Summary
Elektroporation af primater cerebrale organoider giver en præcis og effektiv tilgang til at introducere forbigående genetisk modifikation (er) i forskellige stamfadertyper og neuroner i et modelsystem tæt på primats (pato)fysiologiske neocortexudvikling. Dette muliggør undersøgelse af neurodevelopmental og evolutionære processer og kan også anvendes til sygdomsmodellering.
Abstract
Hjernebarken er den yderste hjernestruktur og er ansvarlig for behandlingen af sensorisk input og motorudgang; Det ses som sæde for højere ordens kognitive evner hos pattedyr, især primater. At studere genfunktioner i primathjerner er udfordrende af tekniske og etiske årsager, men etableringen af hjerneorganoidteknologien har muliggjort studiet af hjernens udvikling i traditionelle primatmodeller (f.eks. rhesusmakak og almindelig silkeaber) såvel som i tidligere eksperimentelt utilgængelige primatarter (f.eks. Store aber) i et etisk forsvarligt og mindre teknisk krævende system. Desuden tillader menneskelige hjerneorganoider avanceret undersøgelse af neuroudviklingsmæssige og neurologiske lidelser.
Da hjerneorganoider rekapitulerer mange processer i hjernens udvikling, repræsenterer de også et kraftfuldt værktøj til at identificere forskelle i og funktionelt sammenligne de genetiske determinanter, der ligger til grund for hjernens udvikling af forskellige arter i en evolutionær sammenhæng. En stor fordel ved at bruge organoider er muligheden for at indføre genetiske modifikationer, som gør det muligt at teste genfunktioner. Indførelsen af sådanne ændringer er imidlertid besværlig og dyr. Dette papir beskriver en hurtig og omkostningseffektiv tilgang til genetisk modifikation af cellepopulationer inden for ventrikellignende strukturer af primater cerebrale organoider, en undertype af hjerneorganoider. Denne metode kombinerer en modificeret protokol til pålidelig generering af cerebrale organoider fra human-, chimpanse-, rhesusmakak- og almindelige marmosetafledte inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) med en mikroinjektions- og elektroporationstilgang. Dette giver et effektivt værktøj til undersøgelse af neurodevelopmental og evolutionære processer, der også kan anvendes til sygdomsmodellering.
Introduction
Undersøgelse af den (pato)fysiologiske udvikling og udvikling af hjernebarken er en formidabel opgave, der hæmmes af manglen på egnede modelsystemer. Tidligere var sådanne undersøgelser begrænset til todimensionelle cellekulturmodeller (såsom primære neurale stamfader eller neuronale cellekulturer) og evolutionært fjerne dyremodeller (såsom gnavere)1,2. Mens disse modeller er nyttige til at løse visse spørgsmål, er de begrænsede til modellering af kompleksiteten, celletypesammensætningen, cellulær arkitektur og genekspressionsmønstre for den udviklende humane neocortex i sunde og syge tilstande. Disse begrænsninger fører f.eks. til dårlig oversættelighed af musemodeller af menneskelige sygdomme til den menneskelige situation, som beskrevet for visse tilfælde af mikrocefali (f.eks. Zhang et al.3). For nylig er transgene ikke-menneskelige primater, som er en evolutionært, funktionelt og morfologisk tættere model for menneskelig neocortexudvikling, kommet i fokus 4,5,6,7,8, da de overvinder mange begrænsninger af cellekultur- og gnaverbaserede modeller. Anvendelsen af ikke-menneskelige primater i forskning er imidlertid ikke kun meget dyr og tidskrævende, men giver også anledning til etiske betænkeligheder. For nylig har udviklingen af hjerneorganoidteknologi 9,10 vist sig som et lovende alternativ, der løser mange af begrænsningerne i tidligere modeller 11,12,13,14,15,16.
Hjerneorganoider er tredimensionelle (3D), multicellulære strukturer, der efterligner hovedtræk ved cytoarkitekturen og celletypesammensætningen af en eller flere hjerneområder i et defineret udviklingstidsvindue 11,12,13,14,17. Disse 3D-strukturer genereres enten fra inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) eller, hvis de er tilgængelige for den pågældende art, fra embryonale stamceller (ESC'er). Generelt kan der skelnes mellem to typer hjerneorganoider baseret på den anvendte metode: ustyrede og regionaliserede (guidede) hjerneorganoider18. Ved generering af sidstnævnte type organoider tilvejebringes små molekyler eller faktorer, der styrer differentieringen af de pluripotente stamceller til organoider i et bestemt hjerneområde (f.eks. Forhjerneorganoider)18. I modsætning hertil styres differentieringen i ikke-styrede organoider ikke af tilsætning af små molekyler, men er udelukkende afhængig af den spontane differentiering af iPSC'erne/ESC'erne. De resulterende hjerneorganoider består af celletyper, der repræsenterer forskellige hjerneområder (f.eks. cerebrale organoider)18. Hjerneorganoider kombinerer mange nøglefunktioner i hjernens udvikling med relativt omkostnings- og tidseffektiv generering fra enhver art af interesse, for hvilke iPSC'er eller ESC'er er tilgængelige 11,12,13,14. Dette gør hjerneorganoider til en fremragende model for mange slags neurobiologiske undersøgelser, lige fra evolutionære og udviklingsmæssige spørgsmål til sygdomsmodellering og lægemiddeltest15,16. Imidlertid afhænger adressering af sådanne spørgsmål ved hjælp af hjerneorganoider stærkt af tilgængeligheden af forskellige metoder til genetisk modifikation.
Et centralt aspekt ved at studere neocortex (pato)fysiologisk udvikling og dens udvikling er den funktionelle analyse af gener og genvarianter. Dette opnås normalt ved (ektopisk) ekspression og / eller ved knock-down (KD) eller knock-out (KO) af disse gener. Sådanne genetiske modifikationer kan klassificeres i stabil og forbigående genetisk modifikation samt i, at modifikationerne er tidsmæssigt og rumligt begrænsede eller ikke begrænsede. Stabil genetisk modifikation defineres ved indførelse af en genetisk ændring i værtsgenomet, der overføres til alle efterfølgende cellegenerationer. Afhængigt af tidspunktet for genetisk modifikation kan det påvirke alle celler i en organoid eller kan begrænses til bestemte cellepopulationer. Oftest opnås stabil genetisk modifikation i hjerneorganoider på iPSC/ESC-niveau ved anvendelse af lentivirus, transposonlignende systemer og CRISPR/Cas9-teknologien (gennemgået af f.eks. Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 og Teriyapirom et al.20). Dette har den fordel, at alle celler i hjerneorganoid bærer den genetiske modifikation, og at den ikke er tidsmæssigt eller rumligt begrænset. Imidlertid er genereringen og karakteriseringen af disse stabile iPSC / ESC-linjer meget tidskrævende og tager ofte flere måneder, indtil de første modificerede hjerneorganoider kan analyseres (gennemgået af f.eks. Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 eller Teriyapirom et al.20).
I modsætning hertil defineres forbigående genetisk modifikation ved levering af genetisk last (f.eks. Et genekspressionsplasmid), der ikke integreres i værtsgenomet. Mens denne modifikation i princippet kan overføres til efterfølgende cellegenerationer, vil den leverede genetiske last gradvist blive fortyndet med hver celledeling. Derfor er denne type genetisk modifikation normalt tidsmæssigt og rumligt begrænset. Forbigående genetisk modifikation kan udføres i hjerneorganoider af adeno-associerede vira eller ved elektroporation (gennemgået af f.eks. Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 og Teriyapirom et al.20), hvor sidstnævnte beskrives detaljeret i denne artikel. I modsætning til stabil genetisk modifikation er denne tilgang meget hurtig og omkostningseffektiv. Faktisk kan elektroporation udføres inden for få minutter, og afhængigt af målcellepopulationen (e) er elektroporerede organoider klar til analyse inden for få dage (gennemgået af f.eks. Fischer et al.17 og Kyrousi et al.19). Imidlertid kan grove morfologiske ændringer i hjerneorganoiden, såsom forskelle i størrelse, ikke påvises ved hjælp af denne metode, da denne type genetisk modifikation er tidsmæssigt og rumligt begrænset. Denne begrænsning kan også være en fordel, for eksempel i tilfælde af at studere individuelle cellepopulationer inden for organoiden eller virkningerne på hjerneorganoider på specifikke udviklingstidspunkter (gennemgået af f.eks. Fischer et al.17 og Kyrousi et al.19).
En klassisk tilgang til at studere genfunktion under hjernens udvikling og evolution er in utero elektroporation. In utero elektroporation er en velkendt og nyttig teknik til levering af genekspressionskonstruktioner i gnavere 21,22,23 og fritter 24,25 hjerner. For det første mikroinjiceres en opløsning, der indeholder ekspressionskonstruktionen (e) af interesse, gennem livmodervæggen ind i en bestemt ventrikel i den embryonale hjerne, afhængigt af den region, der skal målrettes. I det andet trin påføres elektriske impulser for at transfektere cellerne, der direkte forer den målrettede ventrikel. Denne tilgang er ikke kun begrænset til ektopisk ekspression eller overekspression af gener, da den også kan anvendes i KD- eller KO-undersøgelser ved mikroinjektion af kort hårnål (shRNA) eller CRISPR/Cas9 (i form af ekspressionsplasmider eller ribonukleoproteiner [RNP'er]), henholdsvis26,27. Imidlertid har in utero elektroporation af muse-, rotte- og fritteembryoner de samme begrænsninger som beskrevet ovenfor for disse dyremodeller.
Ideelt set vil man gerne udføre i utero elektroporation direkte i primater. Selv om dette i princippet er teknisk muligt, udføres elektroporation in utero ikke i primater på grund af etiske bekymringer, høje omkostninger til dyrevedligeholdelse og små kuldstørrelser. For visse primater, såsom menneskeaber (herunder mennesker), er dette slet ikke muligt. Imidlertid har disse primater det største potentiale for undersøgelsen af menneskelig (pato) fysiologisk neocortexudvikling og dens udvikling. En løsning på dette dilemma er at anvende elektroporationsteknikken på primathjerneorganoider28.
Dette papir præsenterer en protokol til elektroporation af en undertype af primathjerneorganoider, primathjerneorganoider. Denne tilgang muliggør hurtig og omkostningseffektiv genetisk modifikation af cellepopulationer inden for organoidernes ventrikellignende strukturer. Specifikt beskriver vi en samlet protokol til generering af primater cerebrale organoider fra mennesker (Homo sapiens), chimpanser (Pan troglodytes), rhesus makak (Macaca mulatta) og almindelige silkeaber (Callithrix jacchus) iPSC'er. Desuden beskriver vi mikroinjektions- og elektroporationsteknikken detaljeret og giver "go" og "no-go" kriterier for udførelse af primat cerebral organoid elektroporation. Denne tilgang er et effektivt redskab til at studere (pato)fysiologisk neocortex udvikling og dens udvikling i en model, der er særlig tæt på den menneskelige situation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kultur af primater iPSC'er
BEMÆRK: På grund af sin robusthed kan den metode, der præsenteres her, anvendes på enhver primat iPSC-linje. I denne artikel beskriver vi cerebral organoidproduktion fra humane (iLonza2.2)29, chimpanser (Sandra A)30, rhesusmakak (iRh33.1)29 og almindelige silkeaber (cj_160419_5)31 iPSC-linjer. Kulturbetingelserne er opsummeret i tabel 1. Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle materialer, reagenser og udstyr, der anvendes i denne protokol.
- For dyrkning af de respektive iPSC'er skal du følge de oprindeligt beskrevne dyrkningsbetingelser. Generelt skal du bruge iPSC-linjer, der ikke er dyrket i mere end 90 passager, til vellykket generering og elektroporation af cerebrale organoider. Derudover skal du i starten af cerebral organoidgenerering sikre, at iPSC'er udviser træk ved pluripotens uden tegn på differentiering.
2. Generering af cerebrale organoider fra primater iPSC'er
BEMÆRK: Protokollen for cerebral organoidgenerering er baseret på en modificeret version 28,30,32,33 af den oprindelige cerebrale organoidprotokol 10,34 med nogle artsspecifikke ændringer (beskrevet nedenfor).
- Såning af iPSC'er til generering af embryoidlegemer (EB'er)
- Når iPSC'erne har nået 80% -90% sammenløb, vaskes de med Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) og tilsættes 500 μL rekombinant trypsinerstatning eller 1 ml proteolytisk og kollagenolytisk blanding.
BEMÆRK: Typisk dyrkes iPSC'er i en 60 mm cellekulturskål for at opnå ca. 900.000 celler, hvilket er nok til at generere 96 cerebrale organoider. Cellenumrene kan justeres afhængigt af antallet af nødvendige organoider. Vær opmærksom på, at ikke alle de genererede cerebrale organoider kan være egnede til elektroporation. - Skålen inkuberes ved 37 °C i 2 minutter for at løsne cellerne.
BEMÆRK: Der kan være behov for op til yderligere 2 minutters inkubation ved 37 °C afhængigt af den anvendte iPSC-linje eller det anvendte enzym. Det anbefales at undersøge skålen under et mikroskop for at sikre, at cellerne er begyndt at løsne sig. - Der tilsættes 1,5 ml forvarmet (37 °C) iPSC-dyrkningsmedium for at standse reaktionen, og pipetten øges og nedlægges 7x-10x (højst 10x) for at adskille cellerne fra cellekulturskålen og opnå en enkeltcellesuspension.
- Overfør cellesuspensionen til et 15 ml konisk centrifugeglas, og centrifuger cellerne ved 200 × g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten suges op, og pelletsen resuspenderes i 2 ml iPSC-dyrkningsmedium suppleret med enten 50 μM Y27632 eller 50 μM pro-overlevelsesforbindelse.
- Brug 10 μL af cellesuspensionen til at tælle cellerne ved hjælp af et Neubauer-kammer.
- Cellesuspensionen justeres til en koncentration på 9.000 celler pr. 150 μL (60.000 celler/ml) ved hjælp af iPSC-dyrkningsmedium suppleret med 50 μM Y27632 eller 50 μM pro-overlevelsesforbindelse.
- For at generere embryoidlegemer (EB'er) frø 150 μL af cellesuspensionen i hver brønd i en 96-brøndplade med ultralav fastgørelse. Under pipettering rystes forsigtigt røret , der indeholder cellesuspensionen, for at forhindre, at cellerne sedimenterer.
- Dyrk EB'erne i en ydmyget atmosfære af 5% CO2 og 95% luft ved 37 ° C (0 dage efter såning [dps]). Forstyr ikke EB'erne inden for de første 24 timer efter såning.
BEMÆRK: EB'er genereret fra silkeaber iPSC'er skal dyrkes i en ydmyget atmosfære under hypoxiske forhold (5% CO 2, 5% O 2 og 90% N 2) ved 37 ° C. - Efter ~48 timer (2 dps) ændres mediet til iPSC-dyrkningsmediet uden Y27632/pro-overlevelsesforbindelse. Der fjernes 100 μL substrat pr. hul, og der tilsættes 150 μL forvarmet (37 °C) frisksubstrat uden Y27632. Gå række for række.
- Udfør yderligere medieskift hver anden dag; 150 μL substrat fjernes fra hvert hul, og der tilsættes 150 μL forvarmet (37 °C) frisksubstrat uden Y27632/pro-overlevelsesforbindelse pr. hul.
BEMÆRK: Efter 4-5 dps skal periferien af EB'erne blive gennemsigtig.
- Når iPSC'erne har nået 80% -90% sammenløb, vaskes de med Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS) og tilsættes 500 μL rekombinant trypsinerstatning eller 1 ml proteolytisk og kollagenolytisk blanding.
- Induktion af neuroectoderm
BEMÆRK: Generelt bør EB'er af god kvalitet have glatte konturer og gennemsigtige grænser på dette stadium. Tidspunkterne for neural induktion varierer lidt mellem primatarter og iPSC-linjer. I tilfælde af de cellelinjer, der anvendes her (se afsnit 1 og materialetabel), skal neural induktion for silkeaber EB'er normalt startes ved 4 dps, for rhesusmakak ved 5 dps og for humane og chimpanse EB'er ved 4-5 dps (figur 1A), afhængigt af EB'ernes tilstand (se ovenfor).- Der fjernes 150 μL substrat fra hvert hul i den første række af 96-brøndspladen, og der tilsættes 150 μL forvarmet (37 °C) neuralt induktionsmedium (se tabel 2) pr. hul i samme række.
- Fortsæt med at ændre mediet som beskrevet ovenfor række for række for hele 96-brøndspladen. Udfør yderligere neurale induktionsmediumskift (NIM) hver anden dag ved at fjerne 150 μL NIM fra hvert hul og tilføje 150 μL forvarmet (37 °C) frisk NIM.
BEMÆRK: Fra dette tidspunkt bør silkeaber dyrkes under de samme betingelser som de andre primater EB'er (fugtighedsholdig atmosfære med 5% CO2 og 95% luft ved 37 ° C).
- Indlejring i kældermembranmatrix
BEMÆRK: Når EB'erne har udviklet et udtalt, gennemskinneligt, radialt organiseret neuroepitel på overfladen, skal der ydes strukturel støtte til udvikling af ventrikellignende strukturer. Dette opnås ved at indlejre EB'erne i en kældermembranmatrix. På grund af forskelle i udviklingshastigheder er marmoset og rhesus macaque EB'er klar til indlejring allerede ved 7 dps, mens human og chimpanse EB'er normalt er indlejret ved 8-9 dps. For nemheds skyld refererer kældermembranmatrix kun til Matrigel i denne protokol. Geltrex kan dog bruges som erstatning.- Som forberedelse til indlejring UV-steriliseres saks, tang, et lille stativ til 0,2 ml rør og tre til seks firkanter parafilm behandlet med 70% (vol / vol) ethanol under laminar flowhætten i 15 minutter. Lad kældermembranmatrixen tø op på is i flere timer (~ 1,5 ml kældermembranmatrix er normalt nok til 96 EB'er).
BEMÆRK : Hold altid kældermembranmatrixen på is. - Opret et 4 x 4 fordybningsgitter på parafilmen. Placer parafilmgitteret på 0,2 ml rørstativet, så den papirindhyllede side vender opad, og tryk forsigtigt en behandskefinger mod hvert hul i stativet.
- Fjern papiret, og klip fordybningsgitteret ud af parafilmfirkanten ved hjælp af en saks for at justere størrelsen, så den passer ind i en 60 mm cellekulturskål. Placer den fordybede parafilm tilbage på 0,2 ml rørstativet for at danne grundlag for dannelsen af kældermembranmatrixdråber.
- Brug en pipette med en skåret 200 μL pipettespids til forsigtigt at overføre EB'erne efter hinanden fra brønden i kulturskålen til parafilmfordybningerne.
- Når du har flyttet 16 EB'er til gitteret, skal du tage en ny 200 μL pipettespids og fjerne det resterende medium fra fordybningerne.
- Der pipetteres en dråbe (~15 μL) kældermembranmatrix på hver fordybning, der indeholder en EB.
- Tag en 10 μL pipettespids og flyt hurtigt EB'erne ind i midten af hver dråbe uden at forstyrre dråbekanterne.
- Den fordybede parafilm anbringes med kældermembranmatrixdråberne i en 60 mm cellekulturskål, og den inkuberes i 15-30 minutter ved 37 °C for at lade matrixen polymerisere.
- For at løsne de matrixindlejrede EB'er fra parafilmen tilsættes 5 ml differentieringsmedium (DM) uden vitamin A ( se tabel 2) til skålen og vendes parafilmfirkanten på hovedet med pincet, så siden med EB'erne vender mod bunden af skålen.
- Ryst forsigtigt skålen for at få kældermembranmatrixdråberne, der indeholder EB'erne, løsnet fra parafilmen. Hvis nogle af dem stadig er fastgjort, skal du tage en kant af parafilmfirkanten ved hjælp af tang og hurtigt rulle den op mod midten af skålen flere gange.
- Kultiver cerebrale organoider på en orbital shaker ved 55 rpm i en ydmyget atmosfære af 5% CO2 og 95% luft ved 37 ° C. Opbevar dem i DM uden vitamin A med mellemstore ændringer hver anden dag. For at inducere produktionen af neuroner skal du skifte til DM med vitamin A (retinsyre, RA) efter 13 dps for marmoset og rhesus makak cerebrale organoider eller 14-15 dps for humane og chimpanse cerebrale organoider (figur 1A). Fra dette tidspunkt skal du ændre mediet hver 3-4 dage.
BEMÆRK: For at understøtte neuronal overlevelse kan DM med vitamin A suppleres med 20 μg / ml human neurotrophin 3 (NT3), 20 μg / ml hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF) og 1 μL / ml kældermembranmatrix fra 40 dps på.
- Som forberedelse til indlejring UV-steriliseres saks, tang, et lille stativ til 0,2 ml rør og tre til seks firkanter parafilm behandlet med 70% (vol / vol) ethanol under laminar flowhætten i 15 minutter. Lad kældermembranmatrixen tø op på is i flere timer (~ 1,5 ml kældermembranmatrix er normalt nok til 96 EB'er).
3. Elektroporation af primat cerebrale organoider
BEMÆRK: Fra et teknisk synspunkt kan elektroporationen af cerebrale organoider udføres, så snart de ventrikellignende strukturer er udtalt nok til at blive målrettet mod mikroinjektion. Det optimale elektroporationstidsvindue afhænger af det biologiske spørgsmål og af den eller de cellepopulationer, der er af interesse. For eksempel, hvis apikale forfædre (AP'er) er hovedmålet, er cerebrale organoider på omkring 30 dps allerede egnede. Hvis basale stamfædre (BP'er) eller neuroner er hovedmålene, bør ældre cerebrale organoider på mere end 50 dps anvendes (se for eksempel Fischer et al.28).
- Forberedelse af elektroporationsopsætningen
BEMÆRK: Elektroporationseffektiviteten påvirkes stærkt af størrelsen og koncentrationen af det eller de elektroporerede plasmider (se diskussionsafsnittet for detaljer).- Der fremstilles en tilstrækkelig mængde elektroporationsblanding til kontrol og gen af interesse (GOI), f.eks. 10 μL elektroporationsblanding for hver kontrol og GOI til elektroporat ca. 30 cerebrale organoider pr. tilstand.
BEMÆRK: For sammensætningen af elektroporationsblandingerne, se tabel 3. - Forvarm (ikke-steril) Dulbeccos modificerede Eagle medium/næringsstofblanding F-12 (DMEM/F12) og DM med vitamin A til 37 °C. Forbered en lille spatel og fin og normal saks, og sprøjt instrumenterne med 70% (vol / vol) ethanol.
BEMÆRK: Følgende trin kan udføres enten under sterile eller ikke-sterile forhold, da DM indeholder antibiotika (se tabel 2). Det er vores erfaring, at fraværet af sterilitet aldrig har forårsaget nogen kontaminering. - Tilbered 35 mm cellekulturskåle, og tilslut petriskålelektrodekammeret til elektroporatoren.
BEMÆRK: Petri parabolelektrodekamre er kommercielt tilgængelige. De kan dog let fremstilles på en omkostningseffektiv måde (se supplerende fil 1). - Brug mikrolæsserspidser til at fylde mikroinjektionsnåle med 8 μL af hver elektroporationsblanding. Klip nålespidserne med en fin saks inden første brug for at opnå et stabilt flow. Fjern dog kun en lille del af spidsen, da en stump og bred spids kan beskadige organoiderne alvorligt.
BEMÆRK: Mikroinjektionsnåle er enten kommercielt tilgængelige som fortrukne mikroinjektionsnåle eller kan trækkes i laboratoriet, hvis en nåletrækker er tilgængelig. Følg nåleudtrækkerproducentens anvisninger for at generere mikroinjektionsnåle med en lang konus og en diameter på 10 μm spids.
- Der fremstilles en tilstrækkelig mængde elektroporationsblanding til kontrol og gen af interesse (GOI), f.eks. 10 μL elektroporationsblanding for hver kontrol og GOI til elektroporat ca. 30 cerebrale organoider pr. tilstand.
- Mikroinjektion og elektroporation
- Under et mikroskop skal du vælge fem cerebrale organoider med glatte grænser og tydeligt synlige ventrikellignende strukturer. De flyttes til en 35 mm cellekulturskål, der indeholder forvarmet (37 °C) DMEM/F12 ved hjælp af en skåret 1.000 μL pipettespids.
BEMÆRK: Vælg cerebrale organoider med udtalte og tilgængelige ventrikellignende strukturer (se figur 1B). - For at injicere en ventrikellignende struktur skal du forsigtigt indsætte nålen gennem væggen og infundere den med elektroporationsblandingen, indtil den er synligt fyldt. Anvend ikke for stort pres på ventrikellignende strukturer for at undgå, at de brister. Fortsæt med seks til otte ventrikellignende strukturer af hver cerebral organoid på denne måde.
BEMÆRK: Hvis nålen bliver tilstoppet under mikroinjektionsprocessen, skal spidsen trimmes let. - Overfør en mikroinjiceret cerebral organoid til petriskålelektrodekammeret med en lille mængde DMEM / F12. Arranger organoiden på en måde, så overfladerne af de mikroinjicerede ventrikellignende strukturer vender mod elektroden, der er forbundet med elektroporatorens positive pol.
BEMÆRK: Orientering af strukturerne på denne måde sikrer, at cellerne transfekteres på siden af den ventrikellignende struktur, der ikke påvirkes af en tilstødende struktur. - Elektroporat cerebrale organoider en efter en ved hjælp af følgende indstillinger: 5 pulser på 80 V, en pulsvarighed på 50 ms og et interval på 1 s. De elektroporerede organoider flyttes til en ny 35 mm cellekulturskål fyldt med forvarmet (37 °C) DMEM/F12.
BEMÆRK: Elektroporationsindstillingerne kan afhænge af den tilgængelige kvadratbølgeelektroporator. Disse indstillinger er optimeret til det refererede elektroporationssystem. Forøgelse af spændingen kan føre til forskydning af cellerne. - Fortsæt på samme måde med de næste fem cerebrale organoider ved hjælp af den anden elektroporationsblanding (for eksempel GOI).
BEMÆRK: Gentag trin 3.2.1-3.2.5, indtil det ønskede antal elektroporerede cerebrale organoider er nået. - Hvis mikroinjektionen og elektroporationen blev udført under ikke-sterile forhold, overføres de elektroporerede organoider til en steril 35 mm cellekulturskål under en laminar strømningshætte, mens så lidt DMEM/F12 som muligt flyttes til den nye cellekulturskål.
- Under et mikroskop skal du vælge fem cerebrale organoider med glatte grænser og tydeligt synlige ventrikellignende strukturer. De flyttes til en 35 mm cellekulturskål, der indeholder forvarmet (37 °C) DMEM/F12 ved hjælp af en skåret 1.000 μL pipettespids.
- Yderligere kultur og fiksering af cerebrale organoider
- De elektroporerede organoider dyrkes i DM med A-vitamin på en orbitalryster ved 55 omdr./min. i en befugtet atmosfære med 5% CO2 og 95 % luft ved 37 °C.
- Den næste dag efter elektroporation skal du kontrollere cerebrale organoider for vellykket elektroporation under et konventionelt inverteret fluorescensmikroskop.
BEMÆRK: Afhængigt af længden af den videre kultur efter elektroporation påvirkes forskellige cellepopulationer i cerebral organoid (se også afsnittet om repræsentative resultater). - Fortsæt med downstream-applikationer efter dyrkning af de elektroporerede cerebrale organoider i et tidsrum, der er egnet til det biologiske spørgsmål af interesse.
BEMÆRK: Elektroporerede cerebrale organoider kan behandles til forskellige downstream-applikationer (f.eks. fiksering til immunofluorescensfarvning eller snapfrosset til RNA-isolering og qRT-PCR). Her beskriver vi fikseringen af elektroporerede cerebrale organoider. - Overfør de elektroporerede organoider til et 15 ml konisk centrifugerør ved hjælp af en skåret 1.000 μl pipettespids, og fjern overskydende medium.
- Tilsæt en tilstrækkelig mængde 4% paraformaldehyd (PFA) i DPBS (pH 7,5) og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.
FORSIGTIG: PFA er klassificeret som kræftfremkaldende for mennesker og kan forårsage uoprettelig sundhedsskade. Yderligere forholdsregler, herunder nitrilhandsker og beskyttelsesbriller, anbefales kraftigt. - Opsug PFA, tilsæt 5 ml DPBS, ryst lidt og aspirer DPBS. Gentag dette 2x. Organoiderne opbevares i DPBS ved 4 °C indtil yderligere brug.
OBS: Protokollen kan sættes på pause her, da PFA-fikserede cerebrale organoider kan opbevares ved 4 °C i flere måneder. PFA-fikserede elektroporerede organoider kan analyseres ved kryosektion og immunofluorescensfarvning 10,28 eller ved helmonteret farvning og rydning 35,36. For eksempel, se afsnittet om repræsentative resultater (se tabel 4 for antistofdetaljer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet her tillader effektiv generering af cerebrale organoider fra humane, chimpanser, rhesusmakak og almindelige silkeaber iPSC-linjer med minimale tidsændringer, der kræves mellem arter (figur 1A). Disse organoider kan elektroporeres i området fra 20 dps til 50 dps, afhængigt af tilgængeligheden af de ventrikellignende strukturer og overflod af cellepopulationen (e) af interesse. Før elektroporation er det imidlertid vigtigt at afgøre, om cerebrale organoider er af tilstrækkelig kvalitet til at blive elektroporeret.
En cerebral organoid, der er ideel til elektroporation, bør udvise udtalte lyse ventrikellignende strukturer i periferien, ingen tegn på degeneration (f.eks. løsrivelse af celler, forstørret apoptotisk kerne) og en generelt kompakt sund morfologi (f.eks. Ingen overdreven udvækst) (figur 1B, "Go"). Det foretrækkes at vælge cerebrale organoider med store, velorganiserede, ventrikellignende strukturer for at målrette mod et højere antal celler. Hvis den perifere zone af en organoid er mørk og ikke viser nogen fremspringende strukturer, anbefales det ikke at bruge den til elektroporation, da de præcise mikroinjektioner kan blive kompromitteret af manglen på visuelle tegn (figur 1B, "No-go"). For at opnå en optimal cerebral organoid morfologi er det vigtigt at sikre, at kritiske trin såsom neuroectoderm induktion og matrixindlejring er veltimede. Problemer vedrørende cerebral organoid morfologi stammer typisk fra mislykket neuroektoderm og / eller neuroepitelknoppedannelse. Dette skyldes normalt suboptimal timing af den neurale induktion og / eller indlejring af kældermembranmatrixen og kan løses ved at justere timingen af disse trin (yderligere fejlfindingstips til cerebral organoiddannelse findes i Lancaster og Knoblich34).
Efter elektroporation kan en første vurdering af dens succes og dens effektivitet udføres efter 12 timer, når GFP-ekspressionen af de transfekterede celler bliver detekterbar under et konventionelt inverteret fluorescensmikroskop. Ideelt set udsender flere ventrikellignende strukturer på dette stadium lysegrøn fluorescens lokaliseret til en af deres sider (figur 2A). Dette indikerer procedurens høje præcision og effektivitet. Vellykkede elektroporerede cerebrale organoider af de fire forskellige primatarter (dvs. menneske, chimpanse, rhesusmakak og almindelig silkeaber) viser lignende GFP-positive mønstre inden for de målrettede ventrikellignende strukturer (figur 2A). Efter fiksering og kryosektion af elektroporerede primater cerebrale organoider udviser vellykkede elektroporerede ventrikellignende strukturer af alle fire arter kolonner af GFP-positive celler inden for den radialt organiserede og tæt pakkede ventrikulære zone (VZ) (figur 2B). Kvantificeringen af de DAPI-positive celler, der også var GFP-positive i sådanne områder af chimpansen og marmoset cerebrale organoider 2 dage efter elektroporation (17 ventrikler fra 12 organoider kvantificeret) viste, at i gennemsnit blev ca. en tredjedel af cellerne (33%, SD ± 12%) med succes elektroporeret.
Suboptimale elektroporationer er markeret enten af et lille antal GFP-positive celler i den ventrikellignende struktur (figur 3A) eller af nogle få GFP-positive celler fjernt fra enhver ventrikellignende struktur (figur 3B). Et lavt antal GFP-positive celler skyldes en dårlig plasmidoptagelse. Dette kan enten skyldes en lav plasmidkoncentration forårsaget af en utilstrækkelig mængde mikroinjiceret elektroporationsblanding eller på grund af elektriske impulser, der ikke er godt rettet, hvilket kan skyldes suboptimal placering af cerebrale organoider i petriskålelektrodekammeret. Et lavt antal GFP-positive celler fjernt fra enhver ventrikellignende struktur skyldes elektroporation af postmitotiske celler i cerebral organoid (fx neuroner) på grund af en upræcis mikroinjektion. Disse suboptimale elektroporationer skal udelukkes fra yderligere analyser.
Den pålidelige identifikation af de celletyper, der findes i cerebrale organoider, er blandt andet baseret på cellepositionen inden for en ventrikellignende struktur, hvilket kræver en grænsedefinition mellem VZ og SVZ / neuronberiget zone. Denne grænse kan identificeres ved VZ's radiale organisation og egenskaber med høj cellekernetæthed (se DAPI-farvning i supplerende figur S1). Bekræftelsen af VZ / SVZ-grænsen kan udføres ved immunofluorescensfarvning for neurale stammarkører såsom PAX6 eller SOX2, som udtrykkes af stort set alle VZ-celler (AP'er) og nogle SVZ-celler (BP'er). Tilstedeværelsen af en neuronberiget zone kan valideres ved immunofluorescensfarvning for neuronale markører såsom klasse III β-tubulin (TUJ1) eller NeuN (supplerende figur S1).
Varigheden af cerebral organoidkultur efter elektroporation afhænger af det biologiske spørgsmål og de cellepopulationer af interesse. I en nylig undersøgelse blev det påvist, at forskellige længder af yderligere kultur efter elektroporation påvirker forskellige cellepopulationer i chimpanse cerebrale organoider, lige fra AP'er til øvre lag neuroner24. Her viser vi lignende resultater for elektroporerede silkedyrorganoider. Specifikt er GFP-positive celler 2 dage efter elektroporation næsten udelukkende lokaliseret i VZ og er også positive for PAX6 - en markør for neurale stamceller - hvilket indikerer, at disse celler er AP'er eller nyfødte BP'er (figur 4A). Hvis dyrkningsperioden efter elektroporation forlænges til 10 dage, lokaliseres GFP-positive celler i basalområderne (dvs. SVZ og neuronberiget zone) (figur 4B, C). Disse celler kan (ud over GFP-signalet) også være positive for PAX6 (figur 4B), som er vejledende for BP'er, eller NeuN (figur 4C), som er tegn på neuroner. Lignende resultater kan opnås for humane og rhesus macaque elektroporerede cerebrale organoider. Sammenfattende kan forskellige stamfadertyper såvel som neuroner med succes målrettes af denne teknik.
Næsten alle de tidligere viste data blev afledt af immunfarvning af histologiske sektioner genereret fra elektroporerede cerebrale organoider. En anden elegant måde at analysere disse organoider på er imidlertid at udføre helmonteret immunfarvning efterfulgt af optisk clearing35,36. Dette ville gøre det muligt for 3D-rekonstruktion af de elektroporerede cerebrale organoider at opnå et indtryk af 3D-fordelingen af de GFP-positive celler. Figur 5 og video 1 viser et repræsentativt eksempel på GFP-signalet i en optisk renset, elektroporeret cerebral organoid.
Sammenfattende giver elektroporationsprotokollen, der er beskrevet her, en præcis og effektiv måde at introducere forbigående genetisk modifikation (er) i forskellige stamfadertyper og neuroner af cerebrale organoider afledt af forskellige primat-iPSC-linjer.
Figur 1: Skematisk oversigt over primat cerebral organoidgenerering og morfologiske "go"- og "no-go"-kriterier for elektroporation. (A) Tidslinje for generering og elektroporation af primater cerebral organoid, der fremhæver de forskellige tidspunkter for protokoltrinnene for mennesker og chimpanser (blå), rhesusmakak (violet) og silkeaber (magenta). Bemærk, at tidslinjens kronologi ikke skaleres. (B) Brightfield-billeder af en passende (venstre billede, Go) og en uegnet (højre billede, No-go) 32 dps human cerebral organoid. Pilespidserne angiver eksempler på egnede ventrikellignende strukturer til mikroinjektion. Billederne blev taget ved hjælp af et Zeiss Axio Observer.Z1 inverteret fluorescensmikroskop med et 2,5x mål. Skalastænger = 500 μm. Forkortelser: BDNF = hjerneafledt neurotrofisk faktor; dps = dage efter såning; NT3 = neurotropin 3; RA = retinsyre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksempler på vellykkede elektroporerede primater cerebrale organoider. (A) Brightfield (venstre kolonne), fluorescens (midterste kolonne) og flet (højre kolonne) billeder af 22 dps menneske, 32 dps chimpanse, 32 dps rhesus makak og 31 dps marmoset cerebrale organoider (fra top til bund) 15-48 timer efter elektroporation med GFP-ekspressionelle plasmid. De sorte pilespidser angiver eksempler på individuelle elektroporerede ventrikellignende strukturer. Billederne blev taget ved hjælp af et Zeiss Axio Observer.Z1 inverteret fluorescensmikroskop med et 2,5x mål. Skalastænger = 500 μm. (B) Immunofluorescens for GFP (grøn) kombineret med DAPI-farvning (cyan) af 32 dps human, 34 dps chimpanse, 32 dps rhesus makak og 32 dps marmoset cerebrale organoider (fra top til bund) 2-4 dage efter elektroporation med GFP-ekspressionsplasmid. De lysegrå pilespidser angiver grænserne for de elektroporerede regioner inden for de ventrikellignende strukturer. Billederne blev taget ved hjælp af et Zeiss LSM 800 konfokalmikroskop med et 10x mål. Skalastænger = 150 μm. Forkortelser: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; dps = dage efter såning; GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Eksempler på mislykkede elektroporerede primater cerebrale organoider. (A,B) Immunofluorescens for GFP (grøn) kombineret med DAPI-farvning (cyan) af en (A) 34 dps rhesus makak cerebral organoid 4 dage efter elektroporation med GFP-ekspressionsplasmidet og af (B) en 32 dps rhesus makak cerebral organoid 2 dage efter elektroporation med GFP-ekspressionsplasmidet. De lysegrå pilespidser angiver elektroporerede celler. Den lysegrå stiplede kontur angiver grænsen mellem VZ og SVZ / neuron-beriget zone af en ventrikellignende struktur ved siden af de elektroporerede celler. Billederne blev taget ved hjælp af et Zeiss LSM 800 konfokalmikroskop med et 10x mål. Skalastænger = 150 μm. Forkortelser: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; dps = dage efter såning; GFP = grønt fluorescerende protein; SVZ = subventrikulær zone; VZ = ventrikulær zone. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Visualisering af de forskellige cellepopulationer, der er til stede i primater cerebrale organoider efter elektroporation. (A-C) Dobbelt immunfluorescens for GFP (grøn) og enten PAX6 (A,B; magenta) eller NeuN (C; magenta), i alle tilfælde kombineret med DAPI-farvning (cyan), af en (A) 32 dps marmoset cerebral organoid 2 dage efter elektroporation med GFP-ekspressionen plasmid, og (B,C) af en 40 dps marmoset cerebral organoid 10 dage efter elektroporation med GFP-ekspressionen plasmid. De lysegrå pilespidser angiver (A,B) GFP+ og PAX6+ eller (C) NeuN+ dobbeltpositive celler. De lysegrå stiplede linjer angiver grænsen mellem VZ og SVZ/neuron-beriget zone. Billederne blev taget ved hjælp af et Zeiss LSM 800 konfokalmikroskop med et 20x mål. Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; dps = dage efter såning; GFP = grønt fluorescerende protein; NeuN = neuronale kerner protein; PAX6 = parret boks 6-protein; SVZ = subventrikulær zone; VZ = ventrikulær zone. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Tredimensionel rekonstruktion af elektroporerede billeder ved 3D-konfokal billeddannelse af elektroporerede primater cerebrale organoider efter optisk clearing. Frontal (venstre billede), 45 ° roteret (midterste billede) og 90 ° roteret (højre billede) visninger af en 3D rekonstrueret elektroporeret 32 dps human cerebral organoid 2 dage efter elektroporation med GFP-ekspressionelle plasmid. Før billeddannelse blev organoiden optisk ryddet baseret på 2ECI-metode35. En 3D-rekonstruktion af hele elektroporeret organoid blev genereret fra 269 optiske sektioner (1 μM tykkelse hver), der er 3,73 μm fra hinanden ved hjælp af et Zeiss LSM 800 konfokalmikroskop med et 10x mål. Billederne blev behandlet til 3D-rekonstruktion ved hjælp af Fiji. Bemærk, at billederne er taget fra den samme 3D-rekonstruerede organoid, der er vist i video 1. Skalabjælke = 500 μm. Forkortelse: GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Video 1: En 3D-rekonstrueret elektroporeret human cerebral organoid efter optisk clearing. Video af en 3D-rekonstrueret elektroporeret 32 dps human cerebral organoid 2 dage efter elektroporation med GFP-ekspressionelt plasmid. Før billeddannelse blev organoiden optisk ryddet baseret på 2ECI-metode35. En 3D-rekonstruktion af hele elektroporeret organoid blev genereret fra 269 optiske sektioner (1 μM tykkelse hver), der er 3,73 μm fra hinanden ved hjælp af et Zeiss LSM 800 konfokalmikroskop med et 10x mål. Billederne blev behandlet til 3D-rekonstruktion ved hjælp af Fiji. Bemærk, at videoen blev taget fra den samme 3D-rekonstruerede organoid vist i figur 5. Klik her for at downloade denne video.
| iPSC-linje | Art | Publikation | Kultur medium sammensætning | Kulturforhold | ||||
| iLonza2,2 | Homo sapiens | Stauske et al., 2020 | 1 μM IWR1 og 0,5 μM CHIR i StemMACS iPS-Brew XF | befugtet atmosfære med 5% CO2 og 95% luft, 37 °C | ||||
| SandraA | Pan troglodytes | Mora-Bermúdez et al., 2016 | mTeSR1 | befugtet atmosfære med 5% CO2 og 95% luft, 37 °C | ||||
| iRh33.1 | Macaca mulatta | Stauske et al., 2020 | 1 μM IWR1 og 0,5 μM CHIR i StemMACS iPS-Brew XF | befugtet atmosfære med 5% CO2 og 95% luft, 37 °C | ||||
| cj_160419_5 | Callithrix jacchus | Petkov et al., 2020 | 3 μM IWR1, 0,3 μM CGP77675, 0,3 μM AZD77675, 0,5 μM CHIR99021, 10 μM Forskolin, 1 ng/ml Activin A, 1 μM OAC1 i StemMACS iPS-Brew XF | humificeret atmosfære på 5% CO 2, 5% O 2 og 90% N 2, 37 ° C | ||||
Tabel 1: Kulturbetingelser for de primat-iPSC'er, der anvendes i denne publikation. Forkortelse: iPSC'er = inducerede pluripotente stamceller.
| Medium | Sammensætning | ||
| Neuralt induktionsmedium | 1x N-2 supplement, 1x glutamin erstatning supplement, 1x MEM ikke-essentielle aminosyrer opløsning, 1 μg / ml heparin i Dulbecco's modificerede ørn medium F12 (DMEM / F12) | ||
| Differentieringsmedium (DM) uden vitamin A | 0,5x B-27 tilskud (minus vitamin A), 0,5x N-2 supplement, 0,5x MEM ikke-essentielle aminosyrer opløsning, 1x glutamin erstatning supplement, 100 U / ml penicillin-streptomycin, 0,00035% 2-mercaptoethanol, 2,875 ng / ml insulin i 1: 1 DMEM / F12 og neurobasal medium | ||
| Differentieringsmedium (DM) med vitamin A | 0,5x B-27 supplement, 0,5x N-2 supplement, 0,5x MEM ikke-essentielle aminosyrer opløsning, 1x glutamin erstatning supplement, 100 U / ml penicillin-streptomycin, 0,00035% 2-mercaptoethanol, 2,875 ng / ml insulin i 1: 1 DMEM / F12 og neurobasal medium | ||
Tabel 2: Sammensætning af de medier, der anvendes til cerebral organoidgenerering og kultur af primater.
| Komponent | Kontrol elektroporationsblanding | GOI elektroporation mix |
| GFP-ekspressionsplasmid | 500 ng/μL | 500 ng/μL |
| Tom vektor | 500 ng/μL | - |
| GOI-ekspressionsplasmid | - | 500 ng/μL |
| Hurtig grøn | 0.10% | 0.10% |
| i DPBS |
Tabel 3: Sammensætning af elektroporationsblandingen (separat plasmider) for kontrol og gen af interesse. Forkortelse: GOI = gen af interesse.
| Antistof | Firma | Katalognummer | RRID | Fortynding |
| Kylling anti GFP | Aves laboratorier | GFP-1020 | RRID:AB_10000240 | 1:300 |
| Kanin anti PAX6 | Novus Biologicals | NBP1-89100 | RRID:AB_11013575 | 1:300 |
| Kanin anti NeuN | Abcam | AB104225 | RRID:AB_10711153 | 1:300 |
| Geder anti kylling Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11039 | RRID:AB_142924 | 1:500 |
| Æsel anti kanin Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher | A-31572 | RRID:AB_162543 | 1:500 |
Tabel 4: Antistoffer anvendt til immunofluorescensfarvning.
Supplerende figur S1: VZ/SVZ-grænsebestemmelse i elektroporerede primater cerebrale organoider. Dobbelt immunfluorescens for PAX6 (magenta) og TUJ1 (gul) kombineret med DAPI-farvning (cyan) af en 32 dps marmoset cerebral organoid 2 dage efter elektroporation med GFP-ekspressionelt plasmid. Immunofluorescensen for GFP er ikke vist. De lysegrå stiplede linjer angiver grænsen mellem VZ og SVZ/neuron-beriget zone. Billederne blev taget ved hjælp af et Zeiss LSM 800 konfokalmikroskop med et 20x mål. Skalabjælke = 100 μm. Forkortelser: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; dps = dage efter såning; PAX6 = parret boks 6-protein; SVZ = subventrikulær zone; TUJ1 = klasse III β-tubulin; VZ = ventrikulær zone. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 1: Monteringsvejledning til petriskålelektroporationskammer. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De procedurer, der er beskrevet her, repræsenterer en samlet protokol til generering af cerebrale organoider fra forskellige primatarter med en målrettet elektroporationsmetode. Dette muliggør ektopisk ekspression af en GOI i et modelsystem, der efterligner primater (herunder menneskelig) (pato)fysiologisk neocortexudvikling. Denne samlede protokol til generering af primater cerebrale organoider bruger de samme materialer (f.eks. Medier) og protokoltrin for alle fire præsenterede primatarter. Udviklingsforskelle mellem disse arter løses ved at ændre timingen af kritiske protokoltrin (dvs. den neurale induktion og indlejring i kældermembranmatrixen; se ovenfor). Dette kan groft afspejle in vivo neurodevelopmental timing forskelle mellem disse arter og udgør et interessant emne for yderligere undersøgelser.
Denne fremgangsmåde er baseret på elektroporationseksperimenterne beskrevet i en tidligere artikel om cerebrale organoider10. Disse eksperimenter, som bemærket af Lancaster og kolleger, var imidlertid begrænset af omfattende grader af apoptose, som opstod på grund af en høj GFP-koncentration og førte til udelukkelse af de elektroporerede celler, der udviser et stærkt GFP-signal10. I vores eksperimenter fandt vi, at en endelig total plasmidkoncentration (f.eks. EGFP-kodende plasmidkoncentration plus GOI-kodende plasmidkoncentration) på 1.000 ng/μL var optimal. Koncentrationer lavere end 1.000 ng/μL fører til nedsat elektroporationseffektivitet, mens høje koncentrationer over 1.000 ng/μL kan være giftige for de elektroporerede celler og føre til celledød10. Undersøgelser, der kombinerer mere end to forskellige ekspressionsplasmider, er mulige28. Den endelige totale plasmidkoncentration bør dog holdes på 1.000 ng/μL.
I en typisk elektroporationsmetode er et plasmid, der koder for en fluorescensmarkør, nødvendig for at identificere de vellykkede elektroporerede celler. Der er to muligheder for at inkludere fluorescensmarkøren i forsøgsopstillingen: i) ved samtidig injektion af to separate plasmider (dvs. et plasmid, der koder for markøren, plus et kontrolplasmid [f.eks. tom vektor] eller et plasmid, der koder for det relevante gen [GOI]) ( metoden med separate plasmider); ii) ved injektion af et plasmid, der koder for både markøren og GOI, ved hjælp af et internt ribosomindgangssted (IRES) eller et 2A selvspaltende peptid (f.eks. P2A) ( enkeltplasmidmetoden). I dette tilfælde anvendes et plasmid, der udelukkende koder for fluorescensmarkøren, som en kontrol. Mens enkeltplasmidtilgangen resulterer i fuld co-ekspression af fluorescensmarkøren og GOI, er sådanne plasmider store i størrelse, hvilket resulterer i en lav elektroporationseffektivitet. Hvis der er behov for en høj elektroporationseffektivitet, anbefales det at anvende metoden med separate plasmider, da det adskilte udtryk ikke i væsentlig grad påvirker niveauet af coekspression af fluorescensmarkøren og GOI, samtidig med at der opretholdes en høj elektroporationseffektivitet28. I protokollen, der præsenteres her, beskriver vi elektroporationen ved hjælp af den separate plasmidertilgang. Hvis den enkelte plasmidtilgang anvendes, skal trinnene i protokollen justeres i overensstemmelse hermed.
Sammenlignet med en nyligt offentliggjort protokol37 har vores tilgang tre hovedfordele. For det første målretter vi specifikt mod de ventrikellignende strukturer i cerebral organoid. Vi opnår dette (i) ved at mikroinjicere de individuelle ventrikellignende strukturer i cerebral organoid i stedet for at injicere i midten af organoid 37 og (ii) ved at arrangere orienteringen af cerebral organoid i petriskålelektrodekammeret for at optimere retningen af det elektriske felt (se ovenfor) i stedet for at bruge en elektroporationskuvette37. For det andet involverer denne protokol ikke brugen af en dyr nukleofektoropløsning, da denne tilgang bruger en firkantbølgeelektroporator i kombination med et petriskålelektrodekammer. For det tredje tillader denne samlede protokol til generering af primater cerebrale organoider undersøgelsen af ikke kun humane, men også ikke-menneskelige primatorganoider, hvilket tillader evolutionære, komparative og sygdomsundersøgelser.
To funktioner vedrørende cerebrale organoider er afgørende for en vellykket elektroporation - kvaliteten af cerebrale organoider og størrelsen og kvaliteten af de ventrikellignende strukturer (se de repræsentative resultater og figur 1B). Med hensyn til den første funktion præsenterer vi go- og no-go-kriterier (se ovenfor og figur 1B) for at fortsætte med elektroporationen. Hovedkriteriet er tilstedeværelsen af klart synlige, gennemskinnelige og radialt organiserede ventrikellignende strukturer. Størrelsen af de ventrikellignende strukturer er det andet afgørende træk for vellykket mikroinjektion og elektroporation. Ventrikellignende strukturer, der er for små, er vanskelige at injicere og giver normalt ikke et tilstrækkeligt højt antal elektroporerede celler til efterfølgende analyser. Dette er hovedårsagen til, at vi brugte en modificeret cerebral organoidprotokol, da denne protokol i vores hænder og for disse iPSC-linjer producerer sammenlignet med andre protokoller velorganiserede ventrikellignende strukturer, der er tilstrækkeligt store til at blive elektroporeret. I princippet kan elektroporationsmetoden, der præsenteres her, anvendes på enhver anden neural organoidprotokol, så længe sidstnævnte giver tilstrækkeligt store og organiserede ventrikellignende strukturer (se de repræsentative resultater og figur 1B). Desuden kan denne protokol også anvendes på andre primater i fremtiden, såsom den krabbeædende makak (Macaca fascicularis), den klassiske primatmodel, der anvendes i industriel forskning. Dette ville kræve enten identifikation af de korrekte kritiske tidspunkter (se ovenfor) for den modificerede cerebrale organoidprotokol, der er beskrevet her, eller etablering af en neural organoidprotokol, der giver anledning til egnede store ventrikellignende strukturer (se ovenfor).
Efter vellykket elektroporation kan cerebrale organoider dyrkes yderligere i forskellige perioder for at tillade den genetiske modifikation, der undersøges, at påvirke de forskellige cellepopulationer inden for den udviklende cerebrale organoid. Disse spænder fra de forskellige neurale stamfaderpopulationer til de forskellige typer neuroner, der er til stede i cerebral organoid (se de repræsentative resultater og Fischer et al.28). Disse cellepopulationer kan derefter analyseres enten ved kryosektion og immunofluorescensfarvning (se figur 4) eller ved helmonteret immunfluorescensfarvning og optisk clearing (se figur 5 og video 1) af de PFA-fikserede elektroporerede cerebrale organoider.
Indtil videre er elektroporation af hjerneorganoider hovedsageligt blevet brugt til ektopisk ekspression af gener til at udføre genfunktionsundersøgelser 10,28,38,39, levende billeddannelse 10,39,40, visualisering af cellemorfologi 40 og celledelingssporing 10. I det første cerebrale organoidpapir blev shRNA imidlertid introduceret i organoider ved elektroporation for at dæmpe genekspression ved RNA-interferens. Dette viste potentialet for elektroporation til at blive brugt ikke kun til ektopisk ekspression af gener, men også til KD eller endda KO af gener. For nylig blev det vist, at CRISPR/Cas9-medierede KO'er kan opnås ved in utero-elektroporation af museembryoner27 og elektroporation af føtalt humant væv ex vivo41. Sådanne CRISPR/Cas9-baserede KO'er kunne let anvendes til elektroporation af cerebrale organoider, da den vigtigste elektroporationsmekanisme er den samme, og dette ville yderligere udvide nytten af denne tilgang.
En potentiel yderligere anvendelse af elektroporation i cerebrale organoider er redning af specifikke KO-fænotyper i tilfælde, hvor det ikke er muligt at opnå en specifik KO fra GOI på grund af meget ens sekvenser mellem GOI og dens forfædres versioner. Dette er især tilfældet for nyligt udviklede menneskespecifikke gener. I sådanne tilfælde er det ikke muligt (selv ved brug af CRISPR/Cas9-teknologien) at opnå en specifik KO (som det var tilfældet for ARHGAP11A og ARHGAP11B28). En løsning på dette dilemma er at generere en dobbelt KO af GOI og dets forfædres gen og at redde GOI alene, det forfædre gen alene eller begge gener sammen ved elektroporation. Disse elektroporerede organoider kunne derefter betragtes som henholdsvis et selektivt forfædres gen KO, en selektiv GOI KO eller en kontrol. Dette ville gøre det muligt at behandle disse geners individuelle bidrag til fænotypen (se f.eks. Fischer et al.28). En anden potentiel anvendelse er relateret til analysen af cerebrale organoider genereret fra patientafledte iPSC'er. I sådanne tilfælde er det ikke klart, om den observerede fænotype skyldes en mutation i kandidatgenet eller på grund af en anden mutation, der er til stede i patienten. Her vil elektroporationen af kandidatgenet og den (potentielle) redning af fænotypen gøre det muligt at validere dette gens rolle i sygdommen (se f.eks. Lancaster et al.10).
Samlet set tilbyder protokollen, der præsenteres her, en hurtig og omkostningseffektiv tilgang til genetisk modifikation af cellepopulationer inden for ventrikellignende strukturer af primater cerebrale organoider. Dette giver et effektivt værktøj til undersøgelse af neurodevelopmental og evolutionære processer, der også kan anvendes til sygdomsmodellering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi undskylder over for alle de forskere, hvis arbejde ikke kunne citeres på grund af pladsbegrænsninger. Vi takker Ulrich Bleyer fra DPZ' tekniske tjenester og Hartmut Wolfs fra værkstedet hos MPI-CBG for konstruktionen af petriskålelektrodekamrene; Stoyan Petkov og Rüdiger Behr for at levere humane (iLonza2.2), rhesusmakak (iRh33.1) og silkeaber (cj_160419_5) iPSC'er; Sabrina Heide til kryosektionering og immunofluorescensfarvning; og Neringa Liutikaite og César Mateo Bastidas Betancourt for kritisk at have læst manuskriptet. Arbejdet i W.B.H.'s laboratorium blev støttet af et ERA-NET NEURON (MicroKin) tilskud. Arbejdet i M.H.'s laboratorium blev støttet af et ERC-starttilskud (101039421).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 µL Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 8.05740.0005 | |
| 35 mm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3900 | |
| 60 mm cell culture dishes | CytoOne | CC7682-3359 | |
| Activin A | Sigma-Aldrich | SRP3003 | |
| AOC1 | Selleckchem | S7217 | |
| Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope | Zeiss | replacable by comparable fluorescent microscopes | |
| AZD0530 | Selleckchem | S1006 | |
| B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| B-27 Supplement without Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System | BTX | 45-2052 | |
| CGP77675 | Sigma-Aldrich | SML0314 | |
| Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A | doi: 10.7554/elife.18683 | ||
| Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 | doi: 10.3390/cells9112422 | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-094 | pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Forskolin | Selleckchem | 2449 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute supplement |
| Heparin (1 mg/mL stock) | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| Human Neurotrophin-3 (NT-3) | PeproTech | 450-03 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| IWR1 | Sigma-Aldrich | I0161 | |
| Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) | Leica | 10473849 | replacable by comparable stereomicroscopes |
| Matrigel | Corning | 354277/354234 | basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | handle with causion due to cancerogenecity |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | PanBiotech | P06-07100 | |
| Petri dish electrode chamber | self-produced (see Supplemental File 1) | also commertially available | |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter |
| Pro-Survival Compound | MerckMillipore | 529659 | |
| Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | PeproTech | AF-450-02 | |
| Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotech | 130-104-368 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | proteolytic and collagenolytic enzyme mixture |
| TrypLE | Gibco | 12604-013 | recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use |
| Ultra-Low Attachment 96-well plates | Costar | 7007 | |
| Y27632 | Stemcell Technologies | 72305 |
References
- Marchetto, M. C. N., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19 (R1), R71-R76 (2010).
- Zhao, X., Bhattacharyya, A. Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders. The American Journal of Human Genetics. 103 (6), 829-857 (2018).
- Zhang, W., et al. Modeling microcephaly with cerebral organoids reveals a WDR62–CEP170–KIF2A pathway promoting cilium disassembly in neural progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2612 (2019).
- Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
- Niu, Y., et al. Transgenic rhesus monkeys produced by gene transfer into early-cleavage–stage embryos using a simian immunodeficiency virus-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17663-17667 (2010).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
- Shi, L., et al. Transgenic rhesus monkeys carrying the human MCPH1 gene copies show human-like neoteny of brain development. National Science Review. 6 (3), 480-493 (2019).
- Heide, M., et al. Human-specific ARHGAP11B increases size and folding of primate neocortex in the fetal marmoset. Science. 369 (6503), 546-550 (2020).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell–derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem cell models of human brain development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Lullo, E. D., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Arlotta, P. Organoids required! A new path to understanding human brain development and disease. Nature Methods. 15 (1), 27-29 (2018).
- Heide, M., Huttner, W. B., Mora-Bermúdez, F. Brain organoids as models to study human neocortex development and evolution. Current Opinion in Cell Biology. 55, 8-16 (2018).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074 (2019).
- Sun, N., Meng, X., Liu, Y., Song, D., Jiang, C., Cai, J. Applications of brain organoids in neurodevelopment and neurological diseases. Journal of Biomedical Science. 28 (1), 30 (2021).
- Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B.
- Pașca, S. P., et al. A nomenclature consensus for nervous system organoids and assembloids. Nature. 609 (7929), 907-910 (2022).
- Kyrousi, C., Cappello, S. Using brain organoids to study human neurodevelopment, evolution and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 9 (1), e347 (2020).
- Teriyapirom, I., Batista-Rocha, A. S., Koo, B. -K.
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2012).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5 (1), 24 (2012).
- Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nature Neuroscience. 6 (12), 1277-1283 (2003).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Fischer, J., et al. Human-specific ARHGAP11B ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Reports. 23 (11), e54728 (2022).
- Stauske, M., et al. Non-human primate iPSC generation, cultivation, and cardiac differentiation under chemically defined conditions. Cells. 9 (6), 1349 (2020).
- Mora-Bermúdez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. eLife. 5, e18683 (2016).
- Petkov, S., Dressel, R., Rodriguez-Polo, I., Behr, R. Controlling the switch from neurogenesis to pluripotency during marmoset monkey somatic cell reprogramming with self-replicating mRNAs and small molecules. Cells. 9 (11), 2422 (2020).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nature Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), dev166884 (2019).
- Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protocols. 3 (1), 101129 (2022).
- Denoth-Lippuner, A., et al. Visualization of individual cell division history in complex tissues using iCOUNT. Cell Stem Cell. 28 (11), 2020.e12-2034.e12 (2021).
- Kelava, I., Chiaradia, I., Pellegrini, L., Kalinka, A. T., Lancaster, M. A. Androgens increase excitatory neurogenic potential in human brain organoids. Nature. 602 (7895), 112-116 (2022).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535.e9-550.e9 (2019).
