מיקרו-הזרקה ממוקדת ואלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים פרימטים לשינוי גנטי
Summary
אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים של פרימטים מספקת גישה מדויקת ויעילה להחדרת שינויים גנטיים חולפים לסוגי אבות ונוירונים שונים במערכת מודל הקרובה להתפתחות ניאו-קורטקס פיזיולוגי של פרימטים (פתו). זה מאפשר את המחקר של תהליכים נוירו-התפתחותיים ואבולוציוניים והוא יכול להיות מיושם גם עבור מודלים המחלה.
Abstract
קליפת המוח היא מבנה המוח החיצוני ביותר והיא אחראית על עיבוד הקלט החושי והפלט המוטורי; הוא נתפס כמקום מושבן של יכולות קוגניטיביות מסדר גבוה יותר אצל יונקים, במיוחד פרימטים. חקר תפקודי גנים במוחות של פרימטים הוא מאתגר מסיבות טכניות ואתיות, אך הקמת טכנולוגיית אורגנואיד המוח אפשרה לחקור את התפתחות המוח במודלים מסורתיים של פרימטים (למשל, מקוק רזוס ומרמוסט מצוי), כמו גם במינים של פרימטים שלא היו נגישים בעבר בניסוי (למשל, קופי אדם גדולים), במערכת מוצדקת מבחינה אתית ופחות תובענית מבחינה טכנית. יתר על כן, אורגנואידים במוח האנושי מאפשרים חקירה מתקדמת של הפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירולוגיות.
מאחר שאורגנואידים במוח משחזרים תהליכים רבים של התפתחות המוח, הם גם מהווים כלי רב-עוצמה לזיהוי הבדלים ולהשוואה תפקודית בין הגורמים הגנטיים העומדים בבסיס התפתחות המוח של מינים שונים בהקשר אבולוציוני. יתרון גדול של שימוש באורגנואידים הוא האפשרות להכניס שינויים גנטיים, המאפשרים בדיקה של תפקודי גנים. עם זאת, המבוא של שינויים כאלה הוא מייגע ויקר. מאמר זה מתאר גישה מהירה וחסכונית לשינוי גנטי של אוכלוסיות תאים בתוך מבנים דמויי חדרים של אורגנואידים מוחיים של פרימטים, תת-סוג של אורגנואידים במוח. שיטה זו משלבת פרוטוקול שונה לייצור אמין של אורגנואידים מוחיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) שמקורם במרמוסט ונפוצים שמקורם במרמוסט עם גישת מיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה. זה מספק כלי יעיל לחקר תהליכים נוירו-התפתחותיים ואבולוציוניים שניתן ליישם גם עבור מודלים של מחלות.
Introduction
חקירת ההתפתחות והאבולוציה הפיזיולוגית (הפתולוגית) של קליפת המוח היא משימה אימתנית שמתעכבת על ידי היעדר מערכות מודל מתאימות. בעבר, מחקרים כאלה היו מוגבלים למודלים דו-ממדיים של תרביות תאים (כגון אב עצבי ראשוני או תרביות תאים עצביים) ולמודלים אבולוציוניים רחוקים של בעלי חיים (כגון מכרסמים)1,2. בעוד מודלים אלה שימושיים להתמודדות עם שאלות מסוימות, הם מוגבלים במידול המורכבות, הרכב סוג התא, הארכיטקטורה התאית ודפוסי ביטוי הגנים של הניאוקורטקס האנושי המתפתח במצבים בריאים וחולים. מגבלות אלה מובילות, למשל, ליכולת תרגום ירודה של מודלים עכבריים של מחלות אנושיות למצב האנושי, כפי שמתואר במקרים מסוימים של מיקרוצפליה (למשל, Zhang et al.3). לאחרונה, פרימטים טרנסגניים שאינם אנושיים, שהם מודל קרוב יותר מבחינה אבולוציונית, תפקודית ומורפולוגית של התפתחות הניאו-קורטקס האנושי, נכנסו למוקד 4,5,6,7,8 כשהם מתגברים על מגבלות רבות של מודלים מבוססי תרביות תאים ומכרסמים. עם זאת, השימוש בפרימטים לא אנושיים במחקר הוא לא רק יקר מאוד וגוזל זמן רב, אלא גם מעלה חששות אתיים. לאחרונה, הפיתוח של טכנולוגיית אורגנואיד המוח 9,10 התגלה כחלופה מבטיחה שפותרת רבות מהמגבלות של מודלים קודמים 11,12,13,14,15,16.
אורגנואידים במוח הם מבנים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים), רב-תאיים המחקים את המאפיינים העיקריים של הציטוארכיטקטורה והרכב התא של אזור מוח אחד או יותר עבור חלון זמן התפתחותי מוגדר 11,12,13,14,17. מבנים תלת-ממדיים אלה נוצרים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) או, אם הם זמינים עבור המינים המעניינים, מתאי גזע עובריים (ESC). באופן כללי, ניתן להבחין בין שני סוגים של אורגנואידים במוח בהתבסס על המתודולוגיה בה נעשה שימוש: אורגנואידים במוח לא מונחים ואזוריים (מונחים)18. ביצירת הסוג השני של אורגנואידים, מולקולות קטנות או גורמים מסופקים המנחים את ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים לאורגנואידים של אזור מוח מסוים (למשל, אורגנואידים במוח הקדמי)18. לעומת זאת, באורגנואידים לא מונחים, ההתמיינות אינה מונחית על ידי תוספת של מולקולות קטנות אלא מסתמכת אך ורק על התמיינות ספונטנית של iPSCs/ESCs. האורגנואידים במוח המתקבלים מורכבים מסוגי תאים המייצגים אזורי מוח שונים (למשל, אורגנואידים מוחיים)18. אורגנואידים במוח משלבים תכונות מפתח רבות של התפתחות המוח עם ייצור חסכוני יחסית וחסכוני בזמן מכל מין של עניין שעבורו iPSCs או תאי גזע עובריים מושרים זמינים11,12,13,14. זה הופך אורגנואידים במוח למודל מצוין עבור סוגים רבים של מחקרים נוירוביולוגיים, החל משאלות אבולוציוניות והתפתחותיות ועד מודלים של מחלות ובדיקות סמים15,16. עם זאת, מענה לשאלות כאלה באמצעות אורגנואידים במוח תלוי מאוד בזמינות של שיטות שונות לשינוי גנטי.
היבט מרכזי אחד של חקר ההתפתחות הפיזיולוגית של ניאו-קורטקס (פתו) והאבולוציה שלה הוא ניתוח פונקציונלי של גנים וגרסאות גנים. זה מושג בדרך כלל על ידי ביטוי (חוץ רחמי) ו / או על ידי דפיקה (KD) או נוק-אאוט (KO) של גנים אלה. שינויים גנטיים כאלה יכולים להיות מסווגים לשינוי גנטי יציב וחולף, כמו גם לשינויים להיות מוגבל זמנית ומרחבית או לא מוגבל. שינוי גנטי יציב מוגדר על ידי הכנסת שינוי גנטי לגנום המארח המועבר לכל דורות התא הבאים. בהתאם לנקודת הזמן של שינוי גנטי, זה יכול להשפיע על כל התאים של אורגנואיד או יכול להיות מוגבל לאוכלוסיות תאים מסוימות. לרוב, שינוי גנטי יציב מושג באורגנואידים במוח ברמת iPSC/ESC על ידי יישום לנטי-וירוסים, מערכות דמויות טרנספוזון וטכנולוגיית CRISPR/Cas9 (נבדקו על-ידי, למשל, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 ו-Teriyapirom et al.20). יש לכך יתרון בכך שכל תאי האורגנואיד במוח נושאים את השינוי הגנטי וכי הוא אינו מוגבל זמנית או מרחבית. עם זאת, הייצור והאפיון של קווי iPSC/ESC יציבים אלה גוזלים זמן רב, ולעתים קרובות לוקח מספר חודשים עד שניתן לנתח את אורגנואידי המוח הראשונים ששונו (נבדקו על ידי למשל, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19, or Teriyapirom et al.20).
לעומת זאת, שינוי גנטי חולף מוגדר על ידי העברת מטען גנטי (למשל, פלסמיד ביטוי גנים) שאינו משתלב בגנום המאכסן. בעוד ששינוי זה יכול, באופן עקרוני, להיות מועבר לדורות התא הבאים, המטען הגנטי המועבר ידולל בהדרגה עם כל חלוקת תא. לכן, סוג זה של שינוי גנטי מוגבל בדרך כלל באופן זמני ומרחבי. שינוי גנטי חולף יכול להתבצע באורגנואידים במוח על ידי וירוסים הקשורים באדנו או על ידי אלקטרופורציה (נבדק על ידי, למשל, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19, ו Teriyapirom et al.20), כאשר האחרון מתואר בפירוט במאמר זה. בניגוד לשינוי גנטי יציב, גישה זו היא מהירה מאוד וחסכונית. אכן, אלקטרופורציה יכולה להתבצע בתוך דקות, ובהתאם לאוכלוסיית תאי היעד, אורגנואידים מחושמלים מוכנים לניתוח תוך ימים (נבדקו על ידי, למשל, Fischer et al.17 ו- Kyrousi et al.19). עם זאת, שינויים מורפולוגיים גסים של אורגנואיד המוח, כגון הבדלים בגודל, לא ניתן לזהות באמצעות שיטה זו, כמו סוג זה של שינוי גנטי מוגבל באופן זמני ומרחבי. הגבלה זו יכולה להיות גם יתרון, למשל, במקרה של חקר אוכלוסיות תאים בודדות בתוך האורגנואיד או ההשפעות על אורגנואידים במוח בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות (שנסקרו על ידי, למשל, Fischer et al.17 ו- Kyrousi et al.19).
גישה קלאסית לחקר תפקוד גנים במהלך התפתחות המוח והאבולוציה היא אלקטרופורציה ברחם. ברחם אלקטרופורציה היא טכניקה ידועה ושימושית להעברת מבני ביטוי גנים למוחות מכרסמים 21,22,23 וחמוס24,25. ראשית, תמיסה המכילה את מבני הביטוי המעניינים מוזרקת במיקרו דרך דופן הרחם לחדר מסוים במוח העוברי, בהתאם לאזור שיש להתמקד בו. בשלב השני, פולסים חשמליים מוחלים כדי להדביק את התאים ישירות רירית החדר הממוקד. גישה זו אינה מוגבלת רק לביטוי חוץ רחמי או ביטוי יתר של גנים, כפי שהיא יכולה להיות מיושמת גם במחקרי KD או KO על ידי הזרקה זעירה של סיכת שיער קצרה (shRNA) או CRISPR/Cas9 (בצורה של פלסמידים ביטוי או ריבונוקלאו פרוטאינים [RNPs]), בהתאמה26,27. עם זאת, לאלקטרופורציה ברחם של עוברי עכבר, חולדה וחמוס יש את אותן מגבלות שתוארו לעיל עבור מודלים אלה של בעלי חיים.
באופן אידיאלי, אחד רוצה לבצע אלקטרופורציה הרחם ישירות פרימטים. בעוד שבאופן עקרוני זה אפשרי מבחינה טכנית, ברחם אלקטרופורציה אינה מתבצעת בפרימטים בשל חששות אתיים, עלויות תחזוקה גבוהות של בעלי חיים וגודל המלטה קטן. עבור פרימטים מסוימים, כגון קופים גדולים (כולל בני אדם), זה לא אפשרי בכלל. עם זאת, לפרימטים אלה יש את הפוטנציאל הגדול ביותר לחקר התפתחות הניאו-קורטקס הפיזיולוגי (הפתולוגי) האנושי והאבולוציה שלו. פתרון אחד לדילמה זו הוא ליישם את טכניקת האלקטרופורציה על אורגנואידים במוח פרימטים28.
מאמר זה מציג פרוטוקול לאלקטרופורציה של תת-סוג של אורגנואידים במוח פרימטים, אורגנואידים מוחיים של פרימטים. גישה זו מאפשרת שינוי גנטי מהיר וחסכוני של אוכלוסיות תאים בתוך המבנים דמויי החדרים של האורגנואידים. באופן ספציפי, אנו מתארים פרוטוקול מאוחד ליצירת אורגנואידים מוחיים פרימטים מבני אדם (הומו ספיינס), שימפנזה (Pan troglodytes), מקוק רזוס (Macaca mulatta) ומרמוסט מצוי (Callithrix jacchus) iPSCs. יתר על כן, אנו מתארים בפירוט את טכניקת המיקרו-הזרקה והאלקטרופורציה ומספקים קריטריונים של “ללכת” ו”לא-ללכת” לביצוע אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים של פרימטים. גישה זו היא כלי יעיל לחקר התפתחות הניאו-קורטקס הפיזיולוגי (הפתולוגי) והתפתחותו במודל קרוב במיוחד למצב האנושי.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההליכים המתוארים כאן מייצגים פרוטוקול אחיד ליצירת אורגנואידים מוחיים ממיני פרימטים שונים עם גישת אלקטרופורציה ממוקדת. זה מאפשר ביטוי חוץ רחמי של GOI במערכת מודל המדמה התפתחות ניאו-קורטקס פיזיולוגית של פרימטים (כולל בני אדם) (פתו). פרוטוקול מאוחד זה ליצירת אורגנואידים מוחיים של פרימטים משת?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מתנצלים בפני כל החוקרים שלא ניתן היה לצטט את עבודתם בשל מגבלות מקום. אנו מודים לאולריך בלייר מהשירותים הטכניים ב-DPZ ולהרטמוט וולף מהסדנה ב-MPI-CBG על בניית תאי אלקטרודות צלחת פטרי; סטויאן פטקוב ורודיגר בהר על אספקת iPSCs לבני אדם (iLonza2.2), מקוק רזוס (iRh33.1) ומרמוסט (cj_160419_5); סברינה היידה עבור cryosectioning ו immunofluorescence צביעה; ונרינגה ליוטקאיט וסזאר מתאו בסטידס בטנקור על קריאה ביקורתית של כתב היד. העבודה במעבדה של W.B.H. נתמכה על ידי מענק ERA-NET NEUROON (MicroKin). העבודה במעבדה של מ.ה. נתמכה על ידי מענק התחלה של ERC (101039421).
Materials
| 20 µL Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 8.05740.0005 | |
| 35 mm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3900 | |
| 60 mm cell culture dishes | CytoOne | CC7682-3359 | |
| Activin A | Sigma-Aldrich | SRP3003 | |
| AOC1 | Selleckchem | S7217 | |
| Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope | Zeiss | replacable by comparable fluorescent microscopes | |
| AZD0530 | Selleckchem | S1006 | |
| B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| B-27 Supplement without Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System | BTX | 45-2052 | |
| CGP77675 | Sigma-Aldrich | SML0314 | |
| Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A | doi: 10.7554/elife.18683 | ||
| Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 | doi: 10.3390/cells9112422 | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-094 | pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Forskolin | Selleckchem | 2449 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute supplement |
| Heparin (1 mg/mL stock) | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| Human Neurotrophin-3 (NT-3) | PeproTech | 450-03 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| IWR1 | Sigma-Aldrich | I0161 | |
| Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) | Leica | 10473849 | replacable by comparable stereomicroscopes |
| Matrigel | Corning | 354277/354234 | basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | handle with causion due to cancerogenecity |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | PanBiotech | P06-07100 | |
| Petri dish electrode chamber | self-produced (see Supplemental File 1) | also commertially available | |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter |
| Pro-Survival Compound | MerckMillipore | 529659 | |
| Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | PeproTech | AF-450-02 | |
| Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotech | 130-104-368 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | proteolytic and collagenolytic enzyme mixture |
| TrypLE | Gibco | 12604-013 | recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use |
| Ultra-Low Attachment 96-well plates | Costar | 7007 | |
| Y27632 | Stemcell Technologies | 72305 |
References
- Marchetto, M. C. N., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19 (R1), R71-R76 (2010).
- Zhao, X., Bhattacharyya, A. Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders. The American Journal of Human Genetics. 103 (6), 829-857 (2018).
- Zhang, W., et al. Modeling microcephaly with cerebral organoids reveals a WDR62–CEP170–KIF2A pathway promoting cilium disassembly in neural progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2612 (2019).
- Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
- Niu, Y., et al. Transgenic rhesus monkeys produced by gene transfer into early-cleavage–stage embryos using a simian immunodeficiency virus-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17663-17667 (2010).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
- Shi, L., et al. Transgenic rhesus monkeys carrying the human MCPH1 gene copies show human-like neoteny of brain development. National Science Review. 6 (3), 480-493 (2019).
- Heide, M., et al. Human-specific ARHGAP11B increases size and folding of primate neocortex in the fetal marmoset. Science. 369 (6503), 546-550 (2020).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell–derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem cell models of human brain development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Lullo, E. D., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Arlotta, P. Organoids required! A new path to understanding human brain development and disease. Nature Methods. 15 (1), 27-29 (2018).
- Heide, M., Huttner, W. B., Mora-Bermúdez, F. Brain organoids as models to study human neocortex development and evolution. Current Opinion in Cell Biology. 55, 8-16 (2018).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074 (2019).
- Sun, N., Meng, X., Liu, Y., Song, D., Jiang, C., Cai, J. Applications of brain organoids in neurodevelopment and neurological diseases. Journal of Biomedical Science. 28 (1), 30 (2021).
- Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. Genetic modification of brain organoids. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 558 (2019).
- Pașca, S. P., et al. A nomenclature consensus for nervous system organoids and assembloids. Nature. 609 (7929), 907-910 (2022).
- Kyrousi, C., Cappello, S. Using brain organoids to study human neurodevelopment, evolution and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 9 (1), e347 (2020).
- Teriyapirom, I., Batista-Rocha, A. S., Koo, B. -. K. Genetic engineering in organoids. Journal of Molecular Medicine. 99 (4), 555-568 (2021).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2012).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5 (1), 24 (2012).
- Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nature Neuroscience. 6 (12), 1277-1283 (2003).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Fischer, J., et al. Human-specific ARHGAP11B ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Reports. 23 (11), e54728 (2022).
- Stauske, M., et al. Non-human primate iPSC generation, cultivation, and cardiac differentiation under chemically defined conditions. Cells. 9 (6), 1349 (2020).
- Mora-Bermúdez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. eLife. 5, e18683 (2016).
- Petkov, S., Dressel, R., Rodriguez-Polo, I., Behr, R. Controlling the switch from neurogenesis to pluripotency during marmoset monkey somatic cell reprogramming with self-replicating mRNAs and small molecules. Cells. 9 (11), 2422 (2020).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nature Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), dev166884 (2019).
- Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protocols. 3 (1), 101129 (2022).
- Denoth-Lippuner, A., et al. Visualization of individual cell division history in complex tissues using iCOUNT. Cell Stem Cell. 28 (11), 2020.e12-2034.e12 (2021).
- Kelava, I., Chiaradia, I., Pellegrini, L., Kalinka, A. T., Lancaster, M. A. Androgens increase excitatory neurogenic potential in human brain organoids. Nature. 602 (7895), 112-116 (2022).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535.e9-550.e9 (2019).
