Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

الحقن المجهري المستهدف والتثقيب الكهربائي للعضويات الدماغية الرئيسية للتعديل الوراثي

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65176
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,2
1German Primate Center, Leibniz Institute for Primate Research, 2Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics

Summary

يوفر التثقيب الكهربائي للعضويات الدماغية للرئيسيات نهجا دقيقا وفعالا لإدخال تعديل (تعديلات) وراثية عابرة في أنواع مختلفة من السلف والخلايا العصبية في نظام نموذجي قريب من تطور القشرة المخية الحديثة الفسيولوجية للرئيسيات (المرضية). هذا يسمح بدراسة العمليات العصبية النمائية والتطورية ويمكن أيضا تطبيقه على نمذجة المرض.

Abstract

القشرة الدماغية هي بنية الدماغ الخارجية وهي مسؤولة عن معالجة المدخلات الحسية والمخرجات الحركية. ينظر إليه على أنه مقر القدرات المعرفية العليا في الثدييات ، على وجه الخصوص ، الرئيسيات. تعد دراسة وظائف الجينات في أدمغة الرئيسيات أمرا صعبا لأسباب تقنية وأخلاقية ، لكن إنشاء تقنية العضو العضوي في الدماغ مكن من دراسة نمو الدماغ في نماذج الرئيسيات التقليدية (على سبيل المثال ، المكاك الريسوس والمارموسيت الشائع) ، وكذلك في أنواع الرئيسيات التي كان يتعذر الوصول إليها تجريبيا (على سبيل المثال ، القردة العليا) ، في نظام مبرر أخلاقيا وأقل تطلبا من الناحية الفنية. علاوة على ذلك ، تسمح عضويات الدماغ البشري بالتحقيق المتقدم في الاضطرابات العصبية النمائية والعصبية.

نظرا لأن عضويات الدماغ تلخص العديد من عمليات نمو الدماغ ، فإنها تمثل أيضا أداة قوية لتحديد الاختلافات في المحددات الجينية الكامنة وراء نمو الدماغ لمختلف الأنواع في سياق تطوري ومقارنتها وظيفيا. ميزة كبيرة لاستخدام المواد العضوية هي إمكانية إدخال تعديلات وراثية ، مما يسمح باختبار وظائف الجينات. ومع ذلك ، فإن إدخال مثل هذه التعديلات أمر شاق ومكلف. تصف هذه الورقة نهجا سريعا وفعالا من حيث التكلفة لتعديل مجموعات الخلايا وراثيا داخل الهياكل الشبيهة بالبطين للعضويات الدماغية الرئيسية ، وهي نوع فرعي من عضويات الدماغ. تجمع هذه الطريقة بين بروتوكول معدل للتوليد الموثوق به من العضويات الدماغية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الإنسان والشمبانزي المكاك الريسوس والخلايا الجذعية المستحثة المشتقة من المارموسيت (iPSCs) مع نهج الحقن المجهري والتثقيب الكهربائي. يوفر هذا أداة فعالة لدراسة العمليات العصبية النمائية والتطورية التي يمكن تطبيقها أيضا لنمذجة المرض.

Introduction

يعد التحقيق في التطور الفسيولوجي (المرضي) وتطور القشرة الدماغية مهمة هائلة يعوقها عدم وجود أنظمة نموذجية مناسبة. في السابق ، كانت هذه الدراسات تقتصر على نماذج زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (مثل السلف العصبي الأولي أو مزارع الخلايا العصبية) والنماذج الحيوانية البعيدة تطوريا (مثل القوارض)1,2. في حين أن هذه النماذج مفيدة لمعالجة بعض الأسئلة ، إلا أنها محدودة في نمذجة التعقيد ، وتكوين نوع الخلية ، والبنية الخلوية ، وأنماط التعبير الجيني للقشرة المخية البشرية النامية في الحالات الصحية والمريضة. وتؤدي هذه القيود، على سبيل المثال، إلى ضعف قابلية ترجمة نماذج الفئران للأمراض البشرية إلى الحالة البشرية، كما هو موصوف بالنسبة لحالات معينة من صغر الرأس (على سبيل المثال، Zhang et al.3). في الآونة الأخيرة ، أصبحت الرئيسيات غير البشرية المعدلة وراثيا ، والتي تعد نموذجا أقرب تطوريا ووظيفيا ومورفولوجيا لتطور القشرة المخية الحديثة البشرية ، موضع تركيز4،5،6،7،8 لأنها تتغلب على العديد من قيود زراعة الخلايا والنماذج القائمة على القوارض. ومع ذلك ، فإن استخدام الرئيسيات غير البشرية في البحث ليس مكلفا للغاية ويستغرق وقتا طويلا فحسب ، بل يثير أيضا مخاوف أخلاقية. في الآونة الأخيرة ، ظهر تطوير تقنية الدماغ العضوية 9,10 كبديل واعد يحل العديد من قيود النماذج السابقة 11،12،13،14،15،16.

عضويات الدماغ هي هياكل ثلاثية الأبعاد (3D) ، متعددة الخلايا تحاكي السمات الرئيسية للهندسة الخلوية وتكوين نوع الخلية لمنطقة واحدة أو عدة مناطق دماغية لنافذة زمنية تنموية محددة11،12،13،14،17. يتم إنشاء هذه الهياكل 3D إما من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) أو ، إذا كانت متاحة للأنواع ذات الاهتمام ، من الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs). بشكل عام ، يمكن التمييز بين نوعين من عضويات الدماغ بناء على المنهجية المستخدمة: عضويات الدماغ غير الموجهة والإقليمية (الموجهة)18. عند توليد النوع الأخير من الكائنات العضوية ، يتم توفير جزيئات أو عوامل صغيرة توجه تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات إلى عضويات في منطقة معينة من الدماغ (على سبيل المثال ، عضويات الدماغ الأمامي)18. على النقيض من ذلك ، في الكائنات العضوية غير الموجهة ، لا يسترشد التمايز بإضافة جزيئات صغيرة ولكنه يعتمد حصريا على التمايز التلقائي ل iPSCs / ESCs. تتكون عضويات الدماغ الناتجة من أنواع الخلايا التي تمثل مناطق مختلفة من الدماغ (على سبيل المثال ، عضويات دماغية)18. تجمع عضويات الدماغ بين العديد من السمات الرئيسية لنمو الدماغ مع توليد فعال نسبيا من حيث التكلفة والوقت من أي نوع من أنواع الاهتمام التي تتوفر لها iPSCs أو ESCs11،12،13،14. هذا يجعل عضويات الدماغ نموذجا ممتازا للعديد من أنواع الدراسات البيولوجية العصبية ، بدءا من الأسئلة التطورية والتنموية إلى نمذجة الأمراض واختبار الأدوية15,16. ومع ذلك ، فإن معالجة مثل هذه الأسئلة باستخدام عضويات الدماغ تعتمد بشدة على توافر طرق مختلفة للتعديل الوراثي.

أحد الجوانب الرئيسية لدراسة التطور الفسيولوجي للقشرة المخية الحديثة (المرضية) وتطورها هو التحليل الوظيفي للجينات ومتغيرات الجينات. يتم تحقيق ذلك عادة عن طريق التعبير (خارج الرحم) و / أو عن طريق الضربة القاضية (KD) أو الضربة القاضية (KO) لتلك الجينات. ويمكن تصنيف هذه التعديلات الجينية إلى تعديل وراثي مستقر وعابر، وكذلك إلى تعديلات مقيدة زمانيا ومكانيا أو غير مقيدة. يتم تعريف التعديل الوراثي المستقر من خلال إدخال تغيير جيني في جينوم المضيف ينتقل إلى جميع أجيال الخلايا اللاحقة. اعتمادا على النقطة الزمنية للتعديل الوراثي ، يمكن أن يؤثر على جميع خلايا العضو أو يمكن أن يقتصر على مجموعات خلايا معينة. في أغلب الأحيان ، يتم تحقيق تعديل وراثي مستقر في عضويات الدماغ على مستوى iPSC / ESC من خلال تطبيق الفيروسات العدسية ، والأنظمة الشبيهة بالترانسبوزون ، وتقنية CRISPR / Cas9 (تمت مراجعتها من قبل ، على سبيل المثال ، Fischer et al.17 و Kyrousi et al.19 و Teriyapirom et al.20). هذا له ميزة أن جميع خلايا الدماغ العضو تحمل التعديل الجيني وأنه غير مقيد زمانيا أو مكانيا. ومع ذلك ، فإن توليد وتوصيف خطوط iPSC / ESC المستقرة هذه يستغرق وقتا طويلا للغاية ، وغالبا ما يستغرق عدة أشهر حتى يمكن تحليل أول عضويات دماغية معدلة (تمت مراجعته بواسطة Fischer et al.17 أو Kyrousi et al.19 أو Teriyapirom et al.20).

في المقابل ، يتم تعريف التعديل الجيني العابر من خلال توصيل البضائع الجينية (على سبيل المثال ، بلازميد التعبير الجيني) الذي لا يندمج في جينوم المضيف. في حين أن هذا التعديل يمكن ، من حيث المبدأ ، أن ينتقل إلى أجيال الخلايا اللاحقة ، فإن الشحنة الجينية المسلمة سيتم تخفيفها تدريجيا مع كل انقسام خلوي. لذلك ، عادة ما يكون هذا النوع من التعديل الوراثي مقيدا زمانيا ومكانيا. يمكن إجراء التعديل الوراثي العابر في عضويات الدماغ عن طريق الفيروسات المرتبطة بالغدي أو عن طريق التثقيب الكهربائي (تمت مراجعته من قبل ، على سبيل المثال ، Fischer et al.17 و Kyrousi et al.19 و Teriyapirom et al.20) ، مع وصف الأخير بالتفصيل في هذه المقالة. على عكس التعديل الوراثي المستقر ، فإن هذا النهج سريع للغاية وفعال من حيث التكلفة. في الواقع ، يمكن إجراء التثقيب الكهربائي في غضون دقائق ، واعتمادا على مجموعة (مجموعات) الخلايا المستهدفة ، تكون الكائنات العضوية الكهربائية جاهزة للتحليل في غضون أيام (تمت مراجعتها من قبل ، على سبيل المثال ، Fischer et al.17 و Kyrousi et al.19). ومع ذلك ، لا يمكن اكتشاف التغيرات المورفولوجية الإجمالية للعضو في الدماغ ، مثل الاختلافات في الحجم ، باستخدام هذه الطريقة ، لأن هذا النوع من التعديل الوراثي مقيد زمانيا ومكانيا. يمكن أن يكون هذا التقييد أيضا ميزة ، على سبيل المثال ، في حالة دراسة مجموعات الخلايا الفردية داخل العضو العضوي أو التأثيرات على عضويات الدماغ في نقاط زمنية محددة للنمو (تمت مراجعته من قبل ، على سبيل المثال ، Fischer et al.17 و Kyrousi et al.19).

النهج الكلاسيكي لدراسة وظيفة الجينات أثناء نمو الدماغ وتطوره هو في التثقيب الكهربائي للرحم. في الرحم التثقيب الكهربائي هو تقنية معروفة ومفيدة لتوصيل تركيبات التعبير الجيني إلى القوارض 21،22،23 والنمس24،25 أدمغة. أولا ، يتم حقن محلول يحتوي على بنية (تصانيب) التعبير ذات الأهمية من خلال جدار الرحم في بطين معين من الدماغ الجنيني ، اعتمادا على المنطقة المراد استهدافها. في الخطوة الثانية ، يتم تطبيق نبضات كهربائية لنقل الخلايا المبطنة مباشرة للبطين المستهدف. لا يقتصر هذا النهج فقط على التعبير خارج الرحم أو الإفراط في التعبير عن الجينات ، حيث يمكن تطبيقه أيضا في دراسات KD أو KO عن طريق الحقن الدقيق لدبوس الشعر القصير (shRNA) أو CRISPR / Cas9 (في شكل بلازميدات التعبير أو البروتينات النووية الريبية [RNPs]) ، على التوالي26,27. ومع ذلك ، فإن التثقيب الكهربائي في الرحم لأجنة الفئران والجرذان والنمس له نفس القيود الموضحة أعلاه لهذه النماذج الحيوانية.

من الناحية المثالية ، يود المرء أن يؤدي في التثقيب الكهربائي للرحم مباشرة في الرئيسيات. في حين أن هذا ، من حيث المبدأ ، ممكن تقنيا ، إلا أن التثقيب الكهربائي في الرحم لا يتم في الرئيسيات بسبب المخاوف الأخلاقية ، وارتفاع تكاليف صيانة الحيوانات ، وأحجام القمامة الصغيرة. بالنسبة لبعض الرئيسيات ، مثل القردة العليا (بما في ذلك البشر) ، هذا غير ممكن على الإطلاق. ومع ذلك ، فإن هذه الرئيسيات لديها أكبر إمكانات لدراسة تطور القشرة المخية الحديثة الفسيولوجية البشرية (المرضية) وتطورها. أحد الحلول لهذه المعضلة هو تطبيق تقنية التثقيب الكهربائي على عضويات الدماغالرئيسية 28.

تقدم هذه الورقة بروتوكولا للتثقيب الكهربائي لنوع فرعي من عضويات دماغ الرئيسيات ، وهي عضويات دماغية الرئيسيات. يسمح هذا النهج بالتعديل الوراثي السريع والفعال من حيث التكلفة لمجموعات الخلايا داخل الهياكل الشبيهة بالبطين للعضويات. على وجه التحديد ، وصفنا بروتوكولا موحدا لتوليد عضويات دماغية من الإنسان (الإنسان العاقل) ، والشمبانزي (Pan troglodytes) ، المكاك الريسوس (Macaca mulatta) ، والمارموسيت الشائع (Callithrix jacchus) iPSCs. علاوة على ذلك ، نصف تقنية الحقن المجهري والتثقيب الكهربائي بالتفصيل ونقدم معايير "go" و "no-go" لأداء التثقيب الكهربائي العضوي الدماغي الرئيسي. هذا النهج هو أداة فعالة لدراسة (المرض) تطور القشرة المخية الحديثة الفسيولوجية وتطورها في نموذج قريب بشكل خاص من الوضع البشري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ثقافة iPSCs الرئيسيات

ملاحظة: نظرا لقوتها ، يمكن تطبيق الطريقة المعروضة هنا على أي خط iPSC الرئيسيات. في هذه المقالة ، نصف إنتاج الأعضاء الدماغية من الإنسان (iLonza2.2) 29 ، والشمبانزي (Sandra A) 30 ، المكاك الريسوس (iRh33.1) 29 ، وخطوط marmoset الشائعة (cj_160419_5) 31 iPSC. يتم تلخيص ظروف الاستزراع في الجدول 1. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.

  1. لزراعة iPSCs المعنية ، اتبع ظروف الاستزراع الموصوفة في الأصل. بشكل عام ، من أجل التوليد الناجح والتثقيب الكهربائي للعضويات الدماغية ، استخدم خطوط iPSC التي لم يتم استزراعها لأكثر من 90 مقطعا. بالإضافة إلى ذلك ، في بداية توليد الأعضاء الدماغية ، تأكد من أن iPSCs تظهر ميزات تعدد القدرات مع عدم وجود علامات على التمايز.

2. توليد العضويات الدماغية من الرئيسيات iPSCs

ملاحظة: يعتمد بروتوكول توليد الأعضاء التناسلية الدماغية على نسخة معدلة28،30،32،33 من بروتوكول العضو العضوي الدماغي الأصلي10،34 مع بعض التعديلات الخاصة بالأنواع (مفصلة أدناه).

  1. بذر iPSCs لتوليد أجسام جنينية (EBs)
    1. بمجرد أن تصل iPSCs إلى التقاء 80٪ -90٪ ، اغسلها بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) ، وأضف 500 ميكرولتر من بديل التربسين المؤتلف أو 1 مل من خليط تحلل البروتين والكولاجين.
      ملاحظة: عادة ، يتم استزراع iPSCs في طبق زراعة خلية 60 مم للحصول على ما يقرب من 900000 خلية ، وهو ما يكفي لتوليد 96 عضويا دماغيا. يمكن تعديل أرقام الخلايا اعتمادا على عدد المواد العضوية المطلوبة. كن على علم بأنه ليس كل الكائنات العضوية الدماغية المتولدة قد تكون مناسبة للتثقيب الكهربائي.
    2. احتضان الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة لفصل الخلايا.
      ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى ما يصل إلى 2 دقيقة إضافية من الحضانة عند 37 درجة مئوية اعتمادا على خط iPSC أو الإنزيم المستخدم. ينصح بفحص الطبق تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا قد بدأت في الانفصال.
    3. أضف 1.5 مل من وسط زراعة iPSC المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) لإيقاف التفاعل ، والماصة لأعلى ولأسفل 7x-10x (لا تزيد عن 10x) لفصل الخلايا عن طبق زراعة الخلية والحصول على تعليق أحادي الخلية.
    4. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي 15 مل ، وطرد مركزي الخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. نضح المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 2 مل من وسط زراعة iPSC المكمل إما بمركب 50 ميكرومتر Y27632 أو 50 ميكرومتر مؤيد للبقاء على قيد الحياة.
    6. استخدم 10 ميكرولتر من معلق الخلية لحساب الخلايا باستخدام غرفة نيوباور.
    7. اضبط معلق الخلية إلى تركيز 9000 خلية لكل 150 ميكرولتر (60000 خلية / مل) باستخدام وسط ثقافة iPSC المكمل بمركب 50 ميكرومتر Y27632 أو 50 ميكرومتر مؤيد للبقاء على قيد الحياة.
    8. لتوليد أجسام جنينية (EBs) ، قم بزرع 150 ميكرولتر من معلق الخلية في كل بئر من صفيحة 96 بئر منخفضة للغاية. أثناء السحب ، هز الأنبوب الذي يحتوي على تعليق الخلية برفق لمنع الخلايا من الترسيب.
    9. استزرع EBs في جو رطب من 5٪ CO2 و 95٪ هواء عند 37 درجة مئوية (0 يوم بعد البذر [dps]). لا تزعج EBs خلال أول 24 ساعة بعد البذر.
      ملاحظة: يجب استزراع EBs المتولدة من iPSCs marmoset في جو رطب تحت ظروف نقص الأكسجين (5٪ CO 2 و 5٪ O 2 و 90٪ N 2) عند 37 درجة مئوية.
    10. بعد ~ 48 ساعة (2 dps) ، قم بتغيير الوسيط إلى وسيط ثقافة iPSC بدون مركب Y27632 / pro-survival . قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسط لكل بئر ، وأضف 150 ميكرولتر من الوسط الطازج المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) بدون Y27632. اذهب صفا تلو الآخر.
    11. إجراء المزيد من التغييرات المتوسطة كل يوم ؛ قم بإزالة 150 ميكرولتر من الوسط من كل بئر ، وأضف 150 ميكرولتر من الوسط الطازج المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) بدون Y27632 / مركب مؤيد للبقاء لكل بئر.
      ملاحظة: بعد 4-5 dps ، يجب أن يصبح محيط EBs شفافا.
  2. تحريض الأديم الظاهر العصبي
    ملاحظة: بشكل عام، يجب أن يكون للبرامج البيئية عالية الجودة ملامح سلسة وحدود شفافة في هذه المرحلة. تختلف النقاط الزمنية للحث العصبي اختلافا طفيفا بين أنواع الرئيسيات وخطوط iPSC. في حالة خطوط الخلايا المستخدمة هنا (انظر القسم 1 وجدول المواد) ، عادة ما يحتاج الحث العصبي ل marmoset EBs إلى البدء عند 4 dps ، لقرود المكاك الريسوس عند 5 dps ، و EBs البشرية والشمبانزي عند 4-5 dps (الشكل 1A) ، اعتمادا على حالة EBs (انظر أعلاه).
    1. قم بإزالة 150 ميكرولتر من الوسط من كل بئر من الصف الأول من الصفيحة المكونة من 96 بئرا ، وأضف 150 ميكرولتر من وسط الحث العصبي المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) (انظر الجدول 2) لكل بئر في نفس الصف.
    2. استمر في تغيير الوسيط كما هو موضح أعلاه صفا تلو الآخر للوحة 96 بئرا بأكملها. قم بإجراء المزيد من التغييرات في وسط الحث العصبي (NIM) كل يوم عن طريق إزالة 150 ميكرولتر من NIM من كل بئر وإضافة 150 ميكرولتر من NIM الطازج المسخن مسبقا (37 درجة مئوية).
      ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا، يجب استزراع EBs marmoset في نفس الظروف مثل EBs الرئيسيات الأخرى (جو رطب من 5٪ CO2 و 95٪ هواء عند 37 درجة مئوية).
  3. التضمين في مصفوفة الغشاء القاعدي
    ملاحظة: بمجرد أن تطور EBs ظهارة عصبية واضحة وشفافة ومنظمة شعاعيا على السطح ، يجب توفير الدعم الهيكلي لتطوير هياكل تشبه البطين. يتم تحقيق ذلك من خلال تضمين EBs في مصفوفة غشاء القاعد. نظرا للاختلافات في معدلات التطوير ، فإن EBs المكاك والريسوس جاهزة للتضمين بالفعل عند 7 dps ، في حين أن EBs البشرية والشمبانزي عادة ما تكون مضمنة في 8-9 dps. من أجل البساطة ، تشير مصفوفة الغشاء القاعدي فقط إلى Matrigel في هذا البروتوكول. ومع ذلك ، يمكن استخدام Geltrex كبديل.
    1. استعدادا للتضمين ، قم بتعقيم المقص بالأشعة فوق البنفسجية ، والملقط ، ورف صغير لأنابيب سعة 0.2 مل ، وثلاثة إلى ستة مربعات من البارافيلم المعالج بنسبة 70٪ (حجم / حجم) من الإيثانول تحت غطاء التدفق الصفحي لمدة 15 دقيقة. دع مصفوفة الغشاء القاعدي تذوب على الجليد لعدة ساعات (~ 1.5 مل من مصفوفة الغشاء القاعدي عادة ما تكون كافية ل 96 EBs).
      ملاحظة: احتفظ دائما بمصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد.
    2. قم بإنشاء شبكة غمازة 4 × 4 على parafilm. ضع شبكة parafilm على رف الأنبوب سعة 0.2 مل بحيث يكون الجانب المغلف بالورق متجها لأعلى ، واضغط بإصبع قفاز برفق على كل ثقب في الحامل.
    3. قم بإزالة الورق ، واقطع شبكة الدمل من مربع parafilm باستخدام مقص لضبط حجمه ليناسب طبق زراعة الخلايا 60 مم. ضع البارافيلم المدمل مرة أخرى على رف الأنبوب سعة 0.2 مل لتوفير أساس لتوليد قطرات مصفوفة الغشاء القاعدي.
    4. باستخدام ماصة ذات طرف ماصة مقطوع 200 ميكرولتر ، قم بنقل EBs بعناية واحدة تلو الأخرى من بئر طبق الاستزراع إلى غمازات parafilm.
    5. بعد نقل 16 EBs إلى الشبكة ، خذ طرف ماصة جديد سعة 200 ميكرولتر ، وقم بإزالة الوسيط المتبقي من الدمامل.
    6. ماصة قطرة واحدة (~ 15 ميكرولتر) من مصفوفة الغشاء القاعدي على كل غمازة تحتوي على EB واحد.
    7. خذ طرف ماصة سعة 10 ميكرولتر وانقل EBs بسرعة إلى وسط كل قطرة دون الإخلال بحدود القطرات.
    8. ضع البارافيلم المدمل مع قطرات مصفوفة الغشاء القاعدي في طبق زراعة الخلايا 60 مم ، واحتضانه لمدة 15-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية للسماح للمصفوفة بالبلمرة.
    9. لفصل EBs المضمنة في المصفوفة من parafilm ، أضف 5 مل من وسط التمايز (DM) بدون فيتامين A ( انظر الجدول 2) إلى الطبق ، واقلب مربع parafilm رأسا على عقب باستخدام ملقط بحيث يكون الجانب مع EBs مواجها الجزء السفلي من الطبق.
    10. هز الطبق بعناية لجعل قطرات مصفوفة الغشاء القاعدي التي تحتوي على EBs تنفصل عن parafilm. إذا كان بعضها لا يزال متصلا ، خذ حافة مربع parafilm باستخدام ملقط ، وقم بلفها بسرعة نحو وسط الطبق عدة مرات.
    11. استزرع الكائنات العضوية الدماغية على شاكر مداري عند 55 دورة في الدقيقة في جو رطب من 5٪ CO2 و 95٪ هواء عند 37 درجة مئوية. احتفظ بها في DM بدون فيتامين أ مع تغييرات متوسطة كل يوم. للحث على إنتاج الخلايا العصبية ، قم بالتبديل إلى DM مع فيتامين A (حمض الريتينويك ، RA) بعد 13 dps للعضويات الدماغية marmoset المكاك الريسوس أو 14-15 dps للعضويات الدماغية البشرية والشمبانزي (الشكل 1 أ). من هذه النقطة فصاعدا ، قم بتغيير الوسيط كل 3-4 أيام.
      ملاحظة: لدعم بقاء الخلايا العصبية ، يمكن استكمال DM مع فيتامين A ب 20 ميكروغرام / مل من التغذية العصبية البشرية 3 (NT3) ، و 20 ميكروغرام / مل من عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) ، ومصفوفة الغشاء القاعدي 1 ميكرولتر / مل من 40 dps فصاعدا.

3. التثقيب الكهربائي للعضويات الدماغية الرئيسيات

ملاحظة: من وجهة نظر فنية ، يمكن إجراء التثقيب الكهربائي للعضويات الدماغية بمجرد أن تكون الهياكل الشبيهة بالبطين واضحة بما يكفي لاستهدافها بالحقن المجهري. تعتمد النافذة الزمنية المثلى للتثقيب الكهربائي على السؤال البيولوجي وعلى مجموعة (مجموعات) الخلايا ذات الأهمية. على سبيل المثال ، إذا كانت السلف القمي (APs) هي الهدف الرئيسي ، فإن الكائنات العضوية الدماغية عند حوالي 30 dps مناسبة بالفعل. إذا كانت الأسلاف القاعدية (BPs) أو الخلايا العصبية هي الأهداف الرئيسية ، فيجب استخدام عضويات دماغية أقدم تزيد عن 50 dps (انظر ، على سبيل المثال ، Fischer et al.28).

  1. إعداد الإعداد الكهربائي
    ملاحظة: تتأثر كفاءة التثقيب الكهربائي بشدة بحجم وتركيز البلازميد (البلازميدات) المكهربة (انظر قسم المناقشة للحصول على التفاصيل).
    1. قم بإعداد كمية كافية من مزيج التثقيب الكهربائي للتحكم والجين محل الاهتمام (GOI) ، على سبيل المثال ، 10 ميكرولتر من مزيج التثقيب الكهربائي لكل عنصر تحكم و GOI لتوليد ما يقرب من 30 عضويا دماغيا لكل حالة.
      ملاحظة: لمعرفة تركيبة خلطات التثقيب الكهربائي، انظر الجدول 3.
    2. Prewarm (غير معقمة) خليط النسر المعدل / المغذيات من Dulbecco F-12 (DMEM / F12) و DM مع فيتامين A إلى 37 درجة مئوية. قم بإعداد ملعقة صغيرة ومقص ناعم وعادي ، ورش الأدوات بنسبة 70٪ (حجم / حجم).
      ملاحظة: يمكن تنفيذ الخطوات التالية إما في ظروف معقمة أو غير معقمة لأن DM يحتوي على مضادات حيوية (انظر الجدول 2). في تجربتنا ، لم يتسبب غياب العقم في أي تلوث.
    3. قم بإعداد أطباق زراعة الخلايا 35 مم ، وقم بتوصيل غرفة قطب طبق بتري بالكهرباء.
      ملاحظة: غرف قطب طبق بتري متوفرة تجاريا. ومع ذلك ، يمكن إنتاجها بسهولة بطريقة فعالة من حيث التكلفة (انظر الملف التكميلي 1).
    4. باستخدام أطراف اللودر الدقيق ، املأ إبر الحقن المجهري ب 8 ميكرولتر من كل مزيج من مزيج التثقيب الكهربائي. قطع أطراف الإبر باستخدام مقص دقيق قبل الاستخدام الأول لتحقيق تدفق مستقر. ومع ذلك ، قم بإزالة جزء صغير فقط من الحافة ، لأن الطرف الحاد والعريض يمكن أن يلحق أضرارا بالغة بالمواد العضوية.
      ملاحظة: إبر الحقن المجهري إما متاحة تجاريا كإبر حقن مجهرية مسحوبة مسبقا أو يمكن سحبها في المختبر إذا كان مجتذب الإبرة متاحا. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لمجتذب الإبرة لإنشاء إبر حقن مجهرية ذات استدقاق طويل وقطر طرف 10 ميكرومتر.
  2. الحقن المجهري والتثقيب الكهربائي
    1. تحت المجهر ، اختر خمسة عضويات دماغية ذات حدود ناعمة وهياكل تشبه البطين واضحة للعيان. انقلها إلى طبق زراعة الخلايا 35 مم يحتوي على DMEM / F12 مسخن مسبقا (37 درجة مئوية) باستخدام طرف ماصة مقطوع 1000 ميكرولتر.
      ملاحظة: اختر عضويات دماغية ذات هياكل تشبه البطين واضحة ويمكن الوصول إليها (انظر الشكل 1 ب).
    2. لحقن بنية تشبه البطين ، أدخل الإبرة بعناية من خلال جدارها ، وغمرها بمزيج التثقيب الكهربائي حتى تمتلئ بشكل واضح. لا تضغط بشكل مفرط على الهياكل الشبيهة بالبطين لتجنب انفجارها. المضي قدما مع ستة إلى ثمانية هياكل تشبه البطين من كل عضو دماغي بهذه الطريقة.
      ملاحظة: إذا انسدادت الإبرة أثناء عملية الحقن المجهري ، فيجب قطع الطرف قليلا.
    3. انقل عضويا دماغيا محقونا بالحقن الدقيق إلى حجرة قطب طبق بتري بكمية صغيرة من DMEM / F12. رتب العضو العضوي بطريقة تواجهها أسطح الهياكل الشبيهة بالبطين المحقونة الدقيقة باتجاه القطب المتصل بالقطب الموجب للجهاز الكهربي.
      ملاحظة: يضمن توجيه الهياكل بهذه الطريقة نقل الخلايا على جانب الهيكل الشبيه بالبطين الذي لا يتأثر بالهيكل المجاور.
    4. قم بإلكتروبور العضويات الدماغية واحدة تلو الأخرى باستخدام الإعدادات التالية: 5 نبضات 80 فولت ، ومدة النبض 50 مللي ثانية ، وفاصل 1 ثانية. انقل المواد العضوية المكهربة إلى طبق جديد لزراعة الخلايا مقاس 35 مم مملوء ب DMEM / F12 المسخن مسبقا (37 درجة مئوية).
      ملاحظة: قد تعتمد إعدادات التثقيب الكهربائي على جهاز التثقيب الكهربائي ذو الموجة المربعة المتوفر. تم تحسين هذه الإعدادات لنظام التثقيب الكهربائي المشار إليه. زيادة الجهد يمكن أن يؤدي إلى إزاحة الخلايا.
    5. تابع بنفس الطريقة مع المواد العضوية الدماغية الخمسة التالية باستخدام مزيج التثقيب الكهربائي الثاني (على سبيل المثال ، GOI).
      ملاحظة: كرر الخطوات 3.2.1-3.2.5 حتى يتم الوصول إلى العدد المطلوب من العضويات الدماغية المكهربة.
    6. إذا تم إجراء الحقن المجهري والتثقيب الكهربائي في ظل ظروف غير معقمة ، فقم بنقل المواد العضوية الكهربائية إلى طبق زراعة خلية معقم 35 مم تحت غطاء تدفق رقائقي أثناء نقل أقل قدر ممكن من DMEM / F12 إلى طبق زراعة الخلايا الجديد.
  3. مزيد من الثقافة وتثبيت المواد العضوية الدماغية
    1. استزرع الكائنات العضوية المكهربة في DM مع فيتامين A على شاكر مداري عند 55 دورة في الدقيقة في جو رطب من 5٪ CO2 و 95٪ هواء عند 37 درجة مئوية.
    2. في اليوم التالي بعد التثقيب الكهربائي ، تحقق من المواد العضوية الدماغية بحثا عن التثقيب الكهربائي الناجح تحت مجهر مضان تقليدي مقلوب.
      ملاحظة: اعتمادا على طول المزرعة الإضافية بعد التثقيب الكهربائي ، تتأثر مجموعات الخلايا المختلفة داخل العضو الدماغي (انظر أيضا قسم النتائج التمثيلية).
    3. المضي قدما في التطبيقات النهائية بعد زراعة العضويات الدماغية الكهربائية لفترة من الوقت مناسبة للمسألة البيولوجية ذات الأهمية.
      ملاحظة: يمكن معالجة العضويات الدماغية المكهربة لتطبيقات مختلفة في المراحل النهائية (على سبيل المثال ، التثبيت لتلطيخ التألق المناعي أو التجميد المفاجئ لعزل الحمض النووي الريبي و qRT-PCR). هنا ، نصف تثبيت العضويات الدماغية المكهربة.
    4. انقل المواد العضوية المكهربة إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل باستخدام طرف ماصة مقطوع سعة 1000 ميكرولتر ، وقم بإزالة الوسط الزائد.
    5. أضف كمية كافية من 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) في DPBS (درجة الحموضة 7.5) ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      تنبيه: يصنف PFA على أنه مادة مسرطنة للإنسان وقد يتسبب في أضرار صحية لا يمكن إصلاحها. يوصى بشدة باتخاذ تدابير احترازية إضافية بما في ذلك قفازات النتريل والنظارات الواقية.
    6. نضح PFA ، أضف 5 مل من DPBS ، اهتز قليلا ، واستنشق DPBS. كرر هذا 2x. قم بتخزين المواد العضوية في DPBS على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ، حيث يمكن تخزين العضويات الدماغية الثابتة PFA عند 4 درجات مئوية لعدة أشهر. يمكن تحليل المواد العضوية الكهربائية الثابتة PFA عن طريق التشريح بالتبريد وتلطيخ التألق المناعي 10,28 أو عن طريق تلطيخ ومسح 35,36 بالكامل. على سبيل المثال الصور، راجع قسم النتائج التمثيلية (انظر الجدول 4 للحصول على تفاصيل الأجسام المضادة).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يسمح البروتوكول الموصوف هنا بالتوليد الفعال للعضويات الدماغية من الإنسان والشمبانزي المكاك الريسوس وخطوط iPSC الشائعة مع الحد الأدنى من تغييرات التوقيت المطلوبة بين الأنواع (الشكل 1 أ). يمكن تزويد هذه الكائنات العضوية بالكهرباء في حدود 20 dps إلى 50 dps ، اعتمادا على إمكانية الوصول إلى الهياكل الشبيهة بالبطين ووفرة مجموعة (مجموعات) الخلايا ذات الأهمية. ومع ذلك ، قبل التثقيب الكهربائي ، من المهم تحديد ما إذا كانت الكائنات العضوية الدماغية ذات جودة كافية ليتم تثقيفها بالكهرباء.

يجب أن يظهر العضو الدماغي المثالي للتثقيب الكهربائي هياكل واضحة تشبه البطين على المحيط ، ولا توجد علامات تنكس (على سبيل المثال ، فصل الخلايا ، ونواة موت الخلايا المبرمج المتضخمة) ، ومورفولوجيا صحية مدمجة بشكل عام (على سبيل المثال ، لا يوجد نمو مفرط) (الشكل 1 ب ، "اذهب"). يفضل اختيار عضويات دماغية ذات هياكل كبيرة ومنظمة جيدا تشبه البطين لاستهداف عدد أكبر من الخلايا. إذا كانت المنطقة المحيطية للعضو مظلمة ولا تظهر أي هياكل بارزة ، فمن المستحسن عدم استخدامها للتثقيب الكهربائي ، حيث قد تتعرض الحقن الدقيقة الدقيقة للخطر بسبب عدم وجود إشارات بصرية (الشكل 1B ، "ممنوع"). لتحقيق مورفولوجيا عضوية دماغية مثالية ، من الضروري التأكد من أن الخطوات الحاسمة مثل تحريض الأديم الظاهر العصبي وتضمين المصفوفة تأتي في الوقت المناسب. تنشأ المشاكل المتعلقة بالتشكل العضوي الدماغي عادة من فشل الأديم الظاهر العصبي و / أو تكوين البراعم الظهارية العصبية. يحدث هذا عادة بسبب التوقيت دون المستوى الأمثل للحث العصبي و / أو تضمين مصفوفة الغشاء القاعدي ويمكن حلها عن طريق ضبط توقيت هذه الخطوات (يمكن العثور على مزيد من نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها لتشكيل الأعضاء الدماغية في لانكستر و Knoblich34).

بعد التثقيب الكهربائي ، يمكن إجراء تقييم أولي لنجاحه وكفاءته بعد 12 ساعة ، عندما يصبح تعبير GFP للخلايا المنقولة قابلا للاكتشاف تحت مجهر مضان مقلوب تقليدي. من الناحية المثالية ، في هذه المرحلة ، تنبعث الهياكل المتعددة الشبيهة بالبطين من مضان أخضر فاتح موضعي في أحد جوانبها (الشكل 2 أ). هذا يدل على الدقة العالية وكفاءة الإجراء. تظهر العضويات الدماغية المعززة بالكهرباء بنجاح لأنواع الرئيسيات الأربعة المختلفة (أي الإنسان والشمبانزي المكاك الريسوس والمارموسيت الشائع) أنماطا إيجابية مماثلة ل GFP داخل الهياكل الشبيهة بالبطين المستهدفة (الشكل 2 أ). علاوة على ذلك ، بعد التثبيت والاستئصال بالتبريد للعضويات الدماغية الرئيسية الكهربائية ، تظهر الهياكل الشبيهة بالبطين المكهربة بنجاح لجميع الأنواع الأربعة أعمدة من الخلايا الإيجابية ل GFP داخل منطقة البطين المنظمة شعاعيا والمعبأة بكثافة (VZ) (الشكل 2 ب). أظهر القياس الكمي للخلايا الإيجابية DAPI التي كانت أيضا إيجابية ل GFP في مثل هذه المناطق من الشمبانزي والمارموسيت العضويات الدماغية بعد يومين من التثقيب الكهربائي (17 بطينا من 12 عضويا محددا كميا) أنه ، في المتوسط ، تم بنجاح حفر ما يقرب من ثلث الخلايا (33٪ ، SD ± 12٪) بالكهرباء.

يتم تمييز التثقيب الكهربائي دون المستوى الأمثل إما بعدد صغير من الخلايا الإيجابية ل GFP داخل البنية الشبيهة بالبطين (الشكل 3 أ) أو بواسطة عدد قليل من الخلايا الإيجابية ل GFP البعيدة عن أي بنية تشبه البطين (الشكل 3 ب). يحدث انخفاض عدد الخلايا الإيجابية ل GFP بسبب ضعف امتصاص البلازميد. قد يكون هذا إما بسبب انخفاض تركيز البلازميد الناجم عن كمية غير كافية من مزيج التثقيب الكهربائي المحقون بالحقن الدقيق أو بسبب النبضات الكهربائية غير الموجهة بشكل جيد ، والتي قد تكون ناجمة عن وضع دون المستوى الأمثل للعضويات الدماغية في غرفة قطب طبق بتري. يحدث انخفاض عدد الخلايا الإيجابية ل GFP البعيدة عن أي بنية تشبه البطين بسبب التثقيب الكهربائي للخلايا بعد الانقسام داخل العضو الدماغي (مثل الخلايا العصبية) بسبب الحقن المجهري غير الدقيق. يجب استبعاد هذه التثقيب الكهربائي دون المستوى الأمثل من أي تحليلات أخرى.

يعتمد التحديد الموثوق لأنواع الخلايا الموجودة في الكائنات العضوية الدماغية ، من بين أمور أخرى ، على موضع الخلية داخل بنية تشبه البطين ، الأمر الذي يتطلب تعريفا حدوديا بين المنطقة VZ و SVZ / المخصب بالخلايا العصبية. يمكن تحديد هذه الحدود من خلال التنظيم الشعاعي وخصائص كثافة نوى الخلايا العالية ل VZ (انظر تلطيخ DAPI في الشكل التكميلي S1). يمكن إجراء تأكيد حدود VZ / SVZ عن طريق تلطيخ التألق المناعي لعلامات السلف العصبية مثل PAX6 أو SOX2 ، والتي يتم التعبير عنها بواسطة جميع خلايا VZ (APs) وبعض خلايا SVZ (BPs). يمكن التحقق من وجود منطقة غنية بالخلايا العصبية عن طريق تلطيخ التألق المناعي للعلامات العصبية مثل الفئة الثالثة β-توبولين (TUJ1) أو NeuN (الشكل التكميلي S1).

تعتمد مدة الثقافة العضوية الدماغية بعد التثقيب الكهربائي على السؤال البيولوجي ومجموعات الخلايا ذات الأهمية. في دراسة حديثة ، ثبت أن الأطوال المختلفة للثقافة الإضافية بعد التثقيب الكهربائي تؤثر على مجموعات الخلايا المختلفة في العضويات الدماغية للشمبانزي ، بدءا من APs إلى الخلايا العصبية للطبقة العليا24. هنا ، نعرض نتائج مماثلة لعضويات المرموسيت المكهربة. على وجه التحديد ، بعد يومين من التثقيب الكهربائي ، يتم تحديد الخلايا الإيجابية ل GFP بشكل حصري تقريبا في VZ وهي أيضا إيجابية ل PAX6 - علامة للخلايا السلفية العصبية - مما يشير إلى أن هذه الخلايا هي APs أو BPs حديثي الولادة (الشكل 4A). إذا تم تمديد فترة المزرعة بعد التثقيب الكهربائي إلى 10 أيام ، فإن الخلايا الإيجابية ل GFP تكون موضعية في المناطق القاعدية (أي SVZ والمنطقة المخصبة بالخلايا العصبية) (الشكل 4B ، C). يمكن أن تكون هذه الخلايا (بالإضافة إلى إشارة GFP) موجبة أيضا ل PAX6 (الشكل 4B) ، وهو مؤشر على BPs ، أو NeuN (الشكل 4C) ، وهو مؤشر على الخلايا العصبية. يمكن الحصول على نتائج مماثلة للعضويات الدماغية البشرية المكاك الريسوس. باختصار ، يمكن استهداف أنواع السلف المختلفة ، وكذلك الخلايا العصبية ، بنجاح من خلال هذه التقنية.

تم اشتقاق جميع البيانات المعروضة سابقا تقريبا من التلوين المناعي للأقسام النسيجية الناتجة عن العضويات الدماغية المكهربة. ومع ذلك ، هناك طريقة أخرى أنيقة لتحليل هذه الكائنات العضوية وهي إجراء تلطيخ مناعي كامل متبوعا بالمقاصة البصرية35,36. هذا من شأنه أن يسمح بإعادة بناء 3D من المواد العضوية الدماغية الكهربائية للحصول على انطباع عن التوزيع ثلاثي الأبعاد للخلايا الإيجابية GFP. يوضح الشكل 5 والفيديو 1 مثالا تمثيليا لإشارة GFP في عضوي دماغي كهربائي منظف بصريا.

باختصار ، يوفر بروتوكول التثقيب الكهربائي الموصوف هنا طريقة دقيقة وفعالة لإدخال تعديل (تعديلات) وراثية عابرة في أنواع مختلفة من السلف والخلايا العصبية للعضويات الدماغية المشتقة من خطوط iPSC المختلفة للرئيسيات.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية لتوليد الأعضاء الدماغية من الرئيسيات والمعايير المورفولوجية "go" و "no-go" للتثقيب الكهربائي. (أ) الجدول الزمني لتوليد الأعضاء الدماغية الرئيسية والتثقيب الكهربائي مع تسليط الضوء على التوقيتات المختلفة لخطوات البروتوكول للإنسان والشمبانزي (الأزرق) المكاك الريسوس (البنفسجي) والمارموسيت (أرجواني). لاحظ أن التسلسل الزمني للجدول الزمني ليس على نطاق واسع. (ب) صور برايتفيلد لعضو دماغي بشري مناسب (الصورة اليسرى ، Go) وغير مناسب (الصورة اليمنى ، No-go) 32 dps. تشير رؤوس الأسهم إلى أمثلة على الهياكل المناسبة الشبيهة بالبطين للحقن المجهري. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر مضان مقلوب Zeiss Axio Observer.Z1 بهدف 2.5x. قضبان المقياس = 500 ميكرومتر. الاختصارات: BDNF = عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ. dps = أيام بعد البذر ؛ NT3 = نيوروتروفين 3 ؛ RA = حمض الريتينويك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: أمثلة على عضويات دماغية رئيسية ناجحة في الكهرباء . (أ) برايتفيلد (العمود الأيسر) ، مضان (العمود الأوسط) ، ودمج (العمود الأيمن) صور 22 dps الإنسان ، 32 dps الشمبانزي ، 32 dps ريسوس المكاك ، و 31 dps marmoset العضوية الدماغية (من أعلى إلى أسفل) 15-48 ساعة بعد التثقيب الكهربائي مع البلازميد المعبر عن GFP. تشير رؤوس الأسهم السوداء إلى أمثلة على التراكيب الفردية الشبيهة بالبطين المكهرب. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر مضان مقلوب Zeiss Axio Observer.Z1 بهدف 2.5x. قضبان المقياس = 500 ميكرومتر. (ب) التألق المناعي ل GFP (أخضر) جنبا إلى جنب مع تلطيخ DAPI (سماوي) ل 32 dps للإنسان ، و 34 dps شمبانزي ، و 32 dps rhesus macaque ، و 32 dps marmoset عضويات دماغية (من أعلى إلى أسفل) بعد 2-4 أيام من التثقيب الكهربائي باستخدام البلازميد المعبر عن GFP. تشير رؤوس الأسهم ذات اللون الرمادي الفاتح إلى حدود المناطق الكهربية داخل الهياكل الشبيهة بالبطين. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر زايس LSM 800 متحد البؤر بهدف 10x. قضبان المقياس = 150 ميكرومتر. الاختصارات: DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول; dps = أيام بعد البذر ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: أمثلة على العضويات الدماغية للرئيسيات المكهربة غير الناجحة . (أ ، ب) التألق المناعي ل GFP (أخضر) جنبا إلى جنب مع تلطيخ DAPI (سماوي) ل (A) 34 dps rhesus macaque الدماغي العضوي بعد 4 أيام من التثقيب الكهربائي باستخدام البلازميد المعبر عن GFP و (B) 32 dps rhesus macaque الدماغي العضوي بعد يومين من التثقيب الكهربائي باستخدام البلازميد المعبر عن GFP. تشير رؤوس الأسهم ذات اللون الرمادي الفاتح إلى الخلايا الكهربية. يشير المخطط المتقطع باللون الرمادي الفاتح إلى الحد الفاصل بين المنطقة المخصبة VZ و SVZ / الخلايا العصبية لهيكل يشبه البطين مجاور للخلايا الكهربية. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر زايس LSM 800 متحد البؤر بهدف 10x. قضبان المقياس = 150 ميكرومتر. الاختصارات: DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول; dps = أيام بعد البذر ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر ؛ SVZ = منطقة تحت البطين. VZ = منطقة البطين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تصور مجموعات الخلايا المختلفة الموجودة في الكائنات العضوية الدماغية الرئيسية بعد التثقيب الكهربائي. (أ-ج) تألق مناعي مزدوج ل GFP (أخضر) وإما PAX6 (A ، B ؛ أرجواني) أو NeuN (C ؛ أرجواني) ، في جميع الحالات جنبا إلى جنب مع تلطيخ DAPI (سماوي) ، من (A) 32 dps marmoset الدماغي العضوي بعد يومين من التثقيب الكهربائي مع البلازميد المعبر عن GFP ، و (B ، C) من العضو الدماغي المرموسيت 40 dps بعد 10 أيام من التثقيب الكهربائي مع البلازميد المعبر عن GFP. تشير رؤوس الأسهم ذات اللون الرمادي الفاتح إلى (A ، B) GFP + و PAX6 + أو (C) خلايا NeuN + مزدوجة الموجبة. تشير الخطوط المتقطعة ذات اللون الرمادي الفاتح إلى الحد الفاصل بين المنطقة VZ و SVZ / المخصب بالخلايا العصبية. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر زايس LSM 800 متحد البؤر بهدف 20x. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول; dps = أيام بعد البذر ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر ؛ NeuN = بروتين النوى العصبية. PAX6 = بروتين مربع 6 مقترن ؛ SVZ = منطقة تحت البطين. VZ = منطقة البطين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للصور المكهربة عن طريق التصوير البؤري ثلاثي الأبعاد للعضويات الدماغية الرئيسية المكهربة بعد المقاصة البصرية. أمامي (الصورة اليسرى) ، 45 درجة استدارة (الصورة الوسطى) ، و 90 درجة استدارة (الصورة اليمنى) وجهات نظر 3D أعيد بناؤها كهربائيا 32 dps الإنسان الدماغي العضوي بعد يومين من التثقيب الكهربائي مع البلازميد المعبر عن GFP. قبل التصوير ، تم مسح العضو العضوي بصريا بناء على طريقة 2Eci35. تم إنشاء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للعضوي الكهربائي بالكامل من 269 قسما بصريا (سمك 1 ميكرومتر لكل منهما) تفصل بينها 3.73 ميكرومتر عن بعضها البعض باستخدام مجهر زايس LSM 800 متحد البؤر بهدف 10x. تمت معالجة الصور لإعادة الإعمار 3D باستخدام فيجي. لاحظ أن الصور مأخوذة من نفس العضو العضوي المعاد بناؤه 3D الموضح في الفيديو 1. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. اختصار: GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1: عضوي دماغي بشري معاد بناؤه بالكهرباء 3D بعد المقاصة البصرية. فيديو من 3D المعاد بناؤها كهربائيا 32 dps الإنسان الدماغي العضوي 2 أيام بعد التثقيب الكهربائي مع البلازميد التعبير عن GFP. قبل التصوير ، تم مسح العضو العضوي بصريا بناء على طريقة 2Eci35. تم إنشاء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للعضوي الكهربائي بالكامل من 269 قسما بصريا (سمك 1 ميكرومتر لكل منهما) تفصل بينها 3.73 ميكرومتر عن بعضها البعض باستخدام مجهر زايس LSM 800 متحد البؤر بهدف 10x. تمت معالجة الصور لإعادة الإعمار 3D باستخدام فيجي. لاحظ أن الفيديو مأخوذ من نفس العضو العضوي المعاد بناؤه 3D الموضح في الشكل 5. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

خط iPSC جنس نشر تكوين الثقافة المتوسطة ظروف الثقافة
آي لونزا2.2 الإنسان العاقل ستوسكي وآخرون ، 2020 1 ميكرومتر IWR1 و 0.5 ميكرومتر CHIR في StemMACS iPS-Brew XF جو رطب من 5٪ CO2 و 95٪ هواء ، 37 درجة مئوية
ساندرا عموم الكهوف مورا بيرموديز وآخرون، 2016 mTeSR1 جو رطب من 5٪ CO2 و 95٪ هواء ، 37 درجة مئوية
iRh33.1 ماكاكا مولاتا ستوسكي وآخرون ، 2020 1 ميكرومتر IWR1 و 0.5 ميكرومتر CHIR في StemMACS iPS-Brew XF جو رطب من 5٪ CO2 و 95٪ هواء ، 37 درجة مئوية
cj_160419_5 كاليثريكس جاكوس بيتكوف وآخرون ، 2020 3 ميكرومتر IWR1 ، 0.3 ميكرومتر CGP77675 ، 0.3 ميكرومتر AZD77675 ، 0.5 ميكرومتر CHIR99021 ، 10 ميكرومتر فورسكولين ، 1 نانوغرام / مل أكتيفين أ ، 1 ميكرومتر OAC1 في StemMACS iPS-Brew XF جو رطب من 5٪ CO 2 ، 5٪ O 2 ، و 90٪ N2 ، 37 درجة مئوية

الجدول 1: ظروف الاستزراع للرئيسيات iPSCs المستخدمة في هذا المنشور. اختصار: iPSCs = الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات.

متوسط تكوين
وسط الحث العصبي 1x N-2 ملحق ، 1x مكمل بديل الجلوتامين ، 1x محلول أحماض أمينية غير أساسية MEM ، 1 ميكروغرام / مل هيبارين في وسط النسر المعدل من Dulbecco F12 (DMEM / F12)
وسط التمايز (DM) بدون فيتامين أ 0.5x B-27 الملحق (ناقص فيتامين A)، 0.5x N-2 الملحق، 0.5x MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية، 1x غلوتامين بديل الملحق، 100 U / مل البنسلين-الستربتومايسين، 0.00035٪ 2-ميركابتوإيثانول، 2.875 نانوغرام/مل الأنسولين في 1: 1 DMEM/F12 والوسط العصبي القاعدي
وسط التمايز (DM) مع فيتامين أ 0.5x B-27 ملحق ، 0.5x N-2 ملحق ، 0.5x محلول أحماض أمينية غير أساسية MEM ، 1x مكمل بديل الجلوتامين ، 100 وحدة / مل بنسلين - ستربتومايسين ، 0.00035٪ 2-ميركابتوإيثانول ، 2.875 نانوغرام / مل أنسولين في 1: 1 DMEM / F12 ووسط عصبي قاعدي

الجدول 2: تكوين الوسائط المستخدمة لتوليد وثقافة الأعضاء الدماغية الرئيسية.

مكون مزيج التحكم الكهربائي مزيج التثقيب الكهربائي GOI
GFP التعبير البلازميد 500 نانوغرام / ميكرولتر 500 نانوغرام / ميكرولتر
متجه فارغ 500 نانوغرام / ميكرولتر -
بلازميد تعبير حكومة إسرائيل - 500 نانوغرام / ميكرولتر
أخضر سريع 0.10% 0.10%
في DPBS

الجدول 3: تكوين مزيج التثقيب الكهربائي (نهج البلازميدات المنفصلة) للتحكم والجين محل الاهتمام. اختصار: GOI = جين الفائدة.

جسم شركة رقم الكتالوج ريد التخفيف
دجاج مضاد ل GFP مختبرات أفيس أجيال السلام-1020 ريد: AB_10000240 1:300
أرنب مضاد PAX6 نوفوس بيولوجيكس NBP1-89100 ريد: AB_11013575 1:300
أرنب مضاد للنيوين أبكام أب104225 ريد: AB_10711153 1:300
ماعز مضاد للدجاج اليكسا فلور 488 ثيرمو فيشر أ -11039 ريد: AB_142924 1:500
حمار مكافحة الأرنب اليكسا فلور 555 ثيرمو فيشر أ -31572 ريد: AB_162543 1:500

الجدول 4: الأجسام المضادة المستخدمة في تلطيخ التألق المناعي.

الشكل التكميلي S1: تحديد حدود VZ / SVZ في العضويات الدماغية المكهربة بالكهرباء. تألق مناعي مزدوج ل PAX6 (أرجواني) و TUJ1 (أصفر) جنبا إلى جنب مع تلطيخ DAPI (سماوي) لعضوي دماغي 32 dps marmoset بعد يومين من التثقيب الكهربائي باستخدام البلازميد المعبر عن GFP. لا يظهر التألق المناعي ل GFP. تشير الخطوط المتقطعة ذات اللون الرمادي الفاتح إلى الحد الفاصل بين المنطقة VZ و SVZ / المخصب بالخلايا العصبية. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر زايس LSM 800 متحد البؤر بهدف 20x. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول; dps = أيام بعد البذر ؛ PAX6 = بروتين مربع 6 مقترن ؛ SVZ = منطقة تحت البطين. TUJ1 = الفئة الثالثة β-توبولين ؛ VZ = منطقة البطين. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: تعليمات تجميع غرفة التثقيب الكهربائي لطبق بتري. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تمثل الإجراءات الموصوفة هنا بروتوكولا موحدا لتوليد عضويات دماغية من أنواع رئيسية مختلفة مع نهج التثقيب الكهربائي المستهدف. وهذا يسمح بالتعبير خارج الرحم لحكومة إسرائيل في نظام نموذجي يحاكي تطور القشرة المخية الحديثة الفسيولوجية للرئيسيات (بما في ذلك الإنسان) (المرضي). يستخدم هذا البروتوكول الموحد لتوليد العضويات الدماغية للرئيسيات نفس المواد (مثل الوسائط) وخطوات البروتوكول لجميع أنواع الرئيسيات الأربعة المقدمة. تتم معالجة الاختلافات التنموية بين هذه الأنواع عن طريق تغيير توقيت خطوات البروتوكول الحرجة (أي الحث العصبي والتضمين في مصفوفة الغشاء القاعدي ؛ انظر أعلاه). قد يعكس هذا تقريبا اختلافات توقيت النمو العصبي في الجسم الحي بين هذه الأنواع ويشكل موضوعا مثيرا للاهتمام لمزيد من الدراسات.

يعتمد هذا النهج على تجارب التثقيب الكهربائي الموصوفة في ورقة سابقة عن العضويات الدماغية10. ومع ذلك ، فإن هذه التجارب ، كما لاحظ لانكستر وزملاؤه ، كانت محدودة بدرجات واسعة من موت الخلايا المبرمج ، والتي حدثت بسبب ارتفاع تركيز GFP وأدت إلى استبعاد الخلايا الكهربائية التي تظهر إشارة GFP قوية10. في تجاربنا ، وجدنا أن تركيز البلازميد الكلي النهائي (على سبيل المثال ، تركيز البلازميد المشفر EGFP بالإضافة إلى تركيز البلازميد المشفر GOI) البالغ 1000 نانوغرام / ميكرولتر كان هو الأمثل. تؤدي التركيزات الأقل من 1000 نانوغرام / ميكرولتر إلى انخفاض كفاءة التثقيب الكهربائي ، في حين أن التركيزات العالية التي تزيد عن 1000 نانوغرام / ميكرولتر يمكن أن تكون سامة للخلايا الكهربائية وتؤدي إلى موت الخلية10. الدراسات التي تجمع بين أكثر من اثنين من بلازميدات التعبير المختلفة ممكنة28. ومع ذلك ، يجب الحفاظ على تركيز البلازميد الكلي النهائي عند 1000 نانوغرام / ميكرولتر.

في نهج التثقيب الكهربائي النموذجي ، هناك حاجة إلى بلازميد يشفر علامة مضان لتحديد الخلايا الكهربائية بنجاح. هناك احتمالان لإدراج علامة التألق في الإعداد التجريبي: (i) عن طريق الحقن المشترك لبلازميدات منفصلة (أي تشفير البلازميد للعلامة بالإضافة إلى بلازميد التحكم [على سبيل المثال ، ناقل فارغ] أو بلازميد يشفر الجين محل الاهتمام [GOI]) ( نهج البلازميدات المنفصلة) ؛ (ii) عن طريق حقن بلازميد واحد يشفر لكل من العلامة و GOI باستخدام موقع دخول الريبوسوم الداخلي (IRES) أو الببتيد ذاتي الشق 2A (على سبيل المثال ، P2A) ( نهج البلازميد المفرد). في هذه الحالة ، يتم استخدام ترميز البلازميد فقط علامة مضان كعنصر تحكم. في حين أن نهج البلازميد الفردي ينتج عنه التعبير المشترك الكامل لعلامة التألق و GOI ، فإن هذه البلازميدات كبيرة الحجم ، مما يؤدي إلى انخفاض كفاءة التثقيب الكهربائي. إذا كانت هناك حاجة إلى كفاءة عالية في التثقيب الكهربائي ، فمن المستحسن استخدام نهج البلازميدات المنفصلة ، لأن التعبير المنفصل لا يؤثر بشكل كبير على مستوى التعبير المشترك لعلامة التألق و GOI مع الحفاظ على كفاءة عالية في التثقيب الكهربائي28. في البروتوكول المقدم هنا ، نصف التثقيب الكهربائي باستخدام نهج البلازميدات المنفصلة. إذا تم تطبيق نهج البلازميد الفردي ، فيجب تعديل الخطوات الواردة في البروتوكول وفقا لذلك.

بالمقارنة مع البروتوكول37 المنشور مؤخرا ، فإن نهجنا له ثلاث مزايا رئيسية. أولا، نستهدف على وجه التحديد التراكيب الشبيهة بالبطين في العضوي الدماغي. نحقق ذلك (i) عن طريق الحقن الدقيق للهياكل الفردية الشبيهة بالبطين للعضو الدماغي بدلا من الحقن في مركز العضو العضوي 37 و (ii) عن طريق ترتيب اتجاه العضوالعضوي الدماغي في غرفة قطب طبق بتري لتحسين اتجاه المجال الكهربائي (انظر أعلاه) بدلا من استخدام كوفيت التثقيب الكهربائي37. ثانيا ، لا يتضمن هذا البروتوكول استخدام محلول nucleofector باهظ الثمن ، حيث يستخدم هذا النهج جهاز ثقب كهربائي بموجة مربعة مع غرفة قطب طبق بتري. ثالثا ، يسمح هذا البروتوكول الموحد لتوليد العضويات الدماغية للرئيسيات بدراسة ليس فقط الإنسان ولكن أيضا الكائنات العضوية غير البشرية ، مما يسمح بالدراسات التطورية والمقارنة والمرض.

هناك ميزتان تتعلقان بالكائنات العضوية الدماغية مهمتان لنجاح التثقيب الكهربائي - جودة العضويات الدماغية وحجم وجودة الهياكل الشبيهة بالبطين (انظر النتائج التمثيلية والشكل 1 ب). فيما يتعلق بالميزة الأولى ، نقدم معايير go و no-go (انظر أعلاه والشكل 1B) للمضي قدما في التثقيب الكهربائي. المعيار الرئيسي هو وجود هياكل تشبه البطين واضحة للعيان وشفافة ومنظمة شعاعيا. حجم الهياكل الشبيهة بالبطين هو الميزة الحاسمة الثانية لنجاح الحقن المجهري والتثقيب الكهربائي. يصعب حقن الهياكل الشبيهة بالبطين الصغيرة جدا وعادة لا تنتج عددا كبيرا بما فيه الكفاية من الخلايا الكهربائية للتحليلات اللاحقة. هذا هو السبب الرئيسي وراء استخدامنا لبروتوكول عضوي دماغي معدل ، حيث أن هذا البروتوكول ، في أيدينا ولخطوط iPSC هذه - ينتج ، مقارنة بالبروتوكولات الأخرى ، هياكل شبيهة بالبطين جيدة التنظيم وكبيرة بما يكفي ليتم تثقيفها بالكهرباء. من حيث المبدأ ، يمكن تطبيق نهج التثقيب الكهربائي المقدم هنا على أي بروتوكول عضوي عصبي آخر طالما أن الأخير ينتج هياكل تشبه البطين كبيرة ومنظمة بما فيه الكفاية (انظر النتائج التمثيلية والشكل 1 ب). علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول على الرئيسيات الأخرى في المستقبل مثل المكاك آكلة السلطعون (Macaca fascicularis) ، وهو نموذج الرئيسيات الكلاسيكي المستخدم في البحوث الصناعية. سيتطلب ذلك إما تحديد النقاط الزمنية الحرجة الصحيحة (انظر أعلاه) لبروتوكول العضو العضوي الدماغي المعدل الموصوف هنا أو إنشاء بروتوكول عضوي عصبي يؤدي إلى ظهور هياكل كبيرة مناسبة تشبه البطين (انظر أعلاه).

بعد التثقيب الكهربائي الناجح ، يمكن زراعة العضويات الدماغية لفترات زمنية مختلفة للسماح للتعديل الوراثي قيد الفحص بالتأثير على مجموعات الخلايا المختلفة داخل العضو العضوي الدماغي النامي. تتراوح هذه من مجموعات السلف العصبية المختلفة إلى أنواع متنوعة من الخلايا العصبية الموجودة في العضو الدماغي (انظر النتائج التمثيلية و Fischer et al.28). يمكن بعد ذلك تحليل مجموعات الخلايا هذه إما عن طريق التشريح بالتبريد وتلطيخ التألق المناعي (انظر الشكل 4) أو عن طريق تلطيخ التألق المناعي الكامل والمقاصة البصرية (انظر الشكل 5 والفيديو 1) من الكائنات العضوية الدماغية المثبتة كهربائيا PFA.

حتى الآن ، تم استخدام التثقيب الكهربائي لعضويات الدماغ بشكل أساسي للتعبير خارج الرحم للجينات لإجراء دراسات وظائف الجينات 10،28،38،39 ، والتصوير الحي 10،39،40 ، وتصور مورفولوجيا الخلية40 ، وتتبع انقسام الخلايا 10. ومع ذلك ، في أول ورقة عضوية دماغية ، تم إدخال shRNA في المواد العضوية عن طريق التثقيب الكهربائي لإسكات التعبير الجيني عن طريق تدخل الحمض النووي الريبي. أظهر هذا إمكانية استخدام التثقيب الكهربائي ليس فقط للتعبير خارج الرحم للجينات ولكن أيضا ل KD أو حتى KO للجينات. في الآونة الأخيرة ، تبين أنه يمكن تحقيق KOs بوساطة CRISPR / Cas9 عن طريق التثقيب الكهربائي في الرحم لأجنة الفئران27 والتثقيب الكهربائي للأنسجة البشرية الجنينية خارج الجسم الحي41. يمكن تطبيق KOs المستندة إلى CRISPR / Cas9 بسهولة على التثقيب الكهربائي للعضويات الدماغية ، حيث أن الآلية الرئيسية للتثقيب الكهربائي هي نفسها ، وهذا من شأنه أن يزيد من فائدة هذا النهج.

أحد التطبيقات الإضافية المحتملة للتثقيب الكهربائي في العضويات الدماغية هو إنقاذ أنماط ظاهرية محددة من KO في الحالات التي لا يمكن فيها الحصول على KO محدد من GOI بسبب التسلسلات المتشابهة للغاية بين حكومة إسرائيل وإصدارات أسلافها. هذا هو الحال بشكل خاص بالنسبة للجينات الخاصة بالإنسان التي تطورت مؤخرا. في مثل هذه الحالات ، لا يمكن (حتى مع استخدام تقنية CRISPR / Cas9) الحصول على KO محدد (كما كان الحال بالنسبة ل ARHGAP11A و ARHGAP11B 28). الحل لهذه المعضلة هو توليد KO مزدوج ل GOI وجين أسلافها وإنقاذ حكومة إسرائيل وحدها ، أو جين الأسلاف وحده ، أو كلا الجينين معا عن طريق التثقيب الكهربائي. يمكن بعد ذلك اعتبار هذه الكائنات العضوية المكهربة على أنها جين أسلاف انتقائي KO ، أو GOI KO انتقائي ، أو عنصر تحكم ، على التوالي. وهذا من شأنه أن يسمح بمعالجة المساهمات الفردية لهذه الجينات في النمط الظاهري (انظر ، على سبيل المثال ، Fischer et al.28). يرتبط تطبيق محتمل آخر بتحليل العضويات الدماغية الناتجة عن iPSCs المشتقة من المريض. في مثل هذه الحالات ، ليس من الواضح ما إذا كان النمط الظاهري المرصود ناتجا عن طفرة في الجين المرشح أو بسبب أي طفرة أخرى موجودة في المريض. هنا ، سيسمح التثقيب الكهربائي للجين المرشح والإنقاذ (المحتمل) للنمط الظاهري بالتحقق من دور هذا الجين في المرض (انظر ، على سبيل المثال ، Lancaster et al.10).

مجتمعة ، يقدم البروتوكول المقدم هنا نهجا سريعا وفعالا من حيث التكلفة لتعديل مجموعات الخلايا وراثيا داخل الهياكل الشبيهة بالبطين للعضويات الدماغية الرئيسية. يوفر هذا أداة فعالة لدراسة العمليات العصبية النمائية والتطورية التي يمكن تطبيقها أيضا لنمذجة المرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نعتذر لجميع الباحثين الذين لم يتم الاستشهاد بعملهم بسبب ضيق المساحة. نشكر أولريش بليير من الخدمات الفنية في DPZ وهارتموت وولف من ورشة العمل في MPI-CBG لبناء غرف قطب طبق بتري ؛ Stoyan Petkov و Rüdiger Behr لتوفير الإنسان (iLonza2.2) ، المكاك ريسوس (iRh33.1) و marmoset (cj_160419_5) iPSCs ؛ سابرينا هايد للتشريح بالتبريد وتلطيخ المناعة ؛ ونيرينغا ليوتيكايت وسيزار ماتيو باستيداس بيتانكورت لقراءتهما النقدية للمخطوطة. تم دعم العمل في مختبر WBH من خلال منحة ERA-NET NEURON (MICROKin). تم دعم العمل في مختبر M.H. من خلال منحة بدء ERC (101039421).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 µL Microloader Eppendorf 5242956003
2-Mercaptoethanol Merck 8.05740.0005
35 mm cell culture dishes Sarstedt 83.3900
60 mm cell culture dishes CytoOne CC7682-3359
Activin A Sigma-Aldrich SRP3003
AOC1 Selleckchem S7217
Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope Zeiss replacable by comparable fluorescent microscopes
AZD0530 Selleckchem  S1006
B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) Gibco 17504-044
B-27 Supplement without Vitamin A (50x) Gibco 12587-010
BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System BTX 45-2052
CGP77675 Sigma-Aldrich SML0314
Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A doi: 10.7554/elife.18683 
Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 doi: 10.3390/cells9112422
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) Gibco 11320-033
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 14190-094 pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use
Fast Green Sigma-Aldrich F7252-5G
Forskolin Selleckchem 2449
GlutaMAX Supplement (100x) Gibco 35050-061 glutamine substitute supplement
Heparin (1 mg/mL stock) Sigma-Aldrich H3149
Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 doi: 10.3390/cells9061349
Human Neurotrophin-3 (NT-3) PeproTech 450-03
Insulin Sigma-Aldrich 19278
IWR1 Sigma-Aldrich I0161
Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) Leica 10473849 replacable by comparable stereomicroscopes
Matrigel Corning 354277/354234 basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Sigma-Aldrich M7145
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502-048
Neurobasal medium Gibco 21103-049
Parafilm Sigma-Aldrich P7793
Paraformaldehyde  Merck 818715 handle with causion due to cancerogenecity
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) PanBiotech P06-07100
Petri dish electrode chamber self-produced (see Supplemental File 1) also commertially available
Pre-Pulled Glass Pipettes WPI TIP10LT borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter
Pro-Survival Compound MerckMillipore 529659
Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) PeproTech AF-450-02
Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 doi: 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XF Miltenyi Biotech 130-104-368
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco A1110501 proteolytic and collagenolytic enzyme mixture
TrypLE Gibco 12604-013 recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use
Ultra-Low Attachment 96-well plates Costar 7007
Y27632 Stemcell Technologies 72305

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marchetto, M. C. N., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19 (R1), R71-R76 (2010).
  2. Zhao, X., Bhattacharyya, A. Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders. The American Journal of Human Genetics. 103 (6), 829-857 (2018).
  3. Zhang, W., et al. Modeling microcephaly with cerebral organoids reveals a WDR62–CEP170–KIF2A pathway promoting cilium disassembly in neural progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2612 (2019).
  4. Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
  5. Niu, Y., et al. Transgenic rhesus monkeys produced by gene transfer into early-cleavage–stage embryos using a simian immunodeficiency virus-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17663-17667 (2010).
  6. Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
  7. Shi, L., et al. Transgenic rhesus monkeys carrying the human MCPH1 gene copies show human-like neoteny of brain development. National Science Review. 6 (3), 480-493 (2019).
  8. Heide, M., et al. Human-specific ARHGAP11B increases size and folding of primate neocortex in the fetal marmoset. Science. 369 (6503), 546-550 (2020).
  9. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell–derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  10. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  11. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem cell models of human brain development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  12. Lullo, E. D., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
  13. Arlotta, P. Organoids required! A new path to understanding human brain development and disease. Nature Methods. 15 (1), 27-29 (2018).
  14. Heide, M., Huttner, W. B., Mora-Bermúdez, F. Brain organoids as models to study human neocortex development and evolution. Current Opinion in Cell Biology. 55, 8-16 (2018).
  15. Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074 (2019).
  16. Sun, N., Meng, X., Liu, Y., Song, D., Jiang, C., Cai, J. Applications of brain organoids in neurodevelopment and neurological diseases. Journal of Biomedical Science. 28 (1), 30 (2021).
  17. Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. Genetic modification of brain organoids. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 558 (2019).
  18. Pașca, S. P., et al. A nomenclature consensus for nervous system organoids and assembloids. Nature. 609 (7929), 907-910 (2022).
  19. Kyrousi, C., Cappello, S. Using brain organoids to study human neurodevelopment, evolution and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 9 (1), e347 (2020).
  20. Teriyapirom, I., Batista-Rocha, A. S., Koo, B. -K. Genetic engineering in organoids. Journal of Molecular Medicine. 99 (4), 555-568 (2021).
  21. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  22. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
  23. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  24. Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2012).
  25. Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5 (1), 24 (2012).
  26. Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nature Neuroscience. 6 (12), 1277-1283 (2003).
  27. Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO reports. 17 (3), 338-348 (2016).
  28. Fischer, J., et al. Human-specific ARHGAP11B ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Reports. 23 (11), e54728 (2022).
  29. Stauske, M., et al. Non-human primate iPSC generation, cultivation, and cardiac differentiation under chemically defined conditions. Cells. 9 (6), 1349 (2020).
  30. Mora-Bermúdez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. eLife. 5, e18683 (2016).
  31. Petkov, S., Dressel, R., Rodriguez-Polo, I., Behr, R. Controlling the switch from neurogenesis to pluripotency during marmoset monkey somatic cell reprogramming with self-replicating mRNAs and small molecules. Cells. 9 (11), 2422 (2020).
  32. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  33. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  34. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  35. Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nature Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
  36. Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), dev166884 (2019).
  37. Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protocols. 3 (1), 101129 (2022).
  38. Denoth-Lippuner, A., et al. Visualization of individual cell division history in complex tissues using iCOUNT. Cell Stem Cell. 28 (11), 2020.e12-2034.e12 (2021).
  39. Kelava, I., Chiaradia, I., Pellegrini, L., Kalinka, A. T., Lancaster, M. A. Androgens increase excitatory neurogenic potential in human brain organoids. Nature. 602 (7895), 112-116 (2022).
  40. Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
  41. Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535.e9-550.e9 (2019).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 193 ،
الحقن المجهري المستهدف والتثقيب الكهربائي للعضويات الدماغية الرئيسية للتعديل الوراثي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tynianskaia, L., Eşiyok, N.,… More

Tynianskaia, L., Eşiyok, N., Huttner, W. B., Heide, M. Targeted Microinjection and Electroporation of Primate Cerebral Organoids for Genetic Modification. J. Vis. Exp. (193), e65176, doi:10.3791/65176 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter