Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

הגנה על תאי שריר הלב H9c2 מפני עקה חמצונית על ידי קרוצטין באמצעות מיטופגיה בתיווך מסלול PINK1/Parkin

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65105
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 2Fangshan Chinese Medicine Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

Summary

בהתבסס על ניסויים במבחנה , מחקר זה חשף את המנגנון של קרוצטין בתיקון נזקי עקה חמצונית של קרדיומיוציטים על ידי השפעה על מיטופגיה, שבה מסלול האיתות PINK1/Parkin ממלא תפקיד חשוב.

Abstract

מחקר זה נועד לחקור את ההשפעה החמצונית המגנה על עקה של קרוצטין על תאי שריר הלב H9c2 בתיווךH 2 O2באמצעות ניסויים במבחנה, ולחקור עוד יותר אם המנגנון שלו קשור להשפעה של מיטופגיה. מחקר זה נועד גם להדגים את ההשפעה הטיפולית של חומצה חריע על עקה חמצונית בקרדיומיוציטים ולחקור האם המנגנון שלה קשור להשפעת מיטופגיה. כאן, מודל עקה חמצונית מבוסס H 2 O2נבנה והעריך את מידת הפגיעה בעקה חמצונית של קרדיומיוציטים על ידי זיהוי רמות של לקטט דהידרוגנאז (LDH), קריאטין קינאז (CK), מלונדיאלדהיד (MDA), סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD), קטלאז (CAT) וגלוטתיון פרוקסידאז (GSH Px). מיני חמצן תגובתי (ROS) - זיהוי צבע פלואורסצנטי DCFH-DA, JC-1 צבע וצבע טונל שימשו להערכת נזק מיטוכונדריאלי ואפופטוזיס. שטף אוטופגי נמדד על ידי הדבקת אדנווירוס Ad-mCherry-GFP-LC3B. חלבונים הקשורים למיטופגיה זוהו לאחר מכן באמצעות כתמים מערביים ואימונופלואורסנציה. עם זאת, קרוצטין (0.1-10 מיקרומטר) יכול לשפר באופן משמעותי את כדאיות התא ולהפחית אפופטוזיס ונזקי עקה חמצונית הנגרמים על ידי H 2 O2. בתאים עם הפעלה אוטופגית מוגזמת, קרוצטין יכול גם להפחית את זרימת האוטופגיה ואת הביטוי של חלבונים הקשורים למיטופגיה PINK1 ופרקין, ולהפוך את העברת פרקין למיטוכונדריה. קרוצטין יכול להפחית את נזקי העקה החמצונית בתיווך H 2 O2ואת האפופטוזיס של תאי H9c2, והמנגנון שלו היה קשור קשר הדוק למיטופגיה.

Introduction

אוטם שריר הלב חריף (AMI) הוא נמק שריר הלב מסכן חיים הנגרם על ידי איסכמיה חמורה ומתמשכת והיפוקסיה לעורקים הכליליים 1,2. התערבות כלילית מלעורית (PCI) היא אחת האסטרטגיות הטיפוליות הקו הראשון עבור AMI, ובדרך כלל מגנה על קרדיומיוציטים מפני נזק איסכמי 3,4. שריר הלב הדיסטלי יהיה חסר אספקת דם וחמצן אם לא יטופל במהירות וביעילות לאחר AMI, מה שמוביל לנמק איסכמי וסיבוכים קרדיווסקולריים נוספים 5,6. קידום התאוששות קרדיומיוציטים ומזעור נזק בלתי הפיך לשריר הלב לאחר החמצת ההזדמנות הניתוחית PCI היה נקודה חמה מחקרית. לאחר AMI, קרדיומיוציטים נמצאים במצב של איסכמיה והיפוקסיה, וכתוצאה מכך עיכוב של זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי, הפחתה של NAD+ ל-NADPH, והפחתה מוגברת של אלקטרונים בודדים7. כתוצאה מכך, תגובת ההפחתה החלקית של חמצן יוצרת עודף של מיני חמצן תגובתי (ROS) ובסופו של דבר מובילה לנזק לעקה חמצונית לקרדיומיוציטים8. הצטברות מוגזמת של ROS גורמת לחמצון שומנים, ומשבשת עוד יותר את המבנה והתפקוד של קרומי המיטוכונדריה. התוצאה היא פתיחה מתמשכת של נקבוביות המעבר בחדירות המיטוכונדריה וירידה בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, מה שגורם לאפופטוזיס ונמק.

מעכבי אנזים ממיר אנגיוטנסין (ACE), חוסמי קולטן אנגיוטנסין (ARBs), מעכבי β-אדרנוצפטורים, אנטגוניסטים לאלדוסטרון ותרופות סטנדרטיות אחרות ב-AMI יכולים לסייע בשיפור תפקוד הלב לאחר אוטם שריר הלב ולמנוע התרחשות של אירועים ממאירים, כגון הפרעות קצב ועיצוב מחדש של החדר השמאלי9. עם זאת, הישרדות לאחר אוטם ופרוגנוזה מושפעים מאוד מגודל האוטם, ולא הושגו תוצאות משביעות רצון להפחתת אפופטוזיסקרדיומיוציטים 10,11. לפיכך, פיתוח תרופות לקידום התאוששות קרדיומיוציטים לאחר אוטם שריר הלב הפך לנושא דחוף.

הרפואה המסורתית מהווה מקור השראה למחקר הפרמצבטי המודרני מזה שניםרבות 12,13,14,15. לרפואה הסינית המסורתית (TCM) יש היסטוריה ארוכה בטיפול ב- AMI, וסדרה של מחקרי בקרה אקראיים בשנים האחרונות אישרו כי TCM אכן יכול לשפר את הפרוגנוזה של חולים16,17. על פי תיאוריית TCM, AMI נגרמת על ידי קיפאון דם18,19, ולכן תרופות לקידום זרימת הדם משמשות בדרך כלל לטיפול ב- AMI בשלב החריף20. ביניהם, זעפרן הוא האמין יש השפעה חזקה על הפעלת הדם קיפאון, והוא משמש לעתים קרובות בטיפול חריף של AMI. Crocetin, מרכיב עיקרי של זעפרן, עשוי לשחק תפקיד מפתח בהגנה cardiomyocytes21.

במחקר זה, תאי שריר הלב H9c2 הושרו על ידי H 2 O2כדי לדמות איסכמיה / רפרפוזיה של שריר הלב, הגורמת לפגיעה קרדיומיוציטים של AMI, וקרוצטין שימש כהתערבות כדי לחקור את השפעתו המגנה מפני פגיעה חמצונית הנגרמת על ידי לחץ שריר הלב. המנגנון של קרוצטין המגן על קרדיומיוציטים נחקר עוד יותר באמצעות מיטופגיה. חשוב מכך, מאמר זה מספק התייחסות לגישה הטכנית לחקר המיטופגיה ומתאר בפירוט את כל הליך הניסוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הניסויים בוצעו במעבדה לפיזיולוגיה באוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית, סין. כל שיטות הלימוד בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות של אוניברסיטת בייג'ינג.

1. תרבית תאים

  1. הוסף 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין למדיום הבסיסי Eagle medium (DMEM) של Dulbecco (עם 4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז, 4.g.g/L L-גלוטמין ו-110 מ"ג/ליטר נתרן פירובט; ראה טבלת חומרים) כדי להכין מדיום DMEM מלא.
  2. הפשירו את תאי שריר הלב H9c2 הקפואים בחנקן נוזלי (ראו טבלת חומרים) במים חמים בטמפרטורה של 37°C תוך ערבוב מהיר ואחיד עד שהקרח נמס.
  3. מעבירים את התאים לצינור צנטריפוגה ומוסיפים פי ארבעה מנפח התווך המלא של ה-DMEM. צנטריפוגה ב 358 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant באמצעות פיפטה.
  4. לדלל את תרחיף התא המתקבל עם מדיום תרבית, לנשוף בעדינות, ולחסן את התאים בבקבוק תרבית. תרבות באינקובטור ב 37 °C עם 5% CO2.

2. קביעת כדאיות התא

  1. המסת קרוצטין (ראה טבלת חומרים) בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) לריכוזים של 0.05 מילימול, 0.1 מילימול, 0.5 מילימול, 1 מילימול, 5 מילימול, 10 מילימול, 50 מילימול, 100 מילימטר ו-200 מילימול.
  2. לנתק את תאי שריר הלב H9c2 על ידי טריפסין, ולאחר מכן לנטרל את התערובת עם מדיום DMEM מלא.
  3. מעבירים את התאים לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה במהירות 179 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט וערבבו את התאים במדיום המלא של DMEM על ידי נשיפה עדינה.
  4. ספור את התאים באמצעות צלחת ספירת תאי דם22 (ראה טבלת חומרים) ודלל אותם ל 5 × 104 תאים / מ"ל עם DMEM תווך מלא.
  5. חלקו את התאים לתשעה חלקים שווים. הוסף DMSO (מדולל ביחס של 1:1,000 עם מדיום שלם DMEM) לקבוצת הביקורת והוסף ריכוזים שונים של קרוצטין לקבוצות הנותרות ביחס של 1:1,000.
  6. זרעו את התאים בצלחות 96 באר ב 100 μL לכל באר. יש להשליך את הסופרנאטנט לאחר הדגירה במשך 24 שעות ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.
  7. לאחר הוספת 100 μL של מדיום בסיסי DMEM, לדגור על התאים במשך 4 שעות ולהוסיף 20 μL של MTS (ראה טבלה של חומרים).
  8. לדגור על התאים עוד שעתיים, למדוד את הבליעה באורך גל של 490 ננומטר, ולחשב את כדאיות התא.
    הערה: כדאיות התא = (OD מטופל - OD ריק) / (פקד OD - OD ריק) × 100.

3. קביעת לקטט דהידרוגנאז (LDH), קריאטין קינאז (CK), מלונדיאלדהיד (MDA), סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD), גלוטתיון פרוקסידאז (GSH Px) וקטלאז (CAT)

  1. זרעו את תאי H9c2 בצלחת 6 בארות בצפיפות של 1 × 105 תאים. יש לאסוף את הסופרנאטנט לאחר ההתערבות ולזהות רמות LDH ו-SOD, בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
  2. אספו את הסופרנאטנט ושטפו אותו במי מלח חוצצי פוספט (PBS) פעם אחת. מוסיפים את התא ליזט לצלחת התרבית ומניחים לו לשבת על קרח במשך 20 דקות. אוספים את הנוזל מצלחת התרבית לתוך צינור צנטריפוגה.
  3. זיהוי רמות CK, MDA, GSH-PX ו-CAT בהתאם להוראות היצרן23 (ראה טבלת חומרים וקובץ משלים 1).
  4. זהה את ריכוז החלבון הכולל של הליזיס בשיטת חומצה ביכומונית (BCA) כדי לתקן את הריכוז של CK, MDA, GSH-PX ו- CAT24 (ראה טבלת חומרים).

4. קביעת ROS

  1. זרעו את תאי H9c2 בצלחת של 48 בארות בצפיפות של 5 × 103 תאים. יש לדלל DCFH-DA (ראו טבלת חומרים) ביחס של 1:1,000 עם התווך נטול הסרום. יש להשליך את הסופרנאטנט של התא ולשטוף את התא פעמיים עם מדיום ללא סרום.
  2. הוסיפו 150 μL של DCFH-DA מדולל לכל באר ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות. שטפו את התאים שלוש פעמים במדיום נטול סרום וצלמו תמונות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראו טבלת חומרים).

5. איתור פוטנציאל של קרום המיטוכונדריה

  1. זהה את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית באמצעות ערכת בדיקת פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי JC-125 (ראה טבלת חומרים). השליכו את מדיום התרבית ושטפו אותם פעם אחת עם מדיום ללא סרום.
  2. הוסף פתרון עבודה JC-1 לכל צינור וערבב אותם היטב. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות ולשטוף את התאים פעמיים עם חיץ צביעה JC-1. הוסף מדיום שלם לכל באר וצלם תמונות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

6. בדיקת צביעת טונל

  1. השתמש בערכת בדיקת אפופטוזיס TUNEL (ראה טבלת חומרים) כדי לקבוע שיעורי אפופטוזיס26. יש להשליך את הסופרנאטנט ולשטוף את הגלולה פעם אחת עם מדיום ללא סרום.
  2. הוסף תמיסת קיבוע תאים ושטוף אותם עם PBS פעם אחת לאחר הדגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
  3. מוסיפים 0.3% טריטון-100 לכל באר ודגרים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. שטפו את התאים עם PBS פעמיים. הוסף פתרון עבודה לזיהוי TUNEL ודגור בטמפרטורה של 37°C בחושך למשך 60 דקות.
  4. הוסף טבלית איטום מרווה נגד פלואורסצנטיות המכילה 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; ראה טבלת חומרים) וצלם תמונות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

7. ניטור זרימה אוטופגית על ידי טרנספקציה של mCherry GFP-LC3B אדנווירוס

  1. החליפו מחצית מהמדיום בכל באר במדיום טרי. הוסף Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus (ריבוי זיהום [MOI] של 2) למדיום התרבית והוסף 5 מיקרוגרם / מ"ל פוליברן (ראה טבלת חומרים) כדי לשפר את יעילות הזיהום.
  2. החלף את המדיום הטרי לאחר 24 שעות והתבונן בביטוי החלבון הפלואורסצנטי תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.
  3. תרבית את התאים עם אותם תנאים כמו סעיף 1 לאחר אישור זיהום מוצלח וירוס וללכוד תמונות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי27.
    הערה: יותר מ-20% מהתאים הראו פלואורסצנטיות של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), מה שמצביע על זיהום מוצלח.

8. ניתוח כתמים מערביים

  1. אספו תאים למיצוי חלבון מלא וערכו אותם (RIPA, מעכב פרוטאז ומעכב פוספטאז = 100:1:1; ראו טבלת חומרים) על קרח למשך 30 דקות.
  2. הוסף מאגר העמסת חלבון 5x לדגימת החלבון לאחר כימות החלבון והרתיח את הדגימות במשך 10 דקות.
  3. אלקטרופורזה הדגימות המכילות כמויות שוות של חלבון עם נתרן דודציל-סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) ג'ל28. לאחר מכן, העבירו את הדגימות לקרומי פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF).
  4. חסמו את קרומי PVDF למשך שעה אחת עם אבקת חלב רזה 5% ודגרו עם הנוגדן הראשוני (PINK1, פרקין; ראו טבלת חומרים) ב-4°C למשך הלילה והנוגדן המשני בטמפרטורת החדר למשך שעה.
  5. זהה את רצועות המטרה באמצעות פתרון chemiluminescence משופר (ECL) ומערכת זיהוי chemiluminescence. השתמש בתוכנת Image J כדי לכמת את הפסים באמצעות צפיפות,28.

9. זיהוי טרנסלוקציה מיטוכונדריאלית של פרקין על ידי immunofluorescence

  1. שימו לב ללוקליזציה של פרקין עם מיטוכונדריה על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית כפולה. השליכו את הסופרנאטנט של התא מכל קבוצה ושטפו אותם שלוש פעמים עם PBS.
  2. תקן את התאים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם 4% paraformaldehyde ולהוסיף 0.1% triton-100 ב- PBS.
  3. חסום עם תמיסת בלוקים ללא בעלי חיים (ראה טבלת חומרים) למשך שעה אחת כדי למנוע קשירה לא ספציפית בין חלבונים ונוגדנים ולהפחית את הרקע הפלואורסצנטי.
  4. יש לדגור עם נוגדן ראשוני (פרקין ו-Tom20; ראו טבלת חומרים) ב-4°C למשך הלילה.
  5. מוסיפים נוגדן משני פלואורסצנטי (ראו טבלת חומרים) ודגרים בחושך למשך שעה.
  6. הוסף את טבליות המרווה נגד פלואורסצנטיות המכילות DAPI וצלם תמונות תחת המיקרוסקופ הקונפוקלי.

10. ניתוח סטטיסטי

  1. ביצוע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנת גרפים וניתוח (ראה טבלת חומרים).
  2. השווה משתנים רציפים בין קבוצות באמצעות ANOVA חד-כיוונית. P < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השפעות של crocetin על כדאיות התא
קרוצטין ב-0.1 מיקרומטר, 0.5 מיקרומטר, 1 מיקרומטר, 5 מיקרומטר, 10 מיקרומטר, 50 מיקרומטר ו-100 מיקרומטר השפיע באופן משמעותי על התאים, בעוד שלקרוצטין בריכוזים מעל 200 מיקרומטר הייתה השפעה משמעותית על השגשוג של תאי H9c2 (איור 1A). לאחר 4 שעות של טיפול עם 400 מיקרומטר H 2 O2, כדאיות התא הופחתה במידה ניכרת, וקרוצטין יכול היה להפוך את השינוי הזה במידה מסוימת (איור 1B). מאחר שלא נצפה הבדל משמעותי בין 10 מיקרומטר ל-100 מיקרומטר קרוצטין בכדאיות תאי H9c2 המושרה על ידי H 2 O2, נבחר 10 מיקרומטר קרוצטין כריכוז הגבוה, ו-1 מיקרומטר ו-0.1 מיקרומטר שימשו כקבוצות המינון הבינוני והנמוך, בהתאמה.

השפעות קרוצטין על LDH, CK, MDA, SOD, GSH-PX ו- CAT בתאי H9c2
לאחר 4 שעות של טיפול עם 400 מיקרומטר H 2 O2, רמות LDH, CK ו- MDA עלו במידה ניכרת, בעוד רמות SOD, GSH-Px ו- CAT ירדו. טיפול מקדים של 10 מיקרומטר crocetin במשך 24 שעות יכול להפוך את השינויים לעיל מראה השפעה ברורה תלוי מינון. כתרופת בקרה חיובית, קו-אנזים Q10 יכול רק לשנות את הרמות של CK, MDA ו-SOD (איור 2).

ההשפעה של crocetin על ROS ב קרדיומיוציטים H9c2
כביקורת ריקה, קרדיומיוציטים H9c2 כמעט ולא ביטאו ROS. באותו הזמן, 400 μM H 2 O2עבור טיפול של 4 שעות יכול לשפר את רמת ROS באופן משמעותי, אשר יכול להיות הפוך על ידי 10 מיקרומטר crocetin במידה מסוימת (איור 3). תוצאות הפלואורסצנטיות הראו כי הפלואורסצנטיות הירוקה הייתה חלשה מאוד בקבוצה הנורמלית. לשם השוואה, 400 מיקרומטר H2 O2 עבור טיפול של 4 שעות יכול לשפר את האות הפלואורסצנטי הירוק, ושיפור זה יכול להיות מופחת ב -10 מיקרומטר קרוצטין (איור 3).

השפעות קרוצטין על H 2 O2-inducedmitochondrial membrane potential and apoptosis
צביעת JC-1 הראתה יותר פלואורסצנטיות אדומה ופחות פלואורסצנטיות ירוקה בקבוצת הביקורת הריקה. לאחר 4 שעות של טיפול ב-400 מיקרומטר H 2 O2, נצפו יותר פלואורסצנטיות ירוקה ופחות פלואורסצנטיות אדומה, וקרוצטין של 10 מיקרומטר יכול היה להפוך את השינוי הזה במידה מסוימת (איור 4A). תוצאות צביעת טונל הראו כי איתות הקשור לאפופטוזיס לא זוהה בקבוצת הביקורת הריקה, בעוד שהאיתות הקשור לאפופטוזיס השתפר במידה ניכרת לאחר 400 מיקרומטר H 2 O2במשך 4 שעות של טיפול, אשר יכול להתהפך במידה מסוימת על ידי 10 מיקרומטר קרוצטין (איור 4B).

השפעות של crocetin על H 2 O2-המושרהאוטופגיה מוגזמת
קרדיומיוציטים H9c2 בקבוצת הביקורת הריקה לא הראו זרימת אוטופגיה ברורה. פלואורסצנטיות הראתה את המראה של כתמים צהובים מנוקבים בקרדיומיוציטים H9c2 שטופלו מראש עם 400 מיקרומטר H 2 O2במשך 4 שעות, מה שמצביע על הפעלת יתר ברורה של אוטופגיה. עם זאת, שינוי זה בוטל לאחר טיפול מקדים של 10 מיקרומטר קרוצטין. בקבוצת הביקורת, ניתן היה לצפות בנגיף Ad-mCherry GFP-LC3B רק כרקע צהוב מפוזר חלש על ידי פלואורסצנטיות. אולם כתמים צהובים מנוקבים נצפו לאחר 400 מיקרומטר H 2 O2במשך 4 שעות של טיפול, ושינוי זה התהפך לאחר הטיפול המקדים של 10 מיקרומטר קרוצטין (איור 5).

זיהוי של crocetin על ביטוי של חלבונים הקשורים mitophagy
תוצאות הכתם המערבי הראו כי בקבוצת הביקורת, רמות הביטוי של PINK1 ופרקין היו נמוכות יותר. בקרדיומיוציטים H9c2 עם גירוי H9c2 של 4 שעות, רמות הביטוי של PINK1 ופרקין עלו, בעוד שטיפול מקדים של 10 מיקרומטר בקרוצטין יכול להפחית את העלייה של PINK1 ופרקין (איור 6).

זיהוי ההשפעה של crocetin על טרנסלוקציה של פרקין מיטוכונדריה
תוצאות האימונופלואורסנציה הראו כי האות הפלואורסצנטי האדום המייצג פרקין בקבוצת הביקורת הריקה היה חלש מאוד; עם זאת, לאחר 400 מיקרומטר H 2O2 במשך 4 שעות של טיפול, אות הפלואורסצנטיות האדומה שופר, וקולוקליזציה עם הפלואורסצנטיות הירוקה המייצגת את Tom20 גדלה. לאחר טיפול מקדים של 10 מיקרומטר קרוצטין, האות הפלואורסצנטי האדום נחלש, וקולוקליזציה עם האות הפלואורסצנטי הירוק הופחתה (איור 7).

Figure 1
איור 1: זיהוי כדאיות התא על-ידי בדיקת MTT. (A) השפעות של קרוצטין בריכוזים שונים על כדאיות התא (n = 6). (B) השפעות של קרוצטין בריכוזים שונים על כדאיות התא לאחר התערבות H2 02 (n = 6). *p < 0.05 לעומת קבוצת ביקורת, #p < 0.05 לעומת H 2 O2קבוצת טיפול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: זיהוי רמות LDH, CK, MDA, SOD, GSH-PX ו-CAT. (A) רמת LDH בסופרנאטנט התא (n = 6). (B) רמת CK בליזט התא (n = 6). (C) רמת MDA בליזט התא (n = 6). (D) רמת SOD בסופרנאטנט התא (n = 6). (E) רמת GSH-Px בליזט התא (n = 6). (F) רמת CAT בליזט התא (n = 6). *p < 0.05 לעומת קבוצת ביקורת ריקה, #p < 0.05 לעומת קבוצת טיפול H 2 O2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ROS נקבע על-ידי DCFH-DA. (A) DCFH-DA שימש למדידת רמות ROS בקרדיומיוציטים H9c2. ROS: ירוק. (B) נתוני כימות של ROS. (א) קרדיומיוציטים H9c2 ללא טיפול. (ב) קרדיומיוציטים H9c2 מגורה עם 400 מיקרומטר H 2 O 2 במשך 4 שעות. (ג) תאי H9c2 מטופלים עם 10 מיקרומטר crocetin במשך 24 שעות ולאחר מכן מגורה עם 400 μM H 2 O 2במשך 4 שעות. סרגל קנה מידה = 24 מיקרומטר. *p < 0.05 לעומת קבוצת ביקורת ריקה, #p < 0.05 לעומת קבוצת טיפול H 2 O2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: זיהוי פוטנציאל של קרום מיטוכונדריאלי ואפופטוזיס. (A) פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית נקבע על-ידי צביעת JC-1. אגרגטים JC-1: אדום; מונומרים JC-1: ירוק. (B) אפופטוזיס זוהה על ידי צביעת טונל בתאי H9c2. מנגינה: ירוק; DAPI: כחול. (א) קרדיומיוציטים H9c2 ללא טיפול. (ב) קרדיומיוציטים H9c2 מגורה עם 400 מיקרומטר H 2 O 2 במשך 4 שעות. (ג) תאי H9c2 מטופלים עם 10 מיקרומטר crocetin במשך 24 שעות ולאחר מכן מגורה עם 400 μM H 2 O 2במשך 4 שעות. פסי קנה מידה = 72 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: שטף אוטופגי שזוהה על-ידי אדנו-וירוס mCherry-GFP-LC3B. mCherry: אדום; GFP: ירוק. (א) קרדיומיוציטים H9c2 ללא טיפול. (ב) קרדיומיוציטים H9c2 מגורה עם 400 מיקרומטר H 2 O 2 במשך 4 שעות. (ג) תאי H9c2 מטופלים עם 10 מיקרומטר crocetin במשך 24 שעות ולאחר מכן מגורה עם 400 μM H 2 O 2במשך 4 שעות. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: תכולת החלבונים הקשורים למיטופגיה זוהתה על-ידי כתם מערבי. (A) כתם מערבי מייצג הממחיש את הביטוי PINK1 ו-Parkin. β-אקטין אומץ כהתייחסות פנימית. (B) ביטוי PINK1 יחסי (n = 3). (C) ביטוי פרקין יחסי (n = 3). *p < 0.05 לעומת קבוצת ביקורת, #p < 0.05 לעומת קבוצת טיפול H 2 O2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: זיהוי טרנסלוקציה מיטוכונדריאלית של פרקין על-ידי צביעה כפולה של אימונופלואורסנציה. חלבון פרקין אדום עם תווית פלואורסצנטית וחלבון פלואורסצנטי ירוק מסומן כחלבון Tom20. פרקין: אדום; Tom20: ירוק; DAPI: כחול). (א) קרדיומיוציטים H9c2 ללא טיפול. (ב) קרדיומיוציטים H9c2 מגורה עם 400 מיקרומטר H 2 O 2 במשך 4 שעות. (ג) תאי H9c2 מטופלים עם 10 מיקרומטר crocetin במשך 24 שעות ולאחר מכן מגורה עם 400 μM H 2 O 2במשך 4 שעות. פסי קנה מידה = 24 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: הוראות העבודה של מבחני LDH, CK, MDA, SOD, GSH-PX ו- CAT. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

חקר מרכיבים יעילים מתרכובות מורכבות של תרופות טבעיות באמצעות טכנולוגיה מתקדמת היה מוקד חם של מחקר TCM29, והוא יכול לספק ראיות מעבדה לפיתוח תרופות עתידיות לאחר אימות. חריע היא תרופה מייצגת בטיפול ב"קידום זרימת הדם ומזעור קיפאון הדם" והיא נמצאת בשימוש נרחב בטיפול באוטם שריר הלב30,31. מאמינים כי לזעפרן יש השפעות דומות לחריע והשפעתו בקידום זרימת הדם ובהסרת קיפאון הדם טובה משמעותית מחריע31,32. Crocetin הוא אחד המרכיבים הפעילים העיקריים של זעפרן33, ולכן הוא שימש במחקר של ניסוי זה.

H2O2 יכול לגרום לפגיעה בלחץ חמצוני של קרדיומיוציטים ולדמות את מצב אוטם שריר הלב של קרדיומיוציטים, אשר הוקם כמודל של אוטם שריר הלב במבחנה34. במחקר זה, ריכוז נמוך של crocetin יכול לקדם את הכדאיות התא של cardiomyocytes, אשר עשוי להיות קשור קשר הדוק להפעלת חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית. Crocetin יכול לשחזר את הכדאיות המופחתת של cardiomyocytes המושרה על ידי H 2 O2ויש לו השפעה תלוית מינון, דבר המצביע על כך Crocetin יכול לשפר את נזק מתח חמצוני של cardiomyocytes. בינתיים, קרוצטין יכול להפוך ביעילות נזק שריר הלב ואינדקסי מתח חמצוני הנגרמים על ידיH 2 O2, מה שמאשר עוד יותר את אפקט ההגנה של שריר הלב.

הירידה בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית היא אחד האירועים הבולטים בשלבים המוקדמים של אפופטוזיס35. צבעי JC-1 מצטברים באופן תלוי פוטנציאל בתוך המיטוכונדריה. במטריצה המיטוכונדריאלית הרגילה, JC-1 יוצר פולימר פלואורסצנטי באדום. כאשר פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית קורס, JC-1 פולט פלואורסצנטיות ירוקה כמונומרים36. טונל מזהה שברים גדילי DNA גרעיניים בשלבים המאוחרים של אפופטוזיס37. תאים אפופטוטיים מפעילים אנזימי DNA אנדונוקלאז שחותכים DNA גנומי בין נוקלאוזומים, וניתן לזהות חשופים 3'-OH באמצעות dUTP פלואורסצאין פלואורסצאין פלואורסצנטי ירוק (FITC) שכותרתו dUTP המזורז על ידי טרנספראזות deoxynucleotidyl טרמינליות37. תוצאות מחקר זה מראות כי פוטנציאל הקרום המיטוכונדריאלי ירד והאפופטוזיס של קרדיומיוציטים הופיע לאחר מודלים H 2 O2; השינויים יכולים להתהפך על ידי קרוצטין במידה מסוימת, דבר המצביע על כך שקרוצטין יכול לעכב ביעילות את האפופטוזיס של קרדיומיוציטים הנגרם על ידי לחץ חמצוני.

PINK1/Parkin הוא מסלול קלאסי המתווך מיטופגיה38. PINK1 מצטבר על הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית לאחר נזק למיטוכונדריה ופרקין מגויס כדי ליצור את חלבון הממברנה החוץ-מיטוכונדריאלית, אשר נקשר לחלבוני קולטן הקשורים לאוטופגיה ליצירת אוטופגוזומים, המסמן את התרחשות המיטופגיה39,40,4 1. התוצאות מראות כי רמות החלבון של PINK1 ו Parkin היו גבוהות קרדיומיוציטים לאחר מודלים H 2 O2, דבר המצביע על אוטופגיה מוגזמת. לאחר התערבות של crocetin, רמות החלבון של PINK1 ו Parkin ב cardiomyocytes שטופלו עם H 2 O2היו הפוכים במידה מסוימת, דבר המצביע על כך שהוא עשוי לשחק תפקיד טיפולי על ידי עיכוב אוטופגיה מיטוכונדריאלית מוגזמת. במחקר זה, קרוצטין הפחית אתהנזק החמצוני המושרה H 2 O2 ואת האפופטוזיס של קרדיומיוציטים H9c2, ומשערים כי השפעה זו עשויה להיות מושגת על ידי השפעה על מסלול PINK1 / Parkin כדי לעכב מיטופגיה מוגזמת.

ניסוי זה הדגים את ההתערבות של אבקה ליופילית צמחית על עקה חמצונית תאית ומיטופגיה. שימוש באדנו-וירוס mCherry-GFP-LC3B כדי לצפות באוטופגיה מיטוכונדריאלית היה צעד מכריע בניסוי. המפתח להצלחת צעד זה היה להגביר את קצב ההדבקה של התאים, ומגיב הזיהום הפרו-ויראלי פוליברן נוסף למדיום מראש כדי להגביר את יעילות הזיהום במידה ניכרת. זה הושג על ידי נטרול הדחייה האלקטרוסטטית בין פני התא חומצה סיאלית לבין חלקיקים נגיפיים, ובכך להקל על ספיחה. ראוי גם לציין כי כנגיף בטוח יחסית, למרות שהגנום אדנו-וירוס אינו משתלב בגנום התא המארח לאחר ההדבקה ואינו משתכפל בתא, הוא עדיין עלול להיות מסוכן ביולוגית. לכן, מומלץ לבצע את הניסויים תוך עמידה קפדנית בדרישות הרגולציה.

תיוג פלואורסצנטי הוא שיטה נפוצה לזיהוי מיטופגיה, אך בשל הספציפיות הירודה שלו, אברונים אחרים עשויים להיות מסומנים באופן שגוי ובכך להפריע לתוצאות הניסוי41. ככל שהתקדמות הטכנולוגיה נמשכת, אנו יכולים לצפות לפיתוח של בדיקות פלואורסצנטיות מדויקות ואמינות יותר כדי לחקור עוד יותר את מנגנון המיטופגיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי הקרן למדעי הטבע של בייג'ינג (מס '7202119) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '82274380).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin Gibco 2323363
1% Penicillin-streptomycin Sigma V900929
5x protein loading buffer Beijing Pulilai Gene Technology B1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus Beyotime C3011
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZF-0514
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZF-0513
Animal-free blocking solution CST 15019s
Anti-Parkin antibody Santa Cruz sc-32282
Anti-PINK1 antibody ABclonal A11435
Anti-TOM20 antibody ABclonal A19403
Anti-β-actin  antibody ABclonal AC026
BCA protein assay kit KeyGEN Biotech KGP902
Blood cell counting plate Servicebio WG607
CAT assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A007-1-1
Chemiluminescence detection system Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory ChemiScope 6100
CK assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A032-1-1
Coenzyme Q10 (CoQ 10) Macklin C6129
Crocetin Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. RFS-Z01802006012
DAPI-containing antifluorescence quenching tablets Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9557
DCFH-DA Beyotime S0033S
DMSO Solarbio D8371
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Gibco 8122091
Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution NCM Biotech P10100
Fetal bovine serum (FBS) Corning-Cellgro 35-081-CV
GraphPad Prism 7.0  https://www.graphpad.com/
GSH-Px assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A005-1-2
H9c2 myocardial cells Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. CS0062
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZB-2305
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZB-2301
JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit LABLEAD J22202
LDH assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A020-2-2
MDA assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A003-2-2
Methanol Aladdin A2114057
MTS assay Promega G3581
Perhydrol G-clone CS7730
Phosphatase inhibitor CWBIO CW2383
Polybrene Beyotime C0351
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes Millipore ISEQ00010
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer Solarbio R0010
SDS-PAGE gels Shanghai Epizyme Biomedical Technology PG112
SDS-PAGE running buffer powder Servicebio G2018-1L
SDS-PAGE transfer buffer powder Servicebio G2017-1L
SOD assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A001-2-2
Tris-buffered saline powder Servicebio G0001-2L
Triton X-100 Sigma SLCC9172
TUNEL apoptosis assay kit Beyotime C1086
Tween-20 Solarbio T8220

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
  2. Samsky, M. D., et al. Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review. JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).
  3. Abbate, A., et al. Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).
  4. Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention. European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).
  5. Dhruva, S. S., et al. Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock. JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).
  6. Wang, Y., et al. Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction. JAMA Network Open. 1 (4), e181079 (2018).
  7. Jou, M. J., et al. Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis. Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).
  8. La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).
  9. De Filippo, O., et al. Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis. International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).
  10. Davidson, S. M., et al. Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week. Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).
  11. Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002 (2019).
  12. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
  13. Wei, Z., et al. Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review. Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).
  14. Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).
  15. Liu, M., et al. Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs. Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).
  16. Zhang, X. X., et al. Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects. Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).
  17. Hao, P., et al. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms. Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).
  18. Delgado-Montero, A., et al. Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction. Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).
  19. Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction. Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010 (2019).
  20. Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine. Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).
  21. Huang, Z., et al. Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway. International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).
  23. Zeng, Q., et al. Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473 (2022).
  24. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  25. Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
  26. Yuan, Y., et al. Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs. Toxicology. 465, 153032 (2022).
  27. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting. Methods. 38 (4), 283-293 (2006).
  28. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).
  29. Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma. Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).
  30. Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review. The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).
  31. Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower. Metabolites. 10 (6), 253 (2020).
  32. Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).
  33. Gao, H., et al. Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271 (2021).
  34. Chen, G. Y., et al. Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462 (2021).
  35. Reers, M., et al. Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).
  36. Radovits, T., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro. European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).
  37. Song, M., et al. Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts. Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).
  38. Gan, Z. Y., et al. Activation mechanism of PINK1. Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).
  39. Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy. Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).
  40. Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy. Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).
  41. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).

Tags

רפואה גיליון 195 קרוצטין תאי שריר הלב H9c2 עקה חמצונית מסלול PINK1/Parkin מיטופגיה
הגנה על תאי שריר הלב H9c2 מפני עקה חמצונית על ידי קרוצטין <em>באמצעות</em> מיטופגיה בתיווך מסלול PINK1/Parkin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, J., Li, Y. f., Zhang, Y. s.,… More

Chen, J., Li, Y. f., Zhang, Y. s., Du, T. h., Lu, Y., Li, X. y., Guo, S. w. Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy. J. Vis. Exp. (195), e65105, doi:10.3791/65105 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter