Summary
Hücre tedavisi hazırlığı/manipülasyon aşamalarında kullanılmaya başlanan ksenojenik (kimyasal veya hayvansal türevli) ürünler, konakçı hastalarda immün reaktivite ve patojenik bulaşma riskinin artmasıyla ilişkilidir. Burada, insan adipoz türevi kök hücrelerin izolasyonu ve in vitro genişlemesi için tam bir ksenojenik içermeyen yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Kök hücre tedavisinin artan etkisi göz önüne alındığında, in vitro manipülasyon sırasında hayvansal kaynaklı ürünlerin piyasaya sürülmesi nedeniyle potansiyel kontaminasyon veya enfeksiyon bulaşması ile ilgili biyogüvenlik endişeleri dile getirilmiştir. Hücre izolasyonu ve genişleme adımları sırasında yaygın olarak kullanılan kollajenaz veya fetal sığır serumu gibi ksenojenik bileşenler, alıcı hastalarda immün reaktivite veya viral, bakteriyel ve prion enfeksiyonunun potansiyel riskleri ile ilişkili olabilir. İyi üretim uygulamaları kılavuzlarını takiben, kimyasal doku ayrışmasından kaçınılmalı, fetal sığır serumu (FBS) ksenojenik içermeyen takviyelerle ikame edilebilir. Ayrıca, hücre ürünlerinin güvenliğini sağlamak için, daha güvenilir ve tekrarlanabilir yöntemlerin tanımlanması önemlidir. Kollajenaz FBS kültürlü standart protokollere kıyasla özelliklerini değiştirmeden insan adipoz türevi kök hücrelerin izolasyonu ve in vitro genişlemesi için yenilikçi, tamamen ksenojenik içermeyen bir yöntem geliştirdik. Burada, insan adipoz kaynaklı kök hücreler (hASC'ler) abdominal yağ dokusundan izole edildi. Numune makas / neşter ile mekanik olarak kıyılmış, mikro disseke edilmiş ve mekanik olarak 10 cm'lik bir Petri kabında dağılmış ve doku parçalarının bağlanmasını ve hASC'lerin göçünü kolaylaştırmak için neşter kesileri ile hazırlanmıştır. Yıkama adımlarını takiben, hASC'ler enzimatik sindirim olmadan plastik yapışmaları nedeniyle seçildi. İzole edilmiş hASC'ler,% 5 heparin içermeyen insan trombosit lizatı ile desteklenmiş orta dereceli olarak kültürlendi ve hayvansız tripsin ikamesi ile ayrıldı. İnsan tedavisine yönelik hücre ürünlerinin üretimine ilişkin iyi üretim uygulamaları (GMP) talimatlarını takiben, hiçbir kültür ortamında antibiyotik kullanılmamıştır.
Introduction
Son yıllarda, yenilikçi terapötik tedavilere olan talebin artması, translasyonel tıp alanında önemli çabalara ve kaynak yatırımlarına yol açmıştır1. Hücre bazlı ürünler, hücre kaynağı, üretim süreci (izolasyon, genişleme veya genetik modifikasyon) ve hücresel olmayan takviyeler (enzimler, büyüme faktörleri, kültür takviyeleri ve antibiyotikler) tarafından belirlenen risklerle ilişkilidir ve bu risk faktörleri spesifik terapötik endikasyona bağlıdır. Nihai ürünün kalitesi, güvenliği ve etkinliği, yukarıda belirtilen unsurlardan derinden etkilenebilir2. Kök hücre tedavisi biyogüvenlik ilkelerine bağlı kalmayı gerektirir; Hücre kültüründe hayvansal kaynaklı ürünlerle patojenik bulaşmanın potansiyel riskleri sorunlu olabilir ve üretime dahil edilen herhangi bir ürünün kapsamlı bir şekilde test edilmesi esastır3.
İnsan adipoz türevi kök hücreleri (hASK'ler) izole etmek için kullanılan geleneksel yöntem, kollajenaz ile gerçekleştirilen enzimatik bir sindirimi ve ardından santrifüjleme yoluyla yıkama adımlarını içerir4. Enzimatik izolasyon genellikle hücre verimi ve canlılığı açısından diğer mekanik tekniklerden daha verimli olarak kabul edilirken, kollajenaz gibi kullanılan hayvan kaynaklı bileşenlerin ABD Gıda ve İlaç İdaresi tarafından minimum düzeyde manipüle edilmesinden daha fazlası olduğu düşünülmektedir. Bu, immün reaksiyonlar veya hastalık bulaşma riskinin önemli ölçüde arttığı anlamına gelir, böylece hASC tedavisinin klinik ortamlara çevrilmesi sınırlandırılır 5,6.
Tripsin bazlı sindirim, ASC'leri izole etmek için başka bir enzimatik protokoldür. Tripsin konsantrasyonu, santrifüjleme hızı ve inkübasyon süresi açısından küçük değişikliklerle farklı teknikler tanımlanmıştır. Ne yazık ki, bu yöntem iyi tanımlanmamıştır ve literatürde, özellikle mekanik izolasyon protokolleri7 ile karşılaştırma eksikliği vardır. Bununla birlikte, yaklaşımın çevrilebilirliği açısından, tripsin aynı kollajenaz dezavantajlarına sahiptir.
ASC'leri elde etmek için mekanik kuvvetlere dayanan ve enzim ilavesi olmayan alternatif izolasyon yöntemleri, yağ dokusu parçalarının yüksek hızlı santrifüjlenmesini (800 x g veya 1.280 x g, 15 dakika) içerir. Daha sonra, pelet bir kırmızı kan hücresi lizis tamponu (5 dakika) ile inkübe edilir, ardından kültür ortamında yeniden süspansiyondan önce 600 x g'de başka bir santrifüjleme adımı izlenir. İlk günlerde eksplant yöntemlerine kıyasla daha fazla sayıda hücre izole edilmesine rağmen, önceki bir çalışma, kültür8'in ikinci haftasından sonra daha düşük veya hiç proliferasyon göstermediğini göstermiştir.
Bunun yanı sıra, hücre kültürü için bir büyüme faktörü takviyesi olarak kullanılan fetal sığır serumu (FBS) gibi ksenojenik eklenmiş ortamlarla daha fazla manipülasyon, immün reaktivite riskinin artması ve konakçı hastanın viral, bakteriyel veya prion enfeksiyonlarına maruz kalma riski ile ilişkilidir 9,10. İmmün reaksiyonlar ve ürtiker form döküntü gelişimi, FBS11 ile üretilen birkaç doz mezenkimal kök hücre alan bireylerde zaten tanımlanmıştır. Ayrıca, FBS, nihai ürün kalitesi12 üzerinde bir etkisi olabilecek partiden partiye değişkenliğe tabidir.
İyi üretim uygulamaları (GMP) kılavuzlarına uygun olarak, enzimatik doku ayrışmasından kaçınılmalı ve FBS, ksenojenik içermeyen takviyelerle değiştirilmelidir. Bu adımlar, daha güvenilir ve tekrarlanabilir protokollerle birlikte, hücre tedavisinin uygulanmasını desteklemek için gereklidir 3,13.
Bu bağlamda, insan trombosit lizatı (hPL), hücre içermeyen, protein içeren, büyüme faktörü bakımından zenginleştirilmiş bir takviye olduğu için FBS'nin yerine önerilmiş ve daha önce klinik sınıf hücre bazlı ürünler arasında in vitro hücre kültürü ve genleşme14,15 için bir büyüme ortamı katkısı olarak tanıtılmıştır. hPL, insan kaynaklı bir ürün olduğundan, klinik uygulamalara yönelik hASC'lerin in vitro kültürü sırasında FBS'nin yerine sıklıkla kullanılır, böylece FBS çevrilebilirliği ile ilgili immünolojik reaksiyonlar ve enfeksiyonlarla ilgili sorunları azaltır15,16.
Daha yüksek üretim maliyetlerine rağmen, FBS ile karşılaştırıldığında, hPL'nin birçok hücre tipi için hücre canlılığını desteklediği, proliferasyonu arttırdığı, yaşlanmayı geciktirdiği, genomik stabiliteyi sağladığı ve geç hücre pasajlarında bile hücresel immünofenotipi koruduğu gösterilmiştir; tüm bu unsurlar bu kültüre geçişi desteklemektedir ek11.
Bu çalışmanın amacı, klasik FBS kültürlü hASC'lere kıyasla hücre fizyolojisini ve kök özelliklerini değiştirmeden, hASC'leri tam bir hayvansız yöntemle izole etmek ve kültürlemek için standartlaştırılmış bir protokol geliştirmekti (Şekil 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hASK'ler, Lozan Üniversitesi Hastanesi, CHUV, Lozan, İsviçre'de abdominal otolog flepler (derin inferior epigastrik perforatör flepler, [DIEP]) kullanılarak meme rekonstrüksiyonu yapılan sağlıklı bir kadının abdominal yağ dokusundan izole edildi. Flebin atılan kısmı ve yağ dokusu hasta bilgilendirilmiş onam imzaladıktan sonra elde edildi. Tüm protokoller, Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak hastanenin Biobank Departmanı DAL (sayı 314 GGC) ve etik komiteler tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
NOT: Tüm adımlar laminer bir davlumbaz altında ve aseptik koşullarda gerçekleştirilmelidir. Kişisel koruma için eldivenler ve laboratuvar önlükleri her zaman giyilmeli ve tüm yüzeyler uygun biyositlerle yıkanmalıdır. Fazla doku biyomedikal atık olarak uygun şekilde bertaraf edilmelidir.
1. İhtiyaç duyulan malzemeler ve kültür çözümlerinin hazırlanması
- Hücre izolasyonu, genişleme ve kriyoprezervasyon için aşağıdaki aletleri edinin: steril makas; steril neşterler; steril cımbız; 10 cm'lik bir Petri kabı; 15 mL tüpler; T25 şişeleri; bir Burker odası; kriyovyaller; bir hücre dondurma kabı; 4x ve 10x büyütme hedeflerine sahip bir optik mikroskop; ve sallanan bir kova santrifüjü.
- İmmünofenotipleme için, aşağıdaki aletleri ve reaktifleri elde edin: FACS tüpleri, steril fosfat tamponlu salin (PBS); Dulbecco'nun minimal esansiyel ortamı (DMEM); hPL; dimetil sülfür; ve hayvansız tripsin.
- DMEM'i% 5 heparin içermeyen hPL ile destekleyerek tam kültür ortamını hazırlayın. Ortamı 4 ° C'de 3 haftaya kadar saklayın ve her zaman ılık kullanın (oda sıcaklığı ile 37 ° C arasında). İnsan tedavisine yönelik hücre ilaçlarının üretimi için GMP kılavuzlarını takiben, kültür ortamına herhangi bir antibiyotik eklemeyin.
- DMEM'de% 20 hPL ve% 10 dimetil sülfür içeren dondurma ortamı hazırlayın.
2. HSC'lerin yağ dokusu örneğinden izolasyonu
- Yağ dokusu örneğini elde ettikten sonraki 6 saat içinde işleyin. Kurulan mekanik ksenojenik içermeyen izolasyon yöntemine geçmeden önce, bağ dokusu ve kan serbest bırakılana kadar 10 dakika boyunca PBS ile 2x dokuyu yıkayın.
- Abdominoplastik cerrahiden elde edilen yağ dokusu örneğini, hASC canlılığına zarar vermemek için PBS'de işlenene kadar 4 ° C'de ve her durumda 24 saatten fazla olmamak üzere saklayın.
- Yağ dokusunu steril makasla yaklaşık 1cm2'lik daha küçük parçalara bölün.
- Bir neşterle, her bir parçayı <5 mm çapında küçük parçalara mikro disseke edin ve beşini 10 cm'lik bir Petri kabına dağıtın (Şekil 2A).
- Her bir parçayı tutturmak için, plastik yüzeyde kesikler oluşturmak için neşteri kullanın ve her bir parçayı Petri kabına sıkıca yapışana kadar sürükleyin. Parçayı işlemeye yardımcı olması için cımbız kullanın (Şekil 2B).
- Tüm parçaları ayırmadan örtmek için yavaşça 10 mL tam kültür ortamı ekleyin.
- Petri kaplarını 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin. hASK'ler dokudan dışarı göç edecek ve enzimatik sindirim olmadan plastik yapışmaları nedeniyle seçilecektir.
- Hücre birleşene kadar, hASC genişlemesini optik mikroskop altında günde bir kez 4x büyütmede izleyin. HSC'ler dokudan çıkmaya başladıkça, tipik bir fibroblast benzeri morfolojiye sahip doku parçalarının etrafında küçük kümeler halinde görünürler. hASK'ler, plastik yüzeye yapışma yetenekleri nedeniyle seçilir. Her 72 saatte bir, mümkün olduğunca fazla ortamı çıkarın ve hücre kalıntılarını gidermek için taze tam bir ortamla değiştirin.
- Doku parçalarını, genellikle 7 gün sonra olan hücrelerin ilk geçişine kadar yerinde bırakın.
3. İzolasyon aşamasından sonra hASC kültürü
- hASC kültürü% 70 -% 80 akıcılığa ulaştığında, hASC'ler diğer deneyler veya uzun süreli depolama için kullanılmak üzere ayrılmaya ve daha da genişletilmeye hazırdır.
- Steril cımbızla, Petri kabındaki tüm doku parçalarını çıkarın ve atın. Tükenmiş ortamı çıkarın ve atın, çıkarmamak için hASCO'lara dokunmamaya dikkat edin.
- Hücreleri bir kez 10 mL PBS ile dikkatlice yıkayın. 1 mL 1x hayvansız tripsin ekleyin ve Petri kabını inkübatörde 5 dakika boyunca 37 ° C'de bırakın.
- Tüm hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını 4x büyütmede optik mikroskop altında kontrol edin; Aksi takdirde, Petri kabını inkübatörde 2 dakika daha bırakın ve sonunda hücre ayrılmasını desteklemek için plastik yüzeye hafifçe dokunun.
- 2 mL tam ortam ekleyerek tripsin hareketini durdurun ve tüm hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın.
- Kalan tripsisini çıkarmak için, tüpü 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin. Süper nantantı atın, hücreleri 5 mL tam ortam ile askıya alın ve hücre süspansiyonunu yeni bir T25 şişesine aktarın. hASK'leri kültürde tutun ve ihtiyaç duyulana kadar genişletin.
4. Akım sitometrisi ile immünofenotipin incelenmesi
- hASC kültürü %70-%80 akıcılığa ulaştığında, daha önce bölüm 3'te açıklandığı gibi hASC'leri ayırın.
- Hücreleri topladıktan sonra, onları 1 mL'lik tam bir ortamda askıya alın ve 10x büyütmede optik mikroskop altında hücre sayacı ile bir aliquot sayın.
- hASC'leri 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve 1 x 106 hücre/mL FACS tamponunda askıya alın. 1 x 105 hücre içeren süspansiyonun 100 μL'sini bir FACS tüpüne aktarın. İncelenen her antijen için bir FACS tüpü ve ayrıca her izotipik kontrol için bir tane daha kullanın.
- FACS tamponunda seyreltilmiş aşağıdaki antikorların 100 μL'si ile hücreleri sabitleyin: anti-CD73 (1:1.000, IgG1, FITC etiketli), anti-CD105 (1:200, IgG1, PE etiketli); anti-CD34 (1:66, IgG1, FITC etiketli); anti-CD45 (1:66, IgG1, FITC etiketli); ve her florofor için izotipik kontroller, IgG1 FITC etiketli (1:1.000) ve IgG1 PE etiketli (1:50).
- Numuneleri karanlıkta 1 saat boyunca 4 ° C'de ajitasyonla inkübe edin. Tüpleri 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin, süpernatanı atın ve hücreleri 500 μL FACS tamponunda askıya alın.
- Hücre immünofenotipini bir akış sitometri cihazı ile değerlendirin, hücre kalıntılarını dışlamak için seçilen kapının içindeki her tüp için 50.000 olay kaydedin. Eksprese eden hücrelerin yüzdesini, spesifik izotipik kontrolden fark olarak hesaplayın.
5. hASC'nin proliferasyon testi
- hASC kültürü %70-%80 akıcılığa ulaştığında, bölüm 3'te açıklandığı gibi hASC'leri ayırın.
- Hücreleri topladıktan sonra, onları 1 mL'lik tam bir ortamda askıya alın ve 10x büyütmede optik mikroskop altında hücre sayacı ile bir aliquot sayın.
- 96 delikli şeffaf plakalarda200 μL komple ortamda tohum 5 x 10 2 hASC. Hücreleri teknik olarak tohumlayın, her zaman noktası için bir kuyu ile.
- Tohumlamadan 3 gün sonra, üreticinin talimatlarını izleyerek bir proliferasyon testi kiti kullanarak hücre proliferasyonunu tespit etmeye başlayın. Kısacası, kültür ortamını, kuyucuk başına 20 μL tahlil reaktifine eklenen 100 μL taze ortam ile değiştirin. hASC'leri 37 ° C'de 2,5 saat, reaktif gelişimi için% 5 CO2 için inkübe edin ve ardından bir spektrofotometre ile 490 nm'de absorbansı tespit edin.
- Boş absorbansı çıkardıktan sonra hASC proliferasyonunu yüzde absorbans olarak ifade edin.
6. hASK'lerin kriyoprezervasyonu ve depolanması
- Hücreleri bölüm 3'te açıklandığı gibi ayırın ve 10x büyütmede optik mikroskop altında hücre sayacı ile bir aliquot sayın.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve süpernatanı atın. Hücreleri dondurucu karışımla 1 x 106 hASC / mL yoğunlukta askıya alın ve hücre çözeltisinin 1 mL'sini bir kriyovyal içine aktarın.
- Kriyovalleri -80 ° C'de, sıcaklığı 1 ° C / dak düşüren bir dondurucu kaba koyun ve ardından kriyovyalleri uzun süreli depolama için sıvı nitrojene taşıyın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda detaylandırılan izolasyon yöntemi uygulanarak kollajenaz kullanılmadan abdominal yağ dokusu örneklerinden hASC'ler başarıyla elde edildi. Dahası, hASC'ler hPL varlığında ve hayvansal kökenli başka herhangi bir bileşen olmadan tamamen ksenojenik içermeyen koşullarda genişletildi. Aşağıdaki sonuçlar protokolü destekler ve hPL ile paralel olarak kültürlenmiş hASC'lerden ve kontrol koşulu olarak FBS ile elde edilir.
İlk küme görünümünden sonra, hASC'ler klasik iğ benzeri şekli gösterdi ve FBS varlığında kontrol hücrelerine kıyasla daha küçük ve daha uzundu (Şekil 3). Akış sitometrisi ile değerlendirilen hücre immünofenotipinin, iki takviye ile kültürlenen hASC'ler arasında benzer olduğu görülmüştür. Özellikle, hASK'lerin %80-90'ından fazlası CD73 17 veCD105 17 için pozitifti ve %5'ten azı CD34 17 ve CD45 17'yi ifade ediyordu (Şekil 4). Son olarak, proliferasyon testi, FBS kontrolüne kıyasla ortama hPL eklendiğinde hücre büyümesinde önemli bir artış olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 5).
Şekil 1: Protokolün grafik özeti. İnsan adipoz türevi kök hücrelerin izolasyonu ve in vitro genişlemesi için ksenojenik içermeyen yöntem. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: In vitro kültürde hASC elde etmek için yağ dokusu kesme ve tohumlama işlemi. (A) Yağ dokusunun <5 mm çapında parçalara mikrodiseksiyonu ve parçaların 10 cm'lik bir Petri kabında dağılması. (B) Plastik yüzeyde neşterle kesikler oluşturulduktan sonra Petri kabına tutturulması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: hASK'lerin morfolojisi. Ksenojenik içermeyen durumda kültürlenen hASK'ler iğ benzeri bir şekil ve uzatılmış morfoloji gösterdi. FBS'nin varlığında kontrol olarak kültürlenen hASK'ler daha büyüktü ve boğa gözü şeklindeydi. Ölçek çubuğu 100 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: hASC'lerin immünofenotipi. hASC'lerin immünofenotipi hPL ve FBS varlığında benzerdi. Özellikle, her iki durumda da hASC'ler CD73 ve CD105 için pozitif ve CD34 ve CD45 için negatif olarak kabul edilebilir. Hata çubukları standart hatayı gösterir (n = 3). Kısaltmalar: hPL = insan trombosit lizatı; FBS = fetal sığır serumu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: hASC proliferasyonu. Ksenojenik içermeyen koşullarda genişleyen hASK'ler, FBS varlığındakilerden önemli ölçüde daha fazla çoğaldı. ** p < 0.01 (Öğrencinin t-testi ile değerlendirilen anlamlılık, n = 3). X ekseni, tohumlamadan sonraki gün sayısı açısından zamanı temsil eder. Kısaltmalar: hPL = insan trombosit lizatı; FBS = fetal sığır serumu; hASC'ler = insan adipoz türevi kök hücreler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adipoz türevi kök hücreler, bollukları, hızlı ve uygun fiyatlı izolasyon yöntemleri, yüksek in vitro/in vivo proliferasyon oranları ve köklülük/farklılaşma özellikleri 18,19,20 nedeniyle son on yılda translasyonel araştırmaların ilgisini çekmiştir. Sonuç olarak, hASC'ler rejeneratif tıpta hücre bazlı stratejiler için mükemmel bir aday olarak kabul edilir21. Yağ dokusundan izolasyondan sonra, hASC'ler in vitro genişleme gerektirir ve bazı durumlarda, spesifik bir terapötik uygulama için kullanılmadan önce bir farklılaşma adımına tabi tutulmalıdır. İzolasyon, te in vitro genişleme ve nihai farklılaşma dahil olmak üzere tüm süreç, çeviri perspektifinden herhangi bir riski azaltmak için GMP kılavuzlarına uygun olarak yürütülmelidir22,23.
İzolasyon işlemi ile ilgili olarak, enzimatik sindirim ve santrifüjleme adımları nispeten kısa sürede hızlı bir şekilde yüksek sayıda hASC üretirken, önceki raporlar bu yöntemlerin diğer mekanik izolasyon yöntemlerine kıyasla küme farklılaşma belirteçleri açısından olası hücre fenotipik değişikliklerine neden olduğunu ve böylece bu hASC'leri insan hastalarla uygularken biyogüvenlik, hücre özellikleri ve davranışsal sorunlar hakkında sorular ortaya çıkardığını göstermiştir3 . Ayrıca, ksenojenik bileşenlerle ilgili riskleri en aza indirmek için, son çalışmalar hASC'leri izole etmek için sentetik enzimlerin veya mekanik yöntemlerin kullanılmasını önermiştir. Bununla birlikte, sentetik enzimler bile hücre profilini değiştirebilir ve ürün kalitesini etkileyebilir24. Aksine, burada araştırılan eksplant bazlı yöntem, translasyonel amaçlar için geçerli bir alternatif olabilir, çünkü hASC'ler dokudan dışarı göç eder ve herhangi bir ksenojenik reaktif kullanılmadan doğal olarak plastik yüzeylere yapışır9. Aynı zamanda, bu yöntemin klasik kollajenaz izolasyonuna kıyasla daha düşük hücre verimi kanıtladığı düşünülmelidir25.
Ek ortamla ilgili olarak, hPL'nin hASC fizyolojik özellikleri 26,27,28,29'u değiştirmeden FBS'den daha yüksek bir dereceye kadar hASC genişlemesini desteklediğini kabul eden son literatüre dayanarak, geleneksel FBS eklenmiş ortamı hPL16 ile değiştirdik. Hücre kültürünü hPL ile destekleyerek, azalan hücre veriminin ve mekanik izolasyonla ilgili daha yavaş iyileşmenin üstesinden geldik. Bu daha az manipüle edilmiş hASC'ler, klinik olarak ilgili hacimlere verimli ve güvenli bir şekilde ulaşmak için gereken genişlemeye izin veren bir oranla in vitro olarak çoğaldı30,31. Dahası, hPL'li kültür, hASC'lerin tipik kök benzeri özelliklerini ve immünofenotipini değiştirmedi, bu nedenle bu hücrelerin terapötik ilgisinin korunduğu anlamına geliyordu.
Bildiğimiz kadarıyla, ASC'ler için çeşitli eksplant izolasyon protokolleri tanımlanmış olsa da, yöntemimiz, translasyonel uygulamalar için değerli bir hücre popülasyonu elde etmek için ASC'lerin hPL destekli orta kültürle ksenojenik içermeyen mekanik izolasyonunu birleştiren ilk yöntemdir.
Bunun yanı sıra, bu çalışmada açıklanan yöntemin daha fazla detaylandırılması gereken bazı kritik yönleri vardır. İlk olarak, kıyılmış yağ dokusu parçalarının çapları, plastik yüzeye yapışmalarını kolaylaştırmak ve hASC'lerin dokudan dışarı göçüne izin vermek için 5 mm'yi geçmemelidir. İkincisi, kültürde yağ dokusu fragmanlarının varlığı, plağa zaten bağlı olan hASC'lerle birlikte, kontaminasyon riski ve yeterli sayıda göç etmiş hücreye duyulan ihtiyaç göz önüne alınarak dengelenmelidir. Üçüncü olarak, araştırmacıların eksplant tohumlamasından sonraki ilk 24 saatte olası bir azalmış büyüme oranının farkında olmaları gerekir; Bu süreden sonra, hPL takviyesi, klasik FBS30'a kıyasla hücre iyileşmesini ve çoğalmasını uyarır.
Şimdilik, yukarıda açıklanan orijinal protokole kıyasla başka bir adım veya değişiklik yapılmamıştır.
Sonuç olarak, burada açıklanan tam ksenojenik içermeyen yöntem, hayvan kaynaklı ürünlerin, kimyasal enzimlerin veya santrifüjleme adımlarının yokluğunda, hem lipoaspiratlar hem de abdominal yağ dokusu dahil olmak üzere hASC'leri yağ dokusundan izole etmenin basit bir yolunu sağlar. Dahası, hPL takviyeli ortam, ortaya çıkan ilk hücre düşük verimini dengeler ve hASC'lerin terapötik özelliklerini değişmeden tutarken hücre proliferasyonunu arttırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Yazarların herhangi bir kabulü yoktur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | - | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | - | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
References
- Naderi, N., et al. The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery. International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).
- Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).
- Condé-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Chang, H., et al. Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation. Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).
- Spees, J. L., et al. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).
- Fadel, L., et al. Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep. Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).
- Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
- Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Lalu, M. M., et al. Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials. PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).
- Escobar, C. H., Chaparro, O. Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).
- Vaidya, V., et al. Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum. Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).
- Kyllönen, L., et al. Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4 (1), 17 (2013).
- Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion. Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Cowper, M., et al. Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells. Cells. 8 (7), 724 (2019).
- Kim, N., et al. Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice. Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).
- Palombella, S., et al. Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model. Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research. Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).
- Perez-Ilzarbe, M., et al. Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy. Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells. Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).
- Becherucci, V., et al. Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 124 (2018).
- Blande, I. S., et al. Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate. Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).
- Castegnaro, S., et al. Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue. Current Stem Cell Research & Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).
- Palombella, S., et al. Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 142 (2022).
- Palombella, S., et al. Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 432 (2020).
- Krähenbühl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use. International Journal of Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 007 (2015).
