Summary
אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים של פרימטים מספקת גישה מדויקת ויעילה להחדרת שינויים גנטיים חולפים לסוגי אבות ונוירונים שונים במערכת מודל הקרובה להתפתחות ניאו-קורטקס פיזיולוגי של פרימטים (פתו). זה מאפשר את המחקר של תהליכים נוירו-התפתחותיים ואבולוציוניים והוא יכול להיות מיושם גם עבור מודלים המחלה.
Abstract
קליפת המוח היא מבנה המוח החיצוני ביותר והיא אחראית על עיבוד הקלט החושי והפלט המוטורי; הוא נתפס כמקום מושבן של יכולות קוגניטיביות מסדר גבוה יותר אצל יונקים, במיוחד פרימטים. חקר תפקודי גנים במוחות של פרימטים הוא מאתגר מסיבות טכניות ואתיות, אך הקמת טכנולוגיית אורגנואיד המוח אפשרה לחקור את התפתחות המוח במודלים מסורתיים של פרימטים (למשל, מקוק רזוס ומרמוסט מצוי), כמו גם במינים של פרימטים שלא היו נגישים בעבר בניסוי (למשל, קופי אדם גדולים), במערכת מוצדקת מבחינה אתית ופחות תובענית מבחינה טכנית. יתר על כן, אורגנואידים במוח האנושי מאפשרים חקירה מתקדמת של הפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירולוגיות.
מאחר שאורגנואידים במוח משחזרים תהליכים רבים של התפתחות המוח, הם גם מהווים כלי רב-עוצמה לזיהוי הבדלים ולהשוואה תפקודית בין הגורמים הגנטיים העומדים בבסיס התפתחות המוח של מינים שונים בהקשר אבולוציוני. יתרון גדול של שימוש באורגנואידים הוא האפשרות להכניס שינויים גנטיים, המאפשרים בדיקה של תפקודי גנים. עם זאת, המבוא של שינויים כאלה הוא מייגע ויקר. מאמר זה מתאר גישה מהירה וחסכונית לשינוי גנטי של אוכלוסיות תאים בתוך מבנים דמויי חדרים של אורגנואידים מוחיים של פרימטים, תת-סוג של אורגנואידים במוח. שיטה זו משלבת פרוטוקול שונה לייצור אמין של אורגנואידים מוחיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) שמקורם במרמוסט ונפוצים שמקורם במרמוסט עם גישת מיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה. זה מספק כלי יעיל לחקר תהליכים נוירו-התפתחותיים ואבולוציוניים שניתן ליישם גם עבור מודלים של מחלות.
Introduction
חקירת ההתפתחות והאבולוציה הפיזיולוגית (הפתולוגית) של קליפת המוח היא משימה אימתנית שמתעכבת על ידי היעדר מערכות מודל מתאימות. בעבר, מחקרים כאלה היו מוגבלים למודלים דו-ממדיים של תרביות תאים (כגון אב עצבי ראשוני או תרביות תאים עצביים) ולמודלים אבולוציוניים רחוקים של בעלי חיים (כגון מכרסמים)1,2. בעוד מודלים אלה שימושיים להתמודדות עם שאלות מסוימות, הם מוגבלים במידול המורכבות, הרכב סוג התא, הארכיטקטורה התאית ודפוסי ביטוי הגנים של הניאוקורטקס האנושי המתפתח במצבים בריאים וחולים. מגבלות אלה מובילות, למשל, ליכולת תרגום ירודה של מודלים עכבריים של מחלות אנושיות למצב האנושי, כפי שמתואר במקרים מסוימים של מיקרוצפליה (למשל, Zhang et al.3). לאחרונה, פרימטים טרנסגניים שאינם אנושיים, שהם מודל קרוב יותר מבחינה אבולוציונית, תפקודית ומורפולוגית של התפתחות הניאו-קורטקס האנושי, נכנסו למוקד 4,5,6,7,8 כשהם מתגברים על מגבלות רבות של מודלים מבוססי תרביות תאים ומכרסמים. עם זאת, השימוש בפרימטים לא אנושיים במחקר הוא לא רק יקר מאוד וגוזל זמן רב, אלא גם מעלה חששות אתיים. לאחרונה, הפיתוח של טכנולוגיית אורגנואיד המוח 9,10 התגלה כחלופה מבטיחה שפותרת רבות מהמגבלות של מודלים קודמים 11,12,13,14,15,16.
אורגנואידים במוח הם מבנים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים), רב-תאיים המחקים את המאפיינים העיקריים של הציטוארכיטקטורה והרכב התא של אזור מוח אחד או יותר עבור חלון זמן התפתחותי מוגדר 11,12,13,14,17. מבנים תלת-ממדיים אלה נוצרים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) או, אם הם זמינים עבור המינים המעניינים, מתאי גזע עובריים (ESC). באופן כללי, ניתן להבחין בין שני סוגים של אורגנואידים במוח בהתבסס על המתודולוגיה בה נעשה שימוש: אורגנואידים במוח לא מונחים ואזוריים (מונחים)18. ביצירת הסוג השני של אורגנואידים, מולקולות קטנות או גורמים מסופקים המנחים את ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים לאורגנואידים של אזור מוח מסוים (למשל, אורגנואידים במוח הקדמי)18. לעומת זאת, באורגנואידים לא מונחים, ההתמיינות אינה מונחית על ידי תוספת של מולקולות קטנות אלא מסתמכת אך ורק על התמיינות ספונטנית של iPSCs/ESCs. האורגנואידים במוח המתקבלים מורכבים מסוגי תאים המייצגים אזורי מוח שונים (למשל, אורגנואידים מוחיים)18. אורגנואידים במוח משלבים תכונות מפתח רבות של התפתחות המוח עם ייצור חסכוני יחסית וחסכוני בזמן מכל מין של עניין שעבורו iPSCs או תאי גזע עובריים מושרים זמינים11,12,13,14. זה הופך אורגנואידים במוח למודל מצוין עבור סוגים רבים של מחקרים נוירוביולוגיים, החל משאלות אבולוציוניות והתפתחותיות ועד מודלים של מחלות ובדיקות סמים15,16. עם זאת, מענה לשאלות כאלה באמצעות אורגנואידים במוח תלוי מאוד בזמינות של שיטות שונות לשינוי גנטי.
היבט מרכזי אחד של חקר ההתפתחות הפיזיולוגית של ניאו-קורטקס (פתו) והאבולוציה שלה הוא ניתוח פונקציונלי של גנים וגרסאות גנים. זה מושג בדרך כלל על ידי ביטוי (חוץ רחמי) ו / או על ידי דפיקה (KD) או נוק-אאוט (KO) של גנים אלה. שינויים גנטיים כאלה יכולים להיות מסווגים לשינוי גנטי יציב וחולף, כמו גם לשינויים להיות מוגבל זמנית ומרחבית או לא מוגבל. שינוי גנטי יציב מוגדר על ידי הכנסת שינוי גנטי לגנום המארח המועבר לכל דורות התא הבאים. בהתאם לנקודת הזמן של שינוי גנטי, זה יכול להשפיע על כל התאים של אורגנואיד או יכול להיות מוגבל לאוכלוסיות תאים מסוימות. לרוב, שינוי גנטי יציב מושג באורגנואידים במוח ברמת iPSC/ESC על ידי יישום לנטי-וירוסים, מערכות דמויות טרנספוזון וטכנולוגיית CRISPR/Cas9 (נבדקו על-ידי, למשל, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 ו-Teriyapirom et al.20). יש לכך יתרון בכך שכל תאי האורגנואיד במוח נושאים את השינוי הגנטי וכי הוא אינו מוגבל זמנית או מרחבית. עם זאת, הייצור והאפיון של קווי iPSC/ESC יציבים אלה גוזלים זמן רב, ולעתים קרובות לוקח מספר חודשים עד שניתן לנתח את אורגנואידי המוח הראשונים ששונו (נבדקו על ידי למשל, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19, or Teriyapirom et al.20).
לעומת זאת, שינוי גנטי חולף מוגדר על ידי העברת מטען גנטי (למשל, פלסמיד ביטוי גנים) שאינו משתלב בגנום המאכסן. בעוד ששינוי זה יכול, באופן עקרוני, להיות מועבר לדורות התא הבאים, המטען הגנטי המועבר ידולל בהדרגה עם כל חלוקת תא. לכן, סוג זה של שינוי גנטי מוגבל בדרך כלל באופן זמני ומרחבי. שינוי גנטי חולף יכול להתבצע באורגנואידים במוח על ידי וירוסים הקשורים באדנו או על ידי אלקטרופורציה (נבדק על ידי, למשל, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19, ו Teriyapirom et al.20), כאשר האחרון מתואר בפירוט במאמר זה. בניגוד לשינוי גנטי יציב, גישה זו היא מהירה מאוד וחסכונית. אכן, אלקטרופורציה יכולה להתבצע בתוך דקות, ובהתאם לאוכלוסיית תאי היעד, אורגנואידים מחושמלים מוכנים לניתוח תוך ימים (נבדקו על ידי, למשל, Fischer et al.17 ו- Kyrousi et al.19). עם זאת, שינויים מורפולוגיים גסים של אורגנואיד המוח, כגון הבדלים בגודל, לא ניתן לזהות באמצעות שיטה זו, כמו סוג זה של שינוי גנטי מוגבל באופן זמני ומרחבי. הגבלה זו יכולה להיות גם יתרון, למשל, במקרה של חקר אוכלוסיות תאים בודדות בתוך האורגנואיד או ההשפעות על אורגנואידים במוח בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות (שנסקרו על ידי, למשל, Fischer et al.17 ו- Kyrousi et al.19).
גישה קלאסית לחקר תפקוד גנים במהלך התפתחות המוח והאבולוציה היא אלקטרופורציה ברחם. ברחם אלקטרופורציה היא טכניקה ידועה ושימושית להעברת מבני ביטוי גנים למוחות מכרסמים 21,22,23 וחמוס24,25. ראשית, תמיסה המכילה את מבני הביטוי המעניינים מוזרקת במיקרו דרך דופן הרחם לחדר מסוים במוח העוברי, בהתאם לאזור שיש להתמקד בו. בשלב השני, פולסים חשמליים מוחלים כדי להדביק את התאים ישירות רירית החדר הממוקד. גישה זו אינה מוגבלת רק לביטוי חוץ רחמי או ביטוי יתר של גנים, כפי שהיא יכולה להיות מיושמת גם במחקרי KD או KO על ידי הזרקה זעירה של סיכת שיער קצרה (shRNA) או CRISPR/Cas9 (בצורה של פלסמידים ביטוי או ריבונוקלאו פרוטאינים [RNPs]), בהתאמה26,27. עם זאת, לאלקטרופורציה ברחם של עוברי עכבר, חולדה וחמוס יש את אותן מגבלות שתוארו לעיל עבור מודלים אלה של בעלי חיים.
באופן אידיאלי, אחד רוצה לבצע אלקטרופורציה הרחם ישירות פרימטים. בעוד שבאופן עקרוני זה אפשרי מבחינה טכנית, ברחם אלקטרופורציה אינה מתבצעת בפרימטים בשל חששות אתיים, עלויות תחזוקה גבוהות של בעלי חיים וגודל המלטה קטן. עבור פרימטים מסוימים, כגון קופים גדולים (כולל בני אדם), זה לא אפשרי בכלל. עם זאת, לפרימטים אלה יש את הפוטנציאל הגדול ביותר לחקר התפתחות הניאו-קורטקס הפיזיולוגי (הפתולוגי) האנושי והאבולוציה שלו. פתרון אחד לדילמה זו הוא ליישם את טכניקת האלקטרופורציה על אורגנואידים במוח פרימטים28.
מאמר זה מציג פרוטוקול לאלקטרופורציה של תת-סוג של אורגנואידים במוח פרימטים, אורגנואידים מוחיים של פרימטים. גישה זו מאפשרת שינוי גנטי מהיר וחסכוני של אוכלוסיות תאים בתוך המבנים דמויי החדרים של האורגנואידים. באופן ספציפי, אנו מתארים פרוטוקול מאוחד ליצירת אורגנואידים מוחיים פרימטים מבני אדם (הומו ספיינס), שימפנזה (Pan troglodytes), מקוק רזוס (Macaca mulatta) ומרמוסט מצוי (Callithrix jacchus) iPSCs. יתר על כן, אנו מתארים בפירוט את טכניקת המיקרו-הזרקה והאלקטרופורציה ומספקים קריטריונים של "ללכת" ו"לא-ללכת" לביצוע אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים של פרימטים. גישה זו היא כלי יעיל לחקר התפתחות הניאו-קורטקס הפיזיולוגי (הפתולוגי) והתפתחותו במודל קרוב במיוחד למצב האנושי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבית של פרימטים מושרים
הערה: בשל החוסן שלה, השיטה המוצגת כאן יכולה להיות מיושמת על כל קו iPSC פרימטים. במאמר זה אנו מתארים ייצור אורגנואידים מוחיים מקווי iPSC אנושיים (iLonza2.2)29, שימפנזים (Sandra A)30, מקוק רזוס (iRh33.1)29 ומרמוסט מצוי (cj_160419_5)31 קווי iPSC. תנאי התרבות מסוכמים בטבלה 1. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.
- לטיפוח תאי גזע פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים (iPSC) המתאימים, עקבו אחר תנאי התרבות המתוארים במקור. באופן כללי, ליצירה מוצלחת ואלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים, השתמש בקווי iPSC שלא תורבתו במשך יותר מ -90 מעברים. בנוסף, בתחילת ייצור אורגנואידים מוחיים, יש לוודא כי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מציגים תכונות של פלוריפוטנציה ללא סימני הבחנה.
2. יצירת אורגנואידים מוחיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים של פרימטים
הערה: הפרוטוקול ליצירת אורגנואידים מוחיים מבוסס על גרסה שונה 28,30,32,33 של פרוטוקול אורגנואיד מוחי מקורי 10,34 עם כמה שינויים ספציפיים למין (מפורט להלן).
- זריעה של iPSCs ליצירת גופים עובריים (EBs)
- לאחר שתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים הגיעו למפגש של 80%-90%, שטפו אותם במי מלח חוצצי פוספט (DPBS) של Dulbecco, והוסיפו 500 מיקרוליטר של תחליף טריפסין רקומביננטי או 1 מ"ל של תערובת פרוטאוליטית וקולגנוליטית.
הערה: בדרך כלל, iPSCs מתורבתים בצלחת תרבית תאים 60 מ"מ כדי לקבל כ 900,000 תאים, וזה מספיק כדי לייצר 96 אורגנואידים מוחיים. ניתן להתאים את מספרי התאים בהתאם למספר האורגנואידים הדרושים. שימו לב שלא כל האורגנואידים המוחיים שנוצרו עשויים להתאים להתחשמלות. - לדגור על צלחת ב 37 ° C במשך 2 דקות כדי לנתק את התאים.
הערה: ייתכן שיהיה צורך בעד 2 דקות נוספות של דגירה ב-37°C, בהתאם לקו iPSC או לאנזים שבו נעשה שימוש. מומלץ לבחון את התבשיל תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים החלו להתנתק. - הוסף 1.5 מ"ל של מדיום תרבית iPSC שחומם מראש (37 ° C) כדי לעצור את התגובה, ופיפטה למעלה ולמטה 7x-10x (לא יותר מ 10x) כדי לנתק את התאים מצלחת תרבית התא ולקבל תרחיף תא יחיד.
- מעבירים את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל, וצנטריפוגות את התאים ב 200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- שאפו את הסופר-נטנט, והשעו מחדש את הגלולה ב-2 מ"ל של מדיום תרבית iPSC בתוספת תרכובת תומכת הישרדות של 50 מיקרומטר Y27632 או 50 מיקרומטר.
- השתמש ב- 10 μL של תרחיף התא כדי לספור את התאים באמצעות תא נויבאואר.
- התאימו את תרחיף התאים לריכוז של 9,000 תאים לכל 150 מיקרוליטר (60,000 תאים/מ"ל) באמצעות תרבית iPSC בתוספת 50 מיקרומטר Y27632 או 50 מיקרומטר תרכובת פרו-הישרדותית.
- כדי ליצור גופים עובריים (EBs), זרעו 150 μL של תרחיף התא לתוך כל באר של צלחת חיבור 96 באר נמוכה במיוחד. תוך כדי פיפטינג, נערו בעדינות את הצינור המכיל את תרחיף התא כדי למנוע מהתאים לשקוע.
- תרבית את ה- EBs באטמוספירה הוחה של 5% CO2 ו- 95% אוויר ב- 37 ° C (0 ימים לאחר הזריעה [dps]). אין להפריע ל-EBs במהלך 24 השעות הראשונות לאחר הזריעה.
הערה: EBs המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במרמוסט צריכים להיות מתורבתים באטמוספירה הוחה בתנאים היפוקסיים (5% CO 2, 5% O 2 ו-90% N 2) בטמפרטורה של 37°C. - לאחר ~48 שעות (2 dps), שנה את המדיום למדיום תרבית iPSC ללא תרכובת Y27632/pro-survival. מוציאים 100 μL בינוני לכל באר, ומוסיפים 150 μL של מדיום טרי שחומם מראש (37°C) ללא Y27632. עבור שורה אחר שורה.
- לבצע שינויים בינוניים נוספים כל יומיים; הסירו 150 מיקרוליטר מדיום מכל באר, והוסיפו 150 מיקרוליטר של מדיום טרי שחומם מראש (37°C) ללא תרכובת Y27632/פרו-הישרדות לכל באר.
הערה: לאחר 4-5 dps, הפריפריה של EBs צריכה להיות שקופה.
- לאחר שתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים הגיעו למפגש של 80%-90%, שטפו אותם במי מלח חוצצי פוספט (DPBS) של Dulbecco, והוסיפו 500 מיקרוליטר של תחליף טריפסין רקומביננטי או 1 מ"ל של תערובת פרוטאוליטית וקולגנוליטית.
- אינדוקציה של neuroectoderm
הערה: באופן כללי, EBs באיכות טובה צריכים להיות בעלי קווי מתאר חלקים וגבולות שקופים בשלב זה. נקודות הזמן של אינדוקציה עצבית שונות מעט בין מיני פרימטים לבין קווי iPSC. במקרה של קווי התאים המשמשים כאן (ראו סעיף 1 וטבלת החומרים), אינדוקציה עצבית עבור EBs מרמוסט בדרך כלל צריכה להתחיל ב-4 dps, עבור rhesus macaque ב-5 dps, ועבור EBs אנושיים ושימפנזים ב-4-5 dps (איור 1A), בהתאם למצב EBs (ראו לעיל).- הסר 150 μL של מדיום מכל באר בשורה הראשונה של לוח 96 הקידוחים, והוסף 150 μL של תווך אינדוקציה עצבית שחומם מראש (37 ° C) (ראה טבלה 2) לכל באר באותה שורה.
- המשך לשנות את המדיום כמתואר לעיל שורה אחר שורה עבור כל הלוח בן 96 הקידוחים. בצע שינויים נוספים בתווך אינדוקציה עצבית (NIM) כל יומיים על ידי הסרת 150 μL של NIM מכל באר והוספת 150 μL של NIM טרי שחומם מראש (37 ° C).
הערה: מנקודה זו ואילך, יש לתרבית את המרמוסטים EBs באותם תנאים כמו הפרימטים EBs האחרים (אטמוספירה הוחה של 5% CO2 ו-95% אוויר ב-37°C).
- הטבעה במטריצת קרום מרתף
הערה: לאחר שה- EBs פיתחו נוירואפיתל בולט, שקוף ומאורגן רדיאלית על פני השטח, יש לספק תמיכה מבנית לפיתוח מבנים דמויי חדרים. זה מושג על ידי הטבעה EBs לתוך מטריצה קרום מרתף. בשל הבדלים בקצב הפיתוח, EBs של מקוק מרמוסט ורזוס מוכנים להטמעה כבר ב- 7 dps, בעוד EBs אנושיים ושימפנזים מוטמעים בדרך כלל ב- 8-9 dps. לשם הפשטות, מטריצת קרום מרתף מתייחסת רק למטריג'ל בפרוטוקול זה. עם זאת, Geltrex יכול לשמש כתחליף.- כהכנה להטמעה, מספריים מעקרים UV, מלקחיים, מתלה קטן עבור צינורות 0.2 מ"ל, ושלושה עד שישה ריבועים של פרפילם מטופלים עם אתנול 70% (vol/vol) מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית במשך 15 דקות. תנו למטריצת קרום המרתף להפשיר על קרח במשך מספר שעות (~ 1.5 מ"ל של מטריצת קרום מרתף מספיקה בדרך כלל ל 96 EBs).
הערה: שמור תמיד את מטריצת קרום המרתף על קרח. - צור רשת של 4 x 4 גומות על הפרפילם. הניחו את רשת הפרפילם על מדף הצינור בנפח 0.2 מ"ל כך שהצד העטוף בנייר פונה כלפי מעלה, ולחצו בעדינות אצבע בכפפה על כל חור בארון התקשורת.
- הסר את הנייר, וחתך את רשת הגומה מתוך ריבוע הפרפילם באמצעות מספריים כדי להתאים את גודלו כך שיתאים לצלחת תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ. החזירו את הפרפילם השמוט למדף הצינור בנפח 0.2 מ"ל כדי לספק בסיס ליצירת טיפות מטריצת קרום המרתף.
- בעזרת פיפטה עם קצה פיפטה חתוך של 200 מיקרוליטר, מעבירים בזהירות את ה-EBs בזה אחר זה מהבאר של צלחת התרבית לגומות הפרפילם.
- לאחר העברת 16 EBs לרשת, קח קצה פיפטה חדש של 200 μL, והסר את התווך שנותר מהגומות.
- פיפטה טיפה אחת (~ 15 μL) של מטריצת קרום מרתף על כל גומה המכילה EB אחד.
- קח קצה פיפטה של 10 μL והזז במהירות את ה- EBs למרכז כל טיפה מבלי להפריע לגבולות הטיפה.
- מניחים את הפרפילם הפצוע עם טיפות מטריצת קרום המרתף בצלחת תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ, ודגרים במשך 15-30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר למטריצה להתפלמר.
- כדי לנתק את ה-EBs המשובצים במטריצה מהפרפילם, הוסיפו 5 מ"ל של מדיום התמיינות (DM) ללא ויטמין A לצלחת, והפכו את ריבוע הפרפילם הפוך באמצעות מלקחיים, כך שהצד עם ה-EBs פונה לתחתית המנה.
- נערו בזהירות את הכלי כדי לגרום לטיפות מטריצת קרום המרתף המכילות את ה- EBs להתנתק מהפרפילם. אם חלקם עדיין מחוברים, קחו קצה של ריבוע הפרפילם באמצעות מלקחיים, וגלגלו אותו במהירות כלפי מעלה לכיוון מרכז המנה מספר פעמים.
- תרבית את האורגנואידים המוחיים על שייקר מסלול ב 55 סל"ד באטמוספירה לח של 5% CO2 ו 95% אוויר ב 37 ° C. שמור אותם DM ללא ויטמין A עם שינויים בינוניים כל יומיים. כדי לגרום לייצור תאי עצב, עברו ל-DM עם ויטמין A (חומצה רטינואית, RA) לאחר 13 dps עבור אורגנואידים מוחיים של מרמוסט ורזוס מקוק, או 14-15 dps עבור אורגנואידים מוחיים אנושיים ושימפנזים (איור 1A). מנקודה זו ואילך, לשנות את המדיום כל 3-4 ימים.
הערה: כדי לתמוך בהישרדות עצבית, ניתן להוסיף DM עם ויטמין A עם 20 מיקרוגרם/מ"ל נוירוטרופין אנושי 3 (NT3), 20 מיקרוגרם/מ"ל גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF), ומטריצת קרום מרתף 1 μL/מ"ל מ-40 dps ואילך.
- כהכנה להטמעה, מספריים מעקרים UV, מלקחיים, מתלה קטן עבור צינורות 0.2 מ"ל, ושלושה עד שישה ריבועים של פרפילם מטופלים עם אתנול 70% (vol/vol) מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית במשך 15 דקות. תנו למטריצת קרום המרתף להפשיר על קרח במשך מספר שעות (~ 1.5 מ"ל של מטריצת קרום מרתף מספיקה בדרך כלל ל 96 EBs).
3. אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים פרימטים
הערה: מנקודת מבט טכנית, אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים יכולה להתבצע ברגע שהמבנים דמויי החדר בולטים מספיק כדי להיות ממוקדים על ידי מיקרו-הזרקה. חלון הזמן האופטימלי להתחשמלות תלוי בשאלה הביולוגית ובאוכלוסיות התאים המעניינות. לדוגמה, אם אבות אפיים (APs) הם המטרה העיקרית, אז אורגנואידים מוחיים בסביבות 30 dps כבר מתאימים. אם אבות בסיסיים (BPs) או נוירונים הם המטרות העיקריות, יש להשתמש באורגנואידים מוחיים ישנים יותר של יותר מ -50 dps (ראה, למשל, Fischer et al.28).
- הכנת מערך האלקטרופורציה
הערה: יעילות האלקטרופורציה מושפעת מאוד מהגודל והריכוז של הפלסמיד(ים) המחושמלים (ראה פירוט בסעיף הדיון).- הכינו כמות מספקת של תערובת אלקטרופורציה עבור הבקרה וגן העניין (GOI), לדוגמה, 10 מיקרוליטר של תערובת אלקטרופורציה עבור כל בקרה, ו- GOI כדי לחשמל כ -30 אורגנואידים מוחיים לכל מצב.
הערה: להרכב תערובות האלקטרופורציה, ראה טבלה 3. - Prewarm (לא סטרילי) תערובת Dulbecco מדיום/מזין של Dulbecco F-12 (DMEM/F12) ו-DM עם ויטמין A עד 37°C. הכינו מרית קטנה ומספריים עדינים ורגילים, ורססו את המכשירים באתנול 70% (vol/vol).
הערה: ניתן לבצע את השלבים הבאים בתנאים סטריליים או לא סטריליים מכיוון שה- DM מכיל אנטיביוטיקה (ראה טבלה 2). מניסיוננו, היעדר סטריליות מעולם לא גרם לזיהום כלשהו. - הכינו צלחות תרבית תאים בקוטר 35 מ"מ, וחברו את תא אלקטרודות צלחת הפטרי לאלקטרופורטור.
הערה: תאי אלקטרודות צלחת פטרי זמינים באופן מסחרי. עם זאת, ניתן לייצר אותם בקלות בצורה חסכונית (ראה קובץ משלים 1). - באמצעות קצוות microloader, למלא מחטי microinjection עם 8 μL של כל תערובת electroporation. חותכים את קצות המחטים באמצעות מספריים עדינים לפני השימוש הראשון כדי להשיג זרימה יציבה. עם זאת, הסירו רק חלק קטן מהקצה, שכן קצה קהה ורחב עלול לפגוע קשות באורגנואידים.
הערה: מחטי מיקרו-הזרקה זמינות מסחרית כמחטי מיקרו-הזרקה שנמשכו מראש או שניתן למשוך אותן במעבדה אם מושך מחטים זמין. עקוב אחר הוראות יצרן מושך המחטים כדי ליצור מחטי מיקרו-הזרקה עם טייפר ארוך וקוטר קצה של 10 מיקרומטר.
- הכינו כמות מספקת של תערובת אלקטרופורציה עבור הבקרה וגן העניין (GOI), לדוגמה, 10 מיקרוליטר של תערובת אלקטרופורציה עבור כל בקרה, ו- GOI כדי לחשמל כ -30 אורגנואידים מוחיים לכל מצב.
- מיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה
- תחת מיקרוסקופ, בחר חמישה אורגנואידים מוחיים עם גבולות חלקים ומבנים דמויי חדרים נראים בבירור. העבירו אותם לצלחת תרבית תאים בקוטר 35 מ"מ המכילה DMEM/F12 שחומם מראש (37°C) באמצעות קצה פיפטה חתוך של 1,000 מיקרוליטר.
הערה: בחרו אורגנואידים מוחיים עם מבנים בולטים ונגישים דמויי חדרים (ראו איור 1B). - כדי להזריק מבנה דמוי חדר, הכנס בזהירות את המחט דרך הדופן שלו, ולהחדיר אותו עם תערובת אלקטרופורציה עד למילוי גלוי. אין להפעיל לחץ מוגזם על מבנים דמויי חדרים כדי למנוע מהם להתפוצץ. המשך עם שישה עד שמונה מבנים דמויי חדרים של כל אורגנואיד מוחי באופן זה.
הערה: אם המחט נסתמת במהלך תהליך המיקרו-הזרקה, יש לחתוך מעט את הקצה. - העבר אורגנואיד מוחי אחד מוזרק מיקרו לתא אלקטרודת צלחת פטרי עם כמות קטנה של DMEM/F12. סדרו את האורגנואיד כך שהמשטחים של המבנים דמויי החדרים המוזרקים פונים לכיוון האלקטרודה המחוברת לקוטב החיובי של האלקטרופורטור.
הערה: כיוון המבנים בדרך זו מבטיח שהתאים יהיו נגועים בצד המבנה דמוי החדר שאינו מושפע ממבנה סמוך. - אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים אחד אחד באמצעות ההגדרות הבאות: 5 פולסים של 80 V, משך פעימה של 50 ms, ומרווח של 1 s. העבירו את האורגנואידים המחושלים לצלחת תרבית תאים חדשה בקוטר 35 מ"מ מלאה ב-DMEM/F12 שחומם מראש (37°C).
הערה: הגדרות האלקטרופורציה עשויות להיות תלויות באלקטרופורטור הגל הריבועי הזמין. הגדרות אלה ממוטבות עבור מערכת האלקטרופורציה המוזכרת. הגדלת המתח יכולה להוביל לעקירה של התאים. - המשך באותו אופן עם חמשת האורגנואידים המוחיים הבאים באמצעות תערובת האלקטרופורציה השנייה (לדוגמה, GOI).
הערה: חזור על שלבים 3.2.1-3.2.5 עד שתגיע למספר הרצוי של אורגנואידים מוחיים מחושמלים. - אם המיקרו-הזרקה והאלקטרופורציה בוצעו בתנאים לא סטריליים, העבירו את האורגנואידים המחושמלים לצלחת תרבית תאים סטרילית בקוטר 35 מ"מ מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית תוך העברת כמה שפחות DMEM/F12 לצלחת תרבית התאים החדשה.
- תחת מיקרוסקופ, בחר חמישה אורגנואידים מוחיים עם גבולות חלקים ומבנים דמויי חדרים נראים בבירור. העבירו אותם לצלחת תרבית תאים בקוטר 35 מ"מ המכילה DMEM/F12 שחומם מראש (37°C) באמצעות קצה פיפטה חתוך של 1,000 מיקרוליטר.
- תרבות נוספת וקיבוע של אורגנואידים מוחיים
- תרבית את האורגנואידים המחושמלים ב-DM עם ויטמין A על שייקר אורביטלי ב-55 סל"ד באטמוספירה הוחה של 5% CO2 ו-95% אוויר ב-37°C.
- למחרת לאחר ההתחשמלות, בדוק את האורגנואידים המוחיים לאלקטרופורציה מוצלחת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך קונבנציונלי.
הערה: בהתאם לאורך התרבית הנוספת לאחר אלקטרופורציה, אוכלוסיות תאים שונות בתוך אורגנואיד המוח מושפעות (ראה גם את סעיף התוצאות המייצגות). - המשך עם יישומים במורד הזרם לאחר גידול אורגנואידים מוחיים electroporated למשך פרק זמן המתאים לשאלה הביולוגית של עניין.
הערה: אורגנואידים מוחיים אלקטרופורציה יכולים להיות מעובדים עבור יישומים שונים במורד הזרם (למשל, קיבוע עבור צביעה immunofluorescence או הקפאה snap-frozen עבור בידוד RNA ו qRT-PCR). כאן, אנו מתארים את הקיבוע של אורגנואידים מוחיים electroporated . - מעבירים את האורגנואידים המחושלים לצינור צנטריפוגה חרוטי בנפח 15 מ"ל באמצעות קצה פיפטה חתוך של 1,000 מיקרוליטר, ומסירים עודפי תווך.
- הוסיפו כמות מספקת של 4% פרפורמאלדהיד (PFA) ב-DPBS (pH 7.5), ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
אזהרה: PFA מסווג כמסרטן בבני אדם ועלול לגרום לנזק בריאותי בלתי הפיך. אמצעי זהירות נוספים, כולל כפפות ניטריל ומשקפי מגן, מומלצים בחום. - לשאוף את PFA, להוסיף 5 מ"ל של DPBS, לנער קצת, ולשאוף את DPBS. חזור על פעולה זו 2x. אחסנו את האורגנואידים ב-DPBS בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, מכיוון שניתן לאחסן אורגנואידים מוחיים קבועים ב- 4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים. ניתן לנתח אורגנואידים אלקטרופורטים קבועים בתקן PFA על ידי הקפאה וצביעה אימונופלואורסצנטית10,28 או על ידי צביעה וניקוי35,36 בהרכבה שלמה. לדוגמה תמונות, עיין בסעיף תוצאות מייצגות (ראה טבלה 4 לפירוט נוגדנים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר יצירה יעילה של אורגנואידים מוחיים מקווי iPSC אנושיים, שימפנזים, רזוס מקוק ומרמוסט מצוי עם שינויי תזמון מינימליים הנדרשים בין מינים שונים (איור 1A). אורגנואידים אלה יכולים להתחשמל בטווח של 20 dps עד 50 dps, בהתאם לנגישות של מבנים דמויי חדרים ואת שפע של אוכלוסיות התא (ים) של עניין. עם זאת, לפני אלקטרופורציה, חשוב לקבוע אם אורגנואידים מוחיים הם באיכות מספקת כדי להיות electroporated.
אורגנואיד מוחי אידיאלי לאלקטרופורציה צריך להציג מבנים בולטים דמויי חדרים בהירים בפריפריה, ללא סימני ניוון (למשל, ניתוק תאים, ליבה אפופטוטית מוגדלת), ומורפולוגיה בריאה קומפקטית בדרך כלל (למשל, ללא צמיחה מוגזמת) (איור 1B, "Go"). עדיף לבחור אורגנואידים מוחיים עם מבנים גדולים, מאורגנים היטב, דמויי חדרים כדי להתמקד במספר גבוה יותר של תאים. אם האזור ההיקפי של אורגנואיד חשוך ואינו מראה מבנים בולטים, מומלץ לא להשתמש בו להתחשמלות, מאחר שהמיקרו-הזרקות המדויקות עלולות להיפגע על-ידי היעדר רמזים חזותיים (איור 1B, "No-go"). כדי להשיג מורפולוגיה אופטימלית של אורגנואיד מוחי, חיוני להבטיח כי צעדים קריטיים כגון השראת נוירואקטודרם והטבעה מטריצה מתוזמנים היטב. בעיות הנוגעות למורפולוגיה של אורגנואידים מוחיים נובעות בדרך כלל מהיווצרות נוירואקטודרם כושל ו / או היווצרות ניצנים נוירואפיתליאליים. זה נגרם בדרך כלל על ידי תזמון לא אופטימלי של האינדוקציה העצבית ו / או הטבעה של מטריצת קרום המרתף וניתן לפתור על ידי התאמת העיתוי של שלבים אלה (טיפים נוספים לפתרון בעיות עבור היווצרות אורגנואידים מוחיים ניתן למצוא בלנקסטר ו Knoblich34).
לאחר אלקטרופורציה, הערכה ראשונה של הצלחתה ויעילותה יכולה להתבצע לאחר 12 שעות, כאשר ביטוי GFP של התאים הנגועים הופך לגילוי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך קונבנציונאלי. באופן אידיאלי, בשלב זה, מבנים דמויי חדרים מרובים פולטים פלואורסצנטיות ירוקה בהירה הממוקמת באחד הצדדים שלהם (איור 2A). זה מצביע על דיוק גבוה ויעילות של ההליך. אורגנואידים מוחיים שהתחשמלו בהצלחה של ארבעת מיני הפרימטים השונים (כלומר, אדם, שימפנזים, מקוק רזוס ומרמוסט מצוי) מראים דפוסים חיוביים דומים של GFP בתוך מבנים דמויי חדרים ממוקדים (איור 2A). יתר על כן, לאחר הקיבוע וההקפאה של אורגנואידים מוחיים של פרימטים מחושמלים, מבנים דמויי חדרים מחושמלים בהצלחה של כל ארבעת המינים מציגים עמודות של תאים חיוביים ל-GFP בתוך אזור החדרים המאורגן רדיאלית והצפוף (VZ) (איור 2B). הכימות של התאים החיוביים ל-DAPI שהיו חיוביים ל-GFP גם באזורים כאלה של אורגנואידים מוחיים של שימפנזה ומרמוסט יומיים לאחר האלקטרופורציה (17 חדרים מ-12 אורגנואידים כומתים) הראה כי בממוצע, כשליש מהתאים (33%, SD ±-12%) התחשמלו בהצלחה.
אלקטרופורציות תת-אופטימליות מסומנות על-ידי מספר קטן של תאים חיוביים ל-GFP בתוך המבנה דמוי החדר (איור 3A) או על-ידי כמה תאים חיוביים ל-GFP הרחוקים מכל מבנה דמוי חדר (איור 3B). מספר נמוך של תאים חיוביים ל-GFP נגרם על ידי ספיגת פלסמיד ירודה. זה יכול להיות בגלל ריכוז פלסמיד נמוך שנגרם על ידי כמות לא מספקת של תערובת אלקטרופורציה מיקרו-מוזרקת או בגלל פולסים חשמליים שאינם מכוונים היטב, אשר עשויים להיגרם על ידי מיקום לא אופטימלי של אורגנואידים מוחיים בתא אלקטרודות צלחת פטרי. מספר נמוך של תאים חיוביים ל-GFP המרוחקים מכל מבנה דמוי חדר נגרם על ידי אלקטרופורציה של תאים פוסט-מיטוטיים בתוך אורגנואיד המוח (למשל, נוירונים) עקב מיקרו-הזרקה לא מדויקת. אלקטרופורציות תת-אופטימליות אלה צריכות להיכלל בכל ניתוח נוסף.
הזיהוי האמין של סוגי התאים הקיימים באורגנואידים מוחיים מתבסס, בין היתר, על מיקום התא בתוך מבנה דמוי חדר, הדורש הגדרת גבול בין VZ לאזור מועשר בנוירונים. ניתן לזהות גבול זה על ידי הארגון הרדיאלי ומאפייני צפיפות גרעיני התא הגבוהה של VZ (ראו צביעת DAPI באיור משלים S1). אישור גבול VZ/SVZ יכול להתבצע על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית עבור סמני אב עצביים כגון PAX6 או SOX2, אשר מבוטאים כמעט על ידי כל תאי VZ (APs) וכמה תאי SVZ (BPs). נוכחות של אזור מועשר בתאי עצב יכולה להיות מאומתת על-ידי צביעה אימונופלואורסצנטית עבור סמנים עצביים כגון סוג III β-טובולין (TUJ1) או NeuN (איור משלים S1).
משך תרבית אורגנואידים מוחית לאחר אלקטרופורציה תלוי בשאלה הביולוגית ובאוכלוסיות התאים המעניינות. במחקר שנערך לאחרונה הוכח כי אורכים שונים של תרבית נוספת לאחר אלקטרופורציה משפיעים על אוכלוסיות תאים שונות באורגנואידים מוחיים של שימפנזים, החל מ-APs ועד נוירונים בשכבה העליונה24. כאן, אנו מראים תוצאות דומות עבור אורגנואידים מרמוסט מחושמלים. באופן ספציפי, יומיים לאחר ההתחשמלות, תאים חיוביים ל-GFP ממוקמים כמעט אך ורק ב-VZ, והם חיוביים גם עבור PAX6 – סמן עבור תאי אב עצביים – מה שמצביע על כך שהתאים האלה הם APs או BPs של יילודים (איור 4A). אם תקופת התרבית לאחר אלקטרופורציה מוארכת ל-10 ימים, אז תאים חיוביים ל-GFP ממוקמים באזורים הבסיסיים (כלומר, SVZ ואזור מועשר בנוירונים) (איור 4B,C). התאים האלה יכולים (בנוסף לאות GFP) להיות חיוביים גם עבור PAX6 (איור 4B), שמעיד על BPs, או NeuN (איור 4C), שמעיד על תאי עצב. תוצאות דומות ניתן להשיג עבור אורגנואידים מוחיים מקוק מקוק אנושי ורזוס. לסיכום, סוגים שונים של אבות, כמו גם נוירונים, יכולים להיות ממוקדים בהצלחה על ידי טכניקה זו.
כמעט כל הנתונים שהוצגו בעבר נגזרו מ-immunostaining של קטעים היסטולוגיים שנוצרו מאורגנואידים מוחיים מחושמלים. עם זאת, דרך אלגנטית נוספת לנתח אורגנואידים אלה היא לבצע immunostaining כל mount ואחריו ניקוי אופטי35,36. זה יאפשר שחזור תלת-ממדי של אורגנואידים מוחיים מחושמלים כדי לקבל התרשמות מההתפלגות התלת-ממדית של התאים החיוביים ל-GFP. איור 5 ווידאו 1 מראים דוגמה מייצגת של אות GFP באורגנואיד מוחי מחושמל שעבר ניקוי אופטי.
לסיכום, פרוטוקול האלקטרופורציה המתואר כאן מספק דרך מדויקת ויעילה להחדיר שינויים גנטיים חולפים לסוגי אבות שונים ולנוירונים של אורגנואידים מוחיים שמקורם בקווי iPSC שונים של פרימטים.
איור 1: סקירה סכמטית של יצירת אורגנואידים מוחיים של פרימטים וקריטריונים מורפולוגיים של "ללכת" ו"לא ללכת" עבור אלקטרופורציה. (A) ציר הזמן של יצירת אורגנואידים מוחיים של פרימטים ואלקטרופורציה המדגיש את התזמונים השונים של שלבי הפרוטוקול עבור בני אדם ושימפנזים (כחול), מקוק רזוס (סגול) ומרמוסט (מגנטה). שים לב שהכרונולוגיה של ציר הזמן אינה בקנה מידה. (B) תמונות Brightfield של אורגנואיד מוחי אנושי מתאים (תמונה שמאלית, Go) ולא מתאים (תמונה ימנית, No-go) 32 dps. ראשי החץ מצביעים על דוגמאות למבנים דמויי חדרים מתאימים למיקרו-הזרקה. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך Zeiss Axio Observer.Z1 עם מטרה של פי 2.5. פסי קנה מידה = 500 מיקרומטר. קיצורים: BDNF = גורם נוירוטרופי שמקורו במוח; DPS = ימים לאחר הזריעה; NT3 = נוירוטרופין 3; RA = חומצה רטינואית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דוגמאות לאורגנואידים מוחיים של פרימטים שהתחשמלו בהצלחה . (A) ברייטפילד (עמודה שמאלית), פלואורסצנטיות (עמודה אמצעית) ומיזוג תמונות (עמודה ימנית) של 22 DPS אנושיים, 32 DPS שימפנזה, 32 DPS Rhesus macaque ו-31 DPS Marmoset אורגנואידים מוחיים (מלמעלה למטה) 15-48 שעות לאחר אלקטרופורציה עם פלסמיד המבטא GFP. ראשי החץ השחורים מצביעים על דוגמאות למבנים בודדים דמויי חדרים מחושמלים. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך Zeiss Axio Observer.Z1 עם מטרה של פי 2.5. מוטות קנה מידה = 500 מיקרומטר. (B) אימונופלואורסנציה עבור GFP (ירוק) בשילוב עם צביעת DAPI (ציאן) של 32 dps אדם, 34 dps שימפנזה, 32 dps rhesus macaque, ו 32 dps marmoset אורגנואידים מוחיים (מלמעלה למטה) 2-4 ימים לאחר אלקטרופורציה עם פלסמיד המבטא GFP. ראשי החץ האפורים בהירים מציינים את גבולות האזורים המתחשמלים בתוך המבנים דמויי החדרים. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי Zeiss LSM 800 עם מטרה של פי 10. מוטות קנה מידה = 150 מיקרומטר. קיצורים: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; DPS = ימים לאחר הזריעה; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: דוגמאות לאורגנואידים מוחיים של פרימטים שהתחשמלו ללא הצלחה. (A,B) Immunofluorescence for GFP (ירוק) בשילוב עם צביעת DAPI (ציאן) של אורגנואיד מוחי (A) rhesus macaque cerebral organoid 4 ימים לאחר אלקטרופורציה עם פלסמיד המבטא GFP ושל (B) אורגנואיד מוחי rhesus macaque 32 dps יומיים לאחר אלקטרופורציה עם פלסמיד המבטא GFP. ראשי החץ האפורים בהירים מצביעים על תאים מחושמלים. קו המתאר המקווקו בצבע אפור בהיר מציין את הגבול בין אזור VZ לאזור SVZ/מועשר בנוירונים של מבנה דמוי חדר הסמוך לתאים המתחשמלים. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי Zeiss LSM 800 עם מטרה של פי 10. מוטות קנה מידה = 150 מיקרומטר. קיצורים: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; DPS = ימים לאחר הזריעה; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; SVZ = אזור תת-חדרי; VZ = אזור החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הדמיה של אוכלוסיות תאים שונות הקיימות באורגנואידים מוחיים של פרימטים לאחר התחשמלות. (א-ג) אימונופלואורסנציה כפולה עבור GFP (ירוק) ו- PAX6 (A,B; מגנטה) או NeuN (C; מגנטה), בכל המקרים בשילוב עם צביעת DAPI (ציאן), של אורגנואיד מוחי מרמוסט (A) 32 dps marmoset 2 ימים לאחר אלקטרופורציה עם פלסמיד המבטא GFP, ו- (B,C) של אורגנואיד מוחי מרמוסט 40 dps 10 ימים לאחר אלקטרופורציה עם פלסמיד המבטא GFP. ראשי החץ בצבע אפור בהיר מציינים (A,B) תאים חיוביים כפולים מסוג GFP+ ו-PAX6+ או (C) NeuN+ . הקווים המקווקווים האפורים-בהירים מציינים את הגבול בין VZ לאזור מועשר ב-SVZ/נוירונים. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי Zeiss LSM 800 עם מטרה של פי 20. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; DPS = ימים לאחר הזריעה; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; NeuN = חלבון גרעינים עצבי; PAX6 = קופסה 6 חלבון; SVZ = אזור תת-חדרי; VZ = אזור החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: שחזור תלת-ממדי של תמונות מחושמלות באמצעות הדמיה קונפוקלית תלת-ממדית של אורגנואידים מוחיים של פרימטים מפוצלים לאחר ניקוי אופטי. מבט חזיתי (תמונה שמאלית), 45° מסובב (תמונה אמצעית) ו-90° מסובב (תמונה ימנית) של אורגנואיד מוחי אנושי משוחזר תלת-ממדי 32 dps יומיים לאחר אלקטרופורציה עם פלסמיד המבטא GFP. לפני ההדמיה, האורגנואיד נוקה אופטית על בסיס שיטת 2Eci35. שחזור תלת-ממדי של אורגנואיד מחושמל שלם נוצר מ-269 מקטעים אופטיים (עובי של 1 מיקרומטר כל אחד) הנמצאים במרחק של 3.73 מיקרומטר זה מזה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי Zeiss LSM 800 עם מטרה של פי 10. התמונות עובדו לשחזור תלת ממדי באמצעות פיג'י. שים לב שהתמונות נלקחו מאותו אורגנואיד משוחזר בתלת-ממד המוצג בסרטון 1. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. קיצור: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: אורגנואיד מוחי אנושי משוחזר בתלת-ממד לאחר ניקוי אופטי. וידאו של אורגנואיד מוחי אנושי 32 dps משוחזר בתלת-ממד יומיים לאחר אלקטרופורציה עם פלסמיד המבטא GFP. לפני ההדמיה, האורגנואיד נוקה אופטית על בסיס שיטת 2Eci35. שחזור תלת-ממדי של אורגנואיד מחושמל שלם נוצר מ-269 מקטעים אופטיים (עובי של 1 מיקרומטר כל אחד) הנמצאים במרחק של 3.73 מיקרומטר זה מזה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי Zeiss LSM 800 עם מטרה של פי 10. התמונות עובדו לשחזור תלת ממדי באמצעות פיג'י. שימו לב שהסרטון נלקח מאותו אורגנואיד משוחזר בתלת-ממד שמוצג באיור 5. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
| קו iPSC | מינים | פרסום | תרבות, קומפוזיציה בינונית | תנאי תרבות | ||||
| iLonza2.2 | הומו ספיינס | Stauske et al., 2020 | 1 מיקרומטר IWR1 ו- 0.5 מיקרומטר CHIR ב- StemMACS iPS-Brew XF | אטמוספירה לחות של 5% CO2 ו 95% אוויר, 37 °C (77 °F) | ||||
| סנדרה | פאן טרוגלודיטים | Mora-Bermúdez et al., 2016 | mTeSR1 | אטמוספירה לחות של 5% CO2 ו 95% אוויר, 37 °C (77 °F) | ||||
| iRh33.1 | Macaca mulatta | Stauske et al., 2020 | 1 מיקרומטר IWR1 ו- 0.5 מיקרומטר CHIR ב- StemMACS iPS-Brew XF | אטמוספירה לחות של 5% CO2 ו 95% אוויר, 37 °C (77 °F) | ||||
| cj_160419_5 | קליטריקס ג' | פטקוב ואחרים, 2020 | 3 μM IWR1, 0.3 μM CGP77675, 0.3 μM AZD77675, 0.5 μM CHIR99021, 10 μM Forskolin, 1 ng/mL Activin A, 1 μM OAC1 in StemMACS iPS-Brew XF | אטמוספירה לחות של 5% CO 2, 5% O 2, ו 90% N2, 37 °C | ||||
טבלה 1: תנאי התרבות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים המשמשים בפרסום זה. קיצור: iPSCs = תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים.
| בינוני | הרכב | ||
| מדיום אינדוקציה עצבית | 1x תוסף N-2, 1x תוסף תחליף גלוטמין, 1x MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות, 1 מיקרוגרם/מ"ל הפרין ב-Modified Eagle Medium F12 (DMEM/F12) של Dulbecco | ||
| מדיום התמיינות (DM) ללא ויטמין A | תוסף B-27 0.5x (פחות ויטמין A), תוסף N-2 0.5x, תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות 0.5x MEM, תוסף תחליפי גלוטמין 1x, 100 U/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין, 0.00035% 2-מרקפטואתנול, 2.875 נ"ג/מ"ל אינסולין ב-1:1 DMEM/F12 ומדיום נוירובזאלי | ||
| מדיום התמיינות (DM) עם ויטמין A | תוסף B-27 0.5x, תוסף N-2 0.5x, תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות 0.5x MEM, תוסף תחליפי גלוטמין 1x, 100 U/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין, 0.00035% 2-מרקפטואתנול, 2.875 ננוגרם/מ"ל אינסולין ב-1:1 DMEM/F12 ומדיום נוירובזאלי | ||
טבלה 2: הרכב המדיה המשמשת ליצירת אורגנואידים מוחיים של פרימטים ולתרבית.
| רכיב | תערובת אלקטרופורציה בקרה | תערובת אלקטרופורציה של GOI |
| פלסמיד ביטוי GFP | 500 ננוגרם/μL | 500 ננוגרם/μL |
| וקטור ריק | 500 ננוגרם/μL | - |
| פלסמיד ביטוי GOI | - | 500 ננוגרם/μL |
| ירוק מהיר | 0.10% | 0.10% |
| ב- DPBS |
טבלה 3: הרכב תערובת האלקטרופורציה (גישת פלסמידים נפרדת) לבקרה ולגן המעניין. קיצור: GOI = גן של עניין.
| נוגדן | חברה | מספר קטלוגי | $$$$ | דילול |
| עוף נגד GFP | מעבדות Aves | GFP-1020 | RRID:AB_10000240 | 1:300 |
| ארנב נגד PAX6 | Novus Biologicals | NBP1-89100 | RRID:AB_11013575 | 1:300 |
| ארנב אנטי NeuN | אבקאם | ab104225 | RRID:AB_10711153 | 1:300 |
| עיזים נגד עוף Alexa Fluor 488 | תרמו פישר | A-11039 | RRID:AB_142924 | 1:500 |
| חמור נגד ארנב אלכסה פלואור 555 | תרמו פישר | A-31572 | RRID:AB_162543 | 1:500 |
טבלה 4: נוגדנים המשמשים לצביעת אימונופלואורסצנטיות.
איור משלים S1: קביעת גבול VZ/SVZ באורגנואידים מוחיים של פרימטים מחושמלים. אימונופלואורסנציה כפולה עבור PAX6 (מגנטה) ו-TUJ1 (צהוב) בשילוב עם צביעת DAPI (ציאן) של אורגנואיד מוחי מרמוסט 32 dps יומיים לאחר אלקטרופורציה עם פלסמיד המבטא GFP. האימונופלואורסנציה עבור GFP אינה מוצגת. הקווים המקווקווים האפורים-בהירים מציינים את הגבול בין VZ לאזור מועשר ב-SVZ/נוירונים. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי Zeiss LSM 800 עם מטרה של פי 20. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; DPS = ימים לאחר הזריעה; PAX6 = קופסה 6 חלבון; SVZ = אזור תת-חדרי; TUJ1 = מחלקה III β-טובולין; VZ = אזור החדר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 1: הוראות הרכבת תא אלקטרופורציה של צלחת פטרי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההליכים המתוארים כאן מייצגים פרוטוקול אחיד ליצירת אורגנואידים מוחיים ממיני פרימטים שונים עם גישת אלקטרופורציה ממוקדת. זה מאפשר ביטוי חוץ רחמי של GOI במערכת מודל המדמה התפתחות ניאו-קורטקס פיזיולוגית של פרימטים (כולל בני אדם) (פתו). פרוטוקול מאוחד זה ליצירת אורגנואידים מוחיים של פרימטים משתמש באותם חומרים (למשל, מדיה) ושלבי פרוטוקול עבור כל ארבעת מיני הפרימטים שהוצגו. הבדלים התפתחותיים בין מינים אלה מטופלים על ידי שינוי העיתוי של שלבי פרוטוקול קריטיים (כלומר, האינדוקציה העצבית וההטבעה במטריצת קרום המרתף; ראה לעיל). זה עשוי לשקף בערך את הבדלי העיתוי הנוירו-התפתחותיים in vivo בין מינים אלה ומהווה נושא מעניין למחקרים נוספים.
גישה זו מבוססת על ניסויי אלקטרופורציה שתוארו במאמר קודם על אורגנואידים מוחיים10. עם זאת, ניסויים אלה, כפי שצוין על ידי לנקסטר ועמיתיו, היו מוגבלים על ידי דרגות נרחבות של אפופטוזיס, אשר התרחש עקב ריכוז GFP גבוה והוביל להרחקת התאים המחושלים המציגים אות GFP חזק10. בניסויים שלנו, מצאנו כי ריכוז פלסמיד כולל סופי (למשל, ריכוז פלסמיד מקודד EGFP בתוספת ריכוז פלסמיד מקודד GOI) של 1,000 ng/μL היה אופטימלי. ריכוזים נמוכים מ-1,000 ננוגרם/מיקרוליטר מובילים ליעילות אלקטרופורציה מופחתת, בעוד שריכוזים גבוהים מעל 1,000 ננוגרם/מיקרוליטר עלולים להיות רעילים לתאים המתחשמלים ולהוביל למוות תאי10. מחקרים המשלבים יותר משני פלסמידים שונים של ביטוי אפשריים28. עם זאת, ריכוז הפלסמיד הכולל הסופי צריך להישמר על 1,000 ננוגרם/מיקרוליטר.
בגישת אלקטרופורציה טיפוסית, יש צורך בפלסמיד המקודד סמן פלואורסצנטי כדי לזהות את התאים שהתחשמלו בהצלחה. ישנן שתי אפשרויות לכלול את הסמן הפלואורסצנטי במערך הניסוי: (i) על ידי הזרקה משותפת של שני פלסמידים נפרדים (כלומר, פלסמיד המקודד לסמן בתוספת פלסמיד בקרה [למשל, וקטור ריק] או פלסמיד המקודד את הגן המעניין [GOI]) ( גישת הפלסמידים הנפרדים); (ii) על ידי הזרקת פלסמיד אחד המקודד הן עבור הסמן והן עבור ממשלת ישראל באמצעות אתר כניסה פנימי של ריבוזום (IRES) או פפטיד 2A החותך את עצמו (למשל, P2A) ( גישת הפלסמיד היחיד). במקרה זה, פלסמיד המקודד אך ורק את סמן הפלואורסצנטיות משמש כבקרה. בעוד שגישת הפלסמיד היחיד מביאה לביטוי משותף מלא של סמן הפלואורסצנטי ו- GOI, פלסמידים כאלה גדולים בגודלם, מה שמביא ליעילות אלקטרופורציה נמוכה. אם יש צורך ביעילות אלקטרופורציה גבוהה, מומלץ להשתמש בגישת הפלסמידים הנפרדים, שכן הביטוי המופרד אינו משפיע באופן משמעותי על רמת הביטוי המשותף של סמן הפלואורסצנטיות ושל ממשלת ישראל תוך שמירה על יעילות אלקטרופורציה גבוהה28. בפרוטוקול המוצג כאן, אנו מתארים את האלקטרופורציה באמצעות גישת הפלסמידים הנפרדים. אם מיושמת גישת הפלסמיד היחיד, יש להתאים את השלבים בפרוטוקול בהתאם.
בהשוואה לפרוטוקול37 שפורסם לאחרונה, לגישה שלנו יש שלושה יתרונות עיקריים. ראשית, אנו מכוונים באופן ספציפי למבנים דמויי החדרים של האורגנואיד המוחי. אנו משיגים זאת (i) על ידי הזרקה זעירה של המבנים דמויי החדר הבודדים של האורגנואיד המוחי במקום הזרקה למרכז האורגנואיד 37 ו-(ii) על ידי סידור הכיוון של האורגנואיד המוחי בתא אלקטרודת צלחת פטרי כדי לייעל את כיוון השדה החשמלי (ראה לעיל) במקום להשתמש בקובט אלקטרופורציה37. שנית, פרוטוקול זה אינו כרוך בשימוש בתמיסת נוקלאופקטור יקרה, שכן גישה זו משתמשת באלקטרופורטור גל מרובע בשילוב עם תא אלקטרודות צלחת פטרי. שלישית, פרוטוקול מאוחד זה ליצירת אורגנואידים מוחיים של פרימטים מאפשר לחקור לא רק אורגנואידים אנושיים אלא גם פרימטים שאינם אנושיים, מה שמאפשר מחקרים אבולוציוניים, השוואתיים ומחלות.
שני מאפיינים הנוגעים לאורגנואידים המוחיים הם קריטיים להתחשמלות מוצלחת – איכות האורגנואידים המוחיים והגודל והאיכות של המבנים דמויי החדרים (ראו את התוצאות המייצגות ואת איור 1B). בנוגע למאפיין הראשון, אנו מציגים קריטריונים של go ו-no-go (ראו לעיל ואיור 1B) להמשך ההתחשמלות. הקריטריון העיקרי הוא נוכחות של מבנים דמויי חדרים נראים בבירור, שקופים ומאורגנים רדיאלית. גודל המבנים דמויי החדר הוא התכונה החיונית השנייה למיקרו-הזרקה מוצלחת ואלקטרופורציה. מבנים דמויי חדרים קטנים מדי קשים להזרקה ובדרך כלל אינם מניבים מספר גבוה מספיק של תאים מחושמלים לניתוחים הבאים. זו הסיבה העיקרית לכך שהשתמשנו בפרוטוקול אורגנואיד מוחי שונה, שכן פרוטוקול זה, בידינו ועבור קווי iPSC אלה מייצר, בהשוואה לפרוטוקולים אחרים, מבנים מאורגנים היטב דמויי חדרים גדולים מספיק כדי להתחשמל. באופן עקרוני, גישת האלקטרופורציה המוצגת כאן יכולה להיות מיושמת על כל פרוטוקול אורגנואיד עצבי אחר, כל עוד האחרון מניב מבנים גדולים ומאורגנים מספיק דמויי חדרים (ראו את התוצאות המייצגות ואת איור 1B). יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם על פרימטים אחרים בעתיד, כגון מקוק אוכל סרטנים (Macaca fascicularis), מודל הפרימטים הקלאסי המשמש במחקר תעשייתי. זה ידרוש זיהוי של נקודות הזמן הקריטיות הנכונות (ראה לעיל) של פרוטוקול אורגנואיד מוחי שונה המתואר כאן, או הקמת פרוטוקול אורגנואיד עצבי המוליד מבנים מתאימים דמויי חדרים גדולים (ראה לעיל).
לאחר אלקטרופורציה מוצלחת, ניתן להמשיך ולתרבת את האורגנואידים המוחיים לפרקי זמן שונים כדי לאפשר לשינוי הגנטי הנבדק להשפיע על אוכלוסיות התאים השונות בתוך אורגנואיד המוח המתפתח. אלה נעים בין אוכלוסיות האב העצבי השונות לסוגים השונים של תאי עצב הנמצאים באורגנואיד המוחי (ראו את התוצאות המייצגות ואת Fischer et al.28). לאחר מכן ניתן לנתח את אוכלוסיות התאים האלה על-ידי הקפאה וצביעה אימונופלואורסצנטית (ראו איור 4) או על-ידי צביעה אימונופלואורסצנטית וניקוי אופטי בהרכבה שלמה (ראו איור 5 ווידאו 1) של אורגנואידים מוחיים מפוצלים קבועים ב-PFA.
עד כה, אלקטרופורציה של אורגנואידים במוח שימשה בעיקר לביטוי חוץ רחמי של גנים לביצוע מחקרי תפקודי גנים 10,28,38,39, הדמיה חיה 10,39,40, הדמיה של מורפולוגיה של התא 40, ומעקב אחר חלוקת תאים 10. עם זאת, במאמר אורגנואיד מוחי ראשון, shRNA הוכנס לאורגנואידים על ידי אלקטרופורציה כדי להשתיק ביטוי גנים על ידי הפרעות RNA. זה הראה את הפוטנציאל של אלקטרופורציה לשמש לא רק עבור ביטוי חוץ רחמי של גנים, אלא גם עבור KD או אפילו KO של גנים. לאחרונה, הוכח כי KOs בתיווך CRISPR/Cas9 יכולים להיות מושגים על ידי אלקטרופורציה ברחם של עוברי עכבר27 ואלקטרופורציה של רקמה אנושית עוברית ex vivo41. KOs מבוססי CRISPR/Cas9 כאלה יכולים להיות מיושמים בקלות על אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים, מכיוון שהמנגנון העיקרי של אלקטרופורציה זהה, וזה ירחיב עוד יותר את התועלת של גישה זו.
יישום אפשרי נוסף של אלקטרופורציה באורגנואידים מוחיים הוא הצלה של פנוטיפים ספציפיים של KO במקרים בהם לא ניתן לקבל KO ספציפי של ממשלת ישראל עקב רצפים דומים מאוד בין ממשלת ישראל לבין גרסאות אבותיה. זה נכון במיוחד לגבי גנים ספציפיים לבני אדם שהתפתחו לאחרונה. במקרים כאלה, לא ניתן (אפילו עם השימוש בטכנולוגיית CRISPR/Cas9) להשיג KO ספציפי (כפי שהיה במקרה של ARHGAP11A ו- ARHGAP11B28). פתרון לדילמה זו הוא ליצור KO כפול של ממשלת ישראל והגן הקדום שלה ולהציל את ממשלת ישראל לבדה, את הגן הקדמון לבדו, או את שני הגנים יחד על ידי אלקטרופורציה. אורגנואידים מחושמלים אלה יכולים להיחשב אז כגן קדמון סלקטיבי KO, GOI KO סלקטיבי, או בקרה, בהתאמה. הדבר יאפשר להתייחס לתרומות האינדיבידואליות של גנים אלה לפנוטיפ (ראו, למשל, Fischer et al.28). יישום פוטנציאלי נוסף קשור לניתוח של אורגנואידים מוחיים שנוצרו מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם במטופל. במקרים כאלה, לא ברור אם הפנוטיפ שנצפה נובע ממוטציה בגן המועמד או ממוטציה אחרת הקיימת בחולה. כאן, אלקטרופורציה של הגן המועמד והצלה (פוטנציאלית) של הפנוטיפ יאפשרו לאמת את תפקידו של גן זה במחלה (ראו, למשל, Lancaster et al.10).
יחד, הפרוטוקול המוצג כאן מציע גישה מהירה וחסכונית לשינוי גנטי של אוכלוסיות תאים בתוך מבנים דמויי חדרים של אורגנואידים מוחיים פרימטים. זה מספק כלי יעיל לחקר תהליכים נוירו-התפתחותיים ואבולוציוניים שניתן ליישם גם עבור מודלים של מחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אנו מתנצלים בפני כל החוקרים שלא ניתן היה לצטט את עבודתם בשל מגבלות מקום. אנו מודים לאולריך בלייר מהשירותים הטכניים ב-DPZ ולהרטמוט וולף מהסדנה ב-MPI-CBG על בניית תאי אלקטרודות צלחת פטרי; סטויאן פטקוב ורודיגר בהר על אספקת iPSCs לבני אדם (iLonza2.2), מקוק רזוס (iRh33.1) ומרמוסט (cj_160419_5); סברינה היידה עבור cryosectioning ו immunofluorescence צביעה; ונרינגה ליוטקאיט וסזאר מתאו בסטידס בטנקור על קריאה ביקורתית של כתב היד. העבודה במעבדה של W.B.H. נתמכה על ידי מענק ERA-NET NEUROON (MicroKin). העבודה במעבדה של מ.ה. נתמכה על ידי מענק התחלה של ERC (101039421).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 µL Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 8.05740.0005 | |
| 35 mm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3900 | |
| 60 mm cell culture dishes | CytoOne | CC7682-3359 | |
| Activin A | Sigma-Aldrich | SRP3003 | |
| AOC1 | Selleckchem | S7217 | |
| Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope | Zeiss | replacable by comparable fluorescent microscopes | |
| AZD0530 | Selleckchem | S1006 | |
| B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| B-27 Supplement without Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System | BTX | 45-2052 | |
| CGP77675 | Sigma-Aldrich | SML0314 | |
| Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A | doi: 10.7554/elife.18683 | ||
| Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 | doi: 10.3390/cells9112422 | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-094 | pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Forskolin | Selleckchem | 2449 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute supplement |
| Heparin (1 mg/mL stock) | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| Human Neurotrophin-3 (NT-3) | PeproTech | 450-03 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| IWR1 | Sigma-Aldrich | I0161 | |
| Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) | Leica | 10473849 | replacable by comparable stereomicroscopes |
| Matrigel | Corning | 354277/354234 | basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | handle with causion due to cancerogenecity |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | PanBiotech | P06-07100 | |
| Petri dish electrode chamber | self-produced (see Supplemental File 1) | also commertially available | |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter |
| Pro-Survival Compound | MerckMillipore | 529659 | |
| Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | PeproTech | AF-450-02 | |
| Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotech | 130-104-368 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | proteolytic and collagenolytic enzyme mixture |
| TrypLE | Gibco | 12604-013 | recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use |
| Ultra-Low Attachment 96-well plates | Costar | 7007 | |
| Y27632 | Stemcell Technologies | 72305 |
References
- Marchetto, M. C. N., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19 (R1), R71-R76 (2010).
- Zhao, X., Bhattacharyya, A. Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders. The American Journal of Human Genetics. 103 (6), 829-857 (2018).
- Zhang, W., et al. Modeling microcephaly with cerebral organoids reveals a WDR62–CEP170–KIF2A pathway promoting cilium disassembly in neural progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2612 (2019).
- Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
- Niu, Y., et al. Transgenic rhesus monkeys produced by gene transfer into early-cleavage–stage embryos using a simian immunodeficiency virus-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17663-17667 (2010).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
- Shi, L., et al. Transgenic rhesus monkeys carrying the human MCPH1 gene copies show human-like neoteny of brain development. National Science Review. 6 (3), 480-493 (2019).
- Heide, M., et al. Human-specific ARHGAP11B increases size and folding of primate neocortex in the fetal marmoset. Science. 369 (6503), 546-550 (2020).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell–derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem cell models of human brain development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Lullo, E. D., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Arlotta, P. Organoids required! A new path to understanding human brain development and disease. Nature Methods. 15 (1), 27-29 (2018).
- Heide, M., Huttner, W. B., Mora-Bermúdez, F. Brain organoids as models to study human neocortex development and evolution. Current Opinion in Cell Biology. 55, 8-16 (2018).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074 (2019).
- Sun, N., Meng, X., Liu, Y., Song, D., Jiang, C., Cai, J. Applications of brain organoids in neurodevelopment and neurological diseases. Journal of Biomedical Science. 28 (1), 30 (2021).
- Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B.
- Pașca, S. P., et al. A nomenclature consensus for nervous system organoids and assembloids. Nature. 609 (7929), 907-910 (2022).
- Kyrousi, C., Cappello, S. Using brain organoids to study human neurodevelopment, evolution and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 9 (1), e347 (2020).
- Teriyapirom, I., Batista-Rocha, A. S., Koo, B. -K.
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2012).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5 (1), 24 (2012).
- Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nature Neuroscience. 6 (12), 1277-1283 (2003).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Fischer, J., et al. Human-specific ARHGAP11B ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Reports. 23 (11), e54728 (2022).
- Stauske, M., et al. Non-human primate iPSC generation, cultivation, and cardiac differentiation under chemically defined conditions. Cells. 9 (6), 1349 (2020).
- Mora-Bermúdez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. eLife. 5, e18683 (2016).
- Petkov, S., Dressel, R., Rodriguez-Polo, I., Behr, R. Controlling the switch from neurogenesis to pluripotency during marmoset monkey somatic cell reprogramming with self-replicating mRNAs and small molecules. Cells. 9 (11), 2422 (2020).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nature Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), dev166884 (2019).
- Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protocols. 3 (1), 101129 (2022).
- Denoth-Lippuner, A., et al. Visualization of individual cell division history in complex tissues using iCOUNT. Cell Stem Cell. 28 (11), 2020.e12-2034.e12 (2021).
- Kelava, I., Chiaradia, I., Pellegrini, L., Kalinka, A. T., Lancaster, M. A. Androgens increase excitatory neurogenic potential in human brain organoids. Nature. 602 (7895), 112-116 (2022).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535.e9-550.e9 (2019).
