Summary
Los productos xenogénicos (químicos o derivados de animales) introducidos en los pasos de preparación/manipulación de la terapia celular se asocian con un mayor riesgo de reactividad inmune y transmisión patogénica en pacientes huéspedes. Aquí, se describe un método completo libre de xenogénicos para el aislamiento y la expansión in vitro de células madre derivadas de tejido adiposo humano.
Abstract
Teniendo en cuenta el creciente impacto de la terapia con células madre, se han planteado preocupaciones de bioseguridad con respecto a la posible contaminación o transmisión de infecciones debido a la introducción de productos derivados de animales durante la manipulación in vitro . Los componentes xenogénicos, como la colagenasa o el suero bovino fetal, comúnmente utilizados durante los pasos de aislamiento y expansión celular podrían estar asociados con los riesgos potenciales de reactividad inmune o infección viral, bacteriana y priónica en los pacientes receptores. Siguiendo las pautas de buenas prácticas de fabricación, se debe evitar la disociación química del tejido, mientras que el suero bovino fetal (FBS) puede sustituirse con suplementos libres de xenogénicos. Además, para garantizar la seguridad de los productos celulares, es importante definir métodos más fiables y reproducibles. Hemos desarrollado un método innovador, completamente libre de xenogénicos, para el aislamiento y la expansión in vitro de células madre derivadas de tejido adiposo humano sin alterar sus propiedades en comparación con los protocolos estándar de cultivo FBS de colagenasa. Aquí, las células madre derivadas de tejido adiposo humano (hASCs) se aislaron del tejido adiposo abdominal. La muestra se picó mecánicamente con tijeras/bisturí, se microdisecó y se dispersó mecánicamente en una placa de Petri de 10 cm, y se preparó con incisiones de bisturí para facilitar la unión de los fragmentos de tejido y la migración de hASCs. Siguiendo los pasos de lavado, se seleccionaron hASCs debido a su adherencia plástica sin digestión enzimática. Las hASCs aisladas se cultivaron con medio suplementado con lisado plaquetario humano libre de heparina al 5% y se separaron con un sustituto de tripsina libre de animales. Siguiendo las instrucciones de buenas prácticas de fabricación (GMP) sobre la producción de productos celulares destinados a la terapia humana, no se utilizaron antibióticos en ningún medio de cultivo.
Introduction
En las últimas décadas, la creciente demanda de tratamientos terapéuticos innovadores ha dado lugar a importantes esfuerzos e inversión de recursos en el campo de la medicina traslacional1. Los productos basados en células están asociados con riesgos determinados por la fuente celular, el proceso de fabricación (aislamiento, expansión o modificación genética) y los suplementos no celulares (enzimas, factores de crecimiento, suplementos de cultivo y antibióticos), y estos factores de riesgo dependen de la indicación terapéutica específica. La calidad, seguridad y eficacia del producto final podrían verse profundamente influenciadas por los elementos indicados anteriormente2. La terapia con células madre requiere la adhesión a los principios de bioseguridad; Los riesgos potenciales de transmisión patógena con productos derivados de animales en cultivo celular podrían ser problemáticos, y la prueba exhaustiva de cualquier producto introducido en la fabricación es esencial3.
El método tradicional para aislar células madre derivadas de tejido adiposo humano (hASCs) implica una digestión enzimática realizada con colagenasa seguida de pasos de lavado a través de centrifugación4. Si bien el aislamiento enzimático generalmente se considera más eficiente que otras técnicas mecánicas en términos de rendimiento celular y viabilidad, los componentes derivados de animales utilizados, como la colagenasa, se consideran más que mínimamente manipulados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos. Esto significa que existe un riesgo significativamente mayor de reacciones inmunes o transmisión de enfermedades, lo que limita la traducción de la terapia con hASC a entornos clínicos 5,6.
La digestión basada en tripsina es otro protocolo enzimático para aislar las ASC. Se han descrito diferentes técnicas con ligeras modificaciones en cuanto a la concentración de tripsina, velocidad de centrifugación y tiempo de incubación. Desafortunadamente, este método no está bien descrito, y existe una falta de comparación en la literatura, particularmente con los protocolos de aislamiento mecánico7. Sin embargo, en términos de la traducibilidad del enfoque, la tripsina tiene los mismos inconvenientes de la colagenasa.
Los métodos alternativos de aislamiento para obtener ASC, basados en fuerzas mecánicas y sin adición de enzimas, implican la centrifugación a alta velocidad (800 x g o 1.280 x g, 15 min) de los fragmentos de tejido adiposo. A continuación, el pellet se incuba con un tampón de lisis de glóbulos rojos (5 min), seguido de otro paso de centrifugación a 600 x g antes de la resuspensión en medio de cultivo. A pesar de un mayor número de células aisladas en los primeros días en comparación con los métodos de explante, un estudio previo mostró menor o ausencia de proliferación más allá de la segunda semana de cultivo8.
Además de eso, la manipulación adicional con medio xenogénico agregado, como el suero bovino fetal (FBS), que se utiliza como un suplemento de factor de crecimiento para cultivo celular, se asocia con un mayor riesgo de reactividad inmune y exposición a infecciones virales, bacterianas o priónicas del paciente huésped 9,10. Las reacciones inmunes y el desarrollo de erupción urticariforme ya se han descrito en individuos que reciben varias dosis de células madre mesenquimales producidas con FBS11. Además, FBS está sujeto a variabilidad de lote a lote, lo que puede tener un impacto en la calidad del producto final12.
De acuerdo con las directrices de buenas prácticas de fabricación (GMP), se debe evitar la disociación enzimática del tejido, y FBS debe sustituirse con suplementos libres de xenogénicos. Estos pasos, junto con protocolos más confiables y reproducibles, son esenciales para apoyar la aplicación de la terapia celular 3,13.
En este contexto, el lisado plaquetario humano (hPL) ha sido sugerido como un sustituto del FBS, ya que es un suplemento libre de células, que contiene proteínas, enriquecido con factor de crecimiento, y se introdujo anteriormente entre los productos basados en células de grado clínico como aditivo del medio de crecimiento para el cultivo y expansión celular in vitro 14,15. Como el hPL es un producto derivado del ser humano, se utiliza con frecuencia como sustituto del FBS durante el cultivo in vitro de hASCs destinadas a aplicaciones clínicas, reduciendo así los problemas relacionados con las reacciones inmunológicas y las infecciones relacionadas con la traducibilidad del FBS15,16.
A pesar de los mayores costos de producción, ya se ha demostrado que, en comparación con FBS, hPL apoya la viabilidad celular para muchos tipos de células, aumenta la proliferación, retrasa la senescencia, asegura la estabilidad genómica y conserva el inmunofenotipo celular incluso en pasajes celulares tardíos; Todos estos elementos apoyan el cambio hacia este suplemento cultural11.
El objetivo de este trabajo fue desarrollar un protocolo estandarizado para aislar y cultivar hASCs con un método completo libre de animales, sin modificar la fisiología celular y las propiedades del tallo en comparación con las hASCs clásicas cultivadas con FBS (Figura 1).
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Protocol
Las hASC se aislaron del tejido adiposo abdominal de una mujer sana que se sometió a una reconstrucción mamaria utilizando colgajos autólogos abdominales (colgajos perforantes epigástricos inferiores profundos, [DIEP]) en el Hospital Universitario de Lausana, CHUV, Lausana, Suiza. La parte desechada del colgajo y el tejido adiposo se obtuvieron después de que el paciente firmó el consentimiento informado. Todos los protocolos fueron revisados y aprobados por el Departamento de Biobanco DAL del hospital (número 314 GGC) y los comités de ética de acuerdo con la Declaración de Helsinki.
NOTA: Todos los pasos deben realizarse bajo una campana de flujo laminar y con condiciones asépticas. Siempre se deben usar guantes y batas de laboratorio para la protección personal, y todas las superficies deben lavarse con biocidas apropiados. El exceso de tejido debe eliminarse adecuadamente como desechos biomédicos.
1. Materiales necesarios y preparación de las soluciones de cultivo
- Para el aislamiento, expansión y criopreservación celular, obtenga los siguientes instrumentos: tijeras estériles; bisturís estériles; pinzas estériles; una placa de Petri de 10 cm; tubos de 15 ml; Matraces T25; una cámara Burker; crioviales; un contenedor de congelación de celdas; un microscopio óptico con objetivos de aumento de 4x y 10x; y una centrífuga de cubo oscilante.
- Para el inmunofenotipado, obtener los siguientes instrumentos y reactivos: tubos FACS, solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS); Medio esencial mínimo (DMEM) de Dulbecco; hPL; sulfuro de dimetilo; y tripsina libre de animales.
- Prepare el medio de cultivo completo complementando DMEM con hPL libre de heparina al 5%. Conservar el medio a 4 °C durante un máximo de 3 semanas y utilizar siempre caliente (entre temperatura ambiente y 37 °C). Siguiendo las pautas GMP para la producción de medicamentos celulares destinados a la terapia humana, no agregue ningún antibiótico al medio de cultivo.
- Prepare un medio de congelación que contenga 20% de hPL y 10% de sulfuro de dimetilo en DMEM.
2. Aislamiento de hASCs de la muestra de tejido adiposo
- Procesar la muestra de tejido adiposo dentro de las 6 h siguientes a su obtención. Antes de proceder al método de aislamiento mecánico libre de xenogénico establecido, lave el tejido 2 veces con PBS durante 10 minutos hasta que se liberen el tejido conectivo y la sangre.
- Almacenar la muestra de tejido adiposo obtenida de la cirugía abdominoplástica en PBS a 4° C hasta su procesamiento y, en cualquier caso, no más de 24 h, para no dañar la viabilidad de hASC.
- Cortar el tejido adiposo en trozos más pequeños de aproximadamente 1cm2 con tijeras estériles.
- Con un bisturí, microdiseccionar cada pieza en pequeños fragmentos con diámetros <5 mm, y dispersar cinco de ellos en una placa de Petri de 10 cm (Figura 2A).
- Para unir cada fragmento, use el bisturí para crear incisiones en la superficie plástica, arrastrando cada fragmento hasta que esté firmemente pegado a la placa de Petri. Use pinzas para ayudar a manejar el fragmento (Figura 2B).
- Añadir suavemente 10 ml de medio de cultivo completo para cubrir todos los fragmentos sin desprenderlos.
- Incubar las placas de Petri a 37 °C y 5% deCO2. Las hASCs migrarán fuera del tejido y serán seleccionadas debido a su adherencia plástica sin digestión enzimática.
- Hasta la confluencia celular, monitoree la expansión hASC bajo un microscopio óptico con un aumento de 4x una vez al día. A medida que las hASC comienzan a salir del tejido, aparecen como pequeños grupos alrededor de las piezas de tejido con una morfología típica similar a los fibroblastos. Los hASC se seleccionan debido a su capacidad para adherirse a la superficie plástica. Cada 72 h, retire la mayor cantidad de medio posible y reemplácelo con un medio completo fresco para eliminar los restos celulares.
- Deje los fragmentos de tejido en su lugar hasta el primer paso de las células, que generalmente es después de 7 días.
3. cultivo de hASC después de la fase de aislamiento
- Cuando el cultivo hASC alcanza una confluencia del 70% al 80%, las hASC están listas para separarse y expandirse aún más para ser utilizadas para otros experimentos o almacenamiento a largo plazo.
- Con pinzas estériles, retire y deseche todos los trozos de tejido de la placa de Petri. Retire y deseche el medio agotado, teniendo cuidado de no tocar las hASCs para no desprenderlas.
- Lave cuidadosamente las células una vez con 10 ml de PBS. Añadir 1 ml de 1x tripsina libre de animales y dejar la placa de Petri en la incubadora a 37 °C durante 5 min.
- Verifique bajo un microscopio óptico con un aumento de 4x si todas las celdas se han desprendido; de lo contrario, deje la placa de Petri durante 2 minutos adicionales en la incubadora y, finalmente, golpee suavemente la superficie de plástico para soportar el desprendimiento de células.
- Detenga la acción de la tripsina agregando 2 ml de medio completo y recoja todas las células en un tubo de 15 ml.
- Para eliminar cualquier tripsina restante, centrifugar el tubo a 300 x g durante 5 min. Desechar el sobrenadante, suspender las células con 5 ml de medio completo y transferir la suspensión celular a un nuevo matraz T25. Mantenga los hASC en cultivo y expándalos hasta que sea necesario.
4. Investigación del inmunofenotipo por citometría de flujo
- Cuando el cultivo de hASC alcance una confluencia del 70%-80%, separe las hASC como se describió anteriormente en la sección 3.
- Después de recolectar las células, suspenderlas en 1 ml de medio completo y contar una alícuota con el contador celular bajo un microscopio óptico con un aumento de 10x.
- Centrifugar las hASCs a 300 x g durante 5 min, y suspenderlas a 1 x 106 células/ml de tampón FACS. Transfiera 100 μL de la suspensión que contiene 1 x 105 células a un tubo FACS. Utilice un tubo FACS para cada antígeno investigado, más uno más para cada control isotípico.
- Teñir las células con 100 μL de los siguientes anticuerpos diluidos en tampón FACS: anti-CD73 (1:1.000, IgG1, marcado con FITC), anti-CD105 (1:200, IgG1, marcado con PE); anti-CD34 (1:66, IgG1, marcado con FITC); anti-CD45 (1:66, IgG1, marcado con FITC); y controles isotípicos para cada fluoróforo, marcado con IgG1 FITC (1:1.000) e IgG1 PE (1:50).
- Incubar las muestras durante 1 h en la oscuridad con agitación a 4 °C. Centrifugar los tubos a 300 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante y suspender las células en 500 μL de tampón FACS.
- Evaluar el inmunofenotipo celular con un instrumento de citometría de flujo, registrando 50.000 eventos para cada tubo dentro de la puerta seleccionada para excluir restos celulares. Calcule el porcentaje de células que expresan como la diferencia del control isotípico específico.
5. Ensayo de proliferación de hASC
- Cuando el cultivo de hASC alcance una confluencia del 70%-80%, separar las hASCs como se describe en la sección 3.
- Después de recolectar las células, suspenderlas en 1 ml de medio completo y contar una alícuota con el contador celular bajo un microscopio óptico con un aumento de 10x.
- Semilla 5 x 102 hASCs en 200 μL de medio completo en placas transparentes de 96 pocillos. Siembra las células en réplicas técnicas, con un pozo para cada punto de tiempo.
- A los 3 días después de la siembra, comience a detectar la proliferación celular utilizando un kit de ensayo de proliferación siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, reemplace el medio de cultivo con 100 μL de medio fresco agregado a 20 μL de reactivo de ensayo por pocillo. Incubar las hASCs durante 2,5 h a 37 °C, 5% deCO2 para el desarrollo de reactivos, y luego detectar la absorbancia a 490 nm con un espectrofotómetro.
- Exprese la proliferación de hASC como el porcentaje de absorbancia después de eliminar la absorbancia en blanco.
6. Criopreservación y almacenamiento de las hASCs
- Separe las celdas como se describe en la sección 3 y cuente una alícuota con el contador de células bajo un microscopio óptico con un aumento de 10x.
- Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min, y desechar el sobrenadante. Suspender las células con mezcla de congelación a una densidad de 1 x 106 hASCs/mL, y transferir 1 mL de la solución celular a un criovial.
- Coloque los crioviales a -80 ° C en un recipiente de congelación que disminuya la temperatura en 1 ° C / min, y luego mueva los crioviales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
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Representative Results
Aplicando el método de aislamiento detallado anteriormente, las hASCs se obtuvieron con éxito de muestras de tejido adiposo abdominal sin el uso de colagenasa. Además, las hASCs se expandieron en condiciones completamente libres de xenogénicas en presencia de hPL y sin ningún otro componente de origen animal. Los siguientes resultados apoyan el protocolo y se obtienen de hASCs cultivadas en paralelo con hPL y con FBS como condición de control.
Después de la aparición inicial del grupo, las hASCs mostraron la forma clásica de husillo y eran más pequeñas y alargadas en comparación con las células de control en presencia de FBS (Figura 3). El inmunofenotipo celular evaluado por citometría de flujo pareció ser similar entre las hASCs cultivadas con los dos suplementos. En particular, más del 80%-90% de las hASCs fueron positivas para CD73 17 y CD105 17, y menos del 5% expresaron CD34 17 y CD45 17 (Figura 4). Finalmente, el ensayo de proliferación reveló un aumento significativo en el crecimiento celular cuando se agregó hPL al medio en comparación con el control FBS (Figura 5).
Figura 1: Resumen gráfico del protocolo. Método libre de xenogénicos para el aislamiento y la expansión in vitro de células madre derivadas de tejido adiposo humano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Proceso de corte y siembra de tejido adiposo para obtener hASCs en cultivo in vitro . (A) Microdisección del tejido adiposo en fragmentos con diámetros <5 mm y dispersión de los fragmentos en una placa de Petri de 10 cm. (B) Fijación a la placa de Petri después de crear incisiones en la superficie plástica con un bisturí. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Morfología de las hASCs. Las hASCs cultivadas en la condición libre de xenogénica mostraron una forma de huso y morfología alargada. Los hASCs cultivados en presencia de FBS como control eran más grandes y tenían forma de diana. La barra de escala representa 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Inmunofenotipo de las hASCs. El inmunofenotipo de las hASCs fue similar en presencia de hPL y FBS. En particular, las hASCs en ambas condiciones podrían considerarse positivas para CD73 y CD105 y negativas para CD34 y CD45. Las barras de error indican el error estándar (n = 3). Abreviaturas: hPL = lisado de plaquetas humanas; FBS = suero bovino fetal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: proliferación de hASC. Las hASCs expandidas en condiciones libres de xenogénicas proliferaron significativamente más que aquellas en presencia de FBS. ** p < 0,01 (significancia evaluada con una prueba t de Student, n = 3). El eje x representa el tiempo en términos del número de días después de la siembra. Abreviaturas: hPL = lisado de plaquetas humanas; FBS = suero fetal bovino; hASCs = células madre derivadas de tejido adiposo humano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las células madre derivadas de tejido adiposo han atraído el interés de la investigación traslacional en la última década debido a su abundancia, métodos de aislamiento rápidos y asequibles, alta tasa de proliferación in vitro/in vivo y propiedades de tallo/diferenciación18,19,20. Como resultado, las hASCs son consideradas un excelente candidato para estrategias basadas en células en medicina regenerativa21. Después del aislamiento del tejido adiposo, las hASCs requieren expansión in vitro y, en algunos casos, deben someterse a una etapa de diferenciación antes de ser utilizadas para una aplicación terapéutica específica. Todo el proceso, incluyendo el aislamiento, la expansión in vitro y la eventual diferenciación, debe llevarse a cabo de acuerdo con las directrices GMP para reducir cualquier riesgo desde una perspectiva de traducción22,23.
Con respecto al proceso de aislamiento, mientras que los pasos de digestión enzimática y centrifugación producen rápidamente un alto número de hASCs en un tiempo relativamente corto, informes previos han demostrado que estos métodos causan posibles cambios fenotípicos celulares en términos de marcadores de diferenciación de conglomerados en comparación con otros métodos de aislamiento mecánico, lo que plantea preguntas sobre la bioseguridad, las propiedades celulares y los problemas de comportamiento al aplicar estos hASC con pacientes humanos3 . Además, para minimizar los riesgos relacionados con los componentes xenogénicos, estudios recientes han sugerido el uso de enzimas sintéticas o métodos mecánicos para aislar las hASC. Sin embargo, incluso las enzimas sintéticas pueden modificar el perfil celular y afectar la calidad del producto24. Por el contrario, el método basado en explantes aquí investigado puede ser una alternativa válida para fines traslacionales, ya que las hASCs migran fuera del tejido y se adhieren a las superficies plásticas de forma natural, sin el uso de ningún reactivo xenogénico9. Al mismo tiempo, debe considerarse que este método evidenció menor rendimiento celular en comparación con el aislamiento clásico de colagenasa25.
En cuanto al medio suplementario, basado en la literatura reciente, que coincide en que el hPL apoya la expansión de hASC en mayor grado que el FBS sin alterar las propiedades fisiológicas de hASC 26,27,28,29, sustituimos el medio tradicional agregado por FBS por hPL 16. Apoyando el cultivo celular con hPL, superamos la disminución de los rendimientos celulares y la recuperación más lenta relacionada con el aislamiento mecánico. Estas hASCs menos manipuladas proliferaron in vitro con una tasa que permitió la expansión requerida para alcanzar volúmenes clínicamente relevantes de manera eficiente y segura30,31. Además, el cultivo con hPL no alteró las características similares al tallo y el inmunofenotipo típicos de las hASCs, por lo que se mantuvo el interés terapéutico de estas células.
Hasta donde sabemos, mientras que se han descrito una variedad de protocolos de aislamiento de explantes para ASC, nuestro método es el primero que combina el aislamiento mecánico libre de xenogénicas de ASC con cultivo de medio suplementado con hPL para obtener una valiosa población celular para aplicaciones traslacionales.
Además de eso, el método descrito en este trabajo tiene algunos aspectos críticos que deben ser detallados más a fondo. En primer lugar, los diámetros de los fragmentos de tejido adiposo picado no deben superar los 5 mm para facilitar su adhesión a la superficie plástica y permitir la migración de los hASCs fuera del tejido. En segundo lugar, se debe equilibrar la presencia de fragmentos de tejido adiposo en cultivo junto con las hASCs ya adheridas a la placa, teniendo en cuenta el riesgo de contaminación y la necesidad de un número suficiente de células migradas. En tercer lugar, los investigadores deben ser conscientes de una posible tasa de crecimiento reducida en las primeras 24 h después de la siembra del explante; después de este período de tiempo, la suplementación con hPL estimula la recuperación y proliferación celular en comparación con el FBS30 clásico.
Por el momento, no se han introducido más pasos o modificaciones en comparación con el protocolo original descrito anteriormente.
En conclusión, el método xenogénico completo libre descrito aquí proporciona una forma sencilla de aislar las hASC del tejido adiposo, incluidos los lipoaspirados y el tejido adiposo abdominal, en ausencia de productos derivados de animales, enzimas químicas o pasos de centrifugación. Además, el medio suplementado con hPL contrarresta el menor rendimiento celular inicial resultante y mejora la proliferación celular al tiempo que mantiene inalteradas las propiedades terapéuticas de las hASC.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores no tienen reconocimientos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | - | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | - | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
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