Summary
Basert på in vitro-eksperimenter avslørte denne studien crocetins mekanisme for å reparere oksidativ stressskade av kardiomyocytter ved å påvirke mitofagi, hvor PINK1 / Parkin-signalveien spiller en viktig rolle.
Abstract
Denne studien hadde som mål å utforske den oksidative stressbeskyttende effekten av crocetin påH2O2-medierteH9c2-myokardceller gjennom in vitro-eksperimenter, og videre undersøke om mekanismen er relatert til virkningen av mitofagi. Denne studien hadde også som mål å demonstrere den terapeutiske effekten av saflorsyre på oksidativt stress i kardiomyocytter og undersøke om mekanismen er relatert til effekten av mitofagi. Her ble en H 2 O2-basertoksidativ stressmodell konstruert og vurdert graden av oksidativ stressskade av kardiomyocytter ved å oppdage nivåene av laktatdehydrogenase (LDH), kreatinkinase (CK), malondialdehyd (MDA), superoksiddismutase (SOD), katalase (CAT) og glutationperoksidase (GSH Px). Reaktive oksygenarter (ROS)-detekterende fluorescerende fargestoff DCFH-DA, JC-1 fargestoff og TUNEL fargestoff ble brukt for å vurdere mitokondriell skade og apoptose. Autofagisk fluks ble målt ved transfeksjon av Ad-mCherry-GFP-LC3B adenovirus. Mitofagirelaterte proteiner ble deretter påvist via vestlig blotting og immunfluorescens. Imidlertid kan crocetin (0, 1-10 μM) forbedre cellens levedyktighet betydelig og redusere apoptose og oksidativ stressskade forårsaket avH 2 O2. I celler med overdreven autofagisk aktivering kan crocetin også redusere autofagi-flow og ekspresjon av mitofagirelaterte proteiner PINK1 og Parkin, og reversere overføringen av Parkin til mitokondrier. Crocetin kunne redusere H 2 O2-mediert oksidativ stressskade og apoptose av H9c2-celler, og dens mekanisme var nært knyttet til mitofagi.
Introduction
Akutt hjerteinfarkt (AMI) er en livstruende myokardnekrose forårsaket av alvorlig og vedvarende iskemi og hypoksi til koronararterier 1,2. Perkutan koronar intervensjon (PCI) er en av de første behandlingsstrategiene for akutt hjerteinfarkt, og beskytter vanligvis kardiomyocytter mot iskemisk skade 3,4. Det distale myokard vil mangle blod- og oksygenforsyning hvis det ikke behandles raskt og effektivt etter akutt hjerteinfarkt, noe som fører til iskemisk nekrose og ytterligere kardiovaskulære komplikasjoner 5,6. Å fremme kardiomyocyttutvinning og minimere irreversibel myokardskade etter å ha gått glipp av PCI-kirurgisk mulighet har vært et forskningspunkt. Etter AMI er kardiomyocytter i en tilstand av iskemi og hypoksi, noe som resulterer i inhibering av mitokondriell oksidativ fosforylering, reduksjon av NAD + til NADPH og økt enkelt elektronreduksjon7. Som et resultat genererer den ufullstendige reduksjonsreaksjonen av oksygen et overskudd av reaktive oksygenarter (ROS) og fører til slutt til oksidativ stressskade på kardiomyocytter8. En overdreven akkumulering av ROS utløser lipidperoksydasjon, noe som ytterligere forstyrrer strukturen og funksjonen til mitokondrielle membraner. Resultatet er en kontinuerlig åpning av mitokondriell permeabilitet overgangsporer og en reduksjon i mitokondriemembranpotensialet, indusere apoptose og nekrose.
Angiotensinkonverterende enzym (ACE) hemmere, angiotensin-reseptorblokkere (ARB), hemmere av β-adrenoceptorer, aldosteronantagonister og andre standardmedikamenter i AMI kan bidra til å forbedre hjertefunksjonen etter hjerteinfarkt og forhindre forekomst av ondartede hendelser, som arytmier og venstre ventrikkel remodeling9. Overlevelse og prognose etter infarkt påvirkes imidlertid sterkt av infarktstørrelse, og tilfredsstillende resultater er ikke oppnådd for å redusere kardiomyocyttapoptose10,11. Dermed har utviklingen av medisiner for å fremme kardiomyocytgjenoppretting etter hjerteinfarkt blitt et presserende problem.
Tradisjonell medisin har vært en inspirasjonskilde for moderne farmasøytisk forskning i mange år12,13,14,15. Tradisjonell kinesisk medisin (TCM) har en lang historie i behandlingen av AMI, og en rekke randomiserte kontrollstudier de siste årene har bekreftet at TCM faktisk kan forbedre prognosen til pasienter16,17. Ifølge TCM-teorien er AMI forårsaket av blodstasis18,19, så medisiner for å fremme blodsirkulasjonen brukes vanligvis til behandling av AMI i den akutte fasen20. Blant dem antas safran å ha en kraftig effekt på blodaktivering og stasis, og brukes ofte i akutt behandling av AMI. Crocetin, en viktig komponent i safran, kan spille en nøkkelrolle i å beskytte kardiomyocytter21.
I denne studien ble H9c2 myokardceller indusert av H 2 O2for å simulere myokardiskemi / reperfusjon, som forårsaker en kardiomyocyttskade av AMI, og crocetin ble brukt som en intervensjon for å undersøke sin beskyttende effekt mot oksidativ stressindusert myokardskade. Mekanismen for krocetin som beskytter kardiomyocytter ble videre undersøkt gjennom mitofagi. Enda viktigere, denne artikkelen gir en referanse til den tekniske tilnærmingen til studiet av mitofagi og beskriver hele eksperimentell prosedyre i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøkene ble utført i laboratoriet for fysiologi ved Beijing University of Chinese Medicine, Kina. Alle studiemetoder ble utført i samsvar med relevante retningslinjer og forskrifter fra Beijing University.
1. Cellekultur
- Tilsett 10% føtal bovint serum og 1% penicillin / streptomycin til Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) basisk medium (med 4,5 g / L D-glukose, 4.g / L L-glutamin og 110 mg / L natriumpyruvat; se materialfortegnelse) for å forberede DMEM komplett medium.
- Tine de flytende nitrogenfrosne H9c2-myokardcellene (se materialfortegnelse) i varmt vann ved 37 °C med en rask og jevn røring til isen smelter.
- Overfør cellene til et sentrifugerør og legg til fire ganger volumet av DMEM komplett medium. Sentrifuger ved 358 x g i 5 minutter ved romtemperatur og kast supernatanten med en pipette.
- Fortynn den oppnådde cellesuspensjonen med kulturmedium, blås forsiktig og inokuler cellene i en kulturkolbe. Kultur i en inkubator ved 37 °C med 5% CO2.
2. Bestemmelse av celle levedyktighet
- Løs crocetin (se materialtabell) i dimetylsulfoksid (DMSO) til konsentrasjoner på 0,05 mM, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM og 200 mM.
- Dissociere H9c2 myokardcellene med trypsin, og nøytraliser deretter blandingen med DMEM komplett medium.
- Overfør cellene til et sentrifugerør og sentrifuge ved 179 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten og bland cellene i DMEM komplett medium ved forsiktig å blåse.
- Tell cellene ved hjelp av en blodcelletellingsplate22 (se materialfortegnelse) og fortynn dem til 5 × 104 celler/ml med DMEM komplett medium.
- Del cellene i ni like store deler. Legg til DMSO (fortynnet i forholdet 1:1000 med DMEM komplett medium) til kontrollgruppen og legg til forskjellige konsentrasjoner av crocetin til de resterende gruppene i forholdet 1:1000.
- Frø cellene i 96-brønnsplater ved 100 μL per brønn. Kast supernatanten etter inkubasjon i 24 timer og vask cellene tre ganger med PBS.
- Etter tilsetning av 100 μL DMEM basalmedium, inkuber cellene i 4 timer og tilsett 20 μL MTS (se materialfortegnelse).
- Inkuber cellene i ytterligere 2 timer, måler absorbansen ved en bølgelengde på 490 nm, og beregne cellens levedyktighet.
MERK: Celle levedyktighet = (OD behandlet - OD blank) / (OD kontroll - OD blank) × 100.
3. Bestemmelse av laktatdehydrogenase (LDH), kreatinkinase (CK), malondialdehyd (MDA), superoksiddismutase (SOD), glutationperoksidase (GSH Px) og katalase (CAT)
- Frø H9c2-cellene i en 6-brønnplate med en tetthet på 1 × 105 celler. Samle supernatanten etter intervensjonen og oppdag LDH- og SOD-nivåer, i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse).
- Samle supernatanten og vask den med fosfatbufret saltvann (PBS) en gang. Tilsett cellelysatet i kulturskålen og la det ligge på is i 20 minutter. Samle væsken fra kulturskålen i et sentrifugerør.
- Finn CK-, MDA-, GSH-PX- og CAT-nivåer i henhold til produsentens instruksjoner23 (se materialfortegnelse og tilleggsfil 1).
- Oppdag den totale proteinkonsentrasjonen av lysen ved hjelp av bicinchoninsyre (BCA) -metoden for å korrigere konsentrasjonen av CK, MDA, GSH-Px og CAT24 (se materialtabell).
4. Bestemmelse av ROS
- Frø H9c2-cellene i en 48-brønnplate med en tetthet på 5 × 103 celler. Fortynn DCFH-DA (se materialfortegnelse) i forholdet 1:1000 med det serumfrie mediet. Kast cellesupernatanten og vask cellen to ganger med et serumfritt medium.
- Tilsett 150 μL fortynnet DCFH-DA i hver brønn og inkuber ved 37 °C i 20 minutter. Vask cellene tre ganger med et serumfritt medium og ta bilder under et fluorescensmikroskop (se materialfortegnelse).
5. Påvisning av mitokondriemembranpotensial
- Oppdag mitokondriemembranpotensialet ved hjelp av et JC-1 mitokondriemembranpotensialanalysesett25 (se materialtabell). Kast kulturmediet og vask dem én gang med serumfritt medium.
- Legg JC-1 arbeidsløsning til hvert rør og bland dem godt. Inkuber ved 37 °C i 20 minutter og vask cellene to ganger med JC-1 fargebuffer. Legg komplett medium til hver brønn og ta bilder under et fluorescensmikroskop.
6. TUNEL farging analyse
- Bruk et TUNEL apoptoseanalysesett (se Materialfortegnelse) for å bestemme apoptosefrekvenser26. Kast supernatanten og vask pelleten én gang med serumfritt medium.
- Tilsett cellefikseringsløsning og vask dem med PBS en gang etter inkubering ved romtemperatur i 30 minutter.
- Tilsett 0,3% triton-100 til hver brønn og inkuber ved romtemperatur i 5 minutter. Vask cellene med PBS to ganger. Legg til TUNEL deteksjonsarbeidsløsning og inkuber ved 37 °C i mørket i 60 minutter.
- Legg til en anti-fluorescens quenching tetningstablett som inneholder 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, se tabell over materialer) og ta bilder under et fluorescensmikroskop.
7. Overvåking av autofagisk strømning ved transfeksjon av mCherry GFP-LC3B adenovirus
- Bytt ut halvparten av mediet i hver brønn med friskt medium. Legg Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus (mangfold av infeksjon [MOI] på 2) til kulturmediet og tilsett 5 μg / ml polybren (se materialtabell) for å forbedre infeksjonseffektiviteten.
- Bytt ut det friske mediet etter 24 timer og observer uttrykket av fluorescerende protein under et konfokalmikroskop.
- Dyrkning av cellene med samme betingelser som seksjon 1 etter å ha bekreftet vellykket virusinfeksjon og ta bilder under konfokalmikroskopet27.
MERK: Mer enn 20% av cellene viste grønt fluorescerende protein (GFP) fluorescens, noe som indikerer en vellykket infeksjon.
8. Western blot analyse
- Samle celler for hele proteinekstraksjon og lyse dem (RIPA, proteasehemmer og fosfatasehemmer = 100: 1: 1; se materialtabell) på is i 30 min.
- Tilsett 5x proteinbelastningsbuffer til proteinprøven etter proteinkvantifisering og kok prøvene i 10 minutter.
- Elektroforese prøvene som inneholder like mengder protein med natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) geler28. Deretter overfører du prøvene til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner.
- Blokker PVDF-membranene i 1 time med 5 % skummet melkpulver og inkuber med det primære antistoffet (PINK1, Parkin; se materialfortegnelse) ved 4 °C over natten og det sekundære antistoffet ved romtemperatur i 1 time.
- Oppdag målbåndene ved hjelp av forbedret kjemiluminescens (ECL)-løsning og kjemiluminescensdeteksjonssystemet. Bruk Image J-programvare til å kvantifisere båndene via densitometri28.
9. Påvisning av Parkins mitokondrielle translokasjon ved immunfluorescens
- Vær oppmerksom på samlokalisering av Parkin med mitokondrier ved dobbelt immunfluorescensfarging. Kast cellesupernatanten fra hver gruppe og vask dem tre ganger med PBS.
- Fest cellene i 10 minutter ved romtemperatur med 4% paraformaldehyd og tilsett 0,1% triton-100 i PBS.
- Blokker med dyrefri blokkløsning (se materialfortegnelse) i 1 time for å forhindre uspesifikk binding mellom proteiner og antistoffer og redusere fluorescensbakgrunnen.
- Inkuber med et primært antistoff (Parkin og Tom20; se materialtabell) ved 4 °C over natten.
- Legg til et fluorescerende sekundært antistoff (se materialtabellen) og inkuber i mørket i 1 time.
- Legg til DAPI-holdige anti-fluorescens-slukketabletter og ta bilder under konfokalmikroskopet.
10. Statistisk analyse
- Utfør statistisk analyse ved hjelp av grafisk og analyse programvare (se Tabell over materialer).
- Sammenlign kontinuerlige variabler mellom grupper ved hjelp av enveis ANOVA. p < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekter av crocetin på cellens levedyktighet
Crocetin ved 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM og 100 μM hadde en signifikant proliferativ effekt på celler, mens crocetin i konsentrasjoner over 200 μM signifikant hemmet proliferasjonen av H9c2-celler (figur 1A). Etter 4 timers behandling med 400 μMH2O2ble cellens levedyktighet redusert betraktelig, og crocetin kunne til en viss grad reversere denne endringen (figur 1B). Siden ingen signifikant forskjell mellom 10 μM og 100 μM crocetin ble observert på H2O2-indusert H9c2-celle levedyktighet, ble 10 μM crocetin valgt som høy konsentrasjon, og 1 μM og 0,1 μM ble brukt som henholdsvis medium og lav dosegruppe.
Effekter av crocetin på LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px og CAT i H9c2-celler
Etter 4 timers behandling med 400 μM H 2 O2økte nivåene av LDH, CK og MDA betydelig, mens nivåene av SOD, GSH-Px og CAT ble redusert. Forbehandling av 10 μM crocetin i 24 timer kan reversere de ovennevnte endringene og viser en åpenbar doseavhengig effekt. Som et positivt kontrollmiddel kan koenzym Q10 bare endre nivåene av CK, MDA og SOD (figur 2).
Effekten av crocetin på ROS i H9c2 kardiomyocytter
Som en tom kontroll uttrykte H9c2 kardiomyocytter nesten ingen ROS. Samtidig kan 400 μMH2 O2 for 4 timers behandling øke ROS-nivået spesielt, noe som kan reverseres med 10 μM crocetin til en viss grad (figur 3). Fluorescensresultatene viste at grønn fluorescens var svært svak i normalgruppen. Til sammenligning kan 400 μMH2 O2 for 4 timers behandling forbedre det grønne fluorescenssignalet, og denne forbedringen kan reduseres med 10 μM crocetin (figur 3).
Effekter av crocetin påH2O2-indusertmitokondriemembranpotensiale og apoptose
JC-1-farging viste mer rød fluorescens og mindre grønn fluorescens i den tomme kontrollgruppen. Etter 4 timers behandling av 400 μMH2O2ble det observert mer grønn fluorescens og mindre rød fluorescens, og 10 μM crocetin kunne til en viss grad reversere denne endringen (figur 4A). TUNEL-fargeresultater viste at apoptoserelatert signalering ikke ble påvist i den tomme kontrollgruppen, mens den apoptoserelaterte signaleringen ble betydelig forbedret etter 400 μMH2O2i 4 timers behandling, som til en viss grad kunne reverseres med 10 μM crocetin (figur 4B).
Effekter av crocetin på H2O2-indusert overdreven autofagi
H9c2 kardiomyocytter i den tomme kontrollgruppen viste ingen åpenbar autofagi flow. Fluorescens viste utseende av punkterte gule flekker i H9c2 kardiomyocytter forbehandlet med 400 μMH2O2i 4 timer, noe som indikerer en åpenbar overaktivering av autofagi. Denne endringen ble imidlertid reversert etter 10 μM crocetin forbehandling. I kontrollgruppen kunne Ad-mCherry GFP-LC3B-viruset bare observeres som en svak diffus gul bakgrunn ved fluorescens. Imidlertid ble det observert punkterte gule flekker etter 400 μMH2 O2 i 4 timers behandling, og denne endringen ble reversert etter 10 μM crocetin forbehandling (figur 5).
Påvisning av crocetin på ekspresjonen av mitofagirelaterte proteiner
Western blot-resultatene viste at i kontrollgruppen var uttrykksnivåene av PINK1 og Parkin lavere. Ved 4 timer H2O2-stimulerte H9c2-kardiomyocytter økte ekspresjonsnivåene av PINK1 og Parkin, mens 10 μM crocetin-forbehandling kunne redusere økningen av PINK1 og Parkin (figur 6).
Påvisning av effekten av crocetin på translokasjon av Parkin mitokondrier
Immunfluorescensresultatene viste at det røde fluorescenssignalet som representerte Parkin i den tomme kontrollgruppen var svært svakt; Etter 400 μM H2O2 i 4 timers behandling ble imidlertid det røde fluorescenssignalet forbedret, og samlokaliseringen med den grønne fluorescensen som representererTom20økte. Etter forbehandling av 10 μM crocetin ble det røde fluorescenssignalet svekket, og kolokalisering med det grønne fluorescenssignalet ble redusert (figur 7).
Figur 1: Påvisning av cellelevedyktighet ved MTT-analysen. (A) Effekter av crocetin ved forskjellige konsentrasjoner på cellens levedyktighet (n = 6). (B) Effekter av crocetin ved forskjellige konsentrasjoner på cellens levedyktighetetter H 2 02 intervensjon (n = 6). *p < 0,05 versus kontrollgruppe, #p < 0,05 versus H 2 O2 behandlingsgruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Påvisning av LDH-, CK-, MDA-, SOD-, GSH-Px- og CAT-nivåer. (A) LDH-nivå i cellesupernatant (n = 6). (B) CK-nivå i cellelysat (n = 6). (C) MDA-nivå i cellelysat (n = 6). (D) SOD-nivå i cellesupernatant (n = 6). (E) GSH-Px-nivå i cellelysat (n = 6). (F) CAT-nivå i cellelysat (n = 6). *p < 0,05 versus tom kontrollgruppe, #p < 0,05 versus H 2 O2 behandlingsgruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: ROS bestemt av DCFH-DA. (A) DCFH-DA ble brukt til å måle ROS-nivåer i H9c2 kardiomyocytter. ROS: grønn. (B) Kvantifiseringsdata for ROS. (a) H9c2 kardiomyocytter uten behandling. (b) H9c2 kardiomyocytter stimulert med 400 μM H 2 O 2 i 4 timer. (c) H9c2 celler forbehandlet med 10 μM crocetin i 24 timer og deretter stimulert med 400 μMH2 O 2i 4 timer. Skala bar = 24 μm. *p < 0,05 versus tom kontrollgruppe, #p < 0,05 versus H 2 O2behandlingsgruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Påvisning av mitokondriemembranpotensial og apoptose. (A) Mitokondriemembranpotensialet ble bestemt ved JC-1-farging. JC-1 aggregater: rød; JC-1 monomerer: grønn. (B) Apoptose ble påvist ved TUNEL-farging i H9c2-celler. TUNEL: grønn; DAPI: blå. (a) H9c2 kardiomyocytter uten behandling. (b) H9c2 kardiomyocytter stimulert med 400 μM H 2 O 2 i 4 timer. (c) H9c2 celler forbehandlet med 10 μM crocetin i 24 timer og deretter stimulert med 400 μMH2 O 2i 4 timer. Skalastenger = 72 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Autofagisk fluks påvist av mCherry-GFP-LC3B adenovirus. mKirsebær: rød; GFP: grønn. (a) H9c2 kardiomyocytter uten behandling. (b) H9c2 kardiomyocytter stimulert med 400 μM H 2 O 2 i 4 timer. (c) H9c2 celler forbehandlet med 10 μM crocetin i 24 timer og deretter stimulert med 400 μMH2 O 2i 4 timer. Skalastenger = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Innholdet av mitofagirelaterte proteiner ble påvist ved vestlig blotting. (A) Representativ western blot som illustrerer PINK1 og Parkin uttrykk. β-aktin ble vedtatt som en intern referanse. (B) Relativt PINK1-uttrykk (n = 3). (C) Relativ Parkin-uttrykk (n = 3). *p < 0,05 versus kontrollgruppe, #p < 0,05 versus H 2 O2 behandlingsgruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Påvisning av Parkins mitokondrielle translokasjon ved dobbeltfarging av immunfluorescens. Rødt fluorescensmerket Parkins protein og grønn fluorescens merket-Tom20 protein. Parkin: rød; Tom20: grønn; DAPI: blå). (a) H9c2 kardiomyocytter uten behandling. (b) H9c2 kardiomyocytter stimulert med 400 μM H 2 O 2 i 4 timer. (c) H9c2 celler forbehandlet med 10 μM crocetin i 24 timer og deretter stimulert med 400 μMH2 O 2i 4 timer. Skala barer = 24 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Arbeidsinstruksjonene til LDH-, CK-, MDA-, SOD-, GSH-PX- og CAT-analyser. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utforskningen av effektive ingredienser fra komplekse forbindelser av naturlige legemidler gjennom avansert teknologi har vært et hotspot for TCM-forskning29, og kan gi laboratoriebevis for fremtidig legemiddelutvikling etter verifisering. Safflower er et representativt stoff i behandlingen av "fremme blodsirkulasjon og minimere blodstasis" og er mye brukt i behandlingen av hjerteinfarkt30,31. Safran antas å ha lignende effekter som saflor, og effekten i å fremme blodsirkulasjonen og fjerne blodstasis er betydelig bedre enn saflor31,32. Crocetin er en av de viktigste aktive komponentene i safran33, så den ble brukt i studien av dette eksperimentet.
H 2O2 kan forårsake oksidativ stressskade av kardiomyocytter og simulere hjerteinfarkttilstanden til kardiomyocytter, som er etablert som en modell for hjerteinfarkt in vitro34. I denne studien kan en lav konsentrasjon av crocetin fremme cellenes levedyktighet av kardiomyocytter, noe som kan være nært knyttet til aktiveringen av mitokondriell energimetabolisme. Crocetin kan gjenopprette den reduserte levedyktigheten av kardiomyocytter indusert avH2O2og har en doseavhengig effekt, noe som tyder på at crocetin kan forbedre oksidativ stressskade av kardiomyocytter. I mellomtiden kan crocetin effektivt reversere myokardskader og oksidative stressindekser forårsaket av H 2 O2, noe som ytterligere bekrefter sin myokardiale beskyttende effekt.
Nedgangen i mitokondriemembranpotensialet er en av de viktigste hendelsene i de tidlige stadiene av apoptose35. JC-1 fargestoffer aggregerer på en potensielt avhengig måte i mitokondriene. I den normale mitokondriematrisen danner JC-1 en fluorescerende polymer i rødt. Når mitokondriemembranpotensialet kollapser, avgir JC-1 grønn fluorescens som monomerer36. TUNEL oppdager brudd i kjernefysisk DNA-tråd i de sene stadiene av apoptose37. Apoptotiske celler aktiverer DNA-endonukleaseenzymer som kutter genomisk DNA mellom nukleosomer, og eksponert 3'-OH kan detekteres med grønn fluorescerende sondefluorescein (FITC) -merket dUTP katalysert av terminale deoksynukleotidyltransferaser37. Resultatene av denne studien viser at mitokondriemembranpotensialet ble redusert og apoptosen av kardiomyocytter dukket opp etterH2O2-modellering; Endringene kan reverseres av Crocetin til en viss grad, noe som tyder på at Crocetin effektivt kan hemme apoptosen av kardiomyocytter forårsaket av oksidativt stress.
PINK1/Parkin er en klassisk vei som formidler mitofagi38. PINK1 akkumuleres på den ytre mitokondriemembranen etter mitokondriell skade og Parkin rekrutteres for å ubiquitinere det ekstramitokondrielle membranproteinet, som binder seg til autofagirelaterte reseptorproteiner for å danne autofagosomer, og markerer forekomsten av mitofagi39,40,4 1. Resultatene viser at proteinnivåene av PINK1 og Parkin ble økt i kardiomyocytter etter H2O2-modellering, noe som tyder på overdreven autofagi. Etter intervensjon av kroketin ble proteinnivåene av PINK1 og Parkin i kardiomyocytter behandlet med H 2 O2reversert til en viss grad, noe som tyder på at det kan spille en terapeutisk rolle ved å hemme overdreven mitokondriell autofagi. I denne studien reduserte crocetin H 2 O2-indusertoksidativ skade og apoptose av H9c2 kardiomyocytter, og det spekuleres på at denne effekten kan oppnås ved å påvirke PINK1 / Parkin-banen for å hemme overdreven mitofagi.
Dette eksperimentet demonstrerte intervensjon av urte lyofilisert pulver på cellulær oksidativt stress og mitofagi. Bruk av mCherry-GFP-LC3B adenovirus for å observere mitokondriell autofagi var et avgjørende skritt i forsøket. Nøkkelen til suksessen til dette trinnet var å øke infeksjonshastigheten til cellene, og det provirale infeksjonsreagenset polybren ble tilsatt mediet på forhånd for å øke infeksjonseffektiviteten sterkt. Dette ble oppnådd ved å nøytralisere den elektrostatiske frastøtningen mellom celleoverflaten sialinsyre og viruspartiklene, og dermed lette adsorpsjonen. Det er også verdt å merke seg at, som et relativt sikkert virus, selv om adenovirusgenomet ikke integreres i vertscellegenomet etter infeksjon og ikke replikerer i cellen, er det fortsatt potensielt biologisk farlig. Derfor anbefales det å gjennomføre forsøkene under streng overholdelse av forskriftskrav.
Fluorescerende merking er en vanlig metode for å oppdage mitofagi, men på grunn av sin dårlige spesifisitet kan andre organeller være feil merket og dermed forstyrre de eksperimentelle resultatene41. Etter hvert som teknologiske fremskritt fortsetter, kan vi forvente utvikling av mer presise og pålitelige fluorescerende prober for å utforske mekanismen for mitofagi ytterligere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Beijing Natural Science Foundation (nr. 7202119) og National Natural Science Foundation of China (nr. 82274380).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 2323363 | |
| 1% Penicillin-streptomycin | Sigma | V900929 | |
| 5x protein loading buffer | Beijing Pulilai Gene Technology | B1030-5 | |
| Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus | Beyotime | C3011 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0514 | |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0513 | |
| Animal-free blocking solution | CST | 15019s | |
| Anti-Parkin antibody | Santa Cruz | sc-32282 | |
| Anti-PINK1 antibody | ABclonal | A11435 | |
| Anti-TOM20 antibody | ABclonal | A19403 | |
| Anti-β-actin antibody | ABclonal | AC026 | |
| BCA protein assay kit | KeyGEN Biotech | KGP902 | |
| Blood cell counting plate | Servicebio | WG607 | |
| CAT assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
| Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
| CK assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A032-1-1 | |
| Coenzyme Q10 (CoQ 10) | Macklin | C6129 | |
| Crocetin | Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. | RFS-Z01802006012 | |
| DAPI-containing antifluorescence quenching tablets | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9557 | |
| DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
| DMSO | Solarbio | D8371 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 8122091 | |
| Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution | NCM Biotech | P10100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning-Cellgro | 35-081-CV | |
| GraphPad Prism 7.0 | https://www.graphpad.com/ | ||
| GSH-Px assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A005-1-2 | |
| H9c2 myocardial cells | Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. | CS0062 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2305 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2301 | |
| JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit | LABLEAD | J22202 | |
| LDH assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 | |
| MDA assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-2-2 | |
| Methanol | Aladdin | A2114057 | |
| MTS assay | Promega | G3581 | |
| Perhydrol | G-clone | CS7730 | |
| Phosphatase inhibitor | CWBIO | CW2383 | |
| Polybrene | Beyotime | C0351 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer | Solarbio | R0010 | |
| SDS-PAGE gels | Shanghai Epizyme Biomedical Technology | PG112 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018-1L | |
| SDS-PAGE transfer buffer powder | Servicebio | G2017-1L | |
| SOD assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-2-2 | |
| Tris-buffered saline powder | Servicebio | G0001-2L | |
| Triton X-100 | Sigma | SLCC9172 | |
| TUNEL apoptosis assay kit | Beyotime | C1086 | |
| Tween-20 | Solarbio | T8220 |
References
- Anderson, J. L., Morrow, D. A.
- Samsky, M. D., et al. Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review. JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).
- Abbate, A., et al. Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).
- Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention. European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).
- Dhruva, S. S., et al. Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock. JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).
- Wang, Y., et al. Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction. JAMA Network Open. 1 (4), e181079 (2018).
- Jou, M. J., et al. Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis. Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).
- La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).
- De Filippo, O., et al. Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis. International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).
- Davidson, S. M., et al. Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week. Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).
- Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002 (2019).
- Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
- Wei, Z., et al. Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review. Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).
- Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).
- Liu, M., et al. Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs. Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).
- Zhang, X. X., et al. Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects. Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).
- Hao, P., et al. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms. Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).
- Delgado-Montero, A., et al. Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction. Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).
- Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction. Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010 (2019).
- Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine. Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).
- Huang, Z., et al. Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway. International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).
- Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).
- Zeng, Q., et al. Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473 (2022).
- Chazotte, B.
- Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
- Yuan, Y., et al. Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs. Toxicology. 465, 153032 (2022).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H.
- Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).
- Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma. Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).
- Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review. The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).
- Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower. Metabolites. 10 (6), 253 (2020).
- Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).
- Gao, H., et al. Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271 (2021).
- Chen, G. Y., et al. Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462 (2021).
- Reers, M., et al. Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).
- Radovits, T., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro. European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).
- Song, M., et al. Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts. Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).
- Gan, Z. Y., et al.
- Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M.
- Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy. Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
