Summary
細胞療法の準備/操作ステップで導入された異種(化学的または動物由来)製品は、宿主患者における免疫反応性および病原性伝播のリスクの増加と関連しています。ここでは、ヒト脂肪由来幹細胞の単離および in vitro 増殖のための完全な異種異系フリーの方法が記載されている。
Abstract
幹細胞治療の影響の増大を考慮して、 in vitro 操作中の動物由来製品の導入による潜在的な汚染または感染伝播に関してバイオセーフティの懸念が提起されています。細胞の単離および増殖ステップで一般的に使用されるコラゲナーゼやウシ胎児血清などの異種成分は、投与を受けた患者の免疫反応性またはウイルス、細菌、プリオン感染の潜在的なリスクに関連している可能性があります。適正製造基準のガイドラインに従って、化学的組織の解離は避ける必要がありますが、ウシ胎児血清(FBS)は異種を含まないサプリメントに置き換えることができます。さらに、細胞製品の安全性を確保するためには、より信頼性が高く再現性のある方法の定義が重要です。私たちは、コラゲナーゼFBS培養標準プロトコルと比較して、その特性を変えることなく、ヒト脂肪由来幹細胞の単離と in vitro 増殖のための革新的で完全に異種異系を含まない方法を開発しました。ここでは、腹部脂肪組織からヒト脂肪由来幹細胞(hASC)を単離した。サンプルはハサミ/メスで機械的にミンチし、マイクロ解剖して10 cmのペトリ皿に機械的に分散させ、組織片の付着とhASCの移動を容易にするためにメスの切開で調製しました。洗浄ステップに続いて、酵素消化なしでプラスチックが付着するため、hASCが選択されました。単離したhASCを、5%ヘパリンフリーヒト血小板溶解物を添加した培地で培養し、動物を含まないトリプシン代替物で剥離しました。ヒト治療を目的とした細胞製品の製造に関する適正製造基準(GMP)の指示に従って、どの培地にも抗生物質は使用されていません。
Introduction
過去数十年で、革新的な治療法に対する需要の高まりにより、トランスレーショナルメディシン分野への多大な努力とリソース投資が発生しました1。細胞ベースの製品は、細胞源、製造プロセス(分離、増殖、または遺伝子組み換え)、および非細胞サプリメント(酵素、成長因子、培養サプリメント、および抗生物質)によって決定されるリスクと関連しており、これらの危険因子は特定の治療適応症に依存します。最終製品の品質、安全性、および有効性は、上記の要素2によって深く影響を受ける可能性があります。幹細胞治療は、バイオセーフティの原則を順守する必要があります。細胞培養における動物由来製品による病原性感染の潜在的なリスクは問題となる可能性があり、製造に導入された製品の徹底的なテストが不可欠です3。
ヒト脂肪由来幹細胞(hASC)を単離する従来の方法では、コラゲナーゼを用いた酵素消化とそれに続く遠心分離による洗浄ステップが行われます4。酵素による単離は、一般に、細胞収量と生存率の点で他の機械的技術よりも効率的であると考えられていますが、コラゲナーゼなど、使用される動物由来の成分は、米国食品医薬品局によって最小限に操作されていると考えられています。これは、免疫反応または疾患伝播のリスクが大幅に増加することを意味し、したがって、hASC療法の臨床現場への翻訳を制限します5,6。
トリプシンベースの消化は、ASCを単離するための別の酵素プロトコルです。トリプシン濃度、遠心分離速度、およびインキュベーション時間の点でわずかな変更を加えたさまざまな技術が説明されています。残念なことに、この方法は十分に説明されておらず、文献、特に機械的絶縁プロトコル7との比較の欠如が存在する。しかしながら、アプローチの翻訳可能性に関して、トリプシンはコラゲナーゼと同じ欠点を有する。
機械的な力に基づいて酵素を添加しないASCを得るための代替単離方法には、脂肪組織断片の高速遠心分離(800 x gまたは1,280 x g、15分)が含まれます。次いで、ペレットを赤血球溶解緩衝液(5分間)と共にインキュベートし、続いて培養培地に再懸濁する前に600 x gで別の遠心分離工程を行う。外植片法と比較して最初の数日間に単離された細胞の数が多いにもかかわらず、以前の研究では、培養2週目以降の増殖が少ないか、または存在しないことが示されました8。
それに加えて、細胞培養のための成長因子サプリメントとして使用されるウシ胎児血清(FBS)などの異種添加培地によるさらなる操作は、免疫反応性のリスクおよび宿主患者のウイルス、細菌、またはプリオン感染への曝露の増加と関連している9,10。免疫反応および蕁麻疹様発疹の発生は、FBS11で産生された間葉系幹細胞を数回投与された個体において既に説明されている。さらに、FBSはバッチ間のばらつきを受け、最終製品の品質に影響を与える可能性があります12。
適正製造基準(GMP)ガイドラインに従って、酵素組織の解離を回避し、FBSを異種を含まないサプリメントに置き換える必要があります。これらのステップは、より信頼性が高く再現性のあるプロトコルとともに、細胞療法の適用をサポートするために不可欠です3、13。
これに関連して、ヒト血小板ライセート(hPL)は、無細胞、タンパク質含有、成長因子が豊富なサプリメントであり、in vitro細胞培養および増殖のための増殖培地の添加剤として臨床グレードの細胞ベースの製品の間で以前に導入されたため、FBSの代替として提案されています14,15。hPLはヒト由来の産物であるため、臨床応用を目的としたhASCのin vitro培養中にFBSの代替として頻繁に使用され、FBSの翻訳可能性に関連する免疫反応や感染症に関する問題を軽減します15,16。
より高い生産コストにもかかわらず、FBSと比較して、hPLは多くの細胞タイプの細胞生存率をサポートし、増殖を増加させ、老化を遅らせ、ゲノム安定性を保証し、後期細胞継代でも細胞免疫表現型を保存することがすでに実証されています。これらすべての要素は、この文化サプリメント11への切り替えをサポートします。
この研究の目的は、従来のFBS培養hASCと比較して、細胞生理学とステムネスの特性を変更することなく、完全な動物を含まない方法でhASCを分離および培養するための標準化されたプロトコルを開発することでした(図1)。
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Protocol
hASCは、スイス、ローザンヌ、CHUVのローザンヌ大学病院で腹部自家皮弁(深部下上腹部穿孔フラップ、[DIEP])を使用して乳房再建術を受けた健康な女性の腹部脂肪組織から分離されました。フラップと脂肪組織の廃棄部分は、患者がインフォームドコンセントに署名した後に取得されました。すべてのプロトコルは、ヘルシンキ宣言に従って、病院のバイオバンク部門DAL(番号314 GGC)および倫理委員会によってレビューおよび承認されました。
注意: すべてのステップは、層流フードの下で無菌状態で実行する必要があります。個人用保護用の手袋と白衣は常に着用し、すべての表面は適切な殺生物剤で洗う必要があります。余分な組織は生物医学廃棄物として適切に処分する必要があります。
1.必要な材料と培養液の調製
- 細胞の単離、増殖、および凍結保存のために、以下の器具を入手してください:滅菌ハサミ;滅菌メス;滅菌ピンセット;10cmのペトリ皿。15 mLチューブ;T25フラスコ;バーカーチャンバー;クライオバイアル;細胞凍結容器;4倍と10倍の倍率対物レンズを備えた光学顕微鏡。スイングバケット遠心分離機。
- イムノフェノタイピングのために、以下の器具および試薬を入手してください:FACSチューブ、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS);ダルベッコの最小必須培地(DMEM);hPL;ジメチルスルフィド;動物を含まないトリプシン。
- DMEMに5%ヘパリンフリーhPLを添加して、完全な培地を調製します。培地を4°Cで最大3週間保管し、常に温かいもの(室温から37°Cの間)を使用してください。ヒト治療を目的とした細胞医薬品の製造に関するGMPガイドラインに従って、培養液に抗生物質を添加しないでください。
- DMEMで20%hPLと10%ジメチルスルフィドを含む凍結培地を準備します。
2.脂肪組織サンプルからのhASCの分離
- 脂肪組織サンプルを入手してから6時間以内に処理します。確立された機械的異種異系フリーの分離方法に進む前に、結合組織と血液が放出されるまで組織をPBSで2回10分間洗浄します。
- 腹部形成外科手術から得られた脂肪組織サンプルは、hASCの生存率を損なわないように、処理されるまで、そしていずれの場合も24時間以内に、4°CのPBSに保管してください。
- 脂肪組織を滅菌ハサミで約1cm2 の小片に切断する。
- メスで、各ピースを直径<5 mmの小さな断片に細かく解剖し、そのうちの5つを10 cmのペトリ皿に分散させます(図2A)。
- 各フラグメントを取り付けるには、メスを使用してプラスチック表面に切り込みを入れ、ペトリ皿にしっかりとくっつくまで各フラグメントをドラッグします。ピンセットを使用してフラグメントを処理します(図2B)。
- 10 mLの完全培養液を穏やかに加え、すべての断片を剥離せずにカバーします。
- ペトリ皿を37°Cおよび5%CO2でインキュベートする。hASCは組織から移動し、酵素消化なしで可塑性接着のために選択されます。
- 細胞コンフルエントになるまで、1日1回、光学顕微鏡下で4倍の倍率でhASC増殖をモニターする。hASCが組織から出始めると、典型的な線維芽細胞様形態の組織片の周りに小さなクラスターとして現れます。hASCは、プラスチック表面に接着する能力のために選択されます。72時間ごとに、できるだけ多くの培地を除去し、細胞残骸を除去するために新鮮な完全培地と交換します。
- 細胞の最初の通過まで、つまり通常7日後まで、組織の断片をそのままにしておきます。
3. 単離段階後のhASC培養
- hASC培養が70%〜80%のコンフルエントに達すると、hASCを分離してさらに拡張して、他の実験または長期保存に使用する準備が整います。
- 滅菌ピンセットを使用して、ペトリ皿からすべての組織片を取り出して廃棄します。消耗した培地を取り外して廃棄し、hASCを切り離さないように注意します。
- 細胞を10 mLのPBSで一度慎重に洗浄します。動物を含まないトリプシン1 mLを1 mL加え、ペトリ皿を37°Cのインキュベーターに5分間放置します。
- すべての細胞が剥離したかどうかを4倍の倍率で光学顕微鏡で確認します。それ以外の場合は、ペトリ皿をインキュベーター内にさらに2分間放置し、最終的にプラスチック表面を軽くたたいて細胞の剥離をサポートします。
- 2 mLの完全培地を加えてトリプシン作用を停止し、15 mLチューブにすべての細胞を回収します。
- 残っているトリプシンを除去するには、チューブを300 x g で5分間遠心分離します。上清を廃棄し、5 mLの完全培地で細胞を懸濁し、細胞懸濁液を新しいT25フラスコに移します。hASCを培養に保持し、必要になるまで拡張します。
4. フローサイトメトリーによる免疫表現型調査
- hASC培養が70%〜80%のコンフルエントに達したら、セクション3で前述したようにhASCを剥離します。
- 細胞を回収した後、1 mLの完全培地に懸濁し、光学顕微鏡下でセルカウンターで10倍の倍率でアリコートを数えます。
- hASCを300 x g で5分間遠心分離し、1 x 106 細胞/mLのFACSバッファーで懸濁します。1 x 105 細胞を含む懸濁液100 μLを1本のFACSチューブに移します。調査対象の抗原ごとに1本のFACSチューブを使用し、さらにアイソタイプコントロールごとにもう1本を使用します。
- FACSバッファーで希釈した100 μLの抗体で細胞を染色します:抗CD73(1:1,000、IgG1、FITC標識)、抗CD105(1:200、IgG1、PE標識);抗CD34(1:66、IgG1、FITC標識);抗CD45(1:66、IgG1、FITC標識);各蛍光色素のアイソタイプコントロール、IgG1 FITC標識(1:1,000)およびIgG1 PE標識(1:50)。
- サンプルを暗所で1時間インキュベートし、4°Cで攪拌します。 チューブを300 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を500 μLのFACSバッファーに懸濁します。
- フローサイトメトリー装置で細胞免疫表現型を評価し、細胞デブリを除外するために選択したゲート内のチューブごとに50,000イベントを記録します。発現細胞の割合を特定のアイソタイプコントロールとの差として算出する。
5. hASCの増殖アッセイ
- hASC培養が70%〜80%のコンフルエントに達したら、セクション3の説明に従ってhASCを剥離します。
- 細胞を回収した後、1 mLの完全培地に懸濁し、光学顕微鏡下でセルカウンターで10倍の倍率でアリコートを数えます。
- 5 x 102 hASCを200 μLの完全培地に96ウェル透明プレートに播種します。テクニカルレプリケートで細胞をシードし、各時点に1つのウェルを使用します。
- 播種後3日目に、製造元の指示に従って増殖アッセイキットを使用して細胞増殖の検出を開始します。簡単に言うと、培養液を、ウェルあたり20 μLのアッセイ試薬に加えた100 μLの新しい培地と交換します。hASCを37°C、5%CO2 で2.5時間インキュベートして試薬開発を行い、分光光度計で490nmの吸光度を検出します。
- hASC増殖をブランク吸光度を除去した後の吸光度百分率で表す。
6. hASCの凍結保存と保存
- セクション3の説明に従って細胞を剥離し、10倍の倍率で光学顕微鏡下でセルカウンターでアリコートを数えます。
- 細胞を300 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。細胞を1 x 106 hASC/mLの密度で凍結ミックスで懸濁し、1 mLの細胞溶液を1つのクライオバイアルに移します。
- クライオバイアルを-80°Cで温度を1°C/分下げる冷凍容器に入れ、クライオバイアルを液体窒素に移して長期保存します。
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Representative Results
上記の単離方法を適用すると、コラゲナーゼを使用せずに腹部脂肪組織サンプルからhASCが首尾よく得られました。さらに、hASCは、hPLの存在下で、動物由来の他の成分を含まない完全な異種異系フリー条件で増殖した。以下の結果は、プロトコルを支持し、hPLと並行して培養し、FBSを対照条件として培養したhASCから得られたものです。
最初のクラスター出現後、hASCは古典的な紡錘体のような形状を示し、FBSの存在下でコントロール細胞と比較して小さく、より細長いものでした(図3)。フローサイトメトリーで評価した細胞免疫表現型は、2つのサプリメントで培養したhASC間で類似しているように見えました。特に、hASCの80%〜90%以上がCD73 17およびCD105 17に陽性であり、CD3417およびCD45 17を発現したのは5%未満でした(図4)。最後に、増殖アッセイは、FBSコントロールと比較して、hPLを培地に添加した場合の細胞増殖の有意な増加を明らかにしました(図5)。
図1:プロトコルのグラフィカルな要約。 ヒト脂肪由来幹細胞の単離および in vitro 増殖のための異種フリー法。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2: in vitro 培養でhASCを得るための脂肪組織の切断および播種プロセス。 (A)脂肪組織を直径<5mmの断片に微量解剖し、10cmのシャーレに分散させる。(B)メスでプラスチック表面に切り込みを入れた後のペトリ皿への取り付け。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:hASCの形態。 異種異系でない条件で培養したhASCは、紡錘状の形状と細長い形態を示しました。対照としてFBSの存在下で培養されたhASCは、より大きく、ブルズアイ形状を有していた。スケールバーは100μmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:hASCの免疫表現型。 hASCの免疫表現型は、hPLおよびFBSの存在下で類似していた。特に、両方の条件のhASCは、CD73およびCD105に対して陽性であり、CD34およびCD45に対して陰性であると見なすことができた。エラーバーは標準誤差(n = 3)を示します。略語:hPL =ヒト血小板溶解物;FBS =ウシ胎児血清。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:hASCの増殖。 異種異系のない条件で増殖したhASCは、FBSの存在下でのhASCよりも有意に増殖した。** p < 0.01(スチューデントのt検定で評価された有意性、n = 3)。x軸は播種後の日数で時間を表す。略語:hPL =ヒト血小板溶解物;FBS =ウシ胎児血清;hASCs=ヒト脂肪由来幹細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
脂肪由来幹細胞は、その豊富さ、迅速で手頃な価格の単離方法、高いin vitro/in vivo増殖率、および幹細胞性/分化特性により、過去10年間でトランスレーショナル研究の関心を集めてきました18,19,20。その結果、hASCは再生医療における細胞ベースの戦略の優れた候補と考えられています21。脂肪組織から単離した後、hASCはin vitroで増殖する必要があり、場合によっては、特定の治療用途に使用する前に分化段階にかける必要があります。単離、in vitroでの増殖、および最終的な分化を含むプロセス全体は、翻訳の観点からリスクを軽減するためにGMPガイドラインに従って実施する必要があります22,23。
単離プロセスに関しては、酵素消化および遠心分離ステップは比較的短時間で多数のhASCを迅速に生成しますが、以前の報告では、これらの方法が他の機械的分離方法と比較してクラスター分化マーカーの観点から細胞表現型の変化を引き起こす可能性があることが示されているため、これらのhASCをヒト患者に適用する際のバイオセーフティ、細胞特性、および行動上の問題について疑問が生じます3。.さらに、異種成分に関連するリスクを最小限に抑えるために、最近の研究では、合成酵素または機械的方法を使用してhASCを分離することが提案されています。しかしながら、合成酵素でさえ、細胞プロファイルを改変し、製品品質に影響を与える可能性がある24。それどころか、ここで検討した外植体ベースの方法は、hASCが組織から移動し、異種試薬を使用せずに自然にプラスチック表面に付着するため、翻訳目的のための有効な代替手段であり得る9。同時に、この方法は、古典的なコラゲナーゼ単離と比較して低い細胞収量を証明したことを考慮しなければならない25。
サプリメント培地に関しては、hPLがhASC生理学的特性を変化させることなくFBSよりも高い程度までhASC拡大をサポートすることに同意した最近の文献に基づいて26,27,28,29、我々は従来のFBS添加培地をhPL16に置き換えた。hPLによる細胞培養をサポートすることで、機械的分離に関連する細胞収量の減少と回収の遅れを克服しました。これらのあまり操作されていないhASCは、効率的かつ安全な方法で臨床的に関連するボリュームに到達するのに必要な増殖を可能にする速度でin vitroで増殖しました30,31。さらに、hPLを用いた培養は、hASCに典型的なステム様の特徴および免疫表現型を変化させなかったため、これらの細胞の治療上の関心が維持されたことを意味します。
私たちの知る限り、ASCについてはさまざまな外植体分離プロトコルが説明されていますが、私たちの方法は、ASCの異種異系を含まない機械的単離とhPL添加培地培養を組み合わせて、トランスレーショナルアプリケーションのための貴重な細胞集団を得る最初の方法です。
それに加えて、この作品で説明されている方法には、さらに詳しく説明する必要があるいくつかの重要な側面があります。第一に、細切された脂肪組織片の直径は、プラスチック表面へのそれらの接着を容易にし、組織からのhASCの移動を可能にするために5mmを超えてはなりません。第二に、プレートにすでに付着しているhASCと一緒に培養中の脂肪組織断片の存在は、汚染リスクと十分な数の遊走細胞の必要性を考慮してバランスをとる必要があります。第三に、研究者は、外植片播種後の最初の24時間で成長率が低下する可能性があることに注意する必要があります。この期間の後、hPL補給は、従来のFBS30と比較して細胞の回復と増殖を刺激します。
現時点では、上記の元のプロトコルと比較して、それ以上のステップや変更は導入されていません。
結論として、ここで説明する完全な異種フリー法は、動物由来製品、化学酵素、または遠心分離ステップがない場合に、脂肪吸引および腹部脂肪組織の両方を含む脂肪組織からhASCを単離する簡単な方法を提供します。さらに、hPL添加培地は、hASCの治療特性を変化させずに、得られる初期細胞の低収率を相殺し、細胞増殖を促進します。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者には謝辞がありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | - | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | - | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
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