Isolering och odling av humana fettbaserade stamceller med en innovativ xenogenfri metod för human terapi

Summary

Xenogena (kemiska eller animaliska produkter) som introduceras i cellterapins berednings-/manipuleringssteg är förknippade med en ökad risk för immunreaktivitet och patogen överföring hos värdpatienter. Här beskrivs en komplett xenogenfri metod för isolering och in vitro-expansion av humana fettderiverade stamceller.

Abstract

Med tanke på den ökande effekten av stamcellsterapi har biosäkerhetsproblem tagits upp när det gäller potentiell kontaminering eller infektionsöverföring på grund av införandet av animaliska produkter under in vitro-manipulation . De xenogena komponenterna, såsom kollagenas eller fetalt bovint serum, som vanligen används under cellisolerings- och expansionsstegen kan associeras med de potentiella riskerna för immunreaktivitet eller virus-, bakterie- och prioninfektion hos de mottagande patienterna. Enligt riktlinjer för god tillverkningssed bör kemisk vävnadsdissociation undvikas, medan fetalt bovint serum (FBS) kan ersättas med xenogenfria kosttillskott. För att garantera cellprodukternas säkerhet är det dessutom viktigt att fastställa mer tillförlitliga och reproducerbara metoder. Vi har utvecklat en innovativ, helt xenogenfri metod för isolering och in vitro-expansion av humana fett-härledda stamceller utan att ändra deras egenskaper jämfört med kollagenas FBS-odlade standardprotokoll. Här isolerades humana fett-härledda stamceller (hASCs) från bukfettvävnad. Provet maldes mekaniskt med sax/skalpell, mikrodissekerades och dispergerades mekaniskt i en 10 cm petriskål och bereddes med skalpellsnitt för att underlätta vidhäftningen av vävnadsfragmenten och migrationen av hASCs. Efter tvättstegen valdes hASC på grund av deras plastvidhäftning utan enzymatisk nedbrytning. De isolerade hASC odlades med medium kompletterat med 5% heparinfritt humant trombocytlysat och lossades med ett djurfritt trypsinsubstitut. I enlighet med god tillverkningssed (GMP) riktlinjer för produktion av cellprodukter avsedda för humanterapi användes inga antibiotika i något odlingsmedium.

Introduction

Under de senaste decennierna har den ökande efterfrågan på innovativa terapeutiska behandlingar gett upphov till betydande insatser och resursinvesteringar inom det translationella medicinområdet¹. Cellbaserade produkter är förknippade med risker som bestäms av cellkällan, tillverkningsprocessen (isolering, expansion eller genetisk modifiering) och de icke-cellulära tillskotten (enzymer, tillväxtfaktorer, odlingstillskott och antibiotika), och dessa riskfaktorer beror på den specifika terapeutiska indikationen. Slutproduktens kvalitet, säkerhet och effektivitet kan påverkas starkt av ovanstående element². Stamcellsterapi kräver att biosäkerhetsprinciper följs; De potentiella riskerna för patogen överföring med produkter av animaliskt ursprung i cellodlingar kan vara problematiska, och det är viktigt att noggrant testa alla produkter som införs vid tillverkningen³.

Den traditionella metoden att isolera humana fettstamceller (hSAC) innebär en enzymatisk nedbrytning som utförs med kollagenas följt av tvättsteg genom centrifugering⁴. Medan enzymatisk isolering i allmänhet anses vara effektivare än andra mekaniska tekniker när det gäller cellutbyten och livskraft, anses de animaliska härledda komponenterna som används, såsom kollagenas, mer än minimalt manipulerade av US Food and Drug Administration. Detta innebär att det finns en signifikant ökad risk för immunreaktioner eller sjukdomsöverföring, vilket begränsar översättningen av hASC-behandling till kliniska miljöer ^5,6.

Trypsinbaserad matsmältning är ett annat enzymatiskt protokoll för att isolera ASC. Olika tekniker har beskrivits med små modifieringar när det gäller trypsinkoncentration, centrifugeringshastighet och inkubationstid. Tyvärr är denna metod inte väl beskriven, och en brist på jämförelse finns i litteraturen, särskilt med de mekaniska isoleringsprotokollen⁷. Men när det gäller översättbarheten av tillvägagångssättet har trypsin samma nackdelar med kollagenas.

Alternativa isoleringsmetoder för att erhålla ASC, baserade på mekaniska krafter och utan enzymtillsats, innefattar höghastighetscentrifugering (800 x g eller 1 280 x g, 15 min) av fettvävnadsfragmenten. Därefter inkuberas pelleten med en röd blodkroppslysbuffert (5 min), följt av ytterligare ett centrifugeringssteg vid 600 x g före resuspension i odlingsmedium. Trots att ett större antal celler isolerades under de första dagarna jämfört med explanteringsmetoderna, visade en tidigare studie lägre eller frånvarande proliferation bortom den andra odlingsveckan⁸.

Dessutom är ytterligare manipulation med xenogent tillsatt medium, såsom fetalt bovint serum (FBS), som används som ett tillväxtfaktortillskott för cellodling, förknippat med en ökad risk för immunreaktivitet och exponering för virus-, bakterie- eller prioninfektioner hos värdpatienten ^9,10. Immunreaktioner och utveckling av urtikariforma utslag har redan beskrivits hos individer som fått flera doser mesenkymala stamceller producerade med FBS¹¹. Dessutom utsätts FBS för batch-till-batch-variabilitet, vilket kan påverka slutproduktens kvalitet¹².

I enlighet med riktlinjerna för god tillverkningssed (GMP) bör enzymatisk vävnadsdissociation undvikas och FBS bör ersättas med xenogenfria kosttillskott. Dessa steg, tillsammans med mer tillförlitliga och reproducerbara protokoll, är avgörande för att stödja tillämpningen av cellterapi ^3,13.

I detta sammanhang har humant trombocytlysat (hPL) föreslagits som ett substitut för FBS eftersom det är ett cellfritt, proteininnehållande, tillväxtfaktorberikat tillskott, och det introducerades tidigare bland cellbaserade produkter av klinisk kvalitet som tillsats till tillväxtmedium för in vitro-cellodling och expansion^14,15. Eftersom hPL är en produkt av mänskligt ursprung används den ofta som ersättning för FBS under in vitro-odling av hASC avsedda för kliniska tillämpningar, vilket minskar problem med immunologiska reaktioner och infektioner relaterade till FBS-översättbarhet^15,16.

Trots de högre produktionskostnaderna har det redan visats att jämfört med FBS stöder hPL cellviabilitet för många celltyper, ökar proliferationen, fördröjer åldrandet, säkerställer genomisk stabilitet och bevarar den cellulära immunofenotypen även i sena cellpassager; Alla dessa element stöder övergången till detta kulturtillägg¹¹.

Syftet med detta arbete var att utveckla ett standardiserat protokoll för att isolera och odla hASC med en komplett djurfri metod, utan att modifiera cellfysiologin och stamhetsegenskaperna i jämförelse med klassiska FBS-odlade hASC (Figur 1).

Protocol

hASC isolerades från bukfettvävnaden hos en frisk kvinna som genomgick bröstrekonstruktion med hjälp av autologa flikar i buken (djupa underlägsna epigastriska perforatorflikar, [DIEP]) vid universitetssjukhuset i Lausanne, CHUV, Lausanne, Schweiz. Den kasserade delen av klaffen och fettvävnaden erhölls efter att patienten undertecknat informerat samtycke. Alla protokoll granskades och godkändes av sjukhusets biobanksavdelning DAL (nummer 314 GGC) och etiska kommittéer i enlighet med Helsingforsdeklarationen.</p…

Representative Results

Genom att tillämpa isoleringsmetoden som beskrivs ovan erhölls hASC framgångsrikt från bukfettvävnadsprover utan användning av kollagenas. Dessutom utvidgades hASC under fullständiga xenogena förhållanden i närvaro av hPL och utan några andra komponenter av animaliskt ursprung. Följande resultat stöder protokollet och erhålls från hASC odlade parallellt med hPL och med FBS som kontrollvillkor. Efter det initiala klusterutseendet visade hASC den klassiska spindelliknande formen o…

Discussion

Fettbaserade stamceller har väckt intresse för translationell forskning under det senaste decenniet på grund av deras överflöd, snabba och prisvärda isoleringsmetoder, hög in vitro / in vivo proliferationshastighet och stamhet / differentieringsegenskaper^18,19,20. Som ett resultat anses hASC vara en utmärkt kandidat för cellbaserade strategier inom regenerativ medicin²¹. Efter i…

Materials

15 mL tubes	euroclone	et5015b
anti-CD105	BD Biosciences	BD560839
anti-CD34	BD Biosciences	BD555821
anti-CD45	BD Biosciences	BD555482
anti-CD73	BD Biosciences	BD561254
autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)	Miltenyi	130-091-222
BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)	BD accuri	–
Burker chamber	Blaubrand	717810
Cell freezing container	corning	CLS432002
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay	Promega	G3582
CoolCell Freezing container	Corning	CLS432002
Cryovials	clearline	390701
Dimethyl sulfide	Sigma Aldrich	D2650-100mL
disposabile blade scalpel	paragon	bs 2982
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose	GIBCO	11965092
Human Platelet Lysate FD (GMP grade)	Stemulate	PL-NH-500
Infinite F50 spectrophotometer	Tecan	–
Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives	Olympus	CKX41
Petri dish 10 cm	Greiner bio-one	664160
Sterile scalpels	Reda	07104-00
Sterile scissors	Bochem	4071
Sterile tweezers	Bochem	1152
Swinging bucket centrifuge	Sigma	3-16K
T25 flasks	Greiner bio-one	6910170
TrypLe (animal free trypsin substitute)	GIBCO	12604-013