Summary
Com base em experimentos in vitro , este estudo revelou o mecanismo da crocetina na reparação do dano por estresse oxidativo de cardiomiócitos influenciando a mitofagia, na qual a via de sinalização PINK1/Parkin desempenha um papel importante.
Abstract
O objetivo deste estudo foi explorar o efeito protetor do estresse oxidativo da crocetina sobre células H9c2 H9c2 mediadaspor H2O2 através de experimentos in vitro, e explorar se seu mecanismo está relacionado ao impacto da mitofagia. Este estudo também teve como objetivo demonstrar o efeito terapêutico do ácido cártamo sobre o estresse oxidativo em cardiomiócitos e explorar se seu mecanismo está relacionado ao efeito da mitofagia. Aqui, um modelo de estresse oxidativo baseado em H 2 O2foi construído e avaliou o grau de lesão por estresse oxidativo de cardiomiócitos por meio da detecção dos níveis de lactato desidrogenase (LDH), creatina quinase (CK), malondialdeído (MDA), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GSH Px). Os corantes fluorescentes DCFH-DA, JC-1 e TUNEL que detectam espécies reativas de oxigênio (ROS) foram empregados para avaliar danos mitocondriais e apoptose. O fluxo autofágico foi medido pela transfecção do adenovírus Ad-mCherry-GFP-LC3B. Proteínas relacionadas à mitofagia foram então detectadas por western blotting e imunofluorescência. No entanto, a crocetina (0,1-10 μM) pode melhorar significativamente a viabilidade celular e reduzir a apoptose e os danos causados pelo estresse oxidativo causados por H 2 O2. Em células com ativação autofágica excessiva, a crocetina também poderia reduzir o fluxo de autofagia e a expressão das proteínas relacionadas à mitofagia PINK1 e Parkin, e reverter a transferência de Parkin para as mitocôndrias. A crocetina foi capaz de reduzir o dano do estresse oxidativo mediado por H 2 O2e a apoptose das células H9c2, e seu mecanismo estava intimamente relacionado à mitofagia.
Introduction
O infarto agudo do miocárdio (IAM) é uma necrose miocárdica com risco de vida causada por isquemia e hipóxia graves e persistentes nas artérias coronárias 1,2. A intervenção coronária percutânea (ICP) é uma das estratégias terapêuticas de primeira linha para o IAM, e geralmente protege os cardiomiócitos do danoisquêmico3,4. O miocárdio distal carecerá de suprimento sanguíneo e de oxigênio se não for tratado pronta e efetivamente após o IAM, o que leva à necrose isquêmica e a complicações cardiovascularesadicionais 5,6. Promover a recuperação dos cardiomiócitos e minimizar o dano miocárdico irreversível após perder a oportunidade cirúrgica da ICP tem sido um ponto de pesquisa. Após o IAM, os cardiomiócitos encontram-se em estado de isquemia e hipóxia, resultando em inibição da fosforilação oxidativa mitocondrial, redução de NAD+ para NADPH e aumento da redução de um elétron7. Como resultado, a reação de redução incompleta do oxigênio gera um excesso de espécies reativas de oxigênio (EROs) e, finalmente, leva a danos por estresse oxidativo aos cardiomiócitos8. Um acúmulo excessivo de ERO desencadeia a peroxidação lipídica, interrompendo ainda mais a estrutura e a função das membranas mitocondriais. O resultado é uma abertura contínua dos poros de transição da permeabilidade mitocondrial e uma diminuição do potencial de membrana mitocondrial, induzindo apoptose e necrose.
Os inibidores da enzima conversora da angiotensina (IECA), os bloqueadores dos receptores da angiotensina (BRA), os inibidores dos receptores β-adrenérgicos, os antagonistas da aldosterona e outras drogas padrão no IAM podem ajudar a melhorar a função cardíaca após o infarto do miocárdio e prevenir a ocorrência de eventos malignos, como arritmias e remodelamento ventricularesquerdo9. No entanto, a sobrevida e o prognóstico pós-infarto são muito afetados pelo tamanho do infarto, e resultados satisfatórios não têm sido alcançados para reduzir a apoptose dos cardiomiócitos10,11. Assim, o desenvolvimento de fármacos que promovam a recuperação dos cardiomiócitos após o infarto do miocárdio tornou-se uma questão urgente.
A medicina tradicional tem sido fonte de inspiração para a pesquisa farmacêutica moderna há muitos anos12,13,14,15. A medicina tradicional chinesa (MTC) tem uma longa história no tratamento do IAM, e uma série de estudos clínicos randomizados nos últimos anos confirmou que a MTC pode realmente melhorar o prognóstico dos pacientes16,17. De acordo com a teoria da MTC, o IAM é causado pela estasesanguínea18,19, de modo que drogas para promover a circulação sanguínea são geralmente utilizadas para o tratamento do IAM na faseaguda20. Entre eles, acredita-se que o açafrão tenha um poderoso efeito na ativação e estase sanguínea, e é frequentemente usado no tratamento agudo do IAM. A crocetina, um dos principais componentes do açafrão, pode desempenhar um papel fundamental na proteção dos cardiomiócitos21.
Neste estudo, células miocárdicas H9c2 foram induzidas por H2 O2 para simular isquemia/reperfusão miocárdica, o que causa lesão cardiomiocitária do IAM, e a crocetina foi utilizada como intervenção para investigar seu efeito protetor contra lesão miocárdica induzida por estresse oxidativo. O mecanismo da crocetina protegendo os cardiomiócitos foi mais explorado através da mitofagia. Mais importante, este artigo fornece uma referência para a abordagem técnica para o estudo da mitofagia e descreve todo o procedimento experimental em detalhes.
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Protocol
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Fisiologia da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim, na China. Todos os métodos de estudo foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes da Universidade de Pequim.
1. Cultura celular
- Adicionar 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina ao meio básico modificado de Eagle (DMEM) da Dulbecco (com 4,5 g/L de D-glicose, 4,g/L de L-glutamina e 110 mg/L de piruvato de sódio; ver Tabela de Materiais) para preparar o meio completo DMEM.
- Descongelar as células miocárdicas H9c2 congeladas com azoto líquido (ver Tabela de Materiais) em água morna a 37 °C com uma agitação rápida e uniforme até que o gelo derreta.
- Transfira as células para um tubo centrífugo e adicione quatro vezes o volume do meio completo DMEM. Centrifugar a 358 x g durante 5 min à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante utilizando uma pipeta.
- Diluir a suspensão celular obtida com meio de cultura, soprar suavemente e inocular as células em balão de cultura. Cultura em estufa a 37 °C com 5% de CO2.
2. Determinação da viabilidade celular
- Dissolver crocetina (ver Tabela de Materiais) em dimetilsulfóxido (DMSO) para concentrações de 0,05 mM, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM e 200 mM.
- Dissociar as células miocárdicas H9c2 por tripsina e, em seguida, neutralizar a mistura com meio completo DMEM.
- Transfira as células para um tubo de centrífuga e centrifugação a 179 x g por 5 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e misture as células em meio completo DMEM soprando suavemente.
- Contar as células utilizando uma placa de contagem de células sanguíneas22 (ver Tabela de Materiais) e diluí-las para 5 × 104 células/mL com meio completo DMEM.
- Divida as células em nove porções iguais. Adicionar DMSO (diluído na proporção de 1:1.000 com meio completo de DMEM) ao grupo controle e adicionar diferentes concentrações de crocetina aos demais grupos na proporção de 1:1.000.
- Semeando as células em placas de 96 poços a 100 μL por poço. Descarte o sobrenadante após incubação por 24 h e lave as células três vezes com PBS.
- Depois de adicionar 100 μL de meio basal DMEM, incubar as células por 4 h e adicionar 20 μL de MTS (ver Tabela de Materiais).
- Incubar as células por mais 2 h, medir a absorbância no comprimento de onda de 490 nm e calcular a viabilidade celular.
NOTA: Viabilidade celular = (OD tratado - OD em branco) / (controle OD - OD em branco) × 100.
3. Determinação de lactato desidrogenase (LDH), creatina quinase (CK), malondialdeído (MDA), superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GSH Px) e catalase (CAT)
- Semeando as células H9c2 em uma placa de 6 poços a uma densidade de 1 × 105 células. Recolher o sobrenadante após a intervenção e detectar os níveis de LDH e SOD, de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
- Recolher o sobrenadante e lavá-lo com solução salina tamponada com fosfato (PBS) uma vez. Adicione o lisado celular à placa de cultura e deixe descansar no gelo por 20 min. Recolher o líquido da placa de cultura num tubo de centrifugação.
- Detectar os níveis de CK, MDA, GSH-Px e CAT de acordo com as instruções do fabricante23 (ver Tabela de Materiais e Arquivo Suplementar 1).
- Detectar a concentração de proteína total da lise pelo método do ácido bicinconínico (BCA) para corrigir a concentração de CK, MDA, GSH-Px e CAT24 (ver Tabela de Materiais).
4. Determinação de ROS
- Semeando as células H9c2 em uma placa de 48 poços a uma densidade de 5 × 103 células. Diluir DCFH-DA (ver Tabela de Materiais) na proporção de 1:1.000 com o meio sem soro. Descarte o sobrenadante celular e lave a célula duas vezes com um meio sem soro.
- Adicionar 150 μL de DCFH-DA diluído em cada poço e incubar a 37 °C durante 20 min. Lave as células três vezes com um meio livre de soro e capture imagens sob um microscópio de fluorescência (ver Tabela de Materiais).
5. Detecção do potencial de membrana mitocondrial
- Detectar o potencial de membrana mitocondrial usando um kit de ensaio de potencial de membrana mitocondrial JC-125 (ver Tabela de Materiais). Descarte o meio de cultura e lave-o uma vez com meio sem soro.
- Adicione a solução de trabalho JC-1 a cada tubo e misture-os bem. Incubar a 37 °C durante 20 min e lavar as células duas vezes com tampão corante JC-1. Adicione meio completo a cada poço e capture fotografias sob um microscópio de fluorescência.
6. Ensaio de coloração TUNEL
- Use um kit de ensaio de apoptose TUNEL (ver Tabela de Materiais) para determinar as taxas de apoptose26. Descarte o sobrenadante e lave o pellet uma vez com meio sem soro.
- Adicionar a solução de fixação celular e lavá-las com PBS uma vez após incubar à temperatura ambiente por 30 min.
- Adicionar 0,3% de triton-100 a cada poço e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Lave as células com PBS duas vezes. Adicionar a solução de trabalho de detecção TUNEL e incubar a 37 °C no escuro durante 60 minutos.
- Adicione um comprimido de vedação antifluorescência contendo 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; ver Tabela de Materiais) e capture fotografias em um microscópio de fluorescência.
7. Monitoramento do fluxo autofágico por transfecção do adenovírus mCherry GFP-LC3B
- Substitua metade do meio em cada poço por meio fresco. Adicionar o adenovírus Ad-mCherry GFP-LC3B (multiplicidade de infecção [MOI] de 2) ao meio de cultura e adicionar 5 μg/mL de polibreno (ver Tabela de Materiais) para melhorar a eficiência da infecção.
- Substitua o meio fresco após 24 h e observe a expressão da proteína fluorescente em microscópio confocal.
- Cultivar as células com as mesmas condições da seção 1 após confirmação de infecção viral bem-sucedida e capturar imagens sob microscópio confocal27.
NOTA: Mais de 20% das células apresentaram fluorescência da proteína fluorescente verde (GFP), indicando uma infecção bem-sucedida.
8. Análise de Western blot
- Coletar células para extração de proteínas inteiras e lisá-las (RIPA, inibidor de protease e inibidor de fosfatase = 100:1:1; ver Tabela de Materiais) em gelo por 30 min.
- Adicionar 5x tampão de carga de proteína à amostra de proteína após a quantificação da proteína e ferver as amostras por 10 min.
- Eletroforese as amostras que contêm quantidades iguais de proteína com géis de eletroforese em gel de poliacrilamida de poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE)28. Em seguida, transfira as amostras para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF).
- Bloquear as membranas de PVDF durante 1 h com leite em pó desnatado a 5% e incubar com o anticorpo primário (PINK1, Parkin; ver Tabela de Materiais) a 4 °C durante a noite e o anticorpo secundário à temperatura ambiente durante 1 h.
- Detecte as bandas alvo usando a solução de quimioluminescência aprimorada (ECL) e o sistema de detecção de quimioluminescência. Utilizar o software Image J para quantificar as bandas via densitometria28.
9. Detecção da translocação mitocondrial de Parkin por imunofluorescência
- Observar a colocalização de Parkin com mitocôndrias por dupla imunofluorescência. Descarte o sobrenadante celular de cada grupo e lave-o três vezes com PBS.
- Fixar as células por 10 min à temperatura ambiente com paraformaldeído a 4% e adicionar triton-100 a 0,1% em PBS.
- Bloquear com solução de bloco livre de animais (ver Tabela de Materiais) durante 1 h para evitar a ligação inespecífica entre proteínas e anticorpos e reduzir o fundo de fluorescência.
- Incubar com um anticorpo primário (Parkin e Tom20; ver Tabela de Materiais) a 4 °C durante a noite.
- Adicione um anticorpo secundário fluorescente (ver Tabela de Materiais) e incube no escuro por 1 h.
- Adicione os comprimidos de têmpera antifluorescência contendo DAPI e capture imagens sob o microscópio confocal.
10. Análise estatística
- Realizar análise estatística utilizando software de gráficos e análise (ver Tabela de Materiais).
- Comparar variáveis contínuas entre os grupos usando ANOVA one-way. Considerou-se estatisticamente significante < de p 0,05.
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Representative Results
Efeitos da crocetina na viabilidade celular
A crocetina a 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM e 100 μM teve um efeito proliferativo significativo sobre as células, enquanto a crocetina em concentrações acima de 200 μM inibiu significativamente a proliferação de células H9c2 (Figura 1A). Após 4 h de tratamento com 400 μM H 2 O2, a viabilidade celular foi reduzida consideravelmente, e a crocetina conseguiu reverter essa alteração até certo ponto (Figura 1B). Como nenhuma diferença significativa entre 10 μM e 100 μM de crocetina foi observada na viabilidade das células H9c2 induzidas por H 2 O2, 10 μM de crocetina foram escolhidos como a alta concentração, e 1 μM e 0,1 μM foram usados como os grupos de média e baixa dose, respectivamente.
Efeitos da crocetina sobre LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px e CAT em células H9c2
Após 4 h de tratamento com 400 μM H 2 O2, os níveis de LDH, CK e MDA aumentaram sensivelmente, enquanto os níveis de SOD, GSH-Px e CAT diminuíram. O pré-tratamento de 10 μM de crocetina por 24 h pode reverter as alterações acima e mostra um efeito dose-dependente óbvio. Como droga de controle positivo, a coenzima Q10 só pode alterar os níveis de CK, MDA e SOD (Figura 2).
Efeito da crocetina sobre as ROS em cardiomiócitos H9c2
Como controle em branco, os cardiomiócitos H9c2 quase não expressaram EROs. Ao mesmo tempo, 400 μM H 2 O2para 4 h de tratamento poderiam aumentar notavelmente o nível de ROS, que pode ser revertido em 10 μM de crocetina até certo ponto (Figura 3). Os resultados de fluorescência mostraram que a fluorescência verde foi muito fraca no grupo normal. Em comparação, 400 μM H 2 O2para tratamento de 4 h poderiam aumentar o sinal de fluorescência verde, e esse aumento poderia ser reduzido em 10 μM de crocetina (Figura 3).
Efeitos da crocetina sobre o potencial demembrana mitocondrial induzido por H 2 O2 e apoptose
A coloração JC-1 mostrou mais fluorescência vermelha e menos fluorescência verde no grupo controle branco. Após 4 h de tratamento de 400 μM H 2 O2,mais fluorescência verde e menos fluorescência vermelha foram observadas, e 10 μM de crocetina poderiam reverter essa alteração até certo ponto (Figura 4A). Os resultados da coloração TUNEL mostraram que a sinalização relacionada à apoptose não foi detectada no grupo controle em branco, enquanto a sinalização relacionada à apoptose foi sensivelmente aumentada após 400 μM H 2 O2por 4 h de tratamento, o que poderia ser revertido por 10 μM de crocetina até certo ponto (Figura 4B).
Efeitos da crocetina sobre a autofagia excessiva induzida por H 2 O2
Os cardiomiócitos H9c2 do grupo controle branco não apresentaram fluxo autofágico evidente. A fluorescência mostrou o aparecimento de manchas amarelas puntiformes em cardiomiócitos H9c2 pré-tratados com 400 μM H 2 O2por 4 h, indicando uma óbvia superativação da autofagia. No entanto, essa alteração foi revertida após o pré-tratamento com 10 μM de crocetina. No grupo controle, o vírus Ad-mCherry GFP-LC3B só pôde ser observado como um fundo amarelo difuso fraco por fluorescência. No entanto, manchas amarelas puntiformes foram observadas após 400 μM H2 O2 por 4 h de tratamento, e essa alteração foi revertida após o pré-tratamento com crocetina 10 μM (Figura 5).
Detecção de crocetina na expressão de proteínas relacionadas à mitofagia
Os resultados do Western blot mostraram que, no grupo controle, os níveis de expressão de PINK1 e Parkin foram menores. Em cardiomiócitos H9c2 estimulados por H9c2 de 4 h H 2 O2, os níveis de expressão de PINK1 e Parkin aumentaram, enquanto o pré-tratamento com crocetina de 10 μM foi capaz de reduzir o aumento de PINK1 e Parkin (Figura 6).
Detecção do efeito da crocetina na translocação de mitocôndrias de Parkin
Os resultados de imunofluorescência mostraram que o sinal de fluorescência vermelho representando Parkin no grupo controle em branco foi muito fraco; no entanto, após 400 μM H 2 O2por 4 h de tratamento, o sinal de fluorescência vermelha foi aumentado, e a colocalização com a fluorescência verde representando Tom20 aumentou. Após o pré-tratamento de 10 μM de crocetina, o sinal de fluorescência vermelho foi enfraquecido e a colocalização com o sinal de fluorescência verde foi reduzida (Figura 7).
Figura 1: Detecção da viabilidade celular pelo ensaio de MTT. (A) Efeitos da crocetina em diferentes concentrações sobre a viabilidade celular (n = 6). (B) Efeitos da crocetina em diferentes concentrações sobre a viabilidade celular após intervenção H 202 (n = 6). *p < 0,05 versus grupo controle, #p < 0,05 versus grupo de tratamento H 2 O2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Detecção dos níveis de LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px e CAT. (A) nível de LDH no sobrenadante celular (n = 6). (B) nível de CK no lisado celular (n = 6). (C) nível de MDA no lisado celular (n = 6). (D) Nível de SOD no sobrenadante celular (n = 6). (E) Nível de GSH-Px no lisado celular (n = 6). (F) nível de CAT no lisado celular (n = 6). *p < 0,05 versus grupo controle branco, #p < 0,05 versus grupo de tratamento H 2 O2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: ROS determinadas por DCFH-DA. (A) DCFH-DA foi utilizada para medir os níveis de ROS em cardiomiócitos H9c2. ROS: verde. (B) Dados de quantificação de ROS. a) Cardiomiócitos H9c2 sem tratamento. (b) cardiomiócitos H9c2 estimulados com 400 μM H 2 O 2 por 4 h. (c) células H9c2 pré-tratadas com 10 μM de crocetina por 24 h e depois estimuladas com 400 μM H 2 O2por 4 h. Barra de escala = 24 μm. *p < 0,05 versus grupo controle em branco, #p < 0,05 versus grupo de tratamento H 2 O2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Detecção de potencial de membrana mitocondrial e apoptose. (A) O potencial de membrana mitocondrial foi determinado pela coloração JC-1. JC-1 agregados: vermelho; Monômeros JC-1: verde. (B) A apoptose foi detectada pela coloração TUNEL em células H9c2. TUNEL: verde; DAPI: azul. a) Cardiomiócitos H9c2 sem tratamento. (b) cardiomiócitos H9c2 estimulados com 400 μM H 2 O 2 por 4 h. (c) células H9c2 pré-tratadas com 10 μM de crocetina por 24 h e depois estimuladas com 400 μM H 2 O2por 4 h. Barras de escala = 72 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Fluxo autofágico detectado pelo adenovírus mCherry-GFP-LC3B. mCherry: vermelho; GFP: verde. a) Cardiomiócitos H9c2 sem tratamento. (b) cardiomiócitos H9c2 estimulados com 400 μM H 2 O 2 por 4 h. (c) células H9c2 pré-tratadas com 10 μM de crocetina por 24 h e depois estimuladas com 400 μM H 2 O2por 4 h. Barras de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: O conteúdo de proteínas relacionadas à mitofagia foi detectado por western blotting. (A) Western blot representativo ilustrando a expressão de PINK1 e Parkin. β-actin foi adotado como referência interna. (B) Expressão relativa de PINK1 (n = 3). (C) Expressão relativa de Parkin (n = 3). *p < 0,05 versus grupo controle, #p < 0,05 versus grupo de tratamento H 2 O2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Detecção de translocação mitocondrial de Parkin por dupla coloração por imunofluorescência. Proteína de Parkin marcada com fluorescência vermelha e proteína Tom20 marcada com fluorescência verde. Parkin: vermelho; Tom20: verde; DAPI: azul). a) Cardiomiócitos H9c2 sem tratamento. (b) cardiomiócitos H9c2 estimulados com 400 μM H 2 O 2 por 4 h. (c) células H9c2 pré-tratadas com 10 μM de crocetina por 24 h e depois estimuladas com 400 μM H 2 O2por 4 h. Barras de escala = 24 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo Suplementar 1: As instruções de trabalho dos ensaios LDH, CK, MDA, SOD, GSH-Px e CAT. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A exploração de ingredientes eficazes a partir de compostos complexos de fármacos naturais por meio de tecnologia avançada tem sido um ponto crítico de pesquisa em MTC29, e pode fornecer evidências laboratoriais para o desenvolvimento futuro de fármacos após verificação. O cártamo é uma droga representativa no tratamento de "promover a circulação sanguínea e minimizar a estase sanguínea" e é amplamente utilizado no tratamento do infarto domiocárdio30,31. Acredita-se que o açafrão tenha efeitos semelhantes ao cártamo, e seu efeito na promoção da circulação sanguínea e remoção da estase sanguínea é significativamente melhor do que o cártamo31,32. A crocetina é um dos principais componentes ativos do açafrão33, por isso foi utilizada no estudo deste experimento.
H 2O2 pode causar lesão por estresse oxidativo dos cardiomiócitos e simular o estado de infarto do miocárdio dos cardiomiócitos, o que se estabelece como modelo de infarto do miocárdio in vitro34. Neste estudo, uma baixa concentração de crocetina poderia promover a viabilidade celular dos cardiomiócitos, o que pode estar intimamente relacionado à ativação do metabolismo energético mitocondrial. A crocetina pode restaurar a diminuição da viabilidade dos cardiomiócitos induzida por H2 O2 e tem um efeito dose-dependente, sugerindo que a crocetina pode melhorar o dano do estresse oxidativo dos cardiomiócitos. Enquanto isso, a crocetina pode efetivamente reverter o dano miocárdico e os índices de estresse oxidativo causados por H 2 O2, confirmando ainda mais seu efeito protetor miocárdico.
O declínio do potencial de membrana mitocondrial é um dos eventos marcantes nos estágios iniciais da apoptose35. Os corantes JC-1 se agregam de forma potencial-dependente dentro das mitocôndrias. Na matriz mitocondrial normal, o JC-1 forma um polímero fluorescente em vermelho. Quando o potencial de membrana mitocondrial entra em colapso, o JC-1 emite fluorescência verde como monômeros36. O TUNEL detecta quebras de fitas de DNA nuclear nos estágios tardios da apoptose37. As células apoptóticas ativam enzimas de DNA endonucleases que cortam o DNA genômico entre os nucleossomos, e a 3'-OH exposta pode ser detectada com dUTP marcada com fluoresceína fluorescente verde (FITC) catalisada por desoxinucleotidiltransferases terminais37. Os resultados deste estudo mostram que o potencial de membrana mitocondrial diminuiu e a apoptose dos cardiomiócitos apareceu após a modelagemH2O2 ; As alterações poderiam ser revertidas pela crocetina até certo ponto, sugerindo que a crocetina poderia efetivamente inibir a apoptose dos cardiomiócitos causada pelo estresse oxidativo.
PINK1/Parkin é uma via clássica que medeia a mitofagia38. O PINK1 acumula-se na membrana mitocondrial externa após dano mitocondrial e Parkin é recrutado para ubiquitinar a proteína de membrana extramitocondrial, que se liga a proteínas receptoras relacionadas à autofagia para formar autofagossomos, marcando a ocorrência de mitofagia39,40,4 1. Os resultados mostram que os níveis proteicos de PINK1 e Parkin estavam aumentados nos cardiomiócitos após a modelagem H2 O2, sugerindo autofagia excessiva. Após a intervenção da crocetina, os níveis proteicos de PINK1 e Parkin em cardiomiócitos tratados com H 2 O2foram revertidos até certo ponto, sugerindo que ela pode desempenhar um papel terapêutico por inibir a autofagia mitocondrial excessiva. Neste estudo, a crocetina reduziu o danooxidativo induzido por H 2 O2 e a apoptose dos cardiomiócitos H9c2, e especula-se que esse efeito possa ser alcançado afetando a via PINK1/Parkin para inibir a mitofagia excessiva.
Este experimento demonstrou a intervenção de pó liofilizado de ervas sobre o estresse oxidativo celular e mitofagia. O uso do adenovírus mCherry-GFP-LC3B para observar a autofagia mitocondrial foi uma etapa crucial no experimento. A chave para o sucesso desta etapa foi aumentar a taxa de infecção das células, e o reagente de infecção proviral polybrene foi adicionado ao meio com antecedência para aumentar muito a eficiência da infecção. Isto foi conseguido neutralizando a repulsão eletrostática entre o ácido siálico da superfície celular e as partículas virais, facilitando assim a adsorção. Também é importante notar que, como um vírus relativamente seguro, embora o genoma do adenovírus não se integre ao genoma da célula hospedeira após a infecção e não se replique na célula, ele ainda é potencialmente perigoso biologicamente. Portanto, recomenda-se a realização dos experimentos sob estrita conformidade com os requisitos regulatórios.
A marcação fluorescente é um método comum para detecção de mitofagia, mas devido à sua baixa especificidade, outras organelas podem ser marcadas incorretamente e, assim, interferir nos resultados experimentais41. À medida que os avanços tecnológicos continuam, podemos esperar o desenvolvimento de sondas fluorescentes mais precisas e confiáveis para explorar ainda mais o mecanismo da mitofagia.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais de Pequim (No. 7202119) e pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 82274380).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibco | 2323363 | |
| 1% Penicillin-streptomycin | Sigma | V900929 | |
| 5x protein loading buffer | Beijing Pulilai Gene Technology | B1030-5 | |
| Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus | Beyotime | C3011 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0514 | |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0513 | |
| Animal-free blocking solution | CST | 15019s | |
| Anti-Parkin antibody | Santa Cruz | sc-32282 | |
| Anti-PINK1 antibody | ABclonal | A11435 | |
| Anti-TOM20 antibody | ABclonal | A19403 | |
| Anti-β-actin antibody | ABclonal | AC026 | |
| BCA protein assay kit | KeyGEN Biotech | KGP902 | |
| Blood cell counting plate | Servicebio | WG607 | |
| CAT assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
| Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
| CK assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A032-1-1 | |
| Coenzyme Q10 (CoQ 10) | Macklin | C6129 | |
| Crocetin | Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. | RFS-Z01802006012 | |
| DAPI-containing antifluorescence quenching tablets | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9557 | |
| DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
| DMSO | Solarbio | D8371 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 8122091 | |
| Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution | NCM Biotech | P10100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning-Cellgro | 35-081-CV | |
| GraphPad Prism 7.0 | https://www.graphpad.com/ | ||
| GSH-Px assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A005-1-2 | |
| H9c2 myocardial cells | Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. | CS0062 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2305 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2301 | |
| JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit | LABLEAD | J22202 | |
| LDH assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 | |
| MDA assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-2-2 | |
| Methanol | Aladdin | A2114057 | |
| MTS assay | Promega | G3581 | |
| Perhydrol | G-clone | CS7730 | |
| Phosphatase inhibitor | CWBIO | CW2383 | |
| Polybrene | Beyotime | C0351 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
| Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer | Solarbio | R0010 | |
| SDS-PAGE gels | Shanghai Epizyme Biomedical Technology | PG112 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018-1L | |
| SDS-PAGE transfer buffer powder | Servicebio | G2017-1L | |
| SOD assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-2-2 | |
| Tris-buffered saline powder | Servicebio | G0001-2L | |
| Triton X-100 | Sigma | SLCC9172 | |
| TUNEL apoptosis assay kit | Beyotime | C1086 | |
| Tween-20 | Solarbio | T8220 |
References
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