Summary
Ксеногенные (химические или животного происхождения) продукты, вводимые на этапах подготовки/манипуляции с клеточной терапией, связаны с повышенным риском иммунной реактивности и патогенной передачи у пациентов-хозяев. Здесь описан полный безксеногенный метод выделения и экспансии in vitro стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека.
Abstract
Учитывая растущее влияние терапии стволовыми клетками, были высказаны опасения по поводу биобезопасности в отношении потенциального загрязнения или передачи инфекции из-за введения продуктов животного происхождения во время манипуляций in vitro . Ксеногенные компоненты, такие как коллагеназа или эмбриональная бычья сыворотка, обычно используемые на этапах выделения и расширения клеток, могут быть связаны с потенциальным риском иммунной реактивности или вирусной, бактериальной и прионной инфекции у получающих пациентов. Следуя рекомендациям по надлежащей производственной практике, следует избегать химической диссоциации тканей, в то время как эмбриональная бычья сыворотка (FBS) может быть заменена добавками, не содержащими ксеногенов. Кроме того, для обеспечения безопасности клеточных продуктов важно определение более надежных и воспроизводимых методов. Мы разработали инновационный, полностью свободный от ксеногенов метод выделения и расширения in vitro стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека, без изменения их свойств по сравнению со стандартными протоколами, культивируемыми коллагеназой FBS. Здесь из жировой ткани брюшной полости были выделены стволовые клетки, полученные из жировой ткани человека (hASCs). Образец механически измельчали ножницами/скальпелем, микрорассекали и механически диспергировали в 10-сантиметровой чашке Петри и готовили с разрезами скальпелем для облегчения прикрепления фрагментов ткани и миграции hASC. После этапов промывки hASC были выбраны из-за их пластической адгезии без ферментативного сбраживания. Выделенные hASC культивировали со средой, дополненной 5% лизатом тромбоцитов человека, не содержащим гепарина, и отделяли с заменителем трипсина, не содержащим животных. В соответствии с указаниями надлежащей производственной практики (GMP) по производству клеточных продуктов, предназначенных для терапии человека, антибиотики не использовались ни в одной питательной среде.
Introduction
В последние десятилетия растущий спрос на инновационные терапевтические методы лечения привел к значительным усилиям и инвестициям в ресурсы в области трансляционной медицины1. Клеточные продукты связаны с рисками, определяемыми клеточным источником, производственным процессом (выделение, экспансия или генетическая модификация) и неклеточными добавками (ферменты, факторы роста, культуральные добавки и антибиотики), и эти факторы риска зависят от конкретных терапевтических показаний. На качество, безопасность и эффективность конечного продукта могут оказывать глубокое влияние вышеуказанные элементы2. Терапия стволовыми клетками требует соблюдения принципов биобезопасности; Потенциальные риски патогенной передачи с продуктами животного происхождения в культуре клеток могут быть проблематичными, и тщательное тестирование любого продукта, введенного в производство, имеет важное значение3.
Традиционный метод выделения стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека (hASCs), включает ферментативное расщепление, выполняемое коллагеназой, с последующим промывом этапов центрифугирования4. В то время как ферментативная изоляция, как правило, считается более эффективной, чем другие механические методы, с точки зрения выхода клеток и жизнеспособности, используемые компоненты животного происхождения, такие как коллагеназа, считаются более чем минимально манипулируемыми Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США. Это означает, что существует значительно повышенный риск иммунных реакций или передачи заболевания, что ограничивает перевод терапии hASC в клинические условия 5,6.
Пищеварение на основе трипсина является еще одним ферментативным протоколом для выделения ИСС. Были описаны различные методы с небольшими изменениями с точки зрения концентрации трипсина, скорости центрифугирования и времени инкубации. К сожалению, этот метод недостаточно хорошо описан, и в литературе отсутствует сравнение, особенно с протоколами механической изоляции7. Однако с точки зрения переводимости подхода трипсин имеет те же недостатки, что и коллагеназа.
Альтернативные методы выделения для получения ИСС, основанные на механических силах и без добавления ферментов, включают высокоскоростное центрифугирование (800 x g или 1,280 x g, 15 мин) фрагментов жировой ткани. Затем гранулы инкубируют с буфером лизиса эритроцитов (5 мин), после чего следует еще одна стадия центрифугирования при 600 x g перед ресуспендированием в питательной среде. Несмотря на большее количество клеток, выделенных в первые дни по сравнению с методами эксплантата, предыдущее исследование показало более низкую или отсутствующую пролиферацию после второй недели культивирования8.
Кроме того, дальнейшие манипуляции с ксеногенной добавленной средой, такой как эмбриональная бычья сыворотка (FBS), которая используется в качестве добавки фактора роста для клеточной культуры, связаны с повышенным риском иммунной реактивности и воздействия вирусных, бактериальных или прионных инфекций пациента-хозяина 9,10. Иммунные реакции и развитие крапивницы уже были описаны у лиц, получавших несколько доз мезенхимальных стволовых клеток, продуцируемых с помощью FBS11. Кроме того, FBS подвержен вариабельности от партии к партии, что может повлиять на качество конечного продукта12.
В соответствии с руководящими принципами надлежащей производственной практики (GMP) следует избегать ферментативной диссоциации тканей и заменять FBS добавками, не содержащими ксеногенов. Эти шаги вместе с более надежными и воспроизводимыми протоколами необходимы для поддержки применения клеточной терапии 3,13.
В этом контексте лизат тромбоцитов человека (hPL) был предложен в качестве замены FBS, поскольку он представляет собой бесклеточную, содержащую белок, обогащенную фактором роста добавку, и ранее он был представлен среди продуктов на клеточной основе клинического класса в качестве добавки питательной среды для культивирования и размножения клеток in vitro 14,15. Поскольку hPL является продуктом человеческого происхождения, он часто используется в качестве заменителя FBS во время культивирования in vitro hASCs, предназначенных для клинического применения, тем самым уменьшая проблемы, связанные с иммунологическими реакциями и инфекциями, связанными с переводимостью FBS15,16.
Несмотря на более высокие производственные затраты, уже было продемонстрировано, что по сравнению с FBS hPL поддерживает жизнеспособность клеток для многих типов клеток, увеличивает пролиферацию, задерживает старение, обеспечивает стабильность генома и сохраняет клеточный иммунофенотип даже в поздних клеточных пассажах; Все эти элементы способствуют переходу на эту культуру Дополнение11.
Целью данной работы была разработка стандартизированного протокола выделения и культивирования hASC полным безживотным методом, без изменения физиологии клеток и свойств стволовости по сравнению с классическими hASC, культивируемыми FBS (рис. 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hASC были выделены из брюшной жировой ткани здоровой женщины, которая перенесла реконструкцию груди с использованием абдоминальных аутологичных лоскутов (глубокие нижние эпигастральные перфораторные лоскуты, [DIEP]) в Университетской больнице Лозанны, CHUV, Лозанна, Швейцария. Отброшенная часть лоскута и жировая ткань были получены после того, как пациент подписал информированное согласие. Все протоколы были рассмотрены и одобрены отделением биобанка больницы DAL (номер 314 GGC) и комитетами по этике в соответствии с Хельсинкской декларацией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы должны выполняться под ламинарным колпаком и в асептических условиях. Перчатки и лабораторные халаты для индивидуальной защиты следует носить всегда, а все поверхности следует мыть соответствующими биоцидами. Излишки тканей следует утилизировать надлежащим образом как биомедицинские отходы.
1. Необходимые материалы и приготовление культуральных растворов
- Для выделения, расширения и криоконсервации клеток приобретите следующие инструменты: стерильные ножницы; стерильные скальпели; стерильный пинцет; чашка Петри диаметром 10 см; пробирки 15 мл; колбы Т25; камера Бюркера; криопрепараты; контейнер для замораживания клеток; оптический микроскоп с объективами 4-кратного и 10-кратного увеличения; и центрифуга с качающимся ковшом.
- Для иммунофенотипирования приобретите следующие инструменты и реагенты: пробирки FACS, стерильный фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS); Минимальная эссенциальная среда Дульбекко (DMEM); hPL; диметилсульфид; и трипсин без животных.
- Приготовьте полную питательную среду, дополнив DMEM 5% hPL, не содержащим гепарина. Храните среду при температуре 4 ° C до 3 недель и всегда используйте теплой (от комнатной температуры до 37 ° C). Следуя рекомендациям GMP по производству клеточных лекарственных средств, предназначенных для терапии человека, не добавляйте антибиотики в питательную среду.
- Приготовьте морозильную среду, содержащую 20% hPL и 10% диметилсульфида в DMEM.
2. Выделение hASC из образца жировой ткани
- Обработайте образец жировой ткани в течение 6 ч после его получения. Прежде чем приступить к установленному механическому методу выделения без ксеногенов, промыть ткань 2 раза PBS в течение 10 мин до высвобождения соединительной ткани и крови.
- Храните полученный образец жировой ткани, полученный в результате абдоминопластической хирургии, в PBS при температуре 4 ° C до обработки и, в любом случае, не дольше 24 часов, чтобы не повредить жизнеспособность hASC.
- Разрежьте жировую ткань на более мелкие кусочки размером примерно 1 см2 стерильными ножницами.
- С помощью скальпеля рассеките каждый кусочек на мелкие фрагменты диаметром <5 мм и распределите пять из них в чашке Петри диаметром 10 см (рис. 2А).
- Для того, чтобы прикрепить каждый фрагмент, с помощью скальпеля создайте надрезы на пластиковой поверхности, перетаскивая каждый фрагмент до тех пор, пока он не будет прочно прилипать к чашке Петри. Используйте пинцет, чтобы помочь справиться с фрагментом (рисунок 2B).
- Аккуратно добавьте 10 мл полной питательной среды, чтобы покрыть все фрагменты, не отделяя их.
- Инкубируют чашки Петри при 37 °C и 5%CO2. hASC будут мигрировать из ткани и отбираться из-за их пластической адгезии без ферментативного переваривания.
- До слияния клеток контролируйте расширение hASC под оптическим микроскопом с 4-кратным увеличением один раз в день. Когда hASC начинают выходить из ткани, они появляются в виде небольших скоплений вокруг кусочков ткани с типичной фибробластоподобной морфологией. hASC выбраны из-за их способности прилипать к пластиковой поверхности. Каждые 72 часа удаляйте как можно больше среды и заменяйте ее свежей полной средой, чтобы удалить клеточный мусор.
- Оставляют фрагменты ткани на месте до первого прохождения клеток, что обычно происходит через 7 дней.
3. Культура hASC после фазы выделения
- Когда культура hASC достигает 70-80% слияния, hASC готовы к отделению и дальнейшему расширению для использования либо для других экспериментов, либо для длительного хранения.
- Стерильным пинцетом удалите и выбросьте все кусочки ткани из чашки Петри. Удалите и выбросьте отработанную среду, стараясь не прикасаться к hASC, чтобы не отсоединить их.
- Тщательно промойте клетки один раз 10 мл PBS. Добавьте 1 мл 1x трипсина, не содержащего животных, и оставьте чашку Петри в инкубаторе при 37 ° C на 5 минут.
- Проверьте под оптическим микроскопом при 4-кратном увеличении, все ли клетки отсоединились; в противном случае оставьте чашку Петри еще на 2 минуты в инкубаторе и в конце концов осторожно постучите по пластиковой поверхности, чтобы поддержать отслоение клеток.
- Остановите действие трипсина, добавив 2 мл полной среды и соберите все клетки в пробирку объемом 15 мл.
- Чтобы удалить оставшийся трипсин, центрифугируйте пробирку при 300 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость, суспендируйте клетки с 5 мл полной среды и перенесите клеточную суспензию в новую колбу T25. Храните hASC в культуре и расширяйте их до тех пор, пока они не понадобятся.
4. Исследование иммунофенотипа методом проточной цитометрии
- Когда культура hASC достигнет 70-80% слияния, отсоедините hASC, как описано ранее в разделе 3.
- После сбора клеток суспендируйте их в 1 мл полной среды и подсчитайте аликвоту с помощью счетчика клеток под оптическим микроскопом при 10-кратном увеличении.
- Центрифугируют hASC при 300 x g в течение 5 мин и суспендируют их при 1 x 106 клетках / мл буфера FACS. Перенесите 100 мкл суспензии, содержащей 1 x10,5 клеток, в одну пробирку FACS. Используйте одну пробирку FACS для каждого исследуемого антигена плюс еще одну для каждого изотипического контроля.
- Окрашивают клетки 100 мкл следующих антител, разведенных в буфере FACS: анти-CD73 (1:1,000, IgG1, меченный FITC), анти-CD105 (1:200, IgG1, меченный PE); анти-CD34 (1:66, IgG1, меченный FITC); анти-CD45 (1:66, IgG1, меченный FITC); и изотипический контроль для каждого флуорофора, меченного IgG1 FITC (1:1,000) и меченного IgG1 PE (1:50).
- Инкубируют образцы в течение 1 ч в темноте при перемешивании при 4 °C. Центрифугируйте пробирки при 300 x g в течение 5 мин, выбросьте надосадочную жидкость и суспендируйте клетки в 500 мкл буфера FACS.
- Оцените клеточный иммунофенотип с помощью инструмента проточной цитометрии, записывая 50 000 событий для каждой пробирки внутри ворот, выбранных для исключения клеточного мусора. Рассчитайте процент экспрессирующих клеток как отличие от конкретного изотипического контроля.
5. Анализ пролиферации hASC
- Когда культура hASC достигнет 70-80% слияния, отсоедините hASC, как описано в разделе 3.
- После сбора клеток суспендируйте их в 1 мл полной среды и подсчитайте аликвоту с помощью счетчика клеток под оптическим микроскопом при 10-кратном увеличении.
- Затравка 5 x 102 hASC в 200 мкл полной среды в прозрачных пластинах с 96 лунками. Засейте клетки в технические реплики, по одной лунке для каждого момента времени.
- Через 3 дня после посева начните обнаруживать пролиферацию клеток с помощью набора для анализа пролиферации, следуя инструкциям производителя. Короче говоря, замените питательную среду 100 мкл свежей среды, добавленной к 20 мкл пробирного реагента на лунку. Инкубируйте hASC в течение 2,5 ч при 37 °C, 5% CO2 для проявления реагента, а затем определите поглощение на длине волны 490 нм с помощью спектрофотометра.
- Выразите пролиферацию hASC как процент поглощения после удаления пустого поглощения.
6. Криоконсервация и хранение hASC
- Отделите клетки, как описано в разделе 3, и подсчитайте аликвоту с помощью счетчика клеток под оптическим микроскопом при 10-кратном увеличении.
- Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Суспендировать клетки с замораживающей смесью при плотности 1 х 106 hASCs/мл и перенести 1 мл клеточного раствора в один криовиал.
- Поместите криовиалы при температуре -80 °C в контейнер для замораживания, температура которого снизится на 1 °C/мин, а затем переместите криовиалы на жидкий азот для длительного хранения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Применяя метод выделения, описанный выше, hASC были успешно получены из образцов жировой ткани брюшной полости без использования коллагеназы. Более того, hASC были расширены в полностью свободных от ксеногенов условиях в присутствии hPL и без каких-либо других компонентов животного происхождения. Следующие результаты подтверждают протокол и получены из hASC, культивируемых параллельно с hPL и с FBS в качестве контрольного условия.
После первоначального появления кластера hASC показали классическую веретенообразную форму и были меньше и более вытянутыми по сравнению с контрольными клетками в присутствии FBS (рис. 3). Клеточный иммунофенотип, оцененный с помощью проточной цитометрии, оказался одинаковым между hASCs, культивируемыми с двумя добавками. В частности, более 80-90% hASC были положительными на CD73 17 и CD105 17 и менее 5% экспрессировали CD34 17 и CD45 17 (рис. 4). Наконец, анализ пролиферации показал значительное увеличение роста клеток при добавлении hPL в среду по сравнению с контролем FBS (рис. 5).
Рисунок 1: Графическая аннотация протокола. Безксеногенный метод выделения и экспансии in vitro стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Процесс разрезания и посева жировой ткани для получения hASC в культуре in vitro . (А) Микродиссекция жировой ткани на фрагменты диаметром <5 мм и дисперсия фрагментов в чашке Петри диаметром 10 см. (B) Прикрепление к чашке Петри после создания надрезов на пластиковой поверхности скальпелем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Морфология hASC. hASCs, культивируемые в безксеногенных условиях, показали веретенообразную форму и удлиненную морфологию. hASC, культивируемые в присутствии FBS в качестве контроля, были больше и имели форму яблочка. Масштабная линейка представляет собой 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Иммунофенотип hASCs. Иммунофенотип hASC был сходным при наличии hPL и FBS. В частности, hASC в обоих условиях можно считать положительными для CD73 и CD105 и отрицательными для CD34 и CD45. Столбцы погрешности указывают на стандартную ошибку (n = 3). Сокращения: hPL = лизат тромбоцитов человека; FBS = эмбриональная бычья сыворотка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Пролиферация hASC. hASCs, расширенные в условиях, свободных от ксеногенов, размножались значительно больше, чем в присутствии FBS. ** p < 0,01 (значимость оценивается с помощью t-критерия Стьюдента, n = 3). Ось X представляет собой время с точки зрения количества дней после посева. Сокращения: hPL = лизат тромбоцитов человека; FBS = эмбриональная бычья сыворотка; hASCs = стволовые клетки, полученные из жировой ткани человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Стволовые клетки, полученные из жировой ткани, привлекли интерес трансляционных исследований в последнее десятилетие из-за их изобилия, быстрых и доступных методов выделения, высокой скорости пролиферации in vitro/in vivo и свойств стволовости/дифференцировки18,19,20. В результате hASC считаются отличным кандидатом для клеточных стратегий в регенеративной медицине21. После выделения из жировой ткани hASC требуют расширения in vitro и, в некоторых случаях, должны быть подвергнуты стадии дифференцировки перед использованием для конкретного терапевтического применения. Весь процесс, включая изоляцию, экстракцию и возможную дифференциацию, должен проводиться в соответствии с руководящими принципами GMP, чтобы снизить любые риски с точки зрения трансляции22,23.
Что касается процесса выделения, в то время как этапы ферментативного расщепления и центрифугирования быстро дают большое количество hASC за относительно короткое время, предыдущие отчеты показали, что эти методы вызывают возможные фенотипические изменения клеток с точки зрения маркеров дифференцировки кластеров по сравнению с другими методами механической изоляции, что поднимает вопросы о биобезопасности, свойствах клеток и поведенческих проблемах при применении этих hASC с пациентами-людьми3 . Более того, чтобы свести к минимуму риски, связанные с ксеногенными компонентами, недавние исследования предложили использовать синтетические ферменты или механические методы для выделения hASCs. Однако даже синтетические ферменты могут модифицировать профиль клетки и влиять на качество продукта24. Напротив, исследованный здесь метод на основе эксплантатов может быть действительной альтернативой для трансляционных целей, поскольку hASC мигрируют из ткани и прилипают к пластическим поверхностям естественным образом, без использования каких-либо ксеногенных реагентов9. В то же время следует учитывать, что этот метод показал более низкий выход клеток по сравнению с классическим выделением коллагеназы25.
Что касается среды добавки, основываясь на недавней литературе, которая согласна с тем, что hPL поддерживает расширение hASC в большей степени, чем FBS, без изменения физиологических свойств hASC 26,27,28,29, мы заменили традиционную среду с добавлением FBS на hPL 16. Поддерживая клеточную культуру с помощью hPL, мы преодолели снижение выхода клеток и более медленное восстановление, связанное с механической изоляцией. Эти менее манипулируемые hASC размножались in vitro со скоростью, позволяющей расширяться, необходимой для достижения клинически значимых объемов эффективным и безопасным способом30,31. Кроме того, культура с hPL не изменяла стволовые признаки и иммунофенотип, типичные для hASCs, что означает, что терапевтический интерес этих клеток сохранялся.
Насколько нам известно, несмотря на то, что для ИСС было описано множество протоколов выделения эксплантатов, наш метод является первым, сочетающим механическую изоляцию ИСС без ксеногены с культурой среды, дополненной hPL, для получения ценной клеточной популяции для трансляционных применений.
Кроме того, метод, описанный в этой работе, имеет некоторые критические аспекты, которые нуждаются в дальнейшем детализации. Во-первых, диаметры измельченных фрагментов жировой ткани не должны превышать 5 мм, чтобы облегчить их адгезию к пластиковой поверхности и обеспечить миграцию hASC из ткани. Во-вторых, наличие фрагментов жировой ткани в культуре вместе с hASCs, уже прикрепленными к пластине, должно быть сбалансировано, учитывая риск загрязнения и необходимость достаточного количества мигрировавших клеток. В-третьих, исследователи должны знать о возможном снижении скорости роста в первые 24 часа после посева эксплантата; по истечении этого периода времени добавка hPL стимулирует восстановление и пролиферацию клеток по сравнению с классическим FBS30.
На данный момент никаких дальнейших шагов или модификаций не было введено по сравнению с исходным протоколом, описанным выше.
В заключение, полный безксеногенный способ, описанный здесь, обеспечивает простой способ выделения hASC из жировой ткани, включая как липоаспираты, так и жировую ткань брюшной полости, в отсутствие продуктов животного происхождения, химических ферментов или стадий центрифугирования. Кроме того, среда, дополненная hPL, уравновешивает полученный начальный меньший выход клеток и усиливает пролиферацию клеток, сохраняя при этом терапевтические свойства hASC неизменными.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
У авторов нет благодарностей.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | - | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | - | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
References
- Naderi, N., et al. The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery. International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).
- Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).
- Condé-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Chang, H., et al. Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation. Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).
- Spees, J. L., et al. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).
- Fadel, L., et al. Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep. Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).
- Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
- Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Lalu, M. M., et al. Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials. PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).
- Escobar, C. H., Chaparro, O. Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).
- Vaidya, V., et al. Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum. Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).
- Kyllönen, L., et al. Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4 (1), 17 (2013).
- Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion. Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Cowper, M., et al. Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells. Cells. 8 (7), 724 (2019).
- Kim, N., et al. Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice. Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).
- Palombella, S., et al. Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model. Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research. Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).
- Perez-Ilzarbe, M., et al. Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy. Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells. Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).
- Becherucci, V., et al. Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 124 (2018).
- Blande, I. S., et al. Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate. Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).
- Castegnaro, S., et al. Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue. Current Stem Cell Research & Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).
- Palombella, S., et al. Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 142 (2022).
- Palombella, S., et al. Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 432 (2020).
- Krähenbühl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use. International Journal of Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 007 (2015).
