Summary
Op basis van in vitro experimenten onthulde deze studie het mechanisme van crocetine bij het repareren van oxidatieve stressschade van cardiomyocyten door mitofagie te beïnvloeden, waarbij de PINK1 / Parkin-signaleringsroute een belangrijke rol speelt.
Abstract
Deze studie was gericht op het onderzoeken van het oxidatieve stressbeschermende effect van crocetine op H 2 O2-gemedieerdeH9c2 myocardiale cellen door middel van in vitro experimenten, en verder onderzoeken of het mechanisme ervan gerelateerd is aan de impact van mitofagie. Deze studie was ook bedoeld om het therapeutische effect van saffloerzuur op oxidatieve stress in cardiomyocyten aan te tonen en te onderzoeken of het mechanisme ervan verband houdt met het effect van mitofagie. Hier werd een opH 2 O2 gebaseerd oxidatief stressmodel geconstrueerd en de mate van oxidatieve stressschade van cardiomyocyten beoordeeld door de niveaus van lactaatdehydrogenase (LDH), creatinekinase (CK), malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) en glutathionperoxidase (GSH Px) te detecteren. Reactieve zuurstofsoorten (ROS) - detecterende fluorescerende kleurstof DCFH-DA, JC-1-kleurstof en TUNEL-kleurstof werden gebruikt om mitochondriale schade en apoptose te beoordelen. Autofagische flux werd gemeten door transfectie Ad-mCherry-GFP-LC3B adenovirus. Mitofagie-gerelateerde eiwitten werden vervolgens gedetecteerd via western blotting en immunofluorescentie. Crocetine (0,1-10 μM) kan echter de levensvatbaarheid van cellen aanzienlijk verbeteren en apoptose en oxidatieve stressschade veroorzaakt door H 2 O2verminderen. In cellen met overmatige autofagische activering kan crocetine ook de autofagiestroom en de expressie van mitofagie-gerelateerde eiwitten PINK1 en Parkin verminderen en de overdracht van Parkin naar mitochondriën omkeren. Crocetine kon H 2 O2-gemedieerde oxidatieve stressschade en de apoptose van H9c2-cellen verminderen, en het mechanisme was nauw verwant aan mitofagie.
Introduction
Acuut myocardinfarct (AMI) is een levensbedreigende myocardiale necrose veroorzaakt door ernstige en aanhoudende ischemie en hypoxie van kransslagaders 1,2. Percutane coronaire interventie (PCI) is een van de eerstelijns therapeutische strategieën voor AMI en beschermt cardiomyocyten meestal tegen ischemische schade 3,4. Het distale myocard zal geen bloed- en zuurstoftoevoer hebben als het niet snel en effectief wordt behandeld na AMI, wat leidt tot ischemische necrose en verdere cardiovasculaire complicaties 5,6. Het bevorderen van cardiomyocytenherstel en het minimaliseren van onomkeerbare myocardiale schade na het missen van de PCI-chirurgische kans is een onderzoekshotspot geweest. Na AMI bevinden cardiomyocyten zich in een toestand van ischemie en hypoxie, wat resulteert in de remming van mitochondriale oxidatieve fosforylering, reductie van NAD + tot NADPH en verhoogde reductie van één elektron7. Als gevolg hiervan genereert de onvolledige reductiereactie van zuurstof een overmaat aan reactieve zuurstofsoorten (ROS) en leidt uiteindelijk tot oxidatieve stressschade aan cardiomyocyten8. Een overmatige accumulatie van ROS veroorzaakt lipideperoxidatie, waardoor de structuur en functie van mitochondriale membranen verder wordt verstoord. Het resultaat is een continue opening van mitochondriale permeabiliteitsovergangsporiën en een afname van het mitochondriale membraanpotentiaal, waardoor apoptose en necrose worden geïnduceerd.
Angiotensine-converting enzyme (ACE) -remmers, angiotensine-receptorblokkers (ARB's), de remmers van β-adrenoceptoren, aldosteronantagonisten en andere standaardgeneesmiddelen in AMI kunnen helpen de hartfunctie na een hartinfarct te verbeteren en het optreden van kwaadaardige gebeurtenissen, zoals aritmieën en linkerventrikelremodellering, te voorkomen9. De overleving en prognose na een infarct worden echter sterk beïnvloed door de grootte van het infarct en er zijn geen bevredigende resultaten bereikt voor het verminderen van cardiomyocytenapoptose10,11. Zo is de ontwikkeling van geneesmiddelen om het herstel van cardiomyocyten na een hartinfarct te bevorderen een urgent probleem geworden.
De traditionele geneeskunde is al vele jaren een inspiratiebron voor het moderne farmaceutische onderzoek12,13,14,15. Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) heeft een lange geschiedenis in de behandeling van AMI, en een reeks gerandomiseerde controlestudies in de afgelopen jaren hebben bevestigd dat TCM inderdaad de prognose van patiënten16,17 kan verbeteren. Volgens de TCM-theorie wordt AMI veroorzaakt door bloedstasis18,19, dus geneesmiddelen voor het bevorderen van de bloedcirculatie worden meestal gebruikt voor de behandeling van AMI in de acute fase20. Onder hen wordt aangenomen dat saffraan een krachtig effect heeft op bloedactivering en stasis, en wordt vaak gebruikt bij de acute behandeling van AMI. Crocetine, een belangrijk bestanddeel van saffraan, kan een sleutelrol spelen bij de bescherming van cardiomyocyten21.
In deze studie werden H9c2 myocardiale cellen geïnduceerd door H2 O2 om myocardiale ischemie / reperfusie te simuleren, wat een cardiomyocytenbeschadiging van AMI veroorzaakt, en crocetine werd gebruikt als een interventie om het beschermende effect tegen oxidatieve stress-geïnduceerde myocardiale schade te onderzoeken. Het mechanisme van crocetine dat cardiomyocyten beschermt, werd verder onderzocht door middel van mitofagie. Wat nog belangrijker is, dit artikel biedt een referentie voor de technische benadering van de studie van mitofagie en beschrijft de hele experimentele procedure in detail.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experimenten werden uitgevoerd in het Laboratorium voor Fysiologie aan de Beijing University of Chinese Medicine, China. Alle studiemethoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften van de Universiteit van Beijing.
1. Celkweek
- Voeg 10% foetaal runderserum en 1% penicilline/streptomycine toe aan dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) basismedium (met 4,5 g/l D-glucose, 4,g.g/l L-glutamine en 110 mg/l natriumpyruvaat; zie materiaaltabel) om DMEM compleet medium te bereiden.
- Ontdooi de vloeibare stikstofbevroren H9c2 myocardcellen (zie Materiaaltabel) in warm water van 37 °C onder een snelle en gelijkmatige roerbeurt tot het ijs smelt.
- Breng de cellen over in een centrifugebuis en voeg vier keer het volume van het DMEM-medium toe. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 358 x g en gooi het supernatant weg met een pipet.
- Verdun de verkregen celsuspensie met kweekmedium, blaas voorzichtig en ent de cellen in een kweekkolf. Kweek in een incubator bij 37 °C met 5% CO2.
2. Bepaling van de levensvatbaarheid van cellen
- Los crocetine (zie tabel met materialen) op in dimethylsulfoxide (DMSO) tot concentraties van 0,05 mM, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM en 200 mM.
- Dissocieer de H9c2 myocardiale cellen door trypsine en neutraliseer vervolgens het mengsel met DMEM compleet medium.
- Breng de cellen over in een centrifugebuis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 179 x g . Gooi het supernatant weg en meng de cellen in DMEM compleet medium door zachtjes te blazen.
- Tel de cellen met behulp van een bloedceltelplaat22 (zie tabel met materialen) en verdun ze tot 5 × 104 cellen / ml met DMEM compleet medium.
- Verdeel de cellen in negen gelijke porties. Voeg DMSO (verdund in een verhouding van 1:1.000 met DMEM compleet medium) toe aan de controlegroep en voeg verschillende concentraties crocetine toe aan de resterende groepen in een verhouding van 1:1.000.
- Zaai de cellen in 96-well platen op 100 μL per put. Gooi het supernatant na incubatie gedurende 24 uur weg en was de cellen drie keer met PBS.
- Na toevoeging van 100 μL DMEM basaal medium, incubeer de cellen gedurende 4 uur en voeg 20 μL MTS toe (zie tabel met materialen).
- Incubeer de cellen gedurende nog eens 2 uur, meet de absorptie bij een golflengte van 490 nm en bereken de levensvatbaarheid van de cel.
OPMERKING: Levensvatbaarheid van cellen = (OD behandeld - OD blanco) / (OD-controle - OD blanco) × 100.
3. Bepaling van lactaatdehydrogenase (LDH), creatinekinase (CK), malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), glutathionperoxidase (GSH Px) en catalase (CAT)
- Zaai de H9c2-cellen in een 6-well-plaat met een dichtheid van 1 × 105-cellen . Verzamel het supernatant na de interventie en detecteer LDH- en SOD-niveaus, volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).
- Verzamel het supernatant en was het eenmaal met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg het cellysaat toe aan de kweekschaal en laat het 20 minuten op ijs staan. Verzamel de vloeistof uit de kweekschaal in een centrifugebuis.
- Detecteer CK-, MDA-, GSH-Px- en CAT-niveaus volgens de instructies van de fabrikant23 (zie Materiaaltabel en Aanvullend bestand 1).
- Detecteer de totale eiwitconcentratie van de lysis met behulp van de bicinchininezuur (BCA) methode om de concentratie van CK, MDA, GSH-Px en CAT24 te corrigeren (zie tabel met materialen).
4. Bepaling van de ROS
- Zaai de H9c2-cellen in een 48-putplaat met een dichtheid van 5 × 103-cellen . Verdun DCFH-DA (zie Materiaaltabel) in een verhouding van 1:1.000 met het serumvrije medium. Gooi het celsupernatant weg en was de cel tweemaal met een serumvrij medium.
- Voeg 150 μL verdund DCFH-DA toe aan elke put en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C. Was de cellen drie keer met een serumvrij medium en leg beelden vast onder een fluorescentiemicroscoop (zie Materiaaltabel).
5. Detectie van mitochondriaal membraanpotentiaal
- Detecteer de mitochondriale membraanpotentiaal met behulp van een JC-1 mitochondriale membraanpotentiaaltestkit25 (zie materiaaltabel). Gooi het kweekmedium weg en was ze eenmaal met serumvrij medium.
- Voeg JC-1 werkoplossing toe aan elke buis en meng ze goed. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C en was de cellen tweemaal met JC-1 kleuringsbuffer. Voeg een compleet medium toe aan elke put en maak foto's onder een fluorescentiemicroscoop.
6. TUNEL kleuringstest
- Gebruik een TUNEL apoptose assay kit (zie Tabel van Materialen) om apoptose snelheden te bepalen26. Gooi het supernatant weg en was de pellet eenmaal met serumvrij medium.
- Voeg celfixatieoplossing toe en was ze eenmaal met PBS na het incuberen op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Voeg 0,3% triton-100 toe aan elke put en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen twee keer met PBS. Voeg TUNEL detectie werkoplossing toe en incubeer bij 37 °C in het donker gedurende 60 min.
- Voeg een antifluorescentie-dovende afdichtingstablet toe met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI; zie materiaaltabel) en maak foto's onder een fluorescentiemicroscoop.
7. Monitoring van de autofagische stroom door transfectie van mCherry GFP-LC3B adenovirus
- Vervang de helft van het medium in elke put door vers medium. Voeg Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus (multipliciteit van infectie [MOI] van 2) toe aan het kweekmedium en voeg 5 μg/ml polybreen toe (zie tabel met materialen) om de infectie-efficiëntie te verbeteren.
- Vervang het verse medium na 24 uur en observeer de expressie van het fluorescerende eiwit onder een confocale microscoop.
- Kweek de cellen met dezelfde omstandigheden als sectie 1 na bevestiging van een succesvolle virusinfectie en leg beelden vast onder de confocale microscoop27.
OPMERKING: Meer dan 20% van de cellen vertoonde fluorescerende fluorescentie van groen fluorescerend eiwit (GFP), wat wijst op een succesvolle infectie.
8. Western blot analyse
- Verzamel cellen voor hele eiwitextractie en lyseer ze (RIPA, proteaseremmer en fosfataseremmer = 100:1:1; zie Materiaaltabel) gedurende 30 minuten op ijs.
- Voeg 5x eiwitlaadbuffer toe aan het eiwitmonster na eiwitkwantificering en kook de monsters gedurende 10 minuten.
- Elektroforese de monsters die gelijke hoeveelheden eiwit bevatten met natriumdodecyl-sulfaat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) gels28. Breng vervolgens de monsters over op polyvinylideendifluoride (PVDF) membranen.
- Blokkeer de PVDF-membranen gedurende 1 uur met 5% magere melkpoeder en incubeer met het primaire antilichaam (PINK1, Parkin; zie Materiaaltabel) bij 4 °C gedurende de nacht en het secundaire antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Detecteer de doelbanden met behulp van een verbeterde chemiluminescentieoplossing (ECL) en het chemiluminescentiedetectiesysteem. Gebruik Image J-software om de banden te kwantificeren via densitometrie28.
9. Detectie van parkine mitochondriale translocatie door immunofluorescentie
- Observeer de colocalisatie van Parkin met mitochondriën door dubbele immunofluorescentiekleuring. Gooi het celsupernatant van elke groep weg en was ze drie keer met PBS.
- Bevestig de cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met 4% paraformaldehyde en voeg 0,1% triton-100 toe in PBS.
- Blok met diervrije blokoplossing (zie materiaaltabel) gedurende 1 uur om niet-specifieke binding tussen eiwitten en antilichamen te voorkomen en de fluorescentie-achtergrond te verminderen.
- Incubeer met een primair antilichaam (Parkin en Tom20; zie Tabel met materialen) bij 4 °C gedurende de nacht.
- Voeg een fluorescerend secundair antilichaam toe (zie materiaaltabel) en incubeer gedurende 1 uur in het donker.
- Voeg de DAPI-bevattende antifluorescentie-blustabletten toe en leg beelden vast onder de confocale microscoop.
10. Statistische analyse
- Voer statistische analyses uit met behulp van grafische en analysesoftware (zie Materiaaltabel).
- Vergelijk continue variabelen tussen groepen met behulp van eenrichtings-ANOVA. p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effecten van crocetine op de levensvatbaarheid van cellen
Crocetine bij 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM en 100 μM had een significant proliferatief effect op cellen, terwijl crocetine bij concentraties boven 200 μM de proliferatie van H9c2-cellen significant remde (figuur 1A). Na 4 uur behandeling met 400 μM H 2 O2was de levensvatbaarheid van de cel aanzienlijk verminderd en kon crocetine deze verandering tot op zekere hoogte omkeren (figuur 1B). Aangezien er geen significant verschil tussen 10 μM en 100 μM crocetine werd waargenomen op de H 2 O2-geïnduceerdeH9c2-cel levensvatbaarheid, werd 10 μM crocetine gekozen als de hoge concentratie en werden 1 μM en 0,1 μM gebruikt als respectievelijk de gemiddelde en lage dosisgroepen.
Effecten van crocetine op LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px en CAT in H9c2-cellen
Na 4 uur behandeling met 400 μM H 2 O2 namende niveaus van LDH, CK en MDA aanzienlijk toe, terwijl de niveaus van SOD, GSH-Px en CAT afnamen. Voorbehandeling van 10 μM crocetine gedurende 24 uur kan de bovenstaande veranderingen omkeren en vertoont een duidelijk dosisafhankelijk effect. Als een positief controlemiddel kan co-enzym Q10 alleen de niveaus van CK, MDA en SOD veranderen (figuur 2).
Het effect van crocetine op ROS in H9c2 cardiomyocyten
Als blanco controle drukten H9c2-cardiomyocyten bijna geen ROS uit. Tegelijkertijd zou 400 μM H 2 O2 voor 4uur behandeling het ROS-niveau aanzienlijk kunnen verhogen, dat tot op zekere hoogte kan worden omgekeerd met 10 μM crocetine (figuur 3). De fluorescentieresultaten toonden aan dat groene fluorescentie zeer zwak was in de normale groep. Ter vergelijking: 400 μM H 2 O2voor 4 uur behandeling zou het groene fluorescentiesignaal kunnen versterken, en deze versterking zou met 10 μM crocetine kunnen worden verminderd (figuur 3).
Effecten van crocetine op H 2 O2-geïnduceerde mitochondriale membraanpotentiaal en apoptose
JC-1-kleuring toonde meer rode fluorescentie en minder groene fluorescentie in de blanco controlegroep. Na 4 uur behandeling van 400 μM H 2 O2 werdenmeer groene fluorescentie en minder rode fluorescentie waargenomen, en 10 μM crocetine kon deze verandering tot op zekere hoogte omkeren (figuur 4A). TUNEL-kleuringsresultaten toonden aan dat apoptose-gerelateerde signalering niet werd gedetecteerd in de blanco controlegroep, terwijl de apoptose-gerelateerde signalering aanzienlijk werd verbeterd na 400 μM H 2 O2gedurende 4 uur behandeling, die tot op zekere hoogte kon worden omgekeerd door 10 μM crocetine (figuur 4B).
Effecten van crocetine op H 2 O2-geïnduceerde overmatige autofagie
H9c2-cardiomyocyten in de blanco controlegroep vertoonden geen duidelijke autofagiestroom. Fluorescentie toonde het verschijnen van punctate gele vlekken in H9c2 cardiomyocyten voorbehandeld met 400 μM H 2 O2gedurende 4 uur, wat wijst op een duidelijke overactivering van autofagie. Deze verandering werd echter teruggedraaid na de 10 μM crocetine voorbehandeling. In de controlegroep kon het Ad-mCherry GFP-LC3B-virus alleen worden waargenomen als een zwakke diffuse gele achtergrond door fluorescentie. Punctate gele vlekken werden echter waargenomen na 400 μM H 2 O2gedurende 4 uur behandeling, en deze verandering werd omgekeerd na de 10 μM crocetine voorbehandeling (figuur 5).
Detectie van crocetine op de expressie van mitofagie-gerelateerde eiwitten
Western blot-resultaten toonden aan dat in de controlegroep de expressieniveaus van PINK1 en Parkin lager waren. In 4 h 2 O2-gestimuleerde H9c2-cardiomyocyten namen de expressieniveaus van PINK1 en Parkin toe, terwijl de 10 μM crocetinevoorbehandeling de toename van PINK1 en Parkin kon verminderen (figuur 6).
Detectie van het effect van crocetine op de translocatie van Parkin mitochondriën
De immunofluorescentieresultaten toonden aan dat het rode fluorescentiesignaal dat Parkin vertegenwoordigde in de blanco controlegroep zeer zwak was; echter, na 400 μM H 2 O2gedurende 4 uur behandeling, werd het rode fluorescentiesignaal versterkt en nam de colocalisatie met de groene fluorescentie die Tom20 vertegenwoordigt toe. Na de voorbehandeling van 10 μM crocetine was het rode fluorescentiesignaal verzwakt en was de colocalisatie met het groene fluorescentiesignaal verminderd (figuur 7).
Figuur 1: Detectie van de levensvatbaarheid van cellen door de MTT-test. (A) Effecten van crocetine bij verschillende concentraties op de levensvatbaarheid van cellen (n = 6). (B) Effecten van crocetine in verschillende concentraties op de levensvatbaarheid van cellen na H 2 02-interventie(n = 6). *p < 0,05 versus controlegroep, #p < 0,05 versus H 2 O2behandelingsgroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Detectie van LDH-, CK-, MDA-, SOD-, GSH-Px- en CAT-niveaus. (A) LDH-niveau in celsupernatant (n = 6). (B) CK-niveau in cellysaat, (n = 6). (C) MDA-gehalte in cellysaat, (n = 6). (D) SOD-gehalte in celsupernatant (n = 6). (E) GSH-Px-niveau in cellysaat, (n = 6). (F) CAT-gehalte in cellysaat, (n = 6). *p < 0,05 versus blanco controlegroep, #p < 0,05 versus H 2 O2 behandelingsgroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: ROS bepaald door DCFH-DA. (A) DCFH-DA werd gebruikt om ROS-niveaus in H9c2-cardiomyocyten te meten. ROS: groen. (B) Kwantificeringsgegevens van ROS. a) H9c2-cardiomyocyten zonder behandeling. b) H9c2-cardiomyocyten gestimuleerd met 400 μM H 2 O 2 gedurende 4 uur. c) H9c2-cellen voorbehandeld met 10 μM crocetine gedurende 24 uur en vervolgens gestimuleerd met 400 μM H 2 O2gedurende 4 uur. Schaalbalk = 24 μm. *p < 0,05 versus blanco controlegroep, #p < 0,05 versus H 2 O2behandelingsgroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Detectie van mitochondriale membraanpotentiaal en apoptose. (A) Mitochondriale membraanpotentiaal werd bepaald door JC-1-kleuring. JC-1 aggregaten: rood; JC-1 monomeren: groen. (B) Apoptose werd gedetecteerd door TUNEL-kleuring in H9c2-cellen. TUNEL: groen; DAPI: blauw. a) H9c2-cardiomyocyten zonder behandeling. b) H9c2-cardiomyocyten gestimuleerd met 400 μM H 2 O 2 gedurende 4 uur. c) H9c2-cellen voorbehandeld met 10 μM crocetine gedurende 24 uur en vervolgens gestimuleerd met 400 μM H 2 O2gedurende 4 uur. Schaalbalken = 72 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Autofagische flux gedetecteerd door mCherry-GFP-LC3B adenovirus. mCherry: rood; GFP: groen. a) H9c2-cardiomyocyten zonder behandeling. b) H9c2-cardiomyocyten gestimuleerd met 400 μM H 2 O 2 gedurende 4 uur. c) H9c2-cellen voorbehandeld met 10 μM crocetine gedurende 24 uur en vervolgens gestimuleerd met 400 μM H 2 O2gedurende 4 uur. Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Het gehalte aan mitofagie-gerelateerde eiwitten werd gedetecteerd door western blotting. (A) Representatieve western blot ter illustratie van PINK1 en Parkin expressie. β-actine werd als interne referentie aangenomen. (B) Relatieve PINK1-uitdrukking (n = 3). (C) Relatieve Parkin-expressie (n = 3). *p < 0,05 versus controlegroep, #p < 0,05 versus H 2 O2behandelingsgroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Detectie van Parkin's mitochondriale translocatie door immunofluorescentie dubbele kleuring. Rood fluorescentie-gelabeld Parkin's eiwit en groene fluorescentie gelabeld-Tom20 eiwit. Parkin: rood; Tom20: groen; DAPI: blauw). a) H9c2-cardiomyocyten zonder behandeling. b) H9c2-cardiomyocyten gestimuleerd met 400 μM H 2 O 2 gedurende 4 uur. c) H9c2-cellen voorbehandeld met 10 μM crocetine gedurende 24 uur en vervolgens gestimuleerd met 400 μM H 2 O2gedurende 4 uur. Schaalbalken = 24 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend dossier 1: De werkinstructies van LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px en CAT assays. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De exploratie van effectieve ingrediënten uit complexe verbindingen van natuurlijke geneesmiddelen door middel van geavanceerde technologie is een hotspot geweest van TCM-onderzoek29 en kan laboratoriumbewijs leveren voor toekomstige medicijnontwikkeling na verificatie. Saffloer is een representatief medicijn bij de behandeling van "het bevorderen van de bloedcirculatie en het minimaliseren van bloedstasis" en wordt veel gebruikt bij de behandeling van een hartinfarct30,31. Saffraan wordt verondersteld vergelijkbare effecten te hebben als saffloer, en het effect ervan bij het bevorderen van de bloedcirculatie en het verwijderen van bloedstasis is aanzienlijk beter dan saffloer31,32. Crocetine is een van de belangrijkste actieve componenten van saffraan33, dus het werd gebruikt in de studie van dit experiment.
H2 O2 kan oxidatieve stressschade van cardiomyocyten veroorzaken en de myocardinfarcttoestand van cardiomyocyten simuleren, die is vastgesteld als een model van myocardinfarct in vitro34. In deze studie zou een lage concentratie crocetine de levensvatbaarheid van cardiomyocyten kunnen bevorderen, wat nauw verband kan houden met de activering van het mitochondriale energiemetabolisme. Crocetine kan de verminderde levensvatbaarheid van cardiomyocyten geïnduceerd door H2 O2 herstellen en heeft een dosisafhankelijk effect, wat suggereert dat crocetine de oxidatieve stressschade van cardiomyocyten kan verbeteren. Ondertussen kan crocetine effectief myocardiale schade en oxidatieve stress-indexen veroorzaakt door H 2O2 omkeren, waardoor het myocardiale beschermende effect verder wordt bevestigd.
De afname van het mitochondriale membraanpotentiaal is een van de kenmerkende gebeurtenissen in de vroege stadia van apoptose35. JC-1 kleurstoffen aggregeren op een potentiaalafhankelijke manier in de mitochondriën. In de normale mitochondriale matrix vormt JC-1 een fluorescerend polymeer in rood. Wanneer de mitochondriale membraanpotentiaal instort, zendt JC-1 groene fluorescentie uit als monomeren36. TUNEL detecteert nucleaire DNA-strengbreuken in de late stadia van apoptose37. Apoptotische cellen activeren DNA-endonuclease-enzymen die genomisch DNA tussen nucleosomen knippen, en blootgestelde 3'-OH kan worden gedetecteerd met groene fluorescerende sonde fluoresceïne (FITC) -gelabeld dUTP gekatalyseerd door terminale deoxynucleotidyltransferasen37. De resultaten van deze studie tonen aan dat het mitochondriale membraanpotentiaal afnam en de apoptose van cardiomyocyten verscheen na H 2 O2-modellering; De veranderingen kunnen tot op zekere hoogte worden omgekeerd door crocetine, wat suggereert dat crocetine de apoptose van cardiomyocyten veroorzaakt door oxidatieve stress effectief zou kunnen remmen.
PINK1/Parkin is een klassiek pad dat mitophagie38 bemiddelt. PINK1 hoopt zich op op het buitenste mitochondriale membraan na mitochondriale schade en Parkin wordt gerekruteerd om het extramitochondriale membraaneiwit te ubiquitineren, dat zich bindt aan autofagie-gerelateerde receptoreiwitten om autofagosomen te vormen, wat het optreden van mitofagie39,40,4 1 markeert. De resultaten tonen aan dat de eiwitniveaus van PINK1 en Parkin verhoogd waren in cardiomyocyten na H 2 O2-modellering, wat wijst op overmatige autofagie. Na de interventie van crocetine werden de eiwitspiegels van PINK1 en Parkine in cardiomyocyten behandeld met H 2O2 tot op zekere hoogte omgekeerd, wat suggereert dat het een therapeutische rol kan spelen door overmatige mitochondriale autofagie te remmen. In deze studie verminderde crocetine H 2 O2-geïnduceerde oxidatieve schade en de apoptose van H9c2-cardiomyocyten, en er wordt gespeculeerd dat dit effect kan worden bereikt door de PINK1 / Parkin-route te beïnvloeden om overmatige mitofagie te remmen.
Dit experiment demonstreerde de interventie van kruidengelyofiliseerd poeder op cellulaire oxidatieve stress en mitofagie. Het gebruik van mCherry-GFP-LC3B adenovirus om mitochondriale autofagie te observeren was een cruciale stap in het experiment. De sleutel tot het succes van deze stap was om de infectiesnelheid van de cellen te verhogen, en het provirale infectiereagens polybreen werd van tevoren aan het medium toegevoegd om de infectie-efficiëntie aanzienlijk te verhogen. Dit werd bereikt door de elektrostatische afstoting tussen het celoppervlak siaalzuur en de virale deeltjes te neutraliseren, waardoor adsorptie werd vergemakkelijkt. Het is ook vermeldenswaard dat, als een relatief veilig virus, hoewel het adenovirusgenoom na infectie niet integreert in het genoom van de gastheercel en zich niet in de cel repliceert, het nog steeds potentieel biologisch gevaarlijk is. Daarom wordt aanbevolen om de experimenten uit te voeren onder strikte naleving van de wettelijke vereisten.
Fluorescerende etikettering is een veelgebruikte methode voor het detecteren van mitofagie, maar vanwege de slechte specificiteit kunnen andere organellen verkeerd worden geëtiketteerd en dus interfereren met de experimentele resultaten41. Naarmate de technologische vooruitgang voortduurt, kunnen we verwachten dat de ontwikkeling van nauwkeurigere en betrouwbaardere fluorescerende sondes het mechanisme van mitofagie verder zal onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Beijing Natural Science Foundation (nr. 7202119) en de National Natural Science Foundation of China (nr. 82274380).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 2323363 | |
| 1% Penicillin-streptomycin | Sigma | V900929 | |
| 5x protein loading buffer | Beijing Pulilai Gene Technology | B1030-5 | |
| Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus | Beyotime | C3011 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0514 | |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0513 | |
| Animal-free blocking solution | CST | 15019s | |
| Anti-Parkin antibody | Santa Cruz | sc-32282 | |
| Anti-PINK1 antibody | ABclonal | A11435 | |
| Anti-TOM20 antibody | ABclonal | A19403 | |
| Anti-β-actin antibody | ABclonal | AC026 | |
| BCA protein assay kit | KeyGEN Biotech | KGP902 | |
| Blood cell counting plate | Servicebio | WG607 | |
| CAT assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
| Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
| CK assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A032-1-1 | |
| Coenzyme Q10 (CoQ 10) | Macklin | C6129 | |
| Crocetin | Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. | RFS-Z01802006012 | |
| DAPI-containing antifluorescence quenching tablets | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9557 | |
| DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
| DMSO | Solarbio | D8371 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 8122091 | |
| Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution | NCM Biotech | P10100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning-Cellgro | 35-081-CV | |
| GraphPad Prism 7.0 | https://www.graphpad.com/ | ||
| GSH-Px assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A005-1-2 | |
| H9c2 myocardial cells | Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. | CS0062 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2305 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2301 | |
| JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit | LABLEAD | J22202 | |
| LDH assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 | |
| MDA assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-2-2 | |
| Methanol | Aladdin | A2114057 | |
| MTS assay | Promega | G3581 | |
| Perhydrol | G-clone | CS7730 | |
| Phosphatase inhibitor | CWBIO | CW2383 | |
| Polybrene | Beyotime | C0351 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer | Solarbio | R0010 | |
| SDS-PAGE gels | Shanghai Epizyme Biomedical Technology | PG112 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018-1L | |
| SDS-PAGE transfer buffer powder | Servicebio | G2017-1L | |
| SOD assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-2-2 | |
| Tris-buffered saline powder | Servicebio | G0001-2L | |
| Triton X-100 | Sigma | SLCC9172 | |
| TUNEL apoptosis assay kit | Beyotime | C1086 | |
| Tween-20 | Solarbio | T8220 |
References
- Anderson, J. L., Morrow, D. A.
- Samsky, M. D., et al. Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review. JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).
- Abbate, A., et al. Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).
- Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention. European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).
- Dhruva, S. S., et al. Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock. JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).
- Wang, Y., et al. Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction. JAMA Network Open. 1 (4), e181079 (2018).
- Jou, M. J., et al. Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis. Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).
- La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).
- De Filippo, O., et al. Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis. International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).
- Davidson, S. M., et al. Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week. Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).
- Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002 (2019).
- Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
- Wei, Z., et al. Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review. Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).
- Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).
- Liu, M., et al. Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs. Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).
- Zhang, X. X., et al. Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects. Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).
- Hao, P., et al. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms. Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).
- Delgado-Montero, A., et al. Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction. Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).
- Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction. Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010 (2019).
- Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine. Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).
- Huang, Z., et al. Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway. International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).
- Zeng, Q., et al. Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473 (2022).
- Chazotte, B.
- Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
- Yuan, Y., et al. Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs. Toxicology. 465, 153032 (2022).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H.
- Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).
- Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma. Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).
- Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review. The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).
- Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower. Metabolites. 10 (6), 253 (2020).
- Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).
- Gao, H., et al. Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271 (2021).
- Chen, G. Y., et al. Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462 (2021).
- Reers, M., et al. Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).
- Radovits, T., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro. European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).
- Song, M., et al. Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts. Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).
- Gan, Z. Y., et al.
- Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M.
- Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy. Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
