灵长类动物脑类器官的靶向显微注射和电穿孔用于基因修饰
Summary
灵长类大脑类器官的电穿孔提供了一种精确有效的方法，将瞬时遗传修饰引入接近灵长类（病理）生理新皮层发育的模型系统中的不同祖细胞类型和神经元中。这允许研究神经发育和进化过程，也可以应用于疾病建模。
Abstract
大脑皮层是大脑最外层的结构，负责处理感觉输入和运动输出;它被视为哺乳动物，特别是灵长类动物的高阶认知能力的所在地。由于技术和伦理原因，研究灵长类动物大脑中的基因功能具有挑战性，但大脑类器官技术的建立使得能够在传统的灵长类动物模型（例如恒河猴和普通狨猴）以及以前实验无法进入的灵长类动物物种（例如，类人猿）中研究大脑发育，在一个道德上合理且技术要求较低的系统中。此外，人脑类器官允许对神经发育和神经系统疾病进行高级研究。
由于大脑类器官概括了大脑发育的许多过程，它们也代表了一种强大的工具，可以识别进化背景下各种物种大脑发育背后的遗传决定因素的差异，并在功能上进行比较。使用类器官的一大优点是可以引入基因修饰，从而可以测试基因功能。然而，引入这种修改既费力又昂贵。本文描述了一种快速且具有成本效益的方法，用于对灵长类动物大脑类器官（大脑类器官的一种亚型）的心室样结构内的细胞群进行基因修饰。该方法将改进的方案与显微注射和电穿孔方法相结合，用于从人、黑猩猩、恒河猴和普通狨猴衍生的诱导多能干细胞 （iPSC） 中可靠生成脑类器官。这为研究神经发育和进化过程提供了有效的工具，也可以应用于疾病建模。
Introduction
研究大脑皮层的（病理）生理发育和进化是一项艰巨的任务，由于缺乏合适的模型系统而受到阻碍。以前，此类研究仅限于二维细胞培养模型（例如原代神经祖细胞或神经元细胞培养物）和进化上遥远的动物模型（例如啮齿动物）1，2。虽然这些模型对于解决某些问题很有用，但它们在模拟健康和患病状态下发育中的人类新皮层的复杂性、细胞类型组成、细胞结构和基因表达模式方面受到限制。例如，这些限制导致人类疾病的小鼠模型对人类情况的可转化性差，如某些小头畸形病例所描述的那样（例如，Zhang等人3）。最近，转基因非人灵长类动物，在进化，功能和形态上更接近人类新皮层发育的模型，已经成为焦点4，5，6，7，8，因为它们克服了基于细胞培养和啮齿动物模型的许多限制。然而，在研究中使用非人类灵长类动物不仅非常昂贵和耗时，而且还引起了伦理问题。最近，脑类器官技术9，10的发展已成为一种有前途的替代方案，解决了以前模型11，12，13，14，15，16的许多局限性。
脑类器官是三维（3D）的多细胞结构，在定义的发育时间窗口11，12，13，14，17内模拟一个或多个脑区域的细胞结构和细胞类型组成的主要特征。这些3D结构由诱导多能干细胞（iPSC）产生，或者，如果可用于感兴趣的物种，则由胚胎干细胞（ESC）产生。一般来说，可以根据所使用的方法区分两种类型的脑类器官：无引导和区域化（引导）脑类器官18。在生成后一种类型的类器官时，提供了小分子或因子，引导多能干细胞分化为特定大脑区域的类器官（例如，前脑类器官）18。相比之下，在无引导类器官中，分化不是由添加小分子引导的，而是完全依赖于iPSC/ESC的自发分化。由此产生的脑类器官由代表不同大脑区域的细胞类型（例如，大脑类器官）组成18。脑类器官结合了大脑发育的许多关键特征，以及从任何感兴趣的物种（iPSCs或ESCs可用）相对经济和时间高效的生成11，12，13，14。这使得脑类器官成为多种神经生物学研究的绝佳模型，从进化和发育问题到疾病建模和药物测试15，16。然而，使用大脑类器官解决这些问题在很大程度上取决于不同基因修饰方法的可用性。
研究新皮层（病理）生理发育及其进化的一个关键方面是基因和基因变异的功能分析。这通常是通过这些基因的（异位）表达和/或敲低（KD）或敲除（KO）来实现的。这种遗传修饰可分为稳定和短暂的遗传修饰，以及受时间和空间限制或不受限的修饰。稳定的基因修饰是通过将遗传改变引入宿主基因组来定义的，该改变会传递给所有后续细胞世代。根据基因改造的时间点，它可以影响类器官的所有细胞，也可以仅限于某些细胞群。最常见的是，通过应用慢病毒、转座子样系统和CRISPR/Cas9技术，在iPSC/ESC水平的脑类器官中实现稳定的基因修饰（例如，Fischer等人17，Kyrousi等人19和Teriyapirom等人20）。这样做的好处是，大脑类器官的所有细胞都携带基因修饰，并且不受时间或空间限制。然而，这些稳定的iPSC/ESC系的生成和表征非常耗时，通常需要几个月的时间才能分析第一个修饰的脑类器官（例如，Fischer等人17，Kyrousi等人19或Teriyapirom等人20）。
相反，瞬时遗传修饰的定义是传递不整合到宿主基因组中的遗传货物（例如，基因表达质粒）。虽然这种修饰原则上可以传递给后续细胞代，但传递的遗传货物将随着每次细胞分裂而逐渐稀释。因此，这种类型的基因改造通常在时间和空间上受到限制。瞬时遗传修饰可以通过腺相关病毒或通过电穿孔在脑类器官中进行（例如，Fischer等人17，Kyrousi等人19和Teriyapirom等人20审查），本文将详细描述后者。与稳定的基因改造相比，这种方法非常快速且具有成本效益。事实上，电穿孔可以在几分钟内完成，并且根据靶细胞群的不同，电穿孔类器官可以在几天内准备好进行分析（例如，由Fischer等人17 和Kyrousi等人19审查）。然而，使用这种方法无法检测到大脑类器官的粗大形态变化，例如大小差异，因为这种类型的遗传修饰在时间和空间上受到限制。这种限制也可能是一个优势，例如，在研究类器官内的单个细胞群或在特定发育时间点对大脑类器官的影响的情况下（由例如Fischer等人17 和Kyrousi等人19审查）。
研究大脑发育和进化过程中基因功能的经典方法是子宫电穿孔。在子宫内电穿孔是一种众所周知的有用技术，用于将基因表达构建体递送到啮齿动物21，22，23和雪貂24，25的大脑中。首先，根据要靶向的区域，通过子宫壁将含有目标表达构建体的溶液显微注射到胚胎大脑的某个脑室中。在第二步中，施加电脉冲以转染直接衬在靶心室内的细胞。这种方法不仅限于异位表达或基因的过表达，因为它还可以通过显微注射短发夹（shRNA）或CRISPR / Cas9（以表达质粒或核糖核蛋白[RNPs]的形式）分别应用于KD或KO研究26，27。然而，小鼠、大鼠和雪貂胚胎的子宫内电穿孔具有与上述这些动物模型相同的局限性。
理想情况下，人们希望直接在灵长类动物的 子宫内 进行电穿孔。虽然这在原则上在技术上是可行的，但由于伦理问题、高动物维护成本和小窝产仔数，灵长类动物不会在 子宫内 进行电穿孔。对于某些灵长类动物，例如类人猿（包括人类），这根本不可能。然而，这些灵长类动物在研究人类（病理）生理新皮层发育及其进化方面具有最大的潜力。解决这一困境的一种方法是将电穿孔技术应用于灵长类动物脑类器官28。
本文提出了灵长类脑类器官亚型灵长类脑类器官电穿孔的方案。这种方法允许对类器官的心室样结构内的细胞群进行快速且具有成本效益的遗传修饰。具体来说，我们描述了从人类（智人），黑猩猩（Pan穴居人），恒河猴（Macaca mulatta）和普通狨猴（Callithrix jacchus）iPSCs中产生灵长类动物大脑类器官的统一协议。此外，我们详细描述了显微注射和电穿孔技术，并提供了进行灵长类大脑类器官电穿孔的“通过”和“不通过”标准。这种方法是研究（病理）生理新皮层发育及其在特别接近人类情况的模型中的进化的有效工具。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的程序代表了一个统一的方案，用于使用靶向电穿孔方法从不同的灵长类动物物种中生成大脑类器官。这允许GOI在模拟灵长类动物（包括人类）（病理）生理新皮层发育的模型系统中的异位表达。这种用于生成灵长类动物大脑类器官的统一方案对所有四种灵长类动物使用相同的材料（例如培养基）和方案步骤。这些物种之间的发育差异通过改变关键方案步骤的时间来解决（即，神经诱导?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们向所有由于篇幅限制而无法引用其工作的研究人员表示歉意。我们感谢DPZ技术服务的Ulrich Bleyer和MPI-CBG研讨会的Hartmut Wolf，以建造培养皿电极室;斯托扬·佩特科夫和吕迪格·贝尔提供人类（iLonza2.2）、恒河猴（iRh33.1）和狨猴（cj_160419_5）iPSC;萨布丽娜·海德用于冷冻切片和免疫荧光染色;以及Neringa Liutikaite和César Mateo Bastidas Betancourt批判性地阅读了手稿。W.B.H.实验室的工作得到了ERA网络神经元（MicroKin）资助的支持。M.H.实验室的工作得到了ERC启动补助金（101039421）的支持。
Materials
| 20 µL Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 8.05740.0005 | |
| 35 mm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3900 | |
| 60 mm cell culture dishes | CytoOne | CC7682-3359 | |
| Activin A | Sigma-Aldrich | SRP3003 | |
| AOC1 | Selleckchem | S7217 | |
| Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope | Zeiss | replacable by comparable fluorescent microscopes | |
| AZD0530 | Selleckchem | S1006 | |
| B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| B-27 Supplement without Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System | BTX | 45-2052 | |
| CGP77675 | Sigma-Aldrich | SML0314 | |
| Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A | doi: 10.7554/elife.18683 | ||
| Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 | doi: 10.3390/cells9112422 | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-094 | pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Forskolin | Selleckchem | 2449 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute supplement |
| Heparin (1 mg/mL stock) | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| Human Neurotrophin-3 (NT-3) | PeproTech | 450-03 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| IWR1 | Sigma-Aldrich | I0161 | |
| Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) | Leica | 10473849 | replacable by comparable stereomicroscopes |
| Matrigel | Corning | 354277/354234 | basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | handle with causion due to cancerogenecity |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | PanBiotech | P06-07100 | |
| Petri dish electrode chamber | self-produced (see Supplemental File 1) | also commertially available | |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter |
| Pro-Survival Compound | MerckMillipore | 529659 | |
| Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | PeproTech | AF-450-02 | |
| Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotech | 130-104-368 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | proteolytic and collagenolytic enzyme mixture |
| TrypLE | Gibco | 12604-013 | recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use |
| Ultra-Low Attachment 96-well plates | Costar | 7007 | |
| Y27632 | Stemcell Technologies | 72305 |
References
- Marchetto, M. C. N., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19 (R1), R71-R76 (2010).
- Zhao, X., Bhattacharyya, A. Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders. The American Journal of Human Genetics. 103 (6), 829-857 (2018).
- Zhang, W., et al. Modeling microcephaly with cerebral organoids reveals a WDR62–CEP170–KIF2A pathway promoting cilium disassembly in neural progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2612 (2019).
- Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
- Niu, Y., et al. Transgenic rhesus monkeys produced by gene transfer into early-cleavage–stage embryos using a simian immunodeficiency virus-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17663-17667 (2010).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
- Shi, L., et al. Transgenic rhesus monkeys carrying the human MCPH1 gene copies show human-like neoteny of brain development. National Science Review. 6 (3), 480-493 (2019).
- Heide, M., et al. Human-specific ARHGAP11B increases size and folding of primate neocortex in the fetal marmoset. Science. 369 (6503), 546-550 (2020).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell–derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem cell models of human brain development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Lullo, E. D., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Arlotta, P. Organoids required! A new path to understanding human brain development and disease. Nature Methods. 15 (1), 27-29 (2018).
- Heide, M., Huttner, W. B., Mora-Bermúdez, F. Brain organoids as models to study human neocortex development and evolution. Current Opinion in Cell Biology. 55, 8-16 (2018).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074 (2019).
- Sun, N., Meng, X., Liu, Y., Song, D., Jiang, C., Cai, J. Applications of brain organoids in neurodevelopment and neurological diseases. Journal of Biomedical Science. 28 (1), 30 (2021).
- Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. Genetic modification of brain organoids. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 558 (2019).
- Pașca, S. P., et al. A nomenclature consensus for nervous system organoids and assembloids. Nature. 609 (7929), 907-910 (2022).
- Kyrousi, C., Cappello, S. Using brain organoids to study human neurodevelopment, evolution and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 9 (1), e347 (2020).
- Teriyapirom, I., Batista-Rocha, A. S., Koo, B. -. K. Genetic engineering in organoids. Journal of Molecular Medicine. 99 (4), 555-568 (2021).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2012).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5 (1), 24 (2012).
- Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nature Neuroscience. 6 (12), 1277-1283 (2003).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Fischer, J., et al. Human-specific ARHGAP11B ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Reports. 23 (11), e54728 (2022).
- Stauske, M., et al. Non-human primate iPSC generation, cultivation, and cardiac differentiation under chemically defined conditions. Cells. 9 (6), 1349 (2020).
- Mora-Bermúdez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. eLife. 5, e18683 (2016).
- Petkov, S., Dressel, R., Rodriguez-Polo, I., Behr, R. Controlling the switch from neurogenesis to pluripotency during marmoset monkey somatic cell reprogramming with self-replicating mRNAs and small molecules. Cells. 9 (11), 2422 (2020).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nature Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), dev166884 (2019).
- Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protocols. 3 (1), 101129 (2022).
- Denoth-Lippuner, A., et al. Visualization of individual cell division history in complex tissues using iCOUNT. Cell Stem Cell. 28 (11), 2020.e12-2034.e12 (2021).
- Kelava, I., Chiaradia, I., Pellegrini, L., Kalinka, A. T., Lancaster, M. A. Androgens increase excitatory neurogenic potential in human brain organoids. Nature. 602 (7895), 112-116 (2022).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535.e9-550.e9 (2019).
