוזאז Tn5 היפר-תגובתי המשמש ב- ATAC-seq מאפשר זיהוי של אזורי כרומטין פתוחים על ידי תיוג מתאמי ריצוף באזור הנגיש לכרומטין, של גרעינים10. ATAC-seq היא שיטה פשוטה, אך היא מספקת תוצאות חזקות והיא יעילה מאוד גם עם דגימות קלט נמוך. בכך היא הפכה לאחת משיטות האפיגנומיות הפופולריות ביותר ותרמה להבנת מנגנוני הבקרה של ביטוי גנים בהקשרים ביולוגיים מגוונים. מאז שנוצר פרוטוקול ATAC-seq המקורי, פותחו טכניקות שונות הנגזרות מ- ATAC-seq כדי לשנות ולייעל את הפרוטוקול עבור סוגים שונים של דגימות. לדוגמה, Fast-ATAC מיועד לניתוח דגימות תאי דם11, Omni-ATAC הוא פרוטוקול אופטימלי לדגימות רקמות קפואות 12, ו- MiniATAC-seq יעיל לניתוח עוברים בשלב מוקדם13. עם זאת, יישום שיטת ATAC-seq על אדיפוציטים, במיוחד מדגימות רקמות, עדיין מאתגר. בנוסף להטרוגניות של רקמת השומן, תכולת השומנים הגבוהה שלה עלולה להפריע לתגובות רקומבינציה יעילות על ידי טרנספוזאז Tn5 גם לאחר בידוד הגרעין. יתר על כן, תכולת המיטוכונדריה הגבוהה באדיפוציטים, במיוחד באדיפוציטים חומים ובז', גורמת לזיהום גבוה בדנ"א המיטוכונדריאלי ולבזבוז קריאות ריצוף. מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור ATAC-seq ספציפי לאדיפוציט באמצעות עכברי Adipoq-NuTRAP (איור 1). על ידי ניצול מיון גרעינים עם תווית פלואורסצנטית, פרוטוקול זה מאפשר איסוף אוכלוסיות טהורות של גרעיני אדיפוציט הרחק מסוגי תאים מבלבלים אחרים והסרה יעילה של שומנים, מיטוכונדריה ופסולת רקמות. לפיכך, פרוטוקול זה יכול להפיק נתונים באיכות גבוהה ספציפיים לסוג התא ולמזער את הבזבוז מקריאות מיטוכונדריאליות תוך שימוש בכמות מופחתת של קלט וריאגנטים בהשוואה לפרוטוקול הסטנדרטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הטיפול והניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי נהלים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אינדיאנה.
1. הכנות לפני תחילת הניסוי
- הכנת רקמות
- עבור תיוג גרעין אדיפוציט, הצליבו עכברי NuTRAP עם קווי adiponectin-Cre ספציפיים לאדיפוציט (Adipoq-Cre) כדי ליצור עכברי Adipoq-NuTRAP, שהם המיזיגוטיים הן עבור Adipoq-Cre והן עבור NuTRAP.
- נתחו את רקמות השומן המעניינות מעכברי Adipoq-NuTRAP כפי שתואר קודם לכן14.
- יש להקפיא את הרקמות בחנקן נוזלי ולאחסן אותן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.
הערה: ניתן לאחסן כל כרית שומן כמכלול, ואת הרקמות הקפואות ניתן לחתוך מאוחר יותר על קרח יבש לחתיכות קטנות יותר (~ 50 מ"ג) לניסויים. לחלופין, ניתן לחתוך, לחרוש ולהקפיא את רקמות השומן בצינורות לאחסון (~ 50 מ"ג לכל צינור). דגימות קפואות לעולם אינן מורשות להפשיר לאחר ההקפאה עד לשימוש.
- הכנת חיץ
הערה: שמור את החוצצים על קרח לאורך כל הניסוי.- הכן חיץ להכנת גרעין (NPB): 250 mM סוכרוז, 10 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, ו 0.1% NP40. הכן 7 מ"ל של NPB לכל דגימה. הוסף קוקטייל מעכב פרוטאז טרי 100x (סופי 1x), DTT (1 mM סופי) ו Hoechst (סופי 1 מיקרוגרם / מ"ל) NPB לפני השימוש.
הערה: מומלץ להכין NPB טרי, אבל זה יכול להיות מאוחסן ב 4 ° C עד 1 חודש. - הכינו 1x מלח חוצץ פוספט עם 0.1% NP-40 (PBS-N).
- הכן חיץ להכנת גרעין (NPB): 250 mM סוכרוז, 10 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, ו 0.1% NP40. הכן 7 מ"ל של NPB לכל דגימה. הוסף קוקטייל מעכב פרוטאז טרי 100x (סופי 1x), DTT (1 mM סופי) ו Hoechst (סופי 1 מיקרוגרם / מ"ל) NPB לפני השימוש.
2. בידוד גרעין
- זכוכית צוננת להקפיץ הומוגנייזרים, עם אחת Dounce לכל דגימה, על קרח. לאחר מכן, הוסף 7 מ"ל של תערובת NPB לכל Dounce.
הערה: מומלץ להשתמש בעד שמונה דגימות בכל ניסוי. עבודה עם יותר משמונה דגימות תעכב משמעותית את כל השלבים, והיא עלולה במיוחד להוריד את איכות הגרעין במהלך המיון. - מכניסים את רקמת השומן הקפואה (50-100 מ"ג) לכוס ומיד חותכים אותה לכמה חתיכות קטנות יותר בעזרת זוג מספריים ארוכים. שבץ 10x עם מזיק רופף עבור כל הדגימות, ולאחר מכן 10x עם מזיק הדוק.
הערה: רקמות שומן הן רכות, ולכן חיתוך אותם לכמה חתיכות קטנות צריך להיות מספיק. עבור דגימות נדירות, חתיכות קטנות יותר (10-20 מ"ג) ניתן להשתמש, אם כי מספר גרעין האדיפוציט שנאסף עשוי להשתנות. - מסננים דרך מסננת של 100 מיקרומטר לתוך צינור חדש של 50 מ"ל. העבר את ההומוגנאטים המסוננים לצינור חדש של 15 מ"ל על ידי מזיגה. סחרור ב 200 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגת דלי נדנדה. הסר את supernatant ככל האפשר.
הערה: יש לשאוף תחילה באמצעות ואקום, ולאחר מכן להסיר את הנפח שנותר באמצעות מיקרופיפטה. - יש להשהות מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של PBS-N על ידי הקשה עדינה אך יסודית על האצבע.
הערה: הימנע pipetting, שכן זה עלול להזיק לגרעינים. - סנן דרך מסננת 40 מיקרומטר לתוך צינור חדש של 50 מ"ל באמצעות פיפטינג עדין. שטפו את המסננת עם 250 מיקרוליטר של PBS-N. העבר את התרחיף הגרעיני המסונן לצינור מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) באמצעות מיקרופיפטה.
הערה: אם זמין, ניתן להשתמש בצינורות ובמסננות תאים עבור נפחים קטנים יותר כדי למזער את אובדן הדגימה.
3. מיון גרעין
- הכנת צינור איסוף
- הוסף 500 μL של PBS-N לצינורות חדשים של 1.5 מ"ל, והפוך כמה פעמים כדי להרטיב את כל המשטחים הפנימיים עם החיץ.
- סובבו בקצרה את הצינורות כדי להוריד את כל הנוזלים, ואז צננו אותם על קרח עד למיון.
- FACS (איור 2)
- השתמש ב- FSC-A/FSC-H GATING עבור סינגלטים וב- FSC-A/SSC-A להסרת פסולת קטנה או גדולה.
- שער לאוכלוסיית גרעין האדיפוציט החיובי mCherry/GFP.
- אספו 10,000 גרעינים בכל אחד מצינורות האיסוף שהוכנו בשלב 3.1.
- הכנת גרעין לאחר מיון
- הוסף 500 μL של PBS-N לכל צינור איסוף, והפוך כמה פעמים כדי לערבב.
- סובב את צינורות האיסוף ב 200 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגת דלי נדנדה. הסר לחלוטין את הסופרנטנט.
הערה: השתמש תחילה בשואב אבק כדי להסיר בועות, שפך את הסופרנאטנט והשתמש במגבוני נייר כדי להסיר את הנוזל שנותר לחלוטין. הגלולה אינה נראית בשלב זה. הכן את תערובת האב Tn5 במהלך שלב הצנטריפוגה כמתואר להלן.
4. תיוג Tn5 (טבלה 1)
- להכנת 25 μL של תערובת האב Tn5, יש לערבב 12.5 μL של 2x תיוג DNA buffer (TD buffer), 1.25 μL של Tn5 transposase (אנזים TDE I) ו-11.25 μL של מים נטולי נוקלאז.
- הוסף 25 μL של תערובת מאסטר Tn5 לכל כדורית גרעין, והשהה מחדש על ידי פיפטינג עדין. יש לדגור ב-600 סל"ד למשך 30 דקות ב-37°C באמצעות תרמומיקסר.
5. טיהור DNA
הערה: ההליך הבא משתמש בערכת טיהור PCR המוזכרת בטבלת החומרים. ניתן להשתמש בכל שיטות טיהור DNA דומות אחרות.
- הוסף 25 μL של מים נטולי nuclease ל 25 μL של תערובת של תרחיף גרעין Tn5 שהתקבל לאחר שלב 4.2. הנפח הסופי הוא 50 μL לדגימה.
- הוסף 250 μL של PB חיץ.
- הוסף 5 μL של 3 M נתרן אצטט (NaOAc) (pH 5.2).
- מעבירים את התערובת לעמוד (מצורף לערכה המוזכרת), ולצנטריפוגה במשקל של 17,900 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר (RT).
- מחק את הזרימה והחזיר את עמודת הסחיטה לאותו צינור איסוף. הוסף 750 μL של PE חיץ המכיל אתנול מוחלט (EtOH), וצנטריפוגה ב 17,900 × גרם למשך דקה אחת ב- RT.
- מחק את הזרימה והחזיר את עמוד הסחיטה לאותו צינור איסוף. צנטריפוגה ב 17,900 × גרם למשך דקה אחת ב- RT, והשליכו את צינור האיסוף עם הזרימה.
- כדי לקלוע את מקטעי הדנ"א, ציידו את העמוד בצינור חדש של 1.5 מ"ל, הוסיפו 10 מיקרוליטר של EB חיץ והשאירו ב-RT למשך 3 דקות. צנטריפוגה ב-17,900 × גרם למשך דקה אחת ב-RT.
הערה: ניתן לאחסן את הדגימות ב -4 ° C במשך ימים או ב -20 ° C במשך שבועות.
6. הגברת PCR (טבלה 2)
הערה: הפריימרים ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלה 3.
- כדי להגביר מקטעי DNA שעברו טרנספוזיה, הכינו תערובת מאסטר PCR מבלי להוסיף פריימר ברקוד Ad2.n ייחודי (פריימר #2). השתמש 38 μL של תערובת מאסטר PCR לכל דגימה: 11 μL של מים ללא nuclease, 2 μL של 25 μM Ad1_noMX פריימר (פריימר #1), ו 25 μL של 2x PCR מאסטר מיקס.
- הוסף 38 μL של תערובת האב PCR לתוך צינור PCR 0.2 מ"ל.
- הוסף 10 μL של מקטעי DNA מדוללים משלב 5.7.
- הוסף 2 μL של פריימר 25 μM #2, אשר צריך להיות ספציפי עבור כל דגימה.
- הפעל את ה- PCR בהתאם לתנאי הרכיבה המצוינים בטבלה 2.
7. בדיקת PCR כמותית בזמן אמת (qPCR) (טבלה 4)
הערה: שלב זה נועד לקבוע את המחזורים הנוספים הדרושים כדי להגביר את הדנ"א. זה אופציונלי אבל מומלץ מאוד, במיוחד עבור ניסויים חדשים.
- הכינו תערובת מאסטר qPCR מבלי להוסיף פריימר #2. השתמש 9.975 μL של תערובת מאסטר qPCR לכל דגימה: 4.41 μL של מים ללא nuclease, 0.25 μL של 25 μM פריימר #1, 5 μL של 2x PCR מאסטר מיקס, ו 0.09 μL 100x SYBR ירוק I.
הערה: כדי להכין 100x SYBR Green I, דללו את המלאי של 10,000x במים נטולי נוקלאז. מכיוון שהנפח של 100x SYBR Green בו השתמשתי עבור תערובת המאסטר qPCR הוא זניח, קל יותר ליצור תערובת מאסטר נוספת של 100x SYBR Green I מדולל (למשל, עבור 8-10 דגימות). - הוסף 9.975 μL של תערובת האב qPCR לכל באר של צלחת qPCR.
- הוסף 0.25 μL של פריימר 25 μM #2 לכל באר.
הערה: הקפד להוסיף את אותו פריימר #2 כדי להתאים למה שנוסף לכל דוגמה ספציפית בשלב 6.4. - הוסף 5 μL של תגובת PCR המתקבלת לאחר הגברת PCR בשלב 6.5, וערבב על ידי pipetting.
הערה: 45 μL הנותרים של תגובת ה-PCR ישמשו להגברת ה-PCR השנייה. - הפעל את ה- qPCR בהתאם לתנאי הרכיבה המצוינים בטבלה 5.
- בדוק את עקומות ההגברה, וזהה את מספר מחזורי ה-PCR הנוספים הדרושים על-ידי הערכת מספר המחזורים שהגיעו ל~35% מהמקסימום (איור 3A).
הערה: בדרך כלל, 10,000 גרעינים דורשים חמישה עד שמונה מחזורי PCR נוספים.
8. הגברה נוספת של PCR
- הפעל את ה- PCR באמצעות כל 45 μL הנותרים של תגובת ה- PCR בהתאם לחישובים משלב 7.6 (טבלה 6).
הערה: כל דגימה עשויה לדרוש מספר שונה של מחזורי הגברה.
9. טיהור DNA שני באמצעות ערכת טיהור PCR
- השתמש באותם הליכים כמו בסעיף 5, אך מחק את מקטעי הדנ"א המוגברים עם 20 μL של EB חיץ.
10. בחירת גודל מקטע DNA
הערה: השתמש בחרוזי אימוביליזציה הפיכים בשלב מלא, כמתואר להלן. ניתן להשתמש בכל חרוזי טיהור DNA דומים אחרים בהתאם להוראות היצרן. מתלה החרוזים SPRI צריך להיות מושעה מחדש לחלוטין ומאוזן ב- RT עם סיבוב לפני השימוש.
- העבר את ה- DNA המדולל לצינור PCR חדש, והוסף 80 μL של EB חיץ כדי ליצור נפח סופי של 100 μL.
- מוסיפים 55 μL של חרוזי SPRI (נפח דגימה פי 0.55), ומערבבים על ידי פיפטטינג. יש לדגור במשך 5 דקות ב-RT, ולאחר מכן להפריד על מעמד מגנטי מיני עבור רצועות PCR עם 8 צינורות למשך 5 דקות.
- מעבירים 150 μL של הסופרנאטנט לצינור PCR חדש. מוסיפים 95 μL של חרוזי SPRI, ומערבבים על ידי pipetting.
הערה: הסופרנאטנט מכיל DNA של כ-500 bp או פחות. - יש לדגור במשך 5 דקות ב-RT, ולאחר מכן להפריד על המעמד המגנטי המיני למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט בזהירות.
- שטפו את החרוזים במשך דקה אחת עם 200 μL של 70% EtOH. חזרו על הפעולה פעמיים במשך שלוש שטיפות בסך הכל.
הערה: אין להזיז שפופרות PCR מהמעמד המגנטי במהלך השטיפות. - לאחר השטיפה הסופית, סובבו את הצינורות ב-1,000 × גרם למשך דקה אחת, והוציאו את ה-EtOH שנותר. יבש את הגלולה עם מכסה פתוח ב 37 ° C במשך 2 דקות על מכונת PCR.
הערה: כדורי החרוזים צריכים להציג רק כמה סדקים קלים לאחר הייבוש. יש להימנע מייבוש יתר. - השהה מחדש את הגלולה עם 20 μL של EB חיץ על ידי pipetting, ודגרה במשך 5 דקות ב RT. להפריד על מעמד מגנטי מיני במשך 5 דקות, ולאחר מכן להעביר 18 μL של supernatant המכיל את הספרייה הסופית לצינור חדש 1.5 מ"ל.
הערה: ניתן לאחסן את הספרייה בטמפרטורה של -20°C בעת ביצוע בדיקת איכות.
11. כימות DNA באמצעות פלואורומטר
- להכנת תערובת האב, יש לדלל מגיב 200x dsDNA High Sensitivity (HS) עם מאגר dsDNA HS לריכוז סופי של 1x.
- עבור תקנים, הוסף 190 μL של תערובת מאסטר 1x ו 10 μL של תקן 1 או תקן 2 לצינור פלואורומטר.
הערה: אזן את התקנים ב- RT בחושך לפני תחילת הכימות. - עבור דגימות הספרייה, הוסף 198 μL של תערובת האב 1x ו- 2 μL של כל דגימה לצינור פלואורומטר נפרד.
הערה: אם כמויות הדגימה מוגבלות, ניתן להקטין את נפח הדגימה ל- 1 μL ולהגדיל את נפח תערובת האב 1x ל- 199 μL. - מערבלים או מנערים את צינורות הפלואורומטר, ונותנים להם לשבת במשך 5 דקות ב- RT בחושך. מדוד את ריכוז ה- DNA באמצעות בדיקת dsDNA HS של הפלואורומטר.
12. בדיקת איכות הספרייה על ידי מערכות אלקטרופורזה בעלות רגישות גבוהה
- קח את ספריית ATAC-seq, ודלל עם מים נטולי נוקלאז לריכוז סופי של 1-5 ננוגרם/μL.
- נתח את התפלגות הגודל של ספריות ATAC-seq באמצעות מערכות אלקטרופורזה אוטומטיות בעלות רגישות גבוהה בהתאם לפרוטוקולים של היצרן.
13. בדיקת איכות של ספריית ATAC-seq באמצעות qPCR ממוקד
- קח 5-10 ng של ספריית ATAC-seq, ודלל עם 50 μL של מים ללא nuclease.
- הפעל את ה- qPCR באמצעות פריימרים המכוונים למקדמים והמשפרים הידועים כפעילים באדיפוציטים בהתאם לתנאי המחזור המצוינים בטבלה 7.
- השתמש בפריימרים לבקרה שלילית המכוונים לאזורים גנומיים סגורים/שקטים (טבלה 7).
- חישוב העשרת המקדם/המשפרים על פני הבקרות השליליות (טבלה 8).
הערה: צפויה העשרה של פי ≥פי 10-20 עם דגימות מוצלחות.
14. רצף
- שלח את ספריות ATAC-seq לריצוף. השתמש ברצף מותאם (2 x 34 bp, 2 x 50 bp או יותר) עם מספרי קריאה ממוצעים של 10-30 מיליון קריאות לדגימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לנתח רקמת שומן באמצעות פרוטוקול ATAC-seq זה, יצרנו עכברי Adipoq-NuTRAP שניזונו מתזונת צ'או; לאחר מכן בודדנו גרעיני אדיפוציט מרקמת השומן הלבן האפידידימלית (eWAT), מרקמת השומן הלבן המפשעה (iWAT) ומרקמת השומן החום (BAT) באמצעות ציטומטריית זרימה. הגרעינים המבודדים שימשו לתיוג, ולאחר מכן לטיהור DNA, הגברת PCR, שלבי בדיקת איכות, ריצוף וניתוח נתונים, כמתואר לעיל. מטרת הניסוי המייצג הזה הייתה לאפיין את נגישות הכרומטין של אוכלוסיות אדיפוציטים טהורים שבודדו ממחסני שומן שונים.
ראינו שניתן להבחין בבירור בין גרעיני האדיפוציט המסומנים ב-mCherry לבין גרעיני תאים אחרים שבודדו מרקמות השומן של עכבר Adipoq-NuTRAP באמצעות ציטומטריית זרימה (איור 2A-C). היו הבדלים בשברי האדיפוציט בהתאם לסוג מחסן השומן: ~50% ב-eWAT, ~30% ב-iWAT ו~65% ב-BAT (איור 2D)7. אספנו 10,000 גרעינים תוך 2-10 דקות לכל דגימה והשתמשנו בהם עבור הליכי ATAC-seq. הרצנו בסך הכל 10-13 מחזורי PCR (חמישה מחזורים של ה-PCR הראשון וחמישה עד שמונה מחזורים של ה-PCR השני, איור 3A). אם הדגימות דורשות יותר מ-15 מחזורי PCR בסך הכל, הדבר עשוי להצביע על דגימות באיכות נמוכה (איור 3B). ניתוח התפלגות הגודל של ספריות ATAC-seq הראה פסגות מרובות המתאימות לאזור נטול הנוקלאוזומים (NFR) ולמונו, די ורב-נוקלאוזומים (איור 4A-C), עם גדלים ממוצעים של ~500-800 bp. דגימות באיכות ירודה הראו בדרך כלל בעיקר NFR ללא פסגות נוקלאוזומליות או מעטות (איור 4D). בדיקות האיכות של ניתוח qRT-PCR הראו העשרה של פי 10-20 עם היסודות הגנומיים החיוביים ליד גנים של סמן אדיפוציט כמו Adipoq, Fabp4, Plin1 ו-Pnpla2, בעוד שלא הודגמה העשרה עם הבקרה השלילית (איור 5). ראינו גם העשרה עם הגן התרמוגני Ucp1 באופן ספציפי ב-BAT, אבל לא ב-eWAT או ב-iWAT (איור 5).
לאחר הריצוף והניתוח, זיהינו ~55,000 פסגות משולבות משלושה מחסני שומן שונים (eWAT, iWAT ו-BAT). קריאות המיטוכונדריה היו <2%, והשבר מתחת לפסגות היה ~18%-44% (איור 6A, B). דגימות באיכות ירודה עשויות להכיל קריאות מיטוכונדריה גבוהות משמעותית ו/או חלק קטן יותר של קריאות באזורי השיא. בדיקה חזותית של רצועות ספריית ATAC-seq חשפה פסגות חזקות מרובות עם יחסי אות לרעש גבוהים ליד גנים של סמן אדיפוציט, כגון Adipoq, Plin1 ו-Fabp4, מכל מחסני השומן (איור 7A-C). ראינו גם פסגות ATAC-seq חזקות בלוקוס Ucp1 של יצרנית האדיפוציטים החומים בדגימת BAT, אולם הפסגות האלה לא נצפו בדגימות eWAT או iWAT (איור 7D). כל הנתונים הללו מצביעים על נתוני ATAC-seq מוצלחים שנוצרו מגרעיני אדיפוציטים.
איור 1: תרשים זרימה סכמטי של ATAC-seq ספציפי לאדיפוציט באמצעות עכברי NuTRAP. השלבים הייחודיים לפרוטוקול זה מודגשים בתיבות המוצללות באדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: FACS מייצג שמדגים את הבידוד של גרעיני אדיפוציט מתויגים mCherry/GFP מרקמות השומן של עכבר Adipoq-NuTRAP. (א-ג) ניתוח ציטומטריית זרימה של גרעינים מבודדים מ- eWAT, iWAT ו- BAT של עכבר Adipoq-NuTRAP. (D) ניתוח כמותי של גרעינים מאדיפוציטים ושאינם אדיפוציטים ב-eWAT, iWAT ו-BAT של עכבר Adipoq-NuTRAP. הנתונים ממוצעים ± SEM (n = 3). נתוני ספירת גרעינים אלה לקוחים מ-Roh et al.7. קיצורים: FACS = מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; eWAT = רקמת שומן לבנה אפידידימלית; iWAT = רקמת שומן לבנה מפשעתית; BAT = רקמת שומן חומה; NuTRAP = תיוג גרעיני ותרגום טיהור זיקה ריבוזום; Adipoq-NuTRAP = עכבר NuTRAP מוצלב עם קו אדיפונקטין-Cre ספציפי לאדיפוציט; FSC-A = אזור פיזור-שיא קדמי; FSC-H = גובה פיזור שיא קדימה; SSC-A = אזור פיזור צדדי; FITC-A = אזור שיא איזותיוציאנט פלואורסצאין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: עקומות הגברה מייצגות מ- qRT-PCR . (A) דגימה באיכות טובה הזקוקה לשבעה מחזורי הגברה נוספים. (B) דגימה באיכות ירודה הזקוקה ל≥15 מחזורים נוספים. קיצור: qRT-PCR = PCR תמלול הפוך כמותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: פרופילי התפלגות גודל של ספריות ATAC-seq. (A-C) ספריות באיכות טובה ו-(D) באיכות ירודה מוצגות כתוצאות מייצגות. קיצורים: ATAC-seq = בדיקה עבור כרומטין נגיש transposase עם רצף תפוקה גבוהה; FU = יחידות פלואורסצנטיות; bp = זוגות בסיס; NFR = אזור ללא נוקלאוזומים; eWAT = רקמת שומן לבנה אפידידימלית; iWAT = רקמת שומן לבנה מפשעתית; BAT = רקמת שומן חומה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח qPCR של בקרת איכות של ספריות ATAC-seq. העשרה למקדמים ומשפרים ליד סמני האדיפוציט הכלליים Adipoq, Fabp4, Plin1 ו-Pnpla2 או סמן האדיפוציט החום Ucp1. קיצורים: ATAC-seq = בדיקה עבור כרומטין נגיש transposase עם רצף תפוקה גבוהה; NC = שליטה שלילית; eWAT = רקמת שומן לבנה אפידידימלית; iWAT = רקמת שומן לבנה מפשעתית; BAT = רקמת שומן חומה. הנתונים ממוצעים ± SEM (n = 2). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: מיטוכונדריה קוראת ושברים מתחת לפסגות של ספריות ATAC-seq. (A) מיטוכונדריה קוראת (%) ו-(B) שברים מתחת לפסגות (%) מ-eWAT, iWAT ו-BAT. קיצורים: ATAC-seq = בדיקה עבור כרומטין נגיש transposase עם רצף תפוקה גבוהה; eWAT = רקמת שומן לבנה אפידידימלית; iWAT = רקמת שומן לבנה מפשעתית; BAT = רקמת שומן חומה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: מעקב אחר אותות ATAC-seq באתרים של גנים מייצגים. (A-C) גנים כלליים של סמן אדיפוציט. (B) סמן סגול לאדיפוציט חום. קיצורים: ATAC-seq = בדיקה עבור כרומטין נגיש transposase עם רצף תפוקה גבוהה; eWAT = רקמת שומן לבנה אפידידימלית; iWAT = רקמת שומן לבנה מפשעתית; BAT = רקמת שומן חומה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: רכיבים של תערובת האב Tn5. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: רכיבים של תערובת האב PCR ותנאי מחזור PCR ראשוניים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 3: רשימת הפריימרים הברקודיים להגברת PCR. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 4: רכיבים של תערובת האב qPCR. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 5: תנאי רכיבה על אופניים qPCR. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 6: תנאי מחזור PCR שני להגברה נוספת. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 7: רצפי פריימר ותנאי מחזור qPCR ממוקדים לבדיקת האיכות של ספריית ATAC-seq. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 8: ניתוח תוצאות qPCR לבדיקת איכות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה, הצגנו פרוטוקול ATAC-seq ממוטב להערכת נגישות כרומטין ספציפי לאדיפוציט in vivo. פרוטוקול ATAC-seq זה המשתמש בעכבר Adipoq-NuTRAP יצר בהצלחה פרופילי נגישות של כרומטין ספציפיים לאדיפוציט. הגורם הקריטי ביותר לניסויי ATAC-seq מוצלחים וניתנים לשחזור הוא איכות הגרעין. חשוב להקפיא מיד את רקמות השומן המנותחות בחנקן נוזלי ולאחסן אותן בבטחה בטמפרטורה של -80°C מבלי להפשיר עד לשימוש. כמו כן, חשוב למנוע נזק לגרעין האדיפוציט במהלך בידוד ומיון הגרעין. יש לטפל בדגימות בעדינות באמצעות צנטריפוגה במהירות נמוכה ומינימום פיפטינג במהלך כל תהליך בידוד הגרעינים.
גאטינג זהיר במהלך מיון גרעינים הוא חיוני כדי לבודד באופן סלקטיבי את גרעיני האדיפוציט המתויגים mCherry/GFP (איור 1). חשוב להקפיד על הפרדה ברורה בין האוכלוסיות החיוביות והשליליות של mCherry/GFP. כמו כן, טיפול עדין ומיון מהיר נחוצים כדי לשמור על אופי הכרומטין בגרעינים. אם הפלואורסצנטיות חלשה, המיון לוקח זמן רב מדי, ו / או שברי האדיפוציט נמצאים מחוץ לטווחים הצפויים, הדבר מצביע על כך שייתכנו בעיות עם הדגימות או בעיות במהלך הליכי בידוד הגרעינים. פרוטוקול זה ניתן לשינוי בהתאם לנסיבות הניסוי. ראשית, מספר הגרעינים הדרוש ל-ATAC-seq יכול לרדת ל-1,000 או עד 100,000. אם יש פחות מ-5,000 גרעינים, שימוש בנפח מופחת נוסף (0.6 μL) של האנזים TDE I ימנע תיוג יתר. עבור מספר גרעינים השווה או גבוה מ- 50,000, ניתן להכפיל את נפח תערובת האב Tn5 ל- 50 μL, שהוא אותו נפח ששימש בפרוטוקולהמקורי 10.
שנית, ניתן להשתמש במערכות תיוג גרעין אחרות, כגון עכברי INTACT (בידוד גרעינים המסומנים בסוגי תאים ספציפיים), במקום עכברי NuTRAP16. מכיוון שעכברי INTACT מבטאים חלבון קרום גרעיני SUN1 המתויג על ידי GFP, ניתן לבודד גרעינים המתויגים ב-GFP על ידי מיון ולהשתמש בהם עבור ATAC-seq באותן שיטות המתוארות בפרוטוקול זה. ניתן לאמץ גם כל שיטת סימון גרעינית אחרת. לבסוף, ניתן להשתמש באדיפוציטים בתרבית חוץ גופית גם עבור ATAC-seq בעקבות פרוטוקול זה. לשם כך, תאים הגדלים על כלים/צלחות מגרדים, נאספים באמצעות NPB, ולאחר מכן נתונים לאותם הליכים במורד הזרם - אלא שהמיון צריך להיעשות רק על בסיס גודל, מורכבות והוכסט, ולא mCherry/GFP כפי שתואר קודם לכן15.
פרוטוקול ATAC-seq ספציפי לאדיפוציט זה המשתמש בטכניקת NuTRAP מהווה מגבלה מכיוון שהוא אינו פועל ללא תיוג פלואורסצנטי; לכן, ניתוח דגימות אנושיות לא יעבוד עם טכניקה זו. עם זאת, עדיין ניתן לבצע ATAC-seq עם אדיפוציטים מבודדים על ידי עיכול רקמות ושיטות ציפה. יש לציין כי לעבודה עם אדיפוציטים צפים אנושיים יש כמה מגבלות, כגון זיהום על ידי סוגי תאים אחרים בעת שימוש בצנטריפוגה במהירות נמוכה ואובדן של אדיפוציטים גדולים בעת שימוש בצנטריפוגה במהירות גבוהה יותר. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל סוג תא שעבורו זמינים קווי Cre ספציפיים, ומאפשר פרופיל כרומטין ספציפי לסוג תא יעיל אפילו עם קלט תא מוגבל17. לסיכום, פרוטוקול ATAC-seq משופר זה יעזור לחוקרים המעוניינים להעריך את נגישות הכרומטין מסוגי תאים ספציפיים בתוך רקמות הטרוגניות ex vivo, בנוסף לאדיפוציטים שדנו בהם כאן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים רלוונטיים או מהותיים הנוגעים למחקר המתואר במאמר זה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי IUSM Showalter Research Trust Fund (ל- H.C.R.), מרכז IUSM לסוכרת ומחלות מטבוליות פיילוט ומענק היתכנות (ל- H.C.R.), המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (R01DK129289 ל- H.C.R.), ופרס הפקולטה הצעירה של האגודה האמריקאית לסוכרת (7-21-JDF-056 ל- H.C.R).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio?5 |
References
- Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
- Farmer, S. R.
- Bielczyk-Maczynska, E. White adipocyte plasticity in physiology and disease. Cells. 8 (12), 1507 (2019).
- Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies. Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).
- Esteve Rafols, M. Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity. Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).
- Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications. Experimental and Molecular Medicine. 48, e215 (2016).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Roh, H. C., et al. Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPARγ activity and elevated TGFβ-SMAD signaling. Molecular Metabolism. 42, 101086 (2020).
- Roh, H. C., et al. Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity. Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).
- Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Wu, J., et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA. Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- So, J., et al. Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility. Molecular Metabolism. 66, 101619 (2022).
- Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing. STAR Protocols. 2 (3), 100805 (2021).
- Heyward, F. D., et al. Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin's hunger-suppressing effects. bioRxiv. , (2022).
