Målrettet mikroinjektion og elektroporation af primathjerneorganoider til genetisk modifikation
Summary
Elektroporation af primater cerebrale organoider giver en præcis og effektiv tilgang til at introducere forbigående genetisk modifikation (er) i forskellige stamfadertyper og neuroner i et modelsystem tæt på primats (pato)fysiologiske neocortexudvikling. Dette muliggør undersøgelse af neurodevelopmental og evolutionære processer og kan også anvendes til sygdomsmodellering.
Abstract
Hjernebarken er den yderste hjernestruktur og er ansvarlig for behandlingen af sensorisk input og motorudgang; Det ses som sæde for højere ordens kognitive evner hos pattedyr, især primater. At studere genfunktioner i primathjerner er udfordrende af tekniske og etiske årsager, men etableringen af hjerneorganoidteknologien har muliggjort studiet af hjernens udvikling i traditionelle primatmodeller (f.eks. rhesusmakak og almindelig silkeaber) såvel som i tidligere eksperimentelt utilgængelige primatarter (f.eks. Store aber) i et etisk forsvarligt og mindre teknisk krævende system. Desuden tillader menneskelige hjerneorganoider avanceret undersøgelse af neuroudviklingsmæssige og neurologiske lidelser.
Da hjerneorganoider rekapitulerer mange processer i hjernens udvikling, repræsenterer de også et kraftfuldt værktøj til at identificere forskelle i og funktionelt sammenligne de genetiske determinanter, der ligger til grund for hjernens udvikling af forskellige arter i en evolutionær sammenhæng. En stor fordel ved at bruge organoider er muligheden for at indføre genetiske modifikationer, som gør det muligt at teste genfunktioner. Indførelsen af sådanne ændringer er imidlertid besværlig og dyr. Dette papir beskriver en hurtig og omkostningseffektiv tilgang til genetisk modifikation af cellepopulationer inden for ventrikellignende strukturer af primater cerebrale organoider, en undertype af hjerneorganoider. Denne metode kombinerer en modificeret protokol til pålidelig generering af cerebrale organoider fra human-, chimpanse-, rhesusmakak- og almindelige marmosetafledte inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) med en mikroinjektions- og elektroporationstilgang. Dette giver et effektivt værktøj til undersøgelse af neurodevelopmental og evolutionære processer, der også kan anvendes til sygdomsmodellering.
Introduction
Undersøgelse af den (pato)fysiologiske udvikling og udvikling af hjernebarken er en formidabel opgave, der hæmmes af manglen på egnede modelsystemer. Tidligere var sådanne undersøgelser begrænset til todimensionelle cellekulturmodeller (såsom primære neurale stamfader eller neuronale cellekulturer) og evolutionært fjerne dyremodeller (såsom gnavere)1,2. Mens disse modeller er nyttige til at løse visse spørgsmål, er de begrænsede til modellering af kompleksiteten, celletypesammensætningen, cellulær arkitektur og genekspressionsmønstre for den udviklende humane neocortex i sunde og syge tilstande. Disse begrænsninger fører f.eks. til dårlig oversættelighed af musemodeller af menneskelige sygdomme til den menneskelige situation, som beskrevet for visse tilfælde af mikrocefali (f.eks. Zhang et al.3). For nylig er transgene ikke-menneskelige primater, som er en evolutionært, funktionelt og morfologisk tættere model for menneskelig neocortexudvikling, kommet i fokus 4,5,6,7,8, da de overvinder mange begrænsninger af cellekultur- og gnaverbaserede modeller. Anvendelsen af ikke-menneskelige primater i forskning er imidlertid ikke kun meget dyr og tidskrævende, men giver også anledning til etiske betænkeligheder. For nylig har udviklingen af hjerneorganoidteknologi 9,10 vist sig som et lovende alternativ, der løser mange af begrænsningerne i tidligere modeller 11,12,13,14,15,16.
Hjerneorganoider er tredimensionelle (3D), multicellulære strukturer, der efterligner hovedtræk ved cytoarkitekturen og celletypesammensætningen af en eller flere hjerneområder i et defineret udviklingstidsvindue 11,12,13,14,17. Disse 3D-strukturer genereres enten fra inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) eller, hvis de er tilgængelige for den pågældende art, fra embryonale stamceller (ESC’er). Generelt kan der skelnes mellem to typer hjerneorganoider baseret på den anvendte metode: ustyrede og regionaliserede (guidede) hjerneorganoider18. Ved generering af sidstnævnte type organoider tilvejebringes små molekyler eller faktorer, der styrer differentieringen af de pluripotente stamceller til organoider i et bestemt hjerneområde (f.eks. Forhjerneorganoider)18. I modsætning hertil styres differentieringen i ikke-styrede organoider ikke af tilsætning af små molekyler, men er udelukkende afhængig af den spontane differentiering af iPSC’erne/ESC’erne. De resulterende hjerneorganoider består af celletyper, der repræsenterer forskellige hjerneområder (f.eks. cerebrale organoider)18. Hjerneorganoider kombinerer mange nøglefunktioner i hjernens udvikling med relativt omkostnings- og tidseffektiv generering fra enhver art af interesse, for hvilke iPSC’er eller ESC’er er tilgængelige 11,12,13,14. Dette gør hjerneorganoider til en fremragende model for mange slags neurobiologiske undersøgelser, lige fra evolutionære og udviklingsmæssige spørgsmål til sygdomsmodellering og lægemiddeltest15,16. Imidlertid afhænger adressering af sådanne spørgsmål ved hjælp af hjerneorganoider stærkt af tilgængeligheden af forskellige metoder til genetisk modifikation.
Et centralt aspekt ved at studere neocortex (pato)fysiologisk udvikling og dens udvikling er den funktionelle analyse af gener og genvarianter. Dette opnås normalt ved (ektopisk) ekspression og / eller ved knock-down (KD) eller knock-out (KO) af disse gener. Sådanne genetiske modifikationer kan klassificeres i stabil og forbigående genetisk modifikation samt i, at modifikationerne er tidsmæssigt og rumligt begrænsede eller ikke begrænsede. Stabil genetisk modifikation defineres ved indførelse af en genetisk ændring i værtsgenomet, der overføres til alle efterfølgende cellegenerationer. Afhængigt af tidspunktet for genetisk modifikation kan det påvirke alle celler i en organoid eller kan begrænses til bestemte cellepopulationer. Oftest opnås stabil genetisk modifikation i hjerneorganoider på iPSC/ESC-niveau ved anvendelse af lentivirus, transposonlignende systemer og CRISPR/Cas9-teknologien (gennemgået af f.eks. Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 og Teriyapirom et al.20). Dette har den fordel, at alle celler i hjerneorganoid bærer den genetiske modifikation, og at den ikke er tidsmæssigt eller rumligt begrænset. Imidlertid er genereringen og karakteriseringen af disse stabile iPSC / ESC-linjer meget tidskrævende og tager ofte flere måneder, indtil de første modificerede hjerneorganoider kan analyseres (gennemgået af f.eks. Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 eller Teriyapirom et al.20).
I modsætning hertil defineres forbigående genetisk modifikation ved levering af genetisk last (f.eks. Et genekspressionsplasmid), der ikke integreres i værtsgenomet. Mens denne modifikation i princippet kan overføres til efterfølgende cellegenerationer, vil den leverede genetiske last gradvist blive fortyndet med hver celledeling. Derfor er denne type genetisk modifikation normalt tidsmæssigt og rumligt begrænset. Forbigående genetisk modifikation kan udføres i hjerneorganoider af adeno-associerede vira eller ved elektroporation (gennemgået af f.eks. Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 og Teriyapirom et al.20), hvor sidstnævnte beskrives detaljeret i denne artikel. I modsætning til stabil genetisk modifikation er denne tilgang meget hurtig og omkostningseffektiv. Faktisk kan elektroporation udføres inden for få minutter, og afhængigt af målcellepopulationen (e) er elektroporerede organoider klar til analyse inden for få dage (gennemgået af f.eks. Fischer et al.17 og Kyrousi et al.19). Imidlertid kan grove morfologiske ændringer i hjerneorganoiden, såsom forskelle i størrelse, ikke påvises ved hjælp af denne metode, da denne type genetisk modifikation er tidsmæssigt og rumligt begrænset. Denne begrænsning kan også være en fordel, for eksempel i tilfælde af at studere individuelle cellepopulationer inden for organoiden eller virkningerne på hjerneorganoider på specifikke udviklingstidspunkter (gennemgået af f.eks. Fischer et al.17 og Kyrousi et al.19).
En klassisk tilgang til at studere genfunktion under hjernens udvikling og evolution er in utero elektroporation. In utero elektroporation er en velkendt og nyttig teknik til levering af genekspressionskonstruktioner i gnavere 21,22,23 og fritter 24,25 hjerner. For det første mikroinjiceres en opløsning, der indeholder ekspressionskonstruktionen (e) af interesse, gennem livmodervæggen ind i en bestemt ventrikel i den embryonale hjerne, afhængigt af den region, der skal målrettes. I det andet trin påføres elektriske impulser for at transfektere cellerne, der direkte forer den målrettede ventrikel. Denne tilgang er ikke kun begrænset til ektopisk ekspression eller overekspression af gener, da den også kan anvendes i KD- eller KO-undersøgelser ved mikroinjektion af kort hårnål (shRNA) eller CRISPR/Cas9 (i form af ekspressionsplasmider eller ribonukleoproteiner [RNP’er]), henholdsvis26,27. Imidlertid har in utero elektroporation af muse-, rotte- og fritteembryoner de samme begrænsninger som beskrevet ovenfor for disse dyremodeller.
Ideelt set vil man gerne udføre i utero elektroporation direkte i primater. Selv om dette i princippet er teknisk muligt, udføres elektroporation in utero ikke i primater på grund af etiske bekymringer, høje omkostninger til dyrevedligeholdelse og små kuldstørrelser. For visse primater, såsom menneskeaber (herunder mennesker), er dette slet ikke muligt. Imidlertid har disse primater det største potentiale for undersøgelsen af menneskelig (pato) fysiologisk neocortexudvikling og dens udvikling. En løsning på dette dilemma er at anvende elektroporationsteknikken på primathjerneorganoider28.
Dette papir præsenterer en protokol til elektroporation af en undertype af primathjerneorganoider, primathjerneorganoider. Denne tilgang muliggør hurtig og omkostningseffektiv genetisk modifikation af cellepopulationer inden for organoidernes ventrikellignende strukturer. Specifikt beskriver vi en samlet protokol til generering af primater cerebrale organoider fra mennesker (Homo sapiens), chimpanser (Pan troglodytes), rhesus makak (Macaca mulatta) og almindelige silkeaber (Callithrix jacchus) iPSC’er. Desuden beskriver vi mikroinjektions- og elektroporationsteknikken detaljeret og giver “go” og “no-go” kriterier for udførelse af primat cerebral organoid elektroporation. Denne tilgang er et effektivt redskab til at studere (pato)fysiologisk neocortex udvikling og dens udvikling i en model, der er særlig tæt på den menneskelige situation.
Protocol
Representative Results
Discussion
De procedurer, der er beskrevet her, repræsenterer en samlet protokol til generering af cerebrale organoider fra forskellige primatarter med en målrettet elektroporationsmetode. Dette muliggør ektopisk ekspression af en GOI i et modelsystem, der efterligner primater (herunder menneskelig) (pato)fysiologisk neocortexudvikling. Denne samlede protokol til generering af primater cerebrale organoider bruger de samme materialer (f.eks. Medier) og protokoltrin for alle fire præsenterede primatarter. Udviklingsforskelle mell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi undskylder over for alle de forskere, hvis arbejde ikke kunne citeres på grund af pladsbegrænsninger. Vi takker Ulrich Bleyer fra DPZ’ tekniske tjenester og Hartmut Wolfs fra værkstedet hos MPI-CBG for konstruktionen af petriskålelektrodekamrene; Stoyan Petkov og Rüdiger Behr for at levere humane (iLonza2.2), rhesusmakak (iRh33.1) og silkeaber (cj_160419_5) iPSC’er; Sabrina Heide til kryosektionering og immunofluorescensfarvning; og Neringa Liutikaite og César Mateo Bastidas Betancourt for kritisk at have læst manuskriptet. Arbejdet i W.B.H.’s laboratorium blev støttet af et ERA-NET NEURON (MicroKin) tilskud. Arbejdet i M.H.’s laboratorium blev støttet af et ERC-starttilskud (101039421).
Materials
| 20 µL Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 8.05740.0005 | |
| 35 mm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3900 | |
| 60 mm cell culture dishes | CytoOne | CC7682-3359 | |
| Activin A | Sigma-Aldrich | SRP3003 | |
| AOC1 | Selleckchem | S7217 | |
| Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope | Zeiss | replacable by comparable fluorescent microscopes | |
| AZD0530 | Selleckchem | S1006 | |
| B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| B-27 Supplement without Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System | BTX | 45-2052 | |
| CGP77675 | Sigma-Aldrich | SML0314 | |
| Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A | doi: 10.7554/elife.18683 | ||
| Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 | doi: 10.3390/cells9112422 | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-094 | pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Forskolin | Selleckchem | 2449 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute supplement |
| Heparin (1 mg/mL stock) | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| Human Neurotrophin-3 (NT-3) | PeproTech | 450-03 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| IWR1 | Sigma-Aldrich | I0161 | |
| Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) | Leica | 10473849 | replacable by comparable stereomicroscopes |
| Matrigel | Corning | 354277/354234 | basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | handle with causion due to cancerogenecity |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | PanBiotech | P06-07100 | |
| Petri dish electrode chamber | self-produced (see Supplemental File 1) | also commertially available | |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter |
| Pro-Survival Compound | MerckMillipore | 529659 | |
| Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | PeproTech | AF-450-02 | |
| Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotech | 130-104-368 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | proteolytic and collagenolytic enzyme mixture |
| TrypLE | Gibco | 12604-013 | recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use |
| Ultra-Low Attachment 96-well plates | Costar | 7007 | |
| Y27632 | Stemcell Technologies | 72305 |
References
- Marchetto, M. C. N., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19 (R1), R71-R76 (2010).
- Zhao, X., Bhattacharyya, A. Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders. The American Journal of Human Genetics. 103 (6), 829-857 (2018).
- Zhang, W., et al. Modeling microcephaly with cerebral organoids reveals a WDR62–CEP170–KIF2A pathway promoting cilium disassembly in neural progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2612 (2019).
- Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
- Niu, Y., et al. Transgenic rhesus monkeys produced by gene transfer into early-cleavage–stage embryos using a simian immunodeficiency virus-based vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17663-17667 (2010).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
- Shi, L., et al. Transgenic rhesus monkeys carrying the human MCPH1 gene copies show human-like neoteny of brain development. National Science Review. 6 (3), 480-493 (2019).
- Heide, M., et al. Human-specific ARHGAP11B increases size and folding of primate neocortex in the fetal marmoset. Science. 369 (6503), 546-550 (2020).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell–derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem cell models of human brain development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Lullo, E. D., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Arlotta, P. Organoids required! A new path to understanding human brain development and disease. Nature Methods. 15 (1), 27-29 (2018).
- Heide, M., Huttner, W. B., Mora-Bermúdez, F. Brain organoids as models to study human neocortex development and evolution. Current Opinion in Cell Biology. 55, 8-16 (2018).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074 (2019).
- Sun, N., Meng, X., Liu, Y., Song, D., Jiang, C., Cai, J. Applications of brain organoids in neurodevelopment and neurological diseases. Journal of Biomedical Science. 28 (1), 30 (2021).
- Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. Genetic modification of brain organoids. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 558 (2019).
- Pașca, S. P., et al. A nomenclature consensus for nervous system organoids and assembloids. Nature. 609 (7929), 907-910 (2022).
- Kyrousi, C., Cappello, S. Using brain organoids to study human neurodevelopment, evolution and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 9 (1), e347 (2020).
- Teriyapirom, I., Batista-Rocha, A. S., Koo, B. -. K. Genetic engineering in organoids. Journal of Molecular Medicine. 99 (4), 555-568 (2021).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2012).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5 (1), 24 (2012).
- Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nature Neuroscience. 6 (12), 1277-1283 (2003).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Fischer, J., et al. Human-specific ARHGAP11B ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Reports. 23 (11), e54728 (2022).
- Stauske, M., et al. Non-human primate iPSC generation, cultivation, and cardiac differentiation under chemically defined conditions. Cells. 9 (6), 1349 (2020).
- Mora-Bermúdez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. eLife. 5, e18683 (2016).
- Petkov, S., Dressel, R., Rodriguez-Polo, I., Behr, R. Controlling the switch from neurogenesis to pluripotency during marmoset monkey somatic cell reprogramming with self-replicating mRNAs and small molecules. Cells. 9 (11), 2422 (2020).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nature Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), dev166884 (2019).
- Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protocols. 3 (1), 101129 (2022).
- Denoth-Lippuner, A., et al. Visualization of individual cell division history in complex tissues using iCOUNT. Cell Stem Cell. 28 (11), 2020.e12-2034.e12 (2021).
- Kelava, I., Chiaradia, I., Pellegrini, L., Kalinka, A. T., Lancaster, M. A. Androgens increase excitatory neurogenic potential in human brain organoids. Nature. 602 (7895), 112-116 (2022).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535.e9-550.e9 (2019).
