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Developmental Biology

Gezielte Mikroinjektion und Elektroporation von Hirnorganoiden von Primaten zur genetischen Modifikation

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65176
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,2
1German Primate Center, Leibniz Institute for Primate Research, 2Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics

Summary

Die Elektroporation von Hirnorganoiden von Primaten bietet einen präzisen und effizienten Ansatz, um transiente genetische Modifikationen in verschiedene Vorläufertypen und Neuronen in einem Modellsystem einzuführen, das der (patho)physiologischen Neokortexentwicklung von Primaten nahe kommt. Dies ermöglicht die Untersuchung neurologischer Entwicklungs- und Evolutionsprozesse und kann auch für die Modellierung von Krankheiten eingesetzt werden.

Abstract

Die Großhirnrinde ist die äußerste Hirnstruktur und für die Verarbeitung von sensorischen und motorischen Inputs verantwortlich. Es gilt als Sitz der kognitiven Fähigkeiten höherer Ordnung bei Säugetieren, insbesondere bei Primaten. Die Untersuchung von Genfunktionen in Primatengehirnen ist aus technischen und ethischen Gründen eine Herausforderung, aber die Etablierung der Gehirnorganoid-Technologie hat die Untersuchung der Gehirnentwicklung in traditionellen Primatenmodellen (z. B. Rhesusaffen und Weißbüschelaffen) sowie in bisher experimentell unzugänglichen Primatenarten (z. B. Menschenaffen) in einem ethisch vertretbaren und technisch weniger anspruchsvollen System ermöglicht. Darüber hinaus ermöglichen menschliche Gehirnorganoide die fortgeschrittene Untersuchung neurologischer Entwicklungsstörungen und neurologischer Störungen.

Da Gehirnorganoide viele Prozesse der Gehirnentwicklung rekapitulieren, stellen sie auch ein leistungsfähiges Werkzeug dar, um Unterschiede in den genetischen Determinanten zu identifizieren und funktionell zu vergleichen, die der Gehirnentwicklung verschiedener Arten in einem evolutionären Kontext zugrunde liegen. Ein großer Vorteil der Verwendung von Organoiden ist die Möglichkeit, genetische Veränderungen einzubringen, die es ermöglichen, Genfunktionen zu testen. Die Einführung solcher Modifikationen ist jedoch mühsam und teuer. Diese Arbeit beschreibt einen schnellen und kostengünstigen Ansatz zur genetischen Veränderung von Zellpopulationen innerhalb der ventrikelartigen Strukturen von Primaten-Hirnorganoiden, einer Subart von Hirnorganoiden. Diese Methode kombiniert ein modifiziertes Protokoll zur zuverlässigen Erzeugung von zerebralen Organoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von Menschen, Schimpansen, Rhesusaffen und Weißbüschelaffen mit einem Mikroinjektions- und Elektroporationsansatz. Dies bietet ein effektives Werkzeug für die Untersuchung neurologischer Entwicklungs- und Evolutionsprozesse, das auch für die Modellierung von Krankheiten verwendet werden kann.

Introduction

Die Untersuchung der (patho)physiologischen Entwicklung und Evolution der Großhirnrinde ist eine gewaltige Aufgabe, die durch den Mangel an geeigneten Modellsystemen erschwert wird. Bisher beschränkten sich solche Studien auf zweidimensionale Zellkulturmodelle (z. B. primäre neuronale Vorläufer- oder neuronale Zellkulturen) und evolutionär entfernte Tiermodelle (z. B. Nagetiere)1,2. Während diese Modelle nützlich sind, um bestimmte Fragen zu beantworten, sind sie bei der Modellierung der Komplexität, der Zelltypzusammensetzung, der zellulären Architektur und der Genexpressionsmuster des sich entwickelnden menschlichen Neokortex in gesunden und kranken Zuständen begrenzt. Diese Einschränkungen führen z.B. zu einer schlechten Übertragbarkeit von Mausmodellen menschlicher Erkrankungen auf die menschliche Situation, wie sie für bestimmte Fälle von Mikrozephalie beschrieben wird (z.B. Zhang et al.3). In jüngster Zeit sind transgene nicht-menschliche Primaten, die evolutionär, funktionell und morphologisch ein näheres Modell der menschlichen Neokortex-Entwicklung darstellen, in den Fokus gerückt 4,5,6,7,8, da sie viele Einschränkungen von Zellkultur- und Nagetiermodellen überwinden. Der Einsatz nichtmenschlicher Primaten in der Forschung ist jedoch nicht nur sehr teuer und zeitaufwändig, sondern wirft auch ethische Bedenken auf. In jüngerer Zeit hat sich die Entwicklung der Gehirnorganoid-Technologie 9,10 als vielversprechende Alternative herausgestellt, die viele der Einschränkungen der Vorgängermodelle 11,12,13,14,15,16 löst.

Hirnorganoide sind dreidimensionale (3D), multizelluläre Strukturen, die die Hauptmerkmale der Zytoarchitektur und Zelltypzusammensetzung einer oder mehrerer Hirnregionen für ein definiertes Entwicklungszeitfenster nachbilden 11,12,13,14,17. Diese 3D-Strukturen werden entweder aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) oder, falls für die interessierende Spezies verfügbar, aus embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) erzeugt. Im Allgemeinen können zwei Arten von Hirnorganoiden aufgrund der verwendeten Methodik unterschieden werden: ungeführte und regionalisierte (geführte) Hirnorganoide18. Bei der Erzeugung der letztgenannten Art von Organoiden werden kleine Moleküle oder Faktoren bereitgestellt, die die Differenzierung der pluripotenten Stammzellen zu Organoiden einer bestimmten Hirnregion (z. B. Vorderhirn-Organoiden) steuern18. Im Gegensatz dazu wird bei ungelenkten Organoiden die Differenzierung nicht durch die Zugabe kleiner Moleküle gesteuert, sondern beruht ausschließlich auf der spontanen Differenzierung der iPSCs/ESCs. Die resultierenden Hirnorganoide bestehen aus Zelltypen, die verschiedene Hirnregionen repräsentieren (z. B. zerebrale Organoide)18. Hirnorganoide kombinieren viele Schlüsselmerkmale der Gehirnentwicklung mit einer relativ kosten- und zeiteffizienten Generierung aus allen Arten von Interesse, für die iPS-Zellen oder ES-Zellen verfügbar sind11,12,13,14. Dies macht Gehirnorganoide zu einem hervorragenden Modell für viele Arten von neurobiologischen Studien, die von evolutionären und entwicklungsbedingten Fragen bis hin zur Modellierung von Krankheiten und Medikamententests reichen15,16. Die Beantwortung solcher Fragen mit Hilfe von Hirnorganoiden hängt jedoch stark von der Verfügbarkeit verschiedener Methoden zur genetischen Veränderung ab.

Ein wichtiger Aspekt bei der Untersuchung der (patho)physiologischen Entwicklung des Neokortex und seiner Evolution ist die funktionelle Analyse von Genen und Genvarianten. Dies wird in der Regel durch (ektopische) Expression und/oder durch Knock-down (KD) oder Knock-out (KO) dieser Gene erreicht. Solche genetischen Modifikationen können in stabile und vorübergehende genetische Modifikationen eingeteilt werden, sowie in die Modifikationen, die zeitlich und räumlich begrenzt oder nicht eingeschränkt sind. Eine stabile genetische Veränderung ist definiert durch die Einbringung einer genetischen Veränderung in das Wirtsgenom, die an alle nachfolgenden Zellgenerationen weitergegeben wird. Je nach Zeitpunkt der genetischen Veränderung kann sie alle Zellen eines Organoids betreffen oder auf bestimmte Zellpopulationen beschränkt sein. Am häufigsten wird eine stabile genetische Modifikation in Hirnorganoiden auf iPSC/ESC-Ebene durch den Einsatz von Lentiviren, Transposon-ähnlichen Systemen und der CRISPR/Cas9-Technologie erreicht (überprüft von z. B. Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 und Teriyapirom et al.20). Das hat den Vorteil, dass alle Zellen des Hirnorganoids die genetische Veränderung tragen und diese zeitlich und räumlich nicht eingeschränkt ist. Die Generierung und Charakterisierung dieser stabilen iPSC/ESC-Linien ist jedoch sehr zeitaufwändig und dauert oft mehrere Monate, bis die ersten modifizierten Hirnorganoide analysiert werden können (überprüft von z.B. Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 oder Teriyapirom et al.20).

Im Gegensatz dazu wird eine vorübergehende genetische Veränderung durch die Abgabe genetischer Fracht (z. B. eines Genexpressionsplasmids) definiert, die sich nicht in das Wirtsgenom integriert. Während diese Modifikation prinzipiell an nachfolgende Zellgenerationen weitergegeben werden kann, wird die abgegebene genetische Fracht mit jeder Zellteilung schrittweise verdünnt. Daher ist diese Art der genetischen Veränderung in der Regel zeitlich und räumlich begrenzt. Vorübergehende genetische Modifikationen können in Hirnorganoiden durch Adeno-assoziierte Viren oder durch Elektroporation durchgeführt werden (überprüft von z. B. Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 und Teriyapirom et al.20), wobei letzteres in diesem Artikel ausführlich beschrieben wird. Im Gegensatz zur stabilen genetischen Veränderung ist dieser Ansatz sehr schnell und kostengünstig. In der Tat kann die Elektroporation innerhalb von Minuten durchgeführt werden, und je nach Zielzellpopulation(en) sind elektroporierte Organoide innerhalb von Tagen bereit für die Analyse (überprüft von z. B. Fischer et al.17 und Kyrousi et al.19). Grobe morphologische Veränderungen des Hirnorganoids, wie z.B. Größenunterschiede, können mit dieser Methode jedoch nicht nachgewiesen werden, da diese Art der genetischen Veränderung zeitlich und räumlich begrenzt ist. Diese Einschränkung kann auch von Vorteil sein, z.B. bei der Untersuchung einzelner Zellpopulationen innerhalb des Organoids oder der Auswirkungen auf Hirnorganoide zu bestimmten Entwicklungszeitpunkten (überprüft z.B. von Fischer et al.17 und Kyrousi et al.19).

Ein klassischer Ansatz zur Untersuchung der Genfunktion während der Entwicklung und Evolution des Gehirns ist die Elektroporation in utero. Die In-utero-Elektroporation ist eine bekannte und nützliche Technik für die Abgabe von Genexpressionskonstrukten in das Gehirn von Nagetieren 21,22,23 und Frettchen24,25. Zunächst wird eine Lösung, die das/die interessierende(n) Expressionskonstrukt(e) enthält, durch die Gebärmutterwand in einen bestimmten Ventrikel des embryonalen Gehirns mikroinjiziert, abhängig von der Region, die anvisiert werden soll. Im zweiten Schritt werden elektrische Impulse angelegt, um die Zellen direkt in den Zielventrikel zu transfizieren. Dieser Ansatz ist nicht nur auf die ektopische Expression oder die Überexpression von Genen beschränkt, sondern kann auch in KD- oder KO-Studien durch Mikroinjektion von kurzer Haarnadel (shRNA) bzw. CRISPR/Cas9 (in Form von Expressionsplasmiden oder Ribonukleoproteinen [RNPs]) angewendet werden26,27. Die In-utero-Elektroporation von Maus-, Ratten- und Frettchenembryonen hat jedoch die gleichen Einschränkungen wie oben für diese Tiermodelle beschrieben.

Idealerweise möchte man die Elektroporation in utero direkt bei Primaten durchführen. Obwohl dies prinzipiell technisch möglich ist, wird die Elektroporation in utero bei Primaten aufgrund ethischer Bedenken, hoher Tierhaltungskosten und kleiner Wurfgrößen nicht durchgeführt. Für bestimmte Primaten, wie z.B. Menschenaffen (einschließlich Menschen), ist dies überhaupt nicht möglich. Diese Primaten haben jedoch das größte Potenzial für die Erforschung der menschlichen (patho)physiologischen Neokortex-Entwicklung und ihrer Evolution. Eine Lösung für dieses Dilemma besteht darin, die Elektroporationstechnik auf Hirnorganoide von Primaten anzuwenden28.

In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Elektroporation eines Subtyps von Primaten-Hirnorganoiden, Primaten-Hirnorganoiden, vorgestellt. Dieser Ansatz ermöglicht die schnelle und kostengünstige genetische Veränderung von Zellpopulationen innerhalb der ventrikelartigen Strukturen der Organoide. Konkret beschreiben wir ein einheitliches Protokoll für die Generierung von Primaten-Hirnorganoiden aus humanen (Homo sapiens), Schimpansen (Pan troglodytes), Rhesusaffen (Macaca mulatta) und Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) iPSCs. Darüber hinaus beschreiben wir die Mikroinjektions- und Elektroporationstechnik im Detail und geben "Go"- und "No-Go"-Kriterien für die Durchführung der zerebralen Organoid-Elektroporation von Primaten an. Dieser Ansatz ist ein effektives Werkzeug, um die (patho)physiologische Entwicklung des Neokortex und seine Evolution in einem Modell zu untersuchen, das der menschlichen Situation besonders nahe kommt.

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Protocol

1. Kultivierung von Primaten-iPS-Zellen

HINWEIS: Aufgrund ihrer Robustheit kann die hier vorgestellte Methode auf jede iPSC-Linie von Primaten angewendet werden. In diesem Artikel beschreiben wir die zerebrale Organoidproduktion aus humanen (iLonza2.2)29, Schimpansen (Sandra A)30, Rhesusaffen (iRh33.1)29 und Weißbüschelaffen (cj_160419_5)31 iPSC-Linien. Die Kulturbedingungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

  1. Für die Kultivierung der jeweiligen iPS-Zellen sind die ursprünglich beschriebenen Kulturbedingungen zu beachten. Im Allgemeinen sollten für die erfolgreiche Erzeugung und Elektroporation von zerebralen Organoiden iPSC-Linien verwendet werden, die seit mehr als 90 Passagen nicht kultiviert wurden. Stellen Sie außerdem zu Beginn der Bildung von zerebralen Organoiden sicher, dass iPS-Zellen Merkmale der Pluripotenz ohne Anzeichen einer Differenzierung aufweisen.

2. Generierung von zerebralen Organoiden aus iPS-Zellen von Primaten

HINWEIS: Das Protokoll für die Erzeugung von zerebralen Organoiden basiert auf einer modifizierten Version 28,30,32,33 des ursprünglichen zerebralen Organoid-Protokolls 10,34 mit einigen speziesspezifischen Modifikationen (siehe unten).

  1. Aussaat von iPS-Zellen zur Erzeugung von Embryoid Bodies (EBs)
    1. Sobald die iPS-Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreicht haben, waschen Sie sie mit Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) und fügen Sie 500 μl rekombinanten Trypsinersatz oder 1 ml proteolytische und kollagennolytische Mischung hinzu.
      HINWEIS: In der Regel werden iPS-Zellen in einer 60-mm-Zellkulturschale kultiviert, um etwa 900.000 Zellen zu erhalten, was ausreicht, um 96 zerebrale Organoide zu erzeugen. Die Zellzahlen können je nach Anzahl der benötigten Organoide angepasst werden. Beachten Sie, dass möglicherweise nicht alle erzeugten zerebralen Organoide für die Elektroporation geeignet sind.
    2. Inkubieren Sie die Schale bei 37 °C für 2 Minuten, um die Zellen abzulösen.
      Anmerkungen: Je nach verwendeter iPSC-Linie oder verwendetem Enzym können bis zu 2 Minuten Inkubation bei 37 °C erforderlich sein. Es wird empfohlen, die Schale unter einem Mikroskop zu untersuchen, um sicherzustellen, dass die Zellen begonnen haben, sich zu lösen.
    3. Fügen Sie 1,5 ml vorgewärmtes (37 °C) iPSC-Nährmedium hinzu, um die Reaktion zu stoppen, und pipettieren Sie 7x-10x (nicht mehr als 10x) auf und ab, um die Zellen von der Zellkulturschale zu trennen und eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
    4. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
    5. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 2 ml iPSC-Nährmedium, das entweder mit 50 μM Y27632 oder 50 μM überlebensfördernder Verbindung ergänzt ist.
    6. Verwenden Sie 10 μl der Zellsuspension, um die Zellen mit einer Neubauer-Kammer zu zählen.
    7. Stellen Sie die Zellsuspension auf eine Konzentration von 9.000 Zellen pro 150 μl (60.000 Zellen/ml) ein, indem Sie iPSC-Kulturmedium verwenden, das mit 50 μM Y27632 oder 50 μM Pro-Survival-Verbindung ergänzt ist.
    8. Um Embryoidkörper (EBs) zu erzeugen, werden 150 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit extrem niedriger Bindung gekeimt. Schütteln Sie während des Pipettierens vorsichtig das Röhrchen mit der Zellsuspension, um zu verhindern, dass sich die Zellen absetzen.
    9. Kultur der EBs in einer humifizierten Atmosphäre von 5 % CO2 und 95 % Luft bei 37 °C (0 Tage nach der Aussaat [dps]). Stören Sie die EBs nicht innerhalb der ersten 24 Stunden nach der Aussaat.
      HINWEIS: EBs, die aus Weißbüschelaffen-iPS-Zellen erzeugt werden, müssen in einer gehumeten Atmosphäre unter hypoxischen Bedingungen (5 % CO 2, 5 %O2 und 90 % N2) bei 37 °C kultiviert werden.
    10. Wechseln Sie nach ~48 h (2 dps) das Medium auf iPSC-Nährmedium ohne Y27632/Pro-Survival-Verbindung. Entfernen Sie 100 μl Medium pro Vertiefung und fügen Sie 150 μl vorgewärmtes (37 °C) frisches Medium ohne Y27632 hinzu. Gehen Sie Reihe für Reihe.
    11. Führen Sie jeden zweiten Tag weitere Mediumwechsel durch. Aus jeder Vertiefung werden 150 μl Medium entnommen und 150 μl vorgewärmtes (37 °C) frisches Medium ohne Y27632/Pro-Survival-Verbindung pro Vertiefung hinzugefügt.
      HINWEIS: Nach 4-5 dps sollte die Peripherie der EBs durchscheinend werden.
  2. Induktion des Neuroektoderms
    HINWEIS: Im Allgemeinen sollten hochwertige EBs in dieser Phase glatte Konturen und durchscheinende Ränder haben. Die Zeitpunkte der neuronalen Induktion unterscheiden sich geringfügig zwischen Primatenarten und iPSC-Linien. Bei den hier verwendeten Zelllinien (siehe Abschnitt 1 und Materialtabelle) muss die neuronale Induktion für Weißbüschelaffen-EBs in der Regel mit 4 dps, für Rhesusaffen mit 5 dps und für Menschen und Schimpansen mit 4-5 dps begonnen werden (Abbildung 1A), je nach Zustand der EBs (siehe oben).
    1. Entnehmen Sie 150 μl Medium aus jeder Vertiefung der ersten Reihe der 96-Well-Platte und fügen Sie 150 μl vorgewärmtes (37 °C) neuronales Induktionsmedium (siehe Tabelle 2) pro Vertiefung in derselben Reihe hinzu.
    2. Fahren Sie mit dem Wechseln des Mediums wie oben beschrieben Reihe für Reihe für die gesamte 96-Well-Platte fort. Führen Sie jeden zweiten Tag weitere Änderungen des neuronalen Induktionsmediums (NIM) durch, indem Sie 150 μl NIM aus jeder Vertiefung entfernen und 150 μl vorgewärmte (37 °C) frische NIM hinzufügen.
      HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt sollten die Weißbüschelaffen-EBs unter den gleichen Bedingungen wie die anderen Primaten-EBs kultiviert werden (humifizierte Atmosphäre von 5% CO2 und 95% Luft bei 37 °C).
  3. Einbettung in die Basalmembranmatrix
    HINWEIS: Sobald die EBs ein ausgeprägtes, durchscheinendes, radial organisiertes Neuroepithel an der Oberfläche entwickelt haben, muss die Entwicklung ventrikelähnlicher Strukturen strukturell unterstützt werden. Dies wird durch die Einbettung der EBs in eine Basalmembranmatrix erreicht. Aufgrund der unterschiedlichen Entwicklungsraten sind Weißbüschelaffen- und Rhesusaffen-EBs bereits bei 7 dps bereit für die Einbettung, während Menschen und Schimpansen EBs normalerweise bei 8-9 dps eingebettet sind. Der Einfachheit halber bezieht sich die Basalmembranmatrix in diesem Protokoll nur auf Matrigel. Geltrex kann jedoch als Ersatz verwendet werden.
    1. Als Vorbereitung für die Einbettung UV-sterilisieren Sie eine Schere, eine Pinzette, ein kleines Gestell für 0,2-ml-Röhrchen und drei bis sechs mit 70 % (vol/vol) behandeltem Parafilm unter der Laminar-Flow-Haube für 15 Minuten. Lassen Sie die Basalmembranmatrix mehrere Stunden auf Eis auftauen (~1,5 ml Basalmembranmatrix reichen normalerweise für 96 EBs).
      Anmerkungen: Bewahren Sie die Basalmembranmatrix immer auf Eis auf.
    2. Erstellen Sie ein 4 x 4 Grübchenraster auf dem Parafilm. Legen Sie das Parafilmgitter so auf das 0,2-ml-Röhrchengestell, dass die mit Papier umhüllte Seite nach oben zeigt, und drücken Sie vorsichtig mit einem behandschuhten Finger gegen jedes Loch des Racks.
    3. Entfernen Sie das Papier und schneiden Sie das Grübchengitter mit einer Schere aus dem Parafilmquadrat aus, um es so zu verkleinern, dass es in eine 60-mm-Zellkulturschale passt. Legen Sie den Noppen-Parafilm wieder auf das 0,2-ml-Röhrchengestell, um eine Grundlage für die Tröpfchenerzeugung der Basalmembranmatrix zu schaffen.
    4. Übertragen Sie mit einer Pipette mit einer abgeschnittenen 200-μL-Pipettenspitze die EBs vorsichtig nacheinander aus der Vertiefung der Kulturschale in die Parafilm-Grübchen.
    5. Nachdem Sie 16 EBs in das Gitter gelegt haben, nehmen Sie eine neue 200-μl-Pipettenspitze und entfernen Sie das restliche Medium aus den Grübchen.
    6. Pipettieren Sie einen Tropfen (~15 μl) der Basalmembranmatrix auf jede Vertiefung, die ein EB enthält.
    7. Nehmen Sie eine 10-μl-Pipettenspitze und bewegen Sie die EBs schnell in die Mitte jedes Tröpfchens, ohne die Tröpfchenränder zu stören.
    8. Den Noppen-Parafilm mit den Matrixtropfen der Basalmembran in eine 60-mm-Zellkulturschale geben und 15-30 min bei 37 °C inkubieren, damit die Matrix polymerisieren kann.
    9. Um die in die Matrix eingebetteten EBs vom Parafilm zu lösen, geben Sie 5 ml Differenzierungsmedium (DM) ohne Vitamin A ( siehe Tabelle 2) in die Schale und drehen Sie das Parafilmquadrat mit einer Pinzette auf den Kopf, so dass die Seite mit den EBs zum Boden der Schale zeigt.
    10. Schütteln Sie die Schale vorsichtig, damit sich die Matrixtropfen der Basalmembran, die die EBs enthalten, vom Parafilm lösen. Wenn einige von ihnen noch angebracht sind, nehmen Sie mit einer Pinzette eine Kante des Parafilm-Quadrats und rollen Sie sie mehrmals schnell in Richtung Mitte der Schale auf.
    11. Kultur der zerebralen Organoide auf einem Orbitalschüttler bei 55 U/min in einer verkrümmten Atmosphäre von 5 % CO2 und 95 % Luft bei 37 °C. Bewahren Sie sie in DM ohne Vitamin A mit mittleren Wechseln jeden zweiten Tag auf. Um die Produktion von Neuronen zu induzieren, wechseln Sie nach 13 dps für Weißbüschelaffen- und Rhesusaffen-Hirnorganoide oder 14-15 dps für menschliche und Schimpansen-Hirnorganoide auf DM mit Vitamin A (Retinsäure, RA) (Abbildung 1A). Wechseln Sie ab diesem Zeitpunkt alle 3-4 Tage das Medium.
      HINWEIS: Um das neuronale Überleben zu unterstützen, kann DM mit Vitamin A mit 20 μg/ml humanem Neurotrophin 3 (NT3), 20 μg/ml brain-derived neurotrophic factor (BDNF) und 1 μl/ml Basalmembranmatrix ab 40 dps ergänzt werden.

3. Elektroporation von Hirnorganoiden von Primaten

HINWEIS: Aus technischer Sicht kann die Elektroporation von zerebralen Organoiden durchgeführt werden, sobald die ventrikelartigen Strukturen ausgeprägt genug ausgeprägt sind, um durch Mikroinjektion angegriffen zu werden. Das optimale Zeitfenster für die Elektroporation hängt von der biologischen Fragestellung und von der interessierenden Zellpopulation(en) ab. Wenn zum Beispiel apikale Vorläuferzellen (APs) das Hauptziel sind, dann sind bereits zerebrale Organoide mit etwa 30 dps geeignet. Wenn basale Vorläuferzellen (BPs) oder Neuronen die Hauptziele sind, sollten ältere zerebrale Organoide mit mehr als 50 dps verwendet werden (siehe z. B. Fischer et al.28).

  1. Vorbereitung des Elektroporationsaufbaus
    HINWEIS: Die Effizienz der Elektroporation wird stark von der Größe und der Konzentration der elektroporierten Plasmide beeinflusst (Einzelheiten finden Sie im Abschnitt Diskussion).
    1. Bereiten Sie eine ausreichende Menge an Elektroporationsmischung für die Kontrolle und das interessierende Gen (GOI) vor, z. B. 10 μl Elektroporationsmischung für jede Kontrolle und GOI zur Elektroporation von etwa 30 zerebralen Organoiden pro Bedingung.
      HINWEIS: Für die Zusammensetzung der Elektroporationsmischungen siehe Tabelle 3.
    2. Vorwärmen (unsteril) von Dulbecco's modifiziertem Eagle Medium/Nährstoff-Gemisch F-12 (DMEM/F12) und DM mit Vitamin A auf 37 °C. Bereiten Sie einen kleinen Spatel und eine feine und normale Schere vor und besprühen Sie die Instrumente mit 70% (vol/vol) Ethanol.
      HINWEIS: Die folgenden Schritte können entweder unter sterilen oder unsterilen Bedingungen durchgeführt werden, da der DM Antibiotika enthält (siehe Tabelle 2). Unserer Erfahrung nach hat das Fehlen von Sterilität noch nie zu einer Kontamination geführt.
    3. Bereiten Sie 35-mm-Zellkulturschalen vor und verbinden Sie die Elektrodenkammer der Petrischale mit dem Elektroporator.
      HINWEIS: Petrischale-Elektrodenkammern sind im Handel erhältlich. Sie können jedoch leicht und kostengünstig hergestellt werden (siehe Ergänzungsdatei 1).
    4. Füllen Sie die Mikroinjektionsnadeln mit Hilfe von Microloader-Spitzen mit 8 μl jeder Elektroporationsmischung. Schneiden Sie die Nadelspitzen vor dem ersten Gebrauch mit einer feinen Schere ab, um einen stabilen Fluss zu erreichen. Entfernen Sie jedoch nur einen kleinen Teil der Spitze, da eine stumpfe und breite Spitze die Organoide stark beschädigen kann.
      HINWEIS: Mikroinjektionsnadeln sind entweder als vorgezogene Mikroinjektionsnadeln im Handel erhältlich oder können im Labor gezogen werden, wenn ein Nadelabzieher verfügbar ist. Befolgen Sie die Anweisungen des Nadelabzieherherstellers, um Mikroinjektionsnadeln mit einer langen Verjüngung und einem Spitzendurchmesser von 10 μm zu erzeugen.
  2. Mikroinjektion und Elektroporation
    1. Wählen Sie unter dem Mikroskop fünf Hirnorganoide mit glatten Rändern und deutlich sichtbaren ventrikelartigen Strukturen aus. Bringen Sie sie mit einer abgeschnittenen 1.000-μl-Pipettenspitze in eine 35-mm-Zellkulturschale mit vorgewärmtem (37 °C) DMEM/F12.
      HINWEIS: Wählen Sie zerebrale Organoide mit ausgeprägten und zugänglichen ventrikelähnlichen Strukturen (siehe Abbildung 1B).
    2. Um eine ventrikelartige Struktur zu injizieren, führen Sie die Nadel vorsichtig durch die Wand und infundieren Sie sie mit der Elektroporationsmischung, bis sie sichtbar gefüllt ist. Üben Sie keinen übermäßigen Druck auf ventrikelartige Strukturen aus, um ein Platzen zu vermeiden. Gehen Sie auf diese Weise mit sechs bis acht ventrikelartigen Strukturen jedes zerebralen Organoids vor.
      Anmerkungen: Wenn die Nadel während des Mikroinjektionsvorgangs verstopft ist, muss die Spitze leicht gekürzt werden.
    3. Übertragen Sie ein mikroinjiziertes Hirnorganoid mit einer kleinen Menge DMEM/F12 in die Petrischale-Elektrodenkammer . Ordnen Sie das Organoid so an, dass die Oberflächen der mikroinjizierten ventrikelartigen Strukturen zur Elektrode zeigen, die mit dem Pluspol des Elektroporators verbunden ist.
      HINWEIS: Durch diese Ausrichtung der Strukturen wird sichergestellt, dass die Zellen auf der Seite der ventrikelartigen Struktur transfiziert werden, die nicht von einer benachbarten Struktur betroffen ist.
    4. Elektroporieren Sie die zerebralen Organoide nacheinander mit den folgenden Einstellungen: 5 Impulse mit 80 V, einer Impulsdauer von 50 ms und einem Intervall von 1 s. Die elektroporierten Organoide werden in eine neue 35-mm-Zellkulturschale überführt, die mit vorgewärmtem (37 °C) DMEM/F12 gefüllt ist.
      Anmerkungen: Die Einstellungen für die Elektroporation können vom verfügbaren Rechteck-Elektroporator abhängen. Diese Einstellungen sind für das referenzierte Elektroporationssystem optimiert. Eine Erhöhung der Spannung kann zur Verschiebung der Zellen führen.
    5. Gehen Sie mit den nächsten fünf Hirnorganoiden auf die gleiche Weise vor, indem Sie die zweite Elektroporationsmischung (z. B. GOI) verwenden.
      HINWEIS: Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1-3.2.5, bis die gewünschte Anzahl elektroporierter zerebraler Organoide erreicht ist.
    6. Wenn die Mikroinjektion und die Elektroporation unter unsterilen Bedingungen durchgeführt wurden, überführen Sie die elektroporierten Organoide in eine sterile 35-mm-Zellkulturschale unter einer Laminar-Flow-Haube und bewegen Sie so wenig DMEM/F12 wie möglich in die neue Zellkulturschale.
  3. Weitere Kultivierung und Fixierung von zerebralen Organoiden
    1. Kultur der elektroporierten Organoide in DM mit Vitamin A auf einem Orbitalschüttler bei 55 U/min in einer humifizierten Atmosphäre von 5 % CO2 und 95 % Luft bei 37 °C.
    2. Am nächsten Tag nach der Elektroporation werden die zerebralen Organoide unter einem herkömmlichen inversen Fluoreszenzmikroskop auf erfolgreiche Elektroporation überprüft.
      HINWEIS: Abhängig von der Länge der weiteren Kultur nach der Elektroporation sind unterschiedliche Zellpopulationen innerhalb des zerebralen Organoids betroffen (siehe auch den Abschnitt Repräsentative Ergebnisse).
    3. Fahren Sie mit nachgelagerten Anwendungen fort, nachdem Sie die elektroporierten zerebralen Organoide für einen Zeitraum kultiviert haben, der für die interessierende biologische Fragestellung geeignet ist.
      HINWEIS: Elektroporierte zerebrale Organoide können für verschiedene nachgelagerte Anwendungen verarbeitet werden (z. B. Fixierung für Immunfluoreszenzfärbung oder Schnellverschluss für RNA-Isolierung und qRT-PCR). Hier beschreiben wir die Fixierung von elektroporierten zerebralen Organoiden.
    4. Übertragen Sie die elektroporierten Organoide mit einer abgeschnittenen 1.000-μl-Pipettenspitze in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen und entfernen Sie überschüssiges Medium.
    5. Fügen Sie eine ausreichende Menge 4%iges Paraformaldehyd (PFA) in DPBS (pH 7,5) hinzu und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
      ACHTUNG: PFA ist als krebserregend für den Menschen eingestuft und kann irreparable Gesundheitsschäden verursachen. Zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen wie Nitrilhandschuhe und -schutzbrillen werden dringend empfohlen.
    6. Saugen Sie die PFA ab, fügen Sie 5 ml DPBS hinzu, schütteln Sie sie ein wenig und saugen Sie die DPBS ab. Wiederholen Sie dies 2x. Lagern Sie die Organoide bis zur weiteren Verwendung in DPBS bei 4 °C.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden, da PFA-fixierte Hirnorganoide mehrere Monate bei 4 °C gelagert werden können. PFA-fixierte elektroporierte Organoide können durch Kryosektion und Immunfluoreszenzfärbung10,28 oder durch Whole-Mount-Färbung und -Clearing35,36 analysiert werden. Beispielbilder finden Sie im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" (Details zu den Antikörpern finden Sie in Tabelle 4).

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Representative Results

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die effiziente Generierung von zerebralen Organoiden aus humanen, Schimpansen-, Rhesusaffen- und Weißbüschelaffen-iPSC-Linien mit minimalen zeitlichen Änderungen, die zwischen den Arten erforderlich sind (Abbildung 1A). Diese Organoide können im Bereich von 20 dps bis 50 dps elektroporiert werden, abhängig von der Zugänglichkeit der ventrikelartigen Strukturen und der Häufigkeit der interessierenden Zellpopulation(en). Vor der Elektroporation ist es jedoch wichtig festzustellen, ob die zerebralen Organoide von ausreichender Qualität sind, um elektroporiert zu werden.

Ein zerebrales Organoid, das sich ideal für die Elektroporation eignet, sollte ausgeprägte helle ventrikelartige Strukturen an der Peripherie, keine Anzeichen von Degeneration (z. B. sich ablösende Zellen, vergrößerter apoptotischer Kern) und eine allgemein kompakte gesunde Morphologie (z. B. kein übermäßiges Wachstum) aufweisen (Abbildung 1B, "Go"). Es ist vorzuziehen, zerebrale Organoide mit großen, gut organisierten, ventrikelähnlichen Strukturen zu wählen, um eine höhere Anzahl von Zellen anzusprechen. Wenn die periphere Zone eines Organoids dunkel ist und keine hervorstehenden Strukturen aufweist, wird empfohlen, sie nicht für die Elektroporation zu verwenden, da die präzisen Mikroinjektionen durch das Fehlen visueller Hinweise beeinträchtigt werden können (Abbildung 1B, "No-go"). Um eine optimale Morphologie der zerebralen Organoide zu erreichen, ist es wichtig sicherzustellen, dass kritische Schritte wie die Induktion des Neuroektoderms und die Matrixeinbettung gut getimt sind. Probleme, die die Morphologie der zerebralen Organoide betreffen, haben typischerweise ihren Ursprung in der fehlerhaften Bildung von Neuroektodermen und/oder neuroepithelialen Knospen. Dies wird in der Regel durch ein suboptimales Timing der neuronalen Induktion und/oder der Einbettung der Basalmembranmatrix verursacht und kann durch Anpassung des Timings dieser Schritte behoben werden (weitere Tipps zur Fehlerbehebung bei der Bildung von zerebralen Organoiden finden sich in Lancaster und Knoblich34).

Nach der Elektroporation kann eine erste Beurteilung des Erfolgs und der Effizienz nach 12 h erfolgen, wenn die GFP-Expression der transfizierten Zellen unter einem konventionellen inversen Fluoreszenzmikroskop nachweisbar wird. Im Idealfall emittieren in diesem Stadium mehrere ventrikelähnliche Strukturen hellgrüne Fluoreszenz, die auf einer ihrer Seiten lokalisiert ist (Abbildung 2A). Dies deutet auf die hohe Präzision und Effizienz des Verfahrens hin. Erfolgreich elektroporierte zerebrale Organoide der vier verschiedenen Primatenarten (d.h. Mensch, Schimpanse, Rhesusaffe und Weißbüschelaffe) zeigen ähnliche GFP-positive Muster innerhalb der anvisierten ventrikelartigen Strukturen (Abbildung 2A). Darüber hinaus zeigen nach der Fixierung und Kryosektion von elektroporierten Primaten-Hirnorganoiden erfolgreich elektroporierte ventrikelartige Strukturen aller vier Spezies Säulen von GFP-positiven Zellen innerhalb der radial organisierten und dicht gepackten ventrikulären Zone (VZ) (Abbildung 2B). Die Quantifizierung der DAPI-positiven Zellen, die in solchen Regionen der Schimpansen- und Weißbüschelaffen-Hirnorganoide 2 Tage nach der Elektroporation ebenfalls GFP-positiv waren (17 Ventrikel von 12 Organoiden quantifiziert), zeigte, dass im Durchschnitt etwa ein Drittel der Zellen (33%, SD ± 12%) erfolgreich elektroporiert wurden.

Suboptimale Elektroporationen werden entweder durch eine kleine Anzahl von GFP-positiven Zellen innerhalb der ventrikelartigen Struktur (Abbildung 3A) oder durch einige GFP-positive Zellen gekennzeichnet, die von einer ventrikelähnlichen Struktur entfernt sind (Abbildung 3B). Eine geringe Anzahl GFP-positiver Zellen wird durch eine schlechte Plasmidaufnahme verursacht. Dies kann entweder auf eine niedrige Plasmidkonzentration zurückzuführen sein, die durch eine unzureichende Menge an mikroinjizierter Elektroporationsmischung verursacht wird, oder auf elektrische Impulse, die nicht gut gerichtet sind, was durch eine suboptimale Positionierung der zerebralen Organoide in der Petrischale-Elektrodenkammer verursacht werden kann. Eine geringe Anzahl von GFP-positiven Zellen, die von einer ventrikelähnlichen Struktur entfernt sind, wird durch die Elektroporation postmitotischer Zellen innerhalb des zerebralen Organoids (z. B. Neuronen) aufgrund einer ungenauen Mikroinjektion verursacht. Diese suboptimalen Elektroporationen müssen von weiteren Analysen ausgeschlossen werden.

Die zuverlässige Identifizierung der in zerebralen Organoiden vorhandenen Zelltypen basiert unter anderem auf der Zellposition innerhalb einer ventrikelartigen Struktur, was eine Grenzdefinition zwischen VZ und SVZ/Neuronen-angereicherter Zone erfordert. Diese Grenze kann durch die radiale Organisation und die hohe Zellkerndichte des VZ identifiziert werden (siehe DAPI-Färbung in der ergänzenden Abbildung S1). Die Bestätigung der VZ/SVZ-Grenze kann durch Immunfluoreszenzfärbung für neurale Vorläufermarker wie PAX6 oder SOX2 erfolgen, die von praktisch allen VZ-Zellen (APs) und einigen SVZ-Zellen (BPs) exprimiert werden. Das Vorhandensein einer mit Neuronen angereicherten Zone kann durch Immunfluoreszenzfärbung für neuronale Marker wie Klasse III β-Tubulin (TUJ1) oder NeuN validiert werden (ergänzende Abbildung S1).

Die Dauer der zerebralen Organoidkultur nach der Elektroporation hängt von der biologischen Fragestellung und den interessierenden Zellpopulationen ab. In einer kürzlich durchgeführten Studie konnte gezeigt werden, dass unterschiedliche Längen der weiteren Kultur nach der Elektroporation unterschiedliche Zellpopulationen in zerebralen Organoiden von Schimpansen beeinflussen, die von APs bis hin zu Neuronen der oberen Schicht reichen24. Hier zeigen wir ähnliche Ergebnisse für elektroporierte Weißbüschelaffen-Organoide. Konkret sind GFP-positive Zellen 2 Tage nach der Elektroporation fast ausschließlich in der VZ lokalisiert und auch positiv für PAX6 – einen Marker für neuronale Vorläuferzellen – was darauf hinweist, dass es sich bei diesen Zellen um APs oder neugeborene BPs handelt (Abbildung 4A). Verlängert man die Kulturperiode nach der Elektroporation auf 10 Tage, so sind GFP-positive Zellen in den basalen Regionen (d.h. der SVZ und der mit Neuronen angereicherten Zone) lokalisiert (Abbildung 4B,C). Diese Zellen können (zusätzlich zum GFP-Signal) auch positiv für PAX6 (Abbildung 4B) sein, was auf BPs hinweist, oder NeuN (Abbildung 4C), was auf Neuronen hinweist. Ähnliche Ergebnisse können für humane und Rhesusaffen-elektroporierte Hirnorganoide erzielt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass verschiedene Vorläufertypen sowie Neuronen mit dieser Technik erfolgreich angegriffen werden können.

Fast alle bisher gezeigten Daten stammen aus der Immunfärbung histologischer Schnitte, die aus elektroporierten zerebralen Organoiden generiert wurden. Eine weitere elegante Möglichkeit, diese Organoide zu analysieren, ist die Durchführung einer Whole-Mount-Immunfärbung mit anschließender optischer Klärung35,36. Dies würde eine 3D-Rekonstruktion der elektroporierten Hirnorganoide ermöglichen, um einen Eindruck von der 3D-Verteilung der GFP-positiven Zellen zu erhalten. Abbildung 5 und Video 1 zeigen ein repräsentatives Beispiel des GFP-Signals in einem optisch geklärten, elektroporierten zerebralen Organoid.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier beschriebene Elektroporationsprotokoll eine präzise und effiziente Möglichkeit bietet, transiente genetische Modifikationen in verschiedene Vorläufertypen und Neuronen von zerebralen Organoiden einzuführen, die aus verschiedenen Primaten-iPSC-Linien stammen.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Übersicht über die Erzeugung von Hirnorganoiden bei Primaten und morphologische "Go"- und "No-Go"-Kriterien für die Elektroporation. (A) Zeitleiste der Erzeugung und Elektroporation von Hirnorganoiden von Primaten, wobei die unterschiedlichen Zeitpunkte der Protokollschritte für Mensch und Schimpanse (blau), Rhesusaffe (violett) und Weißbüschelaffe (magenta) hervorgehoben werden. Beachten Sie, dass die Chronologie der Zeitachse nicht maßstabsgetreu ist. (B) Hellfeldbilder eines geeigneten (linkes Bild, Go) und eines ungeeigneten (rechtes Bild, No-go) 32 dps menschlichen Hirnorganoids. Die Pfeilspitzen zeigen Beispiele für geeignete ventrikelartige Strukturen für die Mikroinjektion. Die Bilder wurden mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop Zeiss Axio Observer.Z1 mit einem 2,5-fachen Objektiv aufgenommen. Maßstabsbalken = 500 μm. Abkürzungen: BDNF = brain-derived neurotrophic factor; dps = Tage nach der Aussaat; NT3 = Neurotrophin 3; RA = Retinsäure. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Beispiele für erfolgreich elektroporierte Hirnorganoide von Primaten. (A) Hellfeld (linke Spalte), Fluoreszenz (mittlere Spalte) und Zusammenführung (rechte Spalte) Bilder von 22 dps Menschen-, 32 dps Schimpansen-, 32 dps Rhesusaffen- und 31 dps Weißbüschelaffen-Hirnorganoiden (von oben nach unten) 15-48 h nach Elektroporation mit dem GFP-exprimierenden Plasmid. Die schwarzen Pfeilspitzen deuten auf Beispiele für einzelne elektroporierte ventrikelartige Strukturen hin. Die Bilder wurden mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop Zeiss Axio Observer.Z1 mit einem 2,5-fachen Objektiv aufgenommen. Maßstabsbalken = 500 μm. (B) Immunfluoreszenz für GFP (grün) kombiniert mit DAPI-Färbung (cyan) von 32 dps menschlichen, 34 dps Schimpansen, 32 dps Rhesusaffen und 32 dps Weißbüschelaffen-Hirnorganoiden (von oben nach unten) 2-4 Tage nach der Elektroporation mit dem GFP-exprimierenden Plasmid. Die hellgrauen Pfeilspitzen zeigen die Ränder der elektroporierten Regionen innerhalb der ventrikelartigen Strukturen an. Die Aufnahmen wurden mit einem konfokalen Zeiss LSM 800 Mikroskop mit 10-fach Objektiv aufgenommen. Maßstabsbalken = 150 μm. Abkürzungen: DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; dps = Tage nach der Aussaat; GFP = grün fluoreszierendes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Beispiele für erfolglos elektroporierte Hirnorganoide von Primaten. (A,B) Immunfluoreszenz für GFP (grün) kombiniert mit DAPI-Färbung (cyan) eines (A) 34 dps Rhesusaffen-Hirnorganoids 4 Tage nach Elektroporation mit dem GFP-exprimierenden Plasmid und von (B) eines 32 dps Rhesusaffen-Hirnorganoids 2 Tage nach Elektroporation mit dem GFP-exprimierenden Plasmid. Die hellgrauen Pfeilspitzen deuten auf elektroporierte Zellen hin. Der hellgrau gestrichelte Umriss zeigt die Grenze zwischen der VZ- und der SVZ/Neuronen-angereicherten Zone einer ventrikelartigen Struktur an, die an die elektroporierten Zellen angrenzt. Die Aufnahmen wurden mit einem konfokalen Zeiss LSM 800 Mikroskop mit 10-fach Objektiv aufgenommen. Maßstabsbalken = 150 μm. Abkürzungen: DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; dps = Tage nach der Aussaat; GFP = grün fluoreszierendes Protein; SVZ = subventrikuläre Zone; VZ = ventrikuläre Zone. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Visualisierung der verschiedenen Zellpopulationen, die in Hirnorganoiden von Primaten nach der Elektroporation vorhanden sind. (A-C) Doppelte Immunfluoreszenz für GFP (grün) und entweder PAX6 (A,B; magenta) oder NeuN (C; magenta), in allen Fällen kombiniert mit DAPI-Färbung (cyan), eines (A) 32 dps Weißbüschelaffen-Hirnorganoids 2 Tage nach Elektroporation mit dem GFP-exprimierenden Plasmid und (B,C) eines 40 dps Weißbüschelaffen-Hirnorganoids 10 Tage nach Elektroporation mit dem GFP-exprimierenden Plasmid. Die hellgrauen Pfeilspitzen zeigen (A,B) GFP+ und PAX6+ oder (C) NeuN+ doppelpositive Zellen an. Die hellgrau gestrichelten Linien zeigen die Grenze zwischen VZ und SVZ/Neuronen-angereicherter Zone an. Die Aufnahmen wurden mit einem konfokalen Zeiss LSM 800 Mikroskop mit 20-fach Objektiv aufgenommen. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzungen: DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; dps = Tage nach der Aussaat; GFP = grün fluoreszierendes Protein; NeuN = neuronales Kernprotein; PAX6 = gepaartes Box-6-Protein; SVZ = subventrikuläre Zone; VZ = ventrikuläre Zone. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Dreidimensionale Rekonstruktion elektroporierter Bilder mittels konfokaler 3D-Bildgebung von elektroporierten Primaten-Hirnorganoiden nach optischer Reinigung. Frontalansicht (linkes Bild), 45° gedreht (mittleres Bild) und 90° gedreht (rechtes Bild) eines 3D-rekonstruierten elektroporierten 32 dps humanen Hirnorganoids 2 Tage nach der Elektroporation mit dem GFP-exprimierenden Plasmid. Vor der Bildgebung wurde das Organoid auf der Grundlage der 2Eci-Methode35 optisch gereinigt. Eine 3D-Rekonstruktion des gesamten elektroporierten Organoids wurde aus 269 optischen Schnitten (je 1 μM Dicke) erstellt, die 3,73 μm voneinander entfernt sind, wobei ein konfokales Zeiss LSM 800 Mikroskop mit einem 10x-Objektiv verwendet wurde. Die Bilder wurden für die 3D-Rekonstruktion mit Fidschi bearbeitet. Beachten Sie, dass die Bilder von demselben 3D-rekonstruierten Organoid stammen, das in Video 1 gezeigt wird. Maßstabsbalken = 500 μm. Abkürzung: GFP = grün fluoreszierendes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Video 1: Ein 3D-rekonstruiertes elektroporiertes humanes Hirnorganoid nach optischer Reinigung. Video eines 3D-rekonstruierten elektroporierten 32 dps humanen Hirnorganoids 2 Tage nach der Elektroporation mit dem GFP-exprimierenden Plasmid. Vor der Bildgebung wurde das Organoid auf der Grundlage der 2Eci-Methode35 optisch gereinigt. Eine 3D-Rekonstruktion des gesamten elektroporierten Organoids wurde aus 269 optischen Schnitten (je 1 μM Dicke) erstellt, die 3,73 μm voneinander entfernt sind, wobei ein konfokales Zeiss LSM 800 Mikroskop mit einem 10x-Objektiv verwendet wurde. Die Bilder wurden für die 3D-Rekonstruktion mit Fidschi bearbeitet. Beachten Sie, dass das Video von demselben 3D-rekonstruierten Organoid aufgenommen wurde, das in Abbildung 5 gezeigt ist. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

iPSC-Linie Spezies Veröffentlichung Zusammensetzung des Nährmediums Kulturelle Bedingungen
iLonza2.2 Menschheit Stauske et al., 2020 1 μM IWR1 und 0,5 μM CHIR im StemMACS iPS-Brew XF Humifizierte Atmosphäre aus 5% CO2 und 95% Luft, 37 °C
SandraA Pan troglodytes Mora-Bermúdez et al., 2016 mTeSR1 Humifizierte Atmosphäre aus 5% CO2 und 95% Luft, 37 °C
iRh33.1 Macaca Mulatta Stauske et al., 2020 1 μM IWR1 und 0,5 μM CHIR im StemMACS iPS-Brew XF Humifizierte Atmosphäre aus 5% CO2 und 95% Luft, 37 °C
cj_160419_5 Callithrix jacchus Petkov et al., 2020 3 μM IWR1, 0,3 μM CGP77675, 0,3 μM AZD77675, 0,5 μM CHIR99021, 10 μM Forskolin, 1 ng/ml Activin A, 1 μM OAC1 in StemMACS iPS-Brew XF verdichtete Atmosphäre von 5 % CO 2, 5 %O2 und 90 % N2, 37 °C

Tabelle 1: Kulturbedingungen für die in dieser Publikation verwendeten Primaten-iPS-Zellen. Abkürzung: iPSCs = induzierte pluripotente Stammzellen.

Mittel Zusammensetzung
Neuronales Induktionsmedium 1x N-2-Ergänzung, 1x Glutamin-Ersatz-Ergänzung, 1x MEM-Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren, 1 μg/ml Heparin in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium F12 (DMEM/F12)
Differenzierungsmedium (TM) ohne Vitamin A 0,5x B-27-Ergänzung (abzüglich Vitamin A), 0,5x N-2-Ergänzung, 0,5x MEM-Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren, 1x Glutaminersatz-Ergänzung, 100 U/ml Penicillin-Streptomycin, 0,00035% 2-Mercaptoethanol, 2,875 ng/ml Insulin in 1:1 DMEM/F12 und neurobasales Medium
Differenzierungsmedium (TM) mit Vitamin A 0,5x B-27-Supplement, 0,5x N-2-Supplement, 0,5x MEM-Lösung mit nicht-essentiellen Aminosäuren, 1x Glutamin-Ersatz-Supplement, 100 U/ml Penicillin-Streptomycin, 0,00035% 2-Mercaptoethanol, 2,875 ng/ml Insulin in 1:1 DMEM/F12 und neurobasales Medium

Tabelle 2: Zusammensetzung der Medien, die für die Erzeugung und Kultur von Hirnorganoiden von Primaten verwendet werden.

Bestandteil Elektroporationsmischung kontrollieren GOI Elektroporationsmischung
GFP-Expressions-Plasmid 500 ng/μL 500 ng/μL
Leerer Vektor 500 ng/μL -
GOI-Expressions-Plasmid - 500 ng/μL
Schnelles Grün 0.10% 0.10%
in DPBS

Tabelle 3: Zusammensetzung der Elektroporationsmischung (separater Plasmidansatz) für die Kontrolle und das interessierende Gen. Abkürzung: GOI = Gen of Interest.

Antikörper Firma Katalognummer RRID Verdünnung
Huhn anti GFP Aves Labore GFP-1020 RRID:AB_10000240 1:300
Kaninchen anti PAX6 Novus Biologicals NBP1-89100 RRID:AB_11013575 1:300
Kaninchen anti NeuN Abcam AB104225 RRID:AB_10711153 1:300
Ziege Anti-Huhn Alexa Fluor 488 Thermo Fisher A-11039 RRID:AB_142924 1:500
Esel Anti Kaninchen Alexa Fluor 555 Thermo Fisher A-31572 RRID:AB_162543 1:500

Tabelle 4: Antikörper für die Immunfluoreszenzfärbung.

Ergänzende Abbildung S1: VZ/SVZ-Grenzbestimmung in elektroporierten Primaten-Hirnorganoiden. Doppelte Immunfluoreszenz für PAX6 (magenta) und TUJ1 (gelb) kombiniert mit DAPI-Färbung (cyan) eines 32 dps Weißbüschelaffen-Hirnorganoids 2 Tage nach Elektroporation mit dem GFP-exprimierenden Plasmid. Die Immunfluoreszenz für GFP ist nicht dargestellt. Die hellgrau gestrichelten Linien zeigen die Grenze zwischen VZ und SVZ/Neuronen-angereicherter Zone an. Die Aufnahmen wurden mit einem konfokalen Zeiss LSM 800 Mikroskop mit 20-fach Objektiv aufgenommen. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzungen: DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; dps = Tage nach der Aussaat; PAX6 = gepaartes Box-6-Protein; SVZ = subventrikuläre Zone; TUJ1 = Klasse III β-Tubulin; VZ = ventrikuläre Zone. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 1: Montageanleitung für die Elektroporationskammer der Petrischale. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Die hier beschriebenen Verfahren stellen ein einheitliches Protokoll für die Erzeugung von zerebralen Organoiden aus verschiedenen Primatenarten mit einem gezielten Elektroporationsansatz dar. Dies ermöglicht die ektopische Expression eines GOI in einem Modellsystem, das die (patho)physiologische Neokortexentwicklung von Primaten (einschließlich des Menschen) nachahmt. Dieses einheitliche Protokoll für die Erzeugung von Hirnorganoiden von Primaten verwendet für alle vier vorgestellten Primatenarten die gleichen Materialien (z.B. Medien) und Protokollschritte. Entwicklungsunterschiede zwischen diesen Spezies werden durch die Änderung des Timings kritischer Protokollschritte (d.h. der neuronalen Induktion und Einbettung in die Basalmembranmatrix; siehe oben) adressiert. Dies könnte in etwa die zeitlichen Unterschiede in vivo der neurologischen Entwicklung zwischen diesen Spezies widerspiegeln und stellt ein interessantes Thema für weitere Studien dar.

Dieser Ansatz basiert auf den Elektroporationsexperimenten, die in einer früheren Arbeit über zerebrale Organoidebeschrieben wurden 10. Diese Experimente waren jedoch, wie Lancaster und Kollegen feststellten, durch ein hohes Maß an Apoptose begrenzt, das aufgrund einer hohen GFP-Konzentration auftrat und zum Ausschluss der elektroporierten Zellen führte, die ein starkes GFP-Signal aufwiesen10. In unseren Experimenten haben wir festgestellt, dass eine endgültige Gesamtplasmidkonzentration (z.B. EGFP-kodierende Plasmidkonzentration plus GOI-kodierende Plasmidkonzentration) von 1.000 ng/μL optimal ist. Konzentrationen unter 1.000 ng/μl führen zu einer verminderten Elektroporationseffizienz, während hohe Konzentrationen über 1.000 ng/μl toxisch für die elektroporierten Zellen sein und zum Zelltod führen können10. Studien, die mehr als zwei verschiedene Expressionsplasmide kombinieren, sind möglich28. Die endgültige Gesamtplasmidkonzentration sollte jedoch bei 1.000 ng/μl gehalten werden.

In einem typischen Elektroporationsansatz wird ein Plasmid benötigt, das für einen Fluoreszenzmarker kodiert, um die erfolgreich elektroporierten Zellen zu identifizieren. Es gibt zwei Möglichkeiten, den Fluoreszenzmarker in den Versuchsaufbau einzubeziehen: (i) durch Co-Injektion von zwei separaten Plasmiden (d. h. ein Plasmid, das für den Marker kodiert, plus ein Kontrollplasmid [z. B. leerer Vektor] oder ein Plasmid, das für das interessierende Gen kodiert [GOI]) (der Ansatz der getrennten Plasmide); ii) durch Injektion eines Plasmids, das sowohl für den Marker als auch für die indonesische Regierung kodiert, unter Verwendung einer internen Ribosomeneintrittsstelle (IRES) oder eines selbstspaltenden 2A-Peptids (z. B. P2A) ( Einzelplasmidansatz). In diesem Fall wird ein Plasmid, das ausschließlich für den Fluoreszenzmarker kodiert, als Kontrolle verwendet. Während der Einzelplasmidansatz zu einer vollständigen Koexpression des Fluoreszenzmarkers und der GOI führt, sind solche Plasmide groß, was zu einer geringen Elektroporationseffizienz führt. Wenn eine hohe Elektroporationseffizienz erforderlich ist, wird empfohlen, den Ansatz der getrennten Plasmide zu verwenden, da die getrennte Expression den Grad der Koexpression des Fluoreszenzmarkers und des GOI nicht signifikant beeinflusst, während eine hohe Elektroporationseffizienz beibehalten wird28. In dem hier vorgestellten Protokoll beschreiben wir die Elektroporation mit Hilfe des Separat-Plasmid-Ansatzes. Wenn der Einzelplasmid-Ansatz angewendet wird, müssen die Schritte im Protokoll entsprechend angepasst werden.

Im Vergleich zu einem kürzlich veröffentlichten Protokoll37 hat unser Ansatz drei wesentliche Vorteile. Zunächst zielen wir gezielt auf die ventrikelartigen Strukturen des Hirnorganoids ab. Dies erreichen wir (i) durch Mikroinjektion der einzelnen ventrikelartigen Strukturen des zerebralen Organoids, anstatt in das Zentrum des Organoids 37 zu injizieren, und (ii) indem wir die Orientierung des zerebralen Organoids in der Petrischale-Elektrodenkammer so anordnen, dass die Richtung des elektrischen Feldes optimiert wird (siehe oben), anstatt eine Elektroporationsküvette37 zu verwenden. Zweitens wird bei diesem Protokoll keine teure Nukleofektorlösung verwendet, da bei diesem Ansatz ein Rechteck-Elektroporator in Kombination mit einer Petrischale-Elektrodenkammer verwendet wird. Drittens ermöglicht dieses einheitliche Protokoll für die Erzeugung von Hirnorganoiden von Primaten nicht nur die Untersuchung menschlicher, sondern auch nicht-menschlicher Primaten-Organoide, was evolutionäre, vergleichende und krankheitsbezogene Studien ermöglicht.

Zwei Merkmale der zerebralen Organoide sind entscheidend für eine erfolgreiche Elektroporation – die Qualität der zerebralen Organoide und die Größe und Qualität der ventrikelähnlichen Strukturen (siehe die repräsentativen Ergebnisse und Abbildung 1B). In Bezug auf das erste Merkmal stellen wir Go- und No-Go-Kriterien (siehe oben und Abbildung 1B) für das Fortfahren mit der Elektroporation vor. Das Hauptkriterium ist das Vorhandensein von deutlich sichtbaren, transluzenten und radial organisierten ventrikelartigen Strukturen. Die Größe der ventrikelartigen Strukturen ist das zweite entscheidende Merkmal für eine erfolgreiche Mikroinjektion und Elektroporation. Zu kleine ventrikelartige Strukturen lassen sich nur schwer injizieren und liefern in der Regel keine ausreichend hohe Anzahl an elektroporierten Zellen für nachfolgende Analysen. Dies ist der Hauptgrund, warum wir ein modifiziertes zerebrales Organoid-Protokoll verwendet haben, da dieses Protokoll in unseren Händen und für diese iPSC-Linien im Vergleich zu anderen Protokollen gut organisierte ventrikelähnliche Strukturen erzeugt, die groß genug sind, um elektroporiert zu werden. Prinzipiell kann der hier vorgestellte Elektroporationsansatz auf jedes andere neuronale Organoid-Protokoll angewendet werden, solange dieses ausreichend große und organisierte ventrikelähnliche Strukturen ergibt (siehe die repräsentativen Ergebnisse und Abbildung 1B). Darüber hinaus könnte dieses Protokoll in Zukunft auch auf andere Primaten angewendet werden, wie zum Beispiel auf den Krabbenmakaken (Macaca fascicularis), das klassische Primatenmodell, das in der industriellen Forschung verwendet wird. Dies würde entweder die Identifizierung der korrekten kritischen Zeitpunkte (s.o.) des hier beschriebenen modifizierten zerebralen Organoid-Protokolls oder die Etablierung eines neuronalen organoiden Protokolls erfordern, das geeignete großventrikelartige Strukturen hervorbringt (s.o.).

Nach erfolgreicher Elektroporation können die zerebralen Organoide für unterschiedliche Zeiträume weiter kultiviert werden, damit die untersuchte genetische Veränderung die verschiedenen Zellpopulationen innerhalb des sich entwickelnden zerebralen Organoids beeinflussen kann. Diese reichen von den verschiedenen neuronalen Vorläuferpopulationen bis hin zu den verschiedenen Arten von Neuronen, die im zerebralen Organoid vorhanden sind (siehe die repräsentativen Ergebnisse und Fischer et al.28). Diese Zellpopulationen können dann entweder durch Kryoschnitt und Immunfluoreszenzfärbung (siehe Abbildung 4) oder durch Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung und optisches Clearing (siehe Abbildung 5 und Video 1) der PFA-fixierten elektroporierten zerebralen Organoide analysiert werden.

Bisher wurde die Elektroporation von Hirnorganoiden hauptsächlich für die ektopische Expression von Genen verwendet, um Genfunktionsstudien 10,28,38,39, Live-Bildgebung 10,39,40, die Visualisierung der Zellmorphologie40 und Zellteilungsverfolgung 10 durchzuführen. In der ersten zerebralen Organoid-Veröffentlichung wurde shRNA jedoch durch Elektroporation in Organoide eingebracht, um die Genexpression durch RNA-Interferenz zum Schweigen zu bringen. Dies zeigte das Potenzial der Elektroporation, nicht nur für die ektopische Expression von Genen, sondern auch für die KD oder sogar KO von Genen genutzt zu werden. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass CRISPR/Cas9-vermittelte KOs durch die in utero Elektroporation von Mausembryonen27 und die Elektroporation von fötalem menschlichem Gewebe ex vivo41 erreicht werden können. Solche CRISPR/Cas9-basierten KOs könnten leicht auf die Elektroporation von zerebralen Organoiden angewendet werden, da der Hauptmechanismus der Elektroporation derselbe ist, und dies würde die Nützlichkeit dieses Ansatzes weiter erweitern.

Eine mögliche weitere Anwendung der Elektroporation in zerebralen Organoiden ist die Rettung spezifischer KO-Phänotypen in Fällen, in denen es aufgrund sehr ähnlicher Sequenzen zwischen der indonesischen Regierung und ihren angestammten Versionen nicht möglich ist, einen spezifischen KO der indonesischen Regierung zu erhalten. Dies gilt insbesondere für neu entwickelte humanspezifische Gene. In solchen Fällen ist es (auch mit der CRISPR/Cas9-Technologie) nicht möglich, einen spezifischen KO zu erhalten (wie es bei ARHGAP11A und ARHGAP11B28 der Fall war). Eine Lösung für dieses Dilemma besteht darin, einen doppelten KO der indonesischen Regierung und ihres angestammten Gens zu erzeugen und die indonesische Regierung allein, das ursprüngliche Gen allein oder beide Gene zusammen durch Elektroporation zu retten. Diese elektroporierten Organoide könnten dann als selektives Ahnengen-KO, selektives GOI-KO bzw. Kontrollgen betrachtet werden. Dies würde es ermöglichen, die individuellen Beiträge dieser Gene zum Phänotyp zu adressieren (siehe z.B. Fischer et al.28). Eine weitere mögliche Anwendung ist die Analyse von zerebralen Organoiden, die aus patienteneigenen iPS-Zellen generiert werden. In solchen Fällen ist nicht klar, ob der beobachtete Phänotyp auf eine Mutation im Kandidatengen oder auf eine andere beim Patienten vorhandene Mutation zurückzuführen ist. Hier würde die Elektroporation des Kandidatgens und die (potenzielle) Rettung des Phänotyps es erlauben, die Rolle dieses Gens in der Erkrankung zu validieren (siehe z.B. Lancaster et al.10).

Zusammenfassend bietet das hier vorgestellte Protokoll einen schnellen und kostengünstigen Ansatz, um Zellpopulationen innerhalb der ventrikelartigen Strukturen von Hirnorganoiden von Primaten genetisch zu verändern. Dies bietet ein effektives Werkzeug für die Untersuchung neurologischer Entwicklungs- und Evolutionsprozesse, das auch für die Modellierung von Krankheiten verwendet werden kann.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Acknowledgments

Wir entschuldigen uns bei allen Forschenden, deren Arbeiten aus Platzgründen nicht zitiert werden konnten. Wir danken Ulrich Bleyer vom Technischen Dienst am DPZ und Hartmut Wolf vom Workshop am MPI-CBG für den Bau der Petrischale-Elektrodenkammern; Stoyan Petkov und Rüdiger Behr für die Bereitstellung von humanen (iLonza2.2), Rhesusaffen (iRh33.1) und Weißbüschelaffen (cj_160419_5) iPSCs; Sabrina Heide für die Kryosektion und Immunfluoreszenzfärbung; und Neringa Liutikaite und César Mateo Bastidas Betancourt für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die Arbeit im Labor von W.B.H. wurde durch ein ERA-NET NEURON (MicroKin) Stipendium unterstützt. Die Arbeit im Labor von M.H. wurde durch einen ERC Starting Grant (101039421) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 µL Microloader Eppendorf 5242956003
2-Mercaptoethanol Merck 8.05740.0005
35 mm cell culture dishes Sarstedt 83.3900
60 mm cell culture dishes CytoOne CC7682-3359
Activin A Sigma-Aldrich SRP3003
AOC1 Selleckchem S7217
Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope Zeiss replacable by comparable fluorescent microscopes
AZD0530 Selleckchem  S1006
B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) Gibco 17504-044
B-27 Supplement without Vitamin A (50x) Gibco 12587-010
BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System BTX 45-2052
CGP77675 Sigma-Aldrich SML0314
Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A doi: 10.7554/elife.18683 
Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 doi: 10.3390/cells9112422
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) Gibco 11320-033
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 14190-094 pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use
Fast Green Sigma-Aldrich F7252-5G
Forskolin Selleckchem 2449
GlutaMAX Supplement (100x) Gibco 35050-061 glutamine substitute supplement
Heparin (1 mg/mL stock) Sigma-Aldrich H3149
Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 doi: 10.3390/cells9061349
Human Neurotrophin-3 (NT-3) PeproTech 450-03
Insulin Sigma-Aldrich 19278
IWR1 Sigma-Aldrich I0161
Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) Leica 10473849 replacable by comparable stereomicroscopes
Matrigel Corning 354277/354234 basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Sigma-Aldrich M7145
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502-048
Neurobasal medium Gibco 21103-049
Parafilm Sigma-Aldrich P7793
Paraformaldehyde  Merck 818715 handle with causion due to cancerogenecity
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) PanBiotech P06-07100
Petri dish electrode chamber self-produced (see Supplemental File 1) also commertially available
Pre-Pulled Glass Pipettes WPI TIP10LT borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter
Pro-Survival Compound MerckMillipore 529659
Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) PeproTech AF-450-02
Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 doi: 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XF Miltenyi Biotech 130-104-368
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco A1110501 proteolytic and collagenolytic enzyme mixture
TrypLE Gibco 12604-013 recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use
Ultra-Low Attachment 96-well plates Costar 7007
Y27632 Stemcell Technologies 72305

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References

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Tynianskaia, L., Eşiyok, N., Huttner, W. B., Heide, M. Targeted Microinjection and Electroporation of Primate Cerebral Organoids for Genetic Modification. J. Vis. Exp. (193), e65176, doi:10.3791/65176 (2023).

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