Summary
Dit manuscript beschrijft een nieuw direct planteninfuusapparaat voor het screenen van de effectiviteit van moleculen tegen de bacteriën (Candidatus Liberibacter asiaticus) of zijn insectenvector (Diaphorina citri, Kuwayama) die, in combinatie, geassocieerd zijn met Huanglongbing citrusziekte.
Abstract
Het testen van de functie van therapeutische verbindingen in planten is een belangrijk onderdeel van landbouwkundig onderzoek. Blad- en bodemdoordrenkmethoden zijn routineus, maar hebben nadelen, waaronder variabele opname en de omgevingsafbraak van geteste moleculen. Staminjectie van bomen is goed ingeburgerd, maar de meeste methoden hiervoor vereisen dure, eigen apparatuur. Om verschillende behandelingen voor Huanglongbing te screenen, is een eenvoudige, goedkope methode nodig om deze verbindingen af te leveren aan het vaatweefsel van kleine in de kas gekweekte citrusbomen die zijn geïnfecteerd met de floëembeperkte bacterie Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) of besmet met de floëemvoedende CLas-insectenvector Diaphorina citri Kuwayama (D. citri).
Om aan deze screeningsvereisten te voldoen, is een direct plant infusion (DPI) -apparaat ontworpen dat verbinding maakt met de stam van de plant. Het apparaat is gemaakt met behulp van een op nylon gebaseerd 3D-printsysteem en gemakkelijk verkrijgbare hulpcomponenten. De werkzaamheid van dit apparaat werd getest in citrusplanten met behulp van de fluorescerende marker 5,6-carboxyfluoresceïne-diacetaat. Uniforme samengestelde verdeling van de marker over de planten werd routinematig waargenomen.
Bovendien werd dit apparaat gebruikt om antimicrobiële en insecticide moleculen af te leveren om hun effecten op respectievelijk CLas en D. citri te bepalen. Het aminoglycoside-antibioticum streptomycine werd met behulp van het apparaat afgeleverd in CLas-geïnfecteerde citrusplanten, wat resulteerde in een vermindering van de CLas-titer van 2 weken tot 4 weken na de behandeling. Het afleveren van het neonicotinoïde insecticide imidacloprid in D. citri-besmette citrusplanten resulteerde in een significante toename van psyllidensterfte na 7 dagen . Deze resultaten suggereren dat dit DPI-apparaat een nuttig systeem vertegenwoordigt voor het leveren van moleculen in planten voor het testen en het vergemakkelijken van onderzoeks- en screeningsdoeleinden.
Introduction
Het beheer van planten in commerciële en landschappelijke omgevingen vereist vaak het gebruik van chemische verbindingen om de groei en gezondheid van de plant te optimaliseren. Hoe deze moleculen worden afgeleverd, hangt af van het type molecuul, de functie van het molecuul, het type plant en het aanwezige managementsysteem. Blad- en bodemtoepassingen zijn de gemakkelijkste afgiftestrategieën, maar beperkingen in de opname van sommige moleculen vereisen directe levering. Een voorbeeld van deze moleculen zijn therapeutische moleculen die het beste functioneren wanneer ze systemisch in de plant bewegen, maar niet effectief kunnen worden geleverd door eenvoudige actuele toepassingen1. Dit is het geval bij Huanglongbing (HLB), ook wel citrus greening disease genoemd. HLB is een ziekte geassocieerd met een floëem-beperkte bacterie, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), die niet buiten de plant kan worden gekweekt, of zijn insectenvector, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
Als de vermeende therapeutische moleculen genproducten zijn, kunnen ze worden getest door transgene planten te maken die deze verbindingen tot expressie brengen. Transgene plantaardige productie kan echter tijd- en hulpbronnenintensief zijn, is sterk genotype-afhankelijk en kan worden geremd door gen-uitschakeling3. Bovendien, zelfs als deze transgenen veelbelovende resultaten laten zien, verminderen beperkingen op het gebied van regelgeving en publieke perceptie de kans op commerciële acceptatie 4,5. De exogene toepassing van verbindingen vereenvoudigt echter het testen van biologische en synthetische moleculen omdat het niet de productie van stabiele of tijdelijk tot expressie brengende transgene planten vereist, wat de tijd en middelen voor het testen van de effecten van een molecuul vermindert. Een methode voor de effectieve en efficiënte systemische levering van exogene verbindingen door planten kan worden gebruikt voor een breed scala aan onderzoeks- en screeningsdoeleinden.
Een van deze toepassingen is de analyse van systemische molecuulbewegingen binnen het vasculaire systeem van een plant, die kan worden gedaan met behulp van traceerbare markers, of het nu fluorescerende, zichtbare of unieke chemische isotopenzijn 6,7,8,9. Een veelgebruikte fluorescerende marker is 5,6-carboxyfluoresceïne-diacetaat (CFDA), een membraandoorlatende kleurstof die door intracellulaire esterasen wordt afgebroken tot 5,6-carboxyfluoresceïne (CF) en vervolgens fluorescerend en membraanondoordringbaarwordt 10. CFDA is op grote schaal gebruikt om floëemtransport, zink- en bronrelaties en vasculatuurpatronen in plantenweefsel te monitoren11,12.
Naast deze markers kunnen bepaalde verbindingen de fysiologie van de plant direct veranderen om de productiviteit te verhogen of de plant te doden in het geval van herbiciden. Zowel insecticiden als antimicrobiële verbindingen zijn een middel om de productiviteit van planten te verhogen, vooral in de aanwezigheid van HLB. Een voorbeeld van een antimicrobieel molecuul dat wordt gebruikt om CLas te beheersen is streptomycine. Streptomycine is een aminoglycoside-antibioticum dat oorspronkelijk werd geïsoleerd uit Streptomyces griseus en waarvan is aangetoond dat het de bacteriegroei remt door de remming van eiwitbiosynthese13. In termen van insecticiden is het belangrijkste doelwit voor HLB-onderzoek D. citri, dat CLas van boom naar boom14 overbrengt. Voor dit doel worden neonicotinoïden, zoals imidacloprid, vaak gebruikt, omdat ze de gouden standaard zijn voor het bestrijden van insectenplagen15. Al deze uiteenlopende toepassingen zijn belangrijke aspecten van de huidige strategieën voor plantbeheer en de ontwikkeling van nieuwe producten is afhankelijk van efficiënte screeningtests.
Een methode die wordt gebruikt voor de introductie van verbindingen in houtachtige planten is directe injectie in de stam. Er zijn verschillende systemen ontworpen die variëren in hun behoeften voor voorgeboorde injectieplaatsen, en deze systemen maken gebruik van op druk gebaseerde injectie of passieve stroom16. Hoewel op druk gebaseerde systemen de snelle introductie van een bepaalde verbinding mogelijk maken, moet de potentiële fysieke schade die wordt veroorzaakt door het forceren van vloeistof door geblokkeerde of geëmboliseerde vasculatuur worden beschouwd17. Hoewel de blad- of drenktoepassing van verbindingen minder tijdsintensief is om te implementeren, vermindert directe planteninjectie de verspilling van de verbinding van belang als gevolg van verliezen aan de lucht of de bodem en kan het ook de tijd verlengen dat verbindingen zich in een actieve toestand bevinden door de blootstelling aan de buitenomgeving te verminderen18. Beide aspecten zijn belangrijk voor het behoud van dure reagentia en het waarborgen van consistentie tussen replicaties in onderzoeksomgevingen.
Deze studie beschrijft het ontwerp, de constructie en het gebruik van een innovatief direct plant infusion (DPI) -apparaat, dat kan worden gebruikt om te beoordelen hoe interessante verbindingen een waardplant beïnvloeden. Een standaard 3D-printer werd gebruikt om zowel het apparaat zelf als verschillende componenten in verband met de constructie te vervaardigen. Deze interne bouwmethode stelt onderzoekers in staat om het apparaat en de apparaatcomponenten aan te passen op basis van hun specifieke experimentele behoeften en vermindert de afhankelijkheid van commercieel verkrijgbare installatie-injectieapparaten. De installatie van het apparaat is eenvoudig en efficiënt en alle hulpcomponenten zijn direct beschikbaar en goedkoop. Hoewel het systeem is ontworpen voor gebruik met een verscheidenheid aan plantensoorten, hebben de hier gepresenteerde voorbeelden betrekking op citrusplanten in pot. Bovendien toont deze studie aan dat dit apparaat in staat is om efficiënt meerdere soorten verbindingen systemisch aan jonge citrusplanten te leveren zonder dodelijkheid te veroorzaken. De geteste verbindingen omvatten CFDA, dat werd gebruikt om de stofverdeling in de plant te beoordelen, en streptomycine en imidacloprid, die werden gebruikt om te verifiëren dat de antimicrobiële en insecticide effecten van deze verbindingen werden waargenomen wanneer ze via DPI werden toegediend.
Protocol
1. Productie van citrusplanten voor injectie van experimentele verbindingen
- Vermeerder kleine citrusbomen in potten uit bewortelde vegetatieve stekken of zaden. Kweek de citruslijnen in pot onder een licht/donker daglengte van 16 uur/8 uur en bij 28 °C.
- Selecteer citrusplanten van de juiste grootte voor het experiment. De beschreven toepassingen vereisten dat de planten tussen de 12 cm en 100 cm hoog moesten zijn met stamdiameters van 4-14 mm. Als er nieuwe spoelgroei nodig is, snoei de planten dan terug voorafgaand aan het experiment.
2. Driedimensionaal printen van het DPI-apparaat en matrijscomponenten
- Breng een dunne laag lijm op basis van polyvinylacetaat aan op het printbed.
- Plaats nylon filament in de 3D-printer en bereid de printer voor volgens de instructies van de fabrikant. Importeer de gewenste . STL-bestand (aanvullend dossier 1, aanvullend dossier 2, aanvullend dossier 3, aanvullend dossier 4, aanvullend dossier 5, aanvullend dossier 6, aanvullend dossier 7, aanvullend dossier 8, aanvullend dossier 9, aanvullend dossier 10, aanvullend dossier 11, aanvullend dossier 11, aanvullend dossier 12, aanvullend dossier 13 en aanvullend bestand 14), instellen en afdrukken.
- Verwijder het stuk van het printbed. Spoel de lijm op basis van polyvinylacetaat van de basis van het geprinte onderdeel met water en verwijder eventuele ondersteuningsstructuren.
- Spuit de DPI-component in met twee lagen heldere glansspuitverf.
3. Fabricage van de plastisol ring mal
- Monteer een malvorm die groot genoeg is om de patroonstukken vast te houden door een rechthoekige behuizing te bouwen met behulp van in elkaar klikbare plastic blokken op een basis (aanvullende figuur S1A).
- Meng het RTV-siliconenmonomeer en de katalysator samen in een verhouding van 10:1 en roer zonder bubbels te introduceren gedurende 1 minuut. Kleur door toevoeging van voedselkleurstof (3 druppels / 25 ml siliconenmengsel) en handzeep (1 ml zeep / 25 ml siliconenmengsel) (aanvullende figuur S1B).
- Giet een dunne laag siliconen in de vorm die voldoende is om de bodem volledig te bedekken. Stamp om het oppervlak plat te maken en wacht 24 uur tot de siliconen zijn uitgehard (aanvullende figuur S1C).
- Giet een tweede laag siliconen, zoals hierboven beschreven, die diep genoeg is om de middelste kernafdruk op het patroon te bedekken (zichtbaar aan de bovenkant van het patroon in aanvullende figuur S1D). Steek het patroon in de vloeibare siliconen met de middelste kernafdruk naar beneden gericht. Zorg ervoor dat er geen bubbels worden opgesloten en dat de patronen goed gescheiden zijn en elkaar niet raken (aanvullende figuur S1E).
- Bevestig de patronen met een zwaar voorwerp en/of tape om te voorkomen dat ze uit de siliconen zweven terwijl deze uitzet. Wacht 24 uur totdat de nieuw gegoten laag is uitgehard (aanvullende figuur S1F).
- Giet extra lagen siliconen totdat het niveau gelijk is met de bovenkant van het patroon. Wacht 24 uur om uit te harden (aanvullende figuur S1G).
- Demonteer de in elkaar klikbare plastic blokken om de mal los te maken. Verwijder de patronen (aanvullende figuur S1H). Inspecteer de mal op scheuren of misvormingen (aanvullende figuur S1I).
4. Gieten van de plastisolringen
- Bedek de binnenkant van de mal, alle kerncomponenten en de O-ringen met bakolie (aanvullende figuur S2A, B). Plaats een O-ring rond de inkeping in het midden van de kern van de middelste paal en plaats de kern in het middelste gat van de plastisolringmal (aanvullende figuur S2C).
- Steek de kern van het afgiftekanaal in het gat aan de zijkant van de plastisolringvorm. Oriënteer de V-vormige punt aan het einde van de kern van het leveringskanaal om uit te lijnen met de O-ring op de kern van de middelste paal (aanvullende figuur S2D,E).
- Verwarm plastisol in de magnetron gedurende korte uitbarstingen van 10 s (aanvullende figuur S2F, G). Roer plastisol voorzichtig om bubbels te voorkomen (aanvullende figuur S2H). Herhaal het verwarmen en roeren totdat de oplossing een temperatuur bereikt tussen 160 °C en 170 °C (aanvullende figuur S2I).
LET OP: Oververhitting van het plastisol kan leiden tot het vrijkomen van giftige dampen. Voer de procedure uit in een goed geventileerde ruimte of zuurkast. Verwarm de plastisol niet boven 170 °C. - Giet de gesmolten plastisol in de plastisolringvorm aan de buitenrand van de mal zonder bubbels te introduceren (aanvullende figuur S2J). Wacht 1 uur tot de plastisolringen zijn afgekoeld (aanvullende figuur S2K). Verwijder de ringen uit de vorm. Zorg voor een goede pasvorm met het DPI-apparaat voor gebruik in experimentele assays (aanvullende figuur S2L).
5. Bevestiging van het DPI-apparaat aan de installatie
- Zoek een gladde, gezonde plek op de kofferbak voor de bevestiging van het apparaat. Vermijd hobbels of knopen, omdat deze kunnen bijdragen aan lekkage van het apparaat.
- Gebruik een boor met een diameter van 2 mm om een gat horizontaal door het midden van de steel te boren in een hoek van 90° met het stamoppervlak (aanvullende figuur S3A). Laat de boor meerdere keren door het gat lopen om het schoon te maken en glad te maken om een onbelemmerd gat te creëren (aanvullende figuur S3B).
- Maak een verticaal segment in de plastisolring aan de andere kant van het samengestelde afgiftekanaal (aanvullende figuur S3C). Plaats de ring om de plant en lijn het afgiftekanaal met het eerder geboorde gat (aanvullende figuur S3D).
OPMERKING: De ring moet goed om de kofferbak passen om lekkages te voorkomen; Kernassemblages met verschillende diameters kunnen worden gebruikt om plastisolringen te maken voor plantenstengels van verschillende grootte. - Voeg het DPI-apparaat toe aan de plastisolring en zorg ervoor dat ze goed op elkaar aansluiten. Lijn de tuit van het DPI-apparaat uit met het afgiftekanaal van de plastisolring en het geboorde gat (aanvullende figuur S3E).
OPMERKING: Het gebruik van een boor om het gat en de tuit van het DPI-apparaat uit te lijnen kan nuttig zijn. - Wikkel stevig met siliconentape om het apparaat op zijn plaats te houden (aanvullende figuur S3F). Inspecteer het volledig geassembleerde en bevestigde apparaat om de juiste uitlijning en oriëntatie op de installatie te garanderen.
6. Het toepassen van de samengestelde rente met behulp van het DPI-apparaat
- Gebruik een spuit of pipet om het DPI-apparaat te vullen met de oplossing van belang (aanvullende figuur S3G). Gebruik een spuit om de siliconentape en plastisolring aan de andere kant van het DPI-apparaat te penetreren om lucht uit het binnenkanaal te trekken en de introductie van luchtbellen in de plantenvasculatuur te voorkomen (aanvullende figuur S3H). Vervang alle geëxtraheerde verbindingen terug in het DPI-apparaat.
- Voeg een extra klein stukje siliconentape toe aan het gat dat door de spuit is gemaakt om het gebied te versterken en scheuren te voorkomen. Inspecteer het apparaat op zichtbare lekkages op het bevestigingspunt en inspecteer het apparaatreservoir op een stabiel vloeistofniveau.
OPMERKING: Water kan in eerste instantie worden gebruikt om te testen op lekken om verspilling van de testoplossing te voorkomen. - Bedek het open uiteinde van het DPI-apparaat met wasafdichtingsfilm en trek naar beneden om een afdichting te vormen en de verdamping van de experimentele verbinding te verminderen. Prik een enkel gat in de wasfilm met een spuitpunt om de ontwikkeling van een vacuüm te voorkomen en vul het apparaat vervolgens opnieuw (aanvullende figuur S3I).
- Controleer het apparaat dagelijks om ervoor te zorgen dat de componenten goed worden uitgelijnd (aanvullende figuur S3J) en vul de vloeistof af met een spuit om te voorkomen dat het reservoir droog wordt. Herhaal dit proces totdat de gewenste hoeveelheid experimentele oplossing is geïntroduceerd.
OPMERKING: Verbindingen kunnen met succes worden geïntroduceerd vanaf een bepaald apparaat gedurende maximaal 1 maand. De opnameduur van de oplossing die dit tijdsbestek overschrijdt, moet empirisch worden getest vóór de experimentele opstelling.
7. CFDA gebruiken om vasculaire bewegingen met citrusplanten te observeren
- Bevestig het DPI-apparaat aan 25 cm hoge citroenplanten (Citrus medica L.), breng een enkele 2,0 ml behandeling van 20% DMSO in H2O-controle of CFDA aan op het DPI-apparaat en laat het gedurende 24 uur opnemen. Om dit protocol te volgen, bereidt u de werkende CFDA-oplossing voor door 1,6 ml H 2 O toe te voegen aan 400 μL CFDA-voorraadoplossing (de stamoplossing bevat 10 mM CFDA opgelost in 100% dimethylsulfoxide [DMSO]) om een uiteindelijke CFDA-concentratie van2mM en 20% DMSO te genereren.
- Maak doorsneden van verschillende weefsels van de plant en gebruik een stereoscoop of samengestelde microscoop met een fluorescerend filter dat de golflengte van 498 nm bevat om de CFDA in de plantenweefsels te visualiseren. Vergelijk de beelden met de 20% DMSO in H2O-controles om rekening te houden met autofluorescentie in het weefsel.
8. Meten van veranderingen in de CLas-titer in bladmonsters na behandeling met streptomycine
- Gebruik met behulp van 0,75 m hoge in de kas gekweekte CLas-geïnfecteerde Valencia (Citrus sinensis (L .) Osbeck "Valencia") planten, verzamel de bladsteel en middenrib van twee HLB-symptomatische bladeren van elke plant, hak ze in kleine secties, pool elk weefseltype en bewaar ze afzonderlijk in slagvaste monsterbuizen van 2 ml met een stalen bal met een diameter van 6,35 mm.
- Maal het monster met behulp van een homogenisator die is geprogrammeerd voor twee cycli van 15 s bij 3,4 m/s. Extraheer het totale nucleïnezuur zoals eerder beschreven19.
- Voer qPCR uit op de met CLas geïnfecteerde bladmonsters met behulp van de qPCR-mix zoals gedefinieerd in tabel 1 en de reactieomstandigheden gedefinieerd in tabel 2. Gebruik planten met robuuste CLas-infecties (robuuste infectie wordt over het algemeen gedefinieerd als op qPCR gebaseerde Ct-waarden < 30 voor de CLas 16S LasLong (LL) primerset) voor verdere analyse.
OPMERKING: De bacteriële titer wordt geschat met behulp van CLas 16S Las Long (LL) en citrus dehydrine DNA-primers om de relatieve genoomequivalenten te schatten, zoals eerder beschreven20. - Rust de citrusplanten die voldoen aan de hierboven beschreven minimale infectietiter uit met DPI-apparaten en onderwerp ze aan een eenmalige behandeling van 2,0 ml H2 O-oplossing of streptomycine-oplossing in de gewenste concentratie. Gebruik voor het volgen van deze studie een enkele behandeling van 2,0 ml van 9,5 mg / ml (19 mg in totaal) streptomycine opgelost in H2O.
- Verzamel bladmonsters 7 dagen, 14 dagen en 28 dagen na de behandeling. Test de bemonsterde bladeren op de CLas-titer met behulp van hetzelfde protocol als hierboven beschreven.
- Verkrijg 60 dagen na de behandeling foto's van de planten die zijn behandeld met H2O of streptomycine. Gebruik visuele observaties van de CLas-infectie om de ernst van de infectie te scoren. Zoek naar <50% van de bladeren die interveneuze chlorose en aderkurken vertonen, samen met bladspoelgroei als tekenen van milde infectie en meer dan 50% van de bladeren met interveneuze chlorose en aderkurken, evenals bladabscissie en groeiachterstand van de plant als tekenen van ernstigere infecties.
9. Meting van de mortaliteit van D. citri na behandeling met imidacloprid
- Snoei 0,5 m hoge citroenplanten (Citrus medica L.) tot een hoogte van 12 cm om de groei van nieuwe spoeling te stimuleren.
OPMERKING: De snelheid van de spoelgroei kan afhankelijk zijn van de gezondheid van de plant en de tijd van het jaar; Houd hier dus rekening mee tijdens het experimenteel ontwerpen. - Nadat >6 spoeling, 1-2 cm lang, zich hebben ontwikkeld, introduceren de planten in kooien met volwassen D. citri. Laat de planten 24 uur in de kooien staan om de afzetting van eieren mogelijk te maken.
- Voer representatieve eiertellingen uit op drie spoelscheuten 1-2 dagen na het leggen en breng vervolgens de DPI-apparaten aan. Vul deze apparaten met 2,0 ml van een watercontrole of de gewenste concentratie imidacloprid (21,8% actief ingrediënt). Gebruik voor het volgen van dit protocol 528 μL/L, 52,8 μL/L en 5,28 μL/L imidacloprid.
OPMERKING: Eitellingen zijn een destructieve maatstaf, dus de tellingen in dit stadium worden gebruikt om het aantal eieren op de niet-getelde spoeling van dezelfde plant te schatten en helpen een basislijn te bieden voor de daaropvolgende nimfopkomsttellingen die aan het einde van het experiment worden uitgevoerd. - Verzamel de D. citri-opkomstsnelheid op ten minste drie van de resterende vlakke scheuten . Verkrijg representatieve plantenfoto's 7 dagen na samengestelde introductie.
Representative Results
Onderdelen van het directe infuusapparaat
De basisversie van het directe infuusapparaat is 8 cm hoog en 3,3 cm breed aan de voor- en zijkant (figuur 1A). Het bevat een enkel centraal reservoir dat aansluit op de tuit en het totale volume dat in deze componenten kan worden opgenomen, is 2,0 ml (figuur 1D). De plastisolring is 1,8 cm hoog en heeft een diameter van 2,7 cm (figuur 1C). Deze ring bevat ook twee kanalen: een voor de tuit van het DPI-apparaat en een andere met een variabele diameter die rond de stam van de te behandelen boom past. Bovendien is er een groef rond het verticale kanaal om overtollige behandeling te richten op de boom, wat extra samengestelde opname door de schors mogelijk maakt (figuur 1F). Wanneer de plastisolring op de juiste manier wordt gemonteerd, moet deze vlak tegen het DPI-apparaat worden geplaatst en moet de tuit in lijn liggen met het gat dat in de boom is geboord (figuur 1B en figuur 1E).
CFDA
Om de effectiviteit van het DPI-apparaat voor het introduceren van exogene chemicaliën in citrusplanten te onderzoeken, werd 2,0 ml 2 mM CFDA geïnfiltreerd met behulp van het apparaat. Een fluorescentiesignaal werd gedetecteerd in de vasculatuur van de behandelde installatie (figuur 2A), maar was afwezig in de controle-installaties die werden behandeld met 20% DMSO in H2O (figuur 2B). Dit signaal werd waargenomen in alle ontleedde plantenweefseltypen, waaronder de bladmesophyl, bladsteelvasculatuur, stengelvasculatuur en wortelvasculatuur (figuur 2C). Dit signaal werd binnen 24 uur na de behandeling in de plant waargenomen en was relatief gelijkmatig over de weefsels verdeeld.
Streptomycine
Om te testen of de geïntroduceerde verbindingen een therapeutisch effect hadden op HLB-ziekte, werd 2,0 ml van een bacteriedodende verbinding, streptomycine, geïntroduceerd in CLas-positieve Valencia (Citrus sinensis) zoete sinaasappelplanten in een concentratie van 9,5 mg / ml (19 mg in totaal). Deze planten werden in kaspotten onderhouden en de CLas-titer (gemeten aan de hand van CLas-genoomequivalenten per citrusgenoomequivalent) werd in de loop van de tijd gemonitord met behulp van qPCR (figuur 3A). De initiële gemiddelde DNA CLas-titers voor de streptomycine- en H2O-behandelde planten waren respectievelijk 0,562 CLas-genoom / citrusgenoom en 0,49 CLas-genoom / citrusgenoom. Reducties in de gemiddelde bacteriële titer werden gedetecteerd door qPCR 7-28 dagen na behandeling met streptomycine in vergelijking met de H2O-controles op hetzelfde tijdstip. Bovendien was het verschil tussen de gemiddelde bacteriële titers van tijd 0 en dag 28 0,314 en 0,117 voor met streptomycine behandelde planten en met H2O behandelde planten.
Dit experiment was ontworpen om de reactie van de plant op verschillende behandelingen over verschillende tijdsperioden te meten. Een twee-factor kwadratisch responsoppervlakontwerp werd gebruikt, waarbij de tijd werd behandeld als een kwantitatieve discrete factor met vier niveaus (0 dagen, 7 dagen, 14 dagen en 28 dagen) en behandeling als een categorische factor met twee niveaus (H2O en streptomycine). Vijf replicaties werden gebruikt voor elk van de acht behandelingscombinaties en de CLas-titer werd gemeten als de responsvariabele. De gegevens werden getransformeerd met behulp van log10 op basis van een Box-Cox plotanalyse. Modelreductie werd uitgevoerd door voorwaartse selectie met behulp van Akaike's informatiecriterium (AICc)21, wat resulteerde in het verwijderen van zowel de tijd- als interactie-effecten. De resterende factor, de behandeling, was significant (p = 0,0252), waarbij met streptomycine behandelde planten een lagere gemiddelde CLas-titer (0,349) vertoonden dan de met H2O behandelde planten (0,496) over alle tijdspunten samen (figuur 3B). Deze afname van de CLas-titer kwam overeen met incidentele toename van de groei van nieuwe gezonde spoelingen na 60 dagen in de met streptomycine behandelde planten, zoals blijkt uit foto's van representatieve bomen behandeld met H2O (figuur 3C) versus 19 mg streptomycine (figuur 3D).
Imidacloprid
Imidacloprid werd geïntroduceerd in juveniele Aziatische citrus psyllid (ACP) -besmette citroenplanten met behulp van het DPI-apparaat om zijn potentieel als een D. citri insecticide screening assay te testen. Een enkele behandeling van 2,0 ml van een commerciële imidacloprid insecticide-oplossing werd getest in drie verschillende concentraties (5,28 μL / L, 52,8 μL / L en 528 μL / L), samen met een watercontrole. Het gemiddelde totale aantal eieren per drie spoelscheuten voorafgaand aan de behandeling varieerde van 280,5 tot 321, en er waren geen significante verschillen tussen de te gebruiken planten voor elke behandelingsgroep (figuur 4A). De gemiddelde totale overlevende nimfen op drie spoelscheuten 7 dagen na de behandeling waren respectievelijk 293,75, 268, 97,5 en 2 voor de watercontrole en 5,28 μL/L, 52,8 μL/L en 528 μL/L imidacloprid-oplossingen (figuur 4B). Dit vertegenwoordigde een significante vermindering van de opkomst van psyllid-nimfen bij de imidacloprid-oplossingsniveaus van 52,8 μL / L (p = 0,029) en 528 μL / L (p = 0,002) in vergelijking met de watercontrole volgens een eenrichtings-ANOVA gevolgd door een post-hocanalyse van Tukey. Bovendien was deze toename van psyllid-nimfsterfte op het hoogste imidacloprid-oplossingsniveau visueel zichtbaar door de vermindering van de productie van nimfhoningdauw op de met imidacloprid behandelde lijnen (figuur 4D) in vergelijking met de watercontrole (figuur 4C).
Figuur 1: Het directe infuusapparaat van de plant en de plastisolring. (A) De intacte directe planteninfuusinrichting en (C) plastisolring samen met hun afmetingen. B) De directe planteninfusie en plastisolring die met een citrusboom zijn verbonden en bevestigd. Verticale doorsneden van het (D) directe planteninfuusapparaat, (F) plastisolring en (E) deze twee componenten verbonden en bevestigd aan een citrusboom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Doorsnede van de bladmiddenrib van een citrusplant van 25 cm. Beelden die 24 uur na behandeling met (A) 2 mM CFDA of (B) 20% DMSO in H2O met behulp van het directe infuusapparaat van de installatie worden getoond. (C) Dwarsdoorsneden van verschillende plantenweefsels 24 uur na 2 mM CFDA-behandeling, inclusief de stam 5 cm boven het directe planteninfuusapparaat (linksboven), de stam 5 cm onder het directe planteninfuusapparaat (midden links), de wortel (linksonder), de bladmiddenrib (rechtsboven), de bladsteel (midden rechts) en het bladmesophyl (rechtsonder). Schaalstaven = 1 mm. Afkortingen: CFDA = 5,6-carboxyfluoresceïne-diacetaat; DMSO = dimethylsulfoxide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Monitoring van de CLas-titer (gemeten aan de hand van CLas-genoomequivalenten per citrusgenoomequivalent) in de loop van de tijd met behulp van qPCR. (A) Tijdsverloop met veranderingen in de CLas DNA-titer waarbij de vijf met 19 mg streptomycine behandelde planten worden vergeleken met de vijf planten die met een H2O-controle zijn behandeld. De punten vertegenwoordigen het gemiddelde voor een bepaalde behandeling op een bepaald tijdstip. De foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. (B) Staafdiagram met de gemiddelde CLas-titer van de met H2O en streptomycine behandelde planten over alle tijdspunten. De foutbalken vertegenwoordigen het 95%-betrouwbaarheidsinterval en de sterretjes geven significante verschillen aan (* = p < 0,05) tussen de gemiddelde CLas-titers voor de streptomycine- en H2O-behandelde planten volgens een eenrichtings-ANOVA. (C) Representatieve beelden van citrusplanten 0 maanden en 2 maanden na directe behandeling met de infusie van de plant met (C) H2O of (D) streptomycine. De met streptomycine behandelde planten vertonen na 2 maanden een nieuwe lichtgroene bladgroei, wat wijst op een vermindering van de CLas-titer. Afkorting: CLas = Candidatus Liberibacter asiaticus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Monitoring van de psyllid nimfsterfte in juveniele ACP-besmette citroenplanten. Staafdiagrammen met (A) het geschatte aantal oorspronkelijke eieren en (B) de overlevende D. citri-nimfen op drie citrusspoelingen 7 dagen na behandeling met een watercontrole en verschillende verdunningen van imidacloprid. De foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde en de sterretjes geven significante verschillen aan (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) tussen een bepaald behandelingsniveau en de waterregeling volgens een eenrichtings-ANOVA gevolgd door een post-hoc analyse van een Tukey. Beelden van met D. citri nymph besmette citrusspoeling 7 dagen na behandeling met ofwel (C) de watercontrole of (D) 528 μL/L imidacloprid met behulp van het directe planteninfusieapparaat. Afkortingen: ACP = Aziatische citrus psyllid; D. citri = Diaphorina citri Kuwayama. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Volume per monster (μL) | Bestanddeel | |||||
| 12.5 | 2x GoTaq qPCR met BRYT Green Dye Master Mix | |||||
| 5 | DNA-sjabloon (20 ng / μL) | |||||
| 0.5 | 10 μM Primer F en R voor CLas | Clas: CTTACCAGCCCTTGACATGTATAGG (Voorwaarts); TCCCTATAAAGTACCCAACATCTAGGTAAA (Omkeer) |
||||
| 0.5 | 10 μM Primer F en R voor citrushuishouding | Citrusdehydrine: TGAGTACGAGCCGAGTGTTG (Voorwaarts); AAAACTTCACCGATCCACCAG (Omgekeerd) |
||||
| 6.5 | H2O | |||||
Tabel 1: De qPCR-mix die wordt gebruikt om de CLas-titer in met streptomycine behandelde citruslijnen te kwantificeren. De volgorde van de 16S Las Long primers en citrus dehydrin primers voor CLas DNA kwantificering en citrus DNA kwantificering worden getoond.
| Stap | Temperatuur (°C) | Tijd | |
| 1 | Initiële denaturering | 95 | 2 min |
| 2 | Denaturering | 95 | 15 s |
| 3 | Annealing | 60 | 20 s |
| 4 | Extensie | 72 | 20 s |
| 5 | Ga naar stap 2, herhaal 39x | ||
| 6 | Smeltcurve | 60 ramping tot 95 bij 0,2 °C/s | 3 min |
Tabel 2: Reactiecondities voor de qPCR die wordt gebruikt om de CLas-titer in met streptomycine behandelde citruslijnen te kwantificeren.
Aanvullende figuur S1: Afbeeldingen van het assemblageproces van de mal om de plastisolring te genereren. (A) Snap-together plastic blokken werden gebruikt om de eerste laag van de plastisol ring mal te genereren. (B) Uniform gemengde oplossing die het siliconen RTV-rubber, katalysator, voedselkleurstof en zeep bevat. (C) Gelijkmatig gegoten eerste laag van de plastisolringvorm. (D) Afbeelding van de plastisol ring patronen met de middelste hold core print aan de bovenkant. (E) Plastisolringpatronen ingebracht in de niet-uitgeharde tweede laag van de mal. (F) Afplaktape en rubberen hamer die worden gebruikt om de patronen vast te zetten terwijl de tweede laag uithardt. (G) Derde laag van de mal toegevoegd totdat deze gelijk is met de bovenkant van de patronen. (H) Het verwijderen van de patronen uit de mal. (I) Volledig geconstrueerde plastisolringvorm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Afbeeldingen van het assemblageproces van de plastisolring die is gekoppeld aan het directe infuusapparaat van de installatie. (A) Plastisolringassemblagecomponenten, inclusief de mal, de middelste kern met een O-ring en de kern van het leveringskanaal. (B) Coating van de kernen in antiaanbakspray bakolie om het verwijderen van de plastisolring na het uitharden te vergemakkelijken. (C) Inbrengen van de middelste kern en O-ring in de mal. (D) Inbrengen van de kern van het leveringskanaal loodrecht op de middelste kern. (E) Juiste montage van de kerncomponenten van de plastisolring in de schimmelholte. (F) Plastisol gebruikt voor het genereren van de plastisolring. (G) Verwarm de plastisol in de magnetron. (H) Roeren van de plastisol na verhitting. (I) Controle van de plastisoltemperatuur. (J) Het verwarmde plastisol in de geassembleerde kern gieten. (K) Zorgen voor de koeling van het plastisol rond de geassembleerde kern. L) Volledig geassembleerde plastisolringen die aan de directe infuusinrichting van de installatie zijn bevestigd. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S3: Afbeeldingen van het assemblageproces van de infuusvoorziening van de directe installatie. (A) Het boren van een gat door het midden van de citrusplant om een kanaal te creëren voor samengestelde levering. (B) Vooraanzicht van het geboorde gat. (C) Snijden door de plastisolring met een scheermesje tegenover het samengestelde afgiftekanaal. (D) De plastisolring strak om de stengel aanbrengen op de plaats van het eerder geboorde gat. (E) Het aanbrengen van de directe planteninfuusinrichting op de plastisolring, waarbij de samengestelde toedieningsspigot op het apparaat in het kanaal van de plastisolring wordt ingebracht. (F) Gebruik siliconentape om het directe infuusapparaat van de plant aan de plastisolring te bevestigen en het hele apparaat op zijn plaats te houden. (G) Het vullen van de directe infuuskamer van de installatie met de verbinding van belang. (H) Gebruik een spuit om lucht uit het geboorde gat in de installatie te trekken en de stroom van de verbinding te starten. (I) Het aanbrengen van wasafdichtingsfolie op de opening in de directe infuuskamer van de installatie en het prikken van een gat om vacuüm te voorkomen. J) Volledig geassembleerde directe planteninjectie-inrichting op een citrusplant. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 1: De kern van de plastisolring in het midden van de paal. STL bestand voor een 4 mm boom. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 2: De kern van de plastisolring in het midden van de paal. STL bestand voor een 6 mm boom. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 3: De plastisol ring centrale post kern . STL bestand voor een 8 mm boom. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 4: De kern van de plastisolring in het midden van de paal. STL bestand voor een 10 mm boom. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 5: De plastisol ring centrale post kern . STL bestand voor een 12 mm boom. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 6: De kern van de plastisolring in het midden van de paal. STL bestand voor een 14 mm boom. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 7: De kern van het plastisolringafgiftekanaal . STL bestand voor een 4 mm boom. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 8: De kern van het plastisolringafgiftekanaal . STL bestand voor een 6 mm boom. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 9: De kern van het plastisolringafgiftekanaal . STL bestand voor een 8 mm boom. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 10: De kern van het plastisolringafgiftekanaal . STL bestand voor een 10 mm boom. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 11: De kern van het plastisolringafgiftekanaal . STL bestand voor een 12 mm boom. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 12: De kern van het plastisolringafgiftekanaal . STL bestand voor een 14 mm boom. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 13: Het directe infuusapparaat van de installatie . STL-bestand. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 14: Het patroon dat is gebruikt om de mal voor de plastisolring te maken. STL-bestand. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Om het DPI-apparaat te kunnen beschouwen als een levensvatbare methode voor exogene toediening van verbindingen in planten, moet het bijdragen aan een robuuste en consistente opname van verbindingen in verschillende weefseltypen. Het experiment met CFDA toonde duidelijk zowel acropetale als basipetale samengestelde beweging, evenals in zowel het vasculaire systeem als mesophylcellen van het blad. Bovendien, en vermoedelijk omdat het geboorde gat dat in dit DPI-apparaat wordt gebruikt een grote hoeveelheid oppervlak biedt voor samengestelde opname, was de CFDA in relatief gelijke hoeveelheden aanwezig in alle delen van de stengel, niet alleen in een kleine subset van de vasculatuur naast het apparaat, zoals is gezien in eerdere kleurstofopnamestudies in planten met behulp van staminjectie6. Bovendien werd de levering van groen fluorescerend eiwit en florale kleurstof getest met behulp van het DPI-apparaat en werd een verdeling van deze verbindingen vergelijkbaar met CFDA waargenomen (gegevens niet getoond). Deze gegevens suggereren dat het apparaat kan worden gebruikt om systemisch een verscheidenheid aan verbindingen af te leveren die variëren in grootte en moleculaire structuur. Het is echter vermeldenswaard dat er verschillen waren in de samengestelde opname op basis van de bladontwikkelingsfase, waarbij jongere ontwikkelende bladeren meer verbinding innamen dan oudere gevestigde bladeren. Dit kan te wijten zijn aan de veranderingen in de vasculatuureigenschappen die aanwezig zijn in zink- versus bronweefsel en moet worden geoptimaliseerd voor een bepaald experiment.
Het DPI-apparaat vertoonde voldoende samengestelde opname voor de visualisatie van CFDA, GFP en florale kleurstof, en het nam ook genoeg in beslag om de antibacteriële en insecticide effecten van respectievelijk streptomycine en imidacloprid aan te tonen. Beide verbindingen resulteerden in veranderingen in de levensvatbaarheid van het doelorganisme 1 week na een enkele behandeling van 2,0 ml. Deze gegevens suggereren dat het DPI-apparaat kan worden gebruikt in tests voor de hele plant om de levensvatbaarheid van een breed scala aan verbindingen voor de bestrijding van microbiële en insectenplagen te testen. Bovendien kan dit apparaat, vanwege het directe contact met het vasculaire systeem, zelfs de mogelijkheid bieden om verbindingen te testen die niet efficiënt worden opgenomen door de wortels of epidermale cellen. Van bijzonder belang zou RNA-interferentie (RNAi) zijn, omdat dit kan worden gebruikt om de genexpressie in de waardplant, ziekteverwekker of pathogeenvector te moduleren. Eerder onderzoek dat haarspeld-RNA introduceerde via een geboord gat in de stam van appel- en druivenplanten toonde aan dat de RNA-moleculen beperkt waren tot het xyleemweefsel, wat suggereert dat deze moleculen mogelijk alleen effectief zijn tegen kauwende en xyleem-sapvoedende organismen22. Gezien het feit dat het DPI-apparaat een vergelijkbaar geboord gatafgiftesysteem gebruikt, is het logisch dat haarspeld-RNA dat met dit apparaat wordt geleverd, ook beperkt kan zijn tot het xyleemweefsel. De waargenomen afname van de titer van de floëembeperkte CLas na behandeling met streptomycine door het DPI-apparaat suggereert echter sterk dat dit antibioticum aanwezig was in het floëem. Daarom is het waarschijnlijk dat de vasculaire verdeling van de verbindingen die met behulp van het DPI-apparaat worden geleverd, afhankelijk is van hun grootte en chemie, en elk molecuul moet op individuele basis worden geëvalueerd.
Hoewel er een aantal in de handel verkrijgbare DPI-apparaten op de markt zijn, kan het hier beschreven apparaat in eigen huis worden vervaardigd en kan het worden gewijzigd. Op deze manier kunnen verbeteringen en veranderingen in grootte worden aangebracht op basis van de plantensoort en het experimentele ontwerp dat wordt gebruikt, en is het niet afhankelijk van commerciële producten. Bovendien is het apparaat semi-permanent aan de plant bevestigd, wat betekent dat meerdere behandelingen van een bepaalde verbinding tegelijkertijd kunnen worden uitgevoerd zonder de plant opnieuw te verwonden met meerdere samengestelde injecties. Waarschuwing: het apparaat kan lekken als het niet correct is geïnstalleerd. Als gevolg hiervan gaat de verbinding verloren aan het milieu in plaats van te worden afgeleverd aan de plant. Daarom moet ervoor worden gezorgd dat het apparaat tijdens de installatie en de eerste paar dagen daarna wordt geïnspecteerd op tekenen van lekkage. Hoewel het boren van een gat in de boom potentieel schadelijk is, is deze methode gekozen om een robuuste en consistente opname van verbindingen te garanderen. Bovendien werden in deze experimenten geen nadelige effecten op de gezondheid van planten waargenomen door de bevestiging van het DPI-apparaat. Er moeten echter extra planten in het experimentele ontwerp worden opgenomen om de planten te vervangen die in de loop van een bepaald experiment aan kracht kunnen inboeten. Ten slotte, aangezien dit apparaat passieve stroming gebruikt om verbindingen te introduceren, kan het moeilijk zijn om de opnamesnelheid van verschillende plantensoorten of ontwikkelingsstadia van dezelfde soort te voorspellen. Dit kan experimenten bemoeilijken als de snelheid van de opname van verbindingen een beperkende factor is. Voor de beste resultaten moeten experimenten zo worden gepland dat de plant voldoende tijd krijgt om de 2,5 ml verbinding volledig te absorberen, wat tot 1 week kan duren. Kortom, dit DPI-apparaat is een effectief hulpmiddel voor de snelle evaluatie van de in planta-activiteit van antimicrobiële of insecticide verbindingen tegen CLas en zijn vector, D. citri, en biedt dus meer informatie over de systemische effectiviteit en invloed op de prestaties van planten dan de eerder gepresenteerde losse bladtest23. Ongetwijfeld reikt de verscheidenheid aan toepassingen voor dit systeem veel verder dan de specifieke toepassingen die in deze studie worden beschreven.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten. Het gebruik van handels-, bedrijfs- of bedrijfsnamen in deze publicatie is ter informatie en gemak van de lezer. Een dergelijk gebruik vormt geen officiële goedkeuring of goedkeuring door het Amerikaanse ministerie van Landbouw of de Agricultural Research Service van een product of dienst met uitsluiting van andere die geschikt kunnen zijn. Het Amerikaanse ministerie van Landbouw (USDA) verbiedt discriminatie in al zijn programma's en activiteiten op basis van ras, huidskleur, nationale afkomst, leeftijd, handicap en, indien van toepassing, geslacht, burgerlijke staat, familiale status, ouderlijke status, religie, seksuele geaardheid, genetische informatie, politieke overtuigingen, represailles, of omdat het inkomen van een persoon geheel of gedeeltelijk is afgeleid van een openbaar hulpprogramma. Niet alle verboden bases zijn van toepassing op alle programma's. Personen met een handicap die alternatieve middelen nodig hebben voor de communicatie van programma-informatie (braille, grote letters, audiotape, enz.) moeten contact opnemen met het TARGET Center van USDA op (202) 720-2600 (spraak en TDD). Om een klacht over discriminatie in te dienen, schrijft u naar USDA, directeur, Office of Civil Rights, 1400 Independence Avenue, S.W., Washington, D.C. 20250-9410, of belt u (800) 795-3272 (stem) of (202) 720-6382 (TDD). USDA is een aanbieder van gelijke kansen en werkgever.
Acknowledgments
De auteurs willen Mant Acon bedanken voor de planten die in deze studie zijn gebruikt. De financiering werd verstrekt door het CRIS-project 8062-22410-007-000-D van het Amerikaanse ministerie van Landbouw (USDA) en USDA NIFA-subsidie 2020-70029-33176.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 cm Diameter Steel Balls | Ballistic Products Inc. | #SHT #T | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | Becton Dickinson | 382903029952 | |
| 20 G 1 Syringe Needle | Becton Dickinson | 305175 | |
| 2 mL Screw Cap Tubes | USA Scientific | 1420-9710 | |
| 3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964077 | |
| 3D Printer | Markforged | F-PR-2027 | |
| 3D Printing Software | Markforged | F-SW-FDVX | |
| 3D Printing Software | Markforged | S-FW-OEVX | |
| 5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C195 | |
| 5/64th Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964502 | |
| 96 Well qPCR Machine | Roche | 5815916001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22621408 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | SP-BX43-BI | |
| Fluorescent Microscope Filter | Chroma | 69401-ET | |
| Gloss Clear Spray Paint | Rustoleum | 249117 | |
| Grey Lego Baseplate | Lego | 11024 | |
| Handheld Cordless Drill | Makita | 6349D | |
| Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | |
| Imidacloprid 2F | Quali-Pro | 83080133 | |
| Liquid Plastisol Medium Hardness | Fusion X Fishing Lures | XSOL-505 | |
| Red Silicone 70 Shore A O-Ring | Grainger | Varies by Size | |
| Non-Stick Cooking Spray | PAM | 64144030217 | |
| NucleoSpin Plant II | Macherey-Nagel | 740770.5 | |
| Parafilm | Bemis | HS234526A | |
| Poly Viyl Acetate Based Glue | Elmers | E301 | |
| qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
| qPCR Primers | Integrated DNA Technologies | Varies by DNA sequence | |
| Reverse Transcriptase | Promega | A5003 | |
| Single Edge Razor Blade | Garvey | 40475 | |
| Translucent Silicone RTV Rubber | Aero Marine Products | AM 115T | |
| Transparent Silicone Tape | Maxwell | KE30S | |
| Truncated Oncocin 112 | Genscript | Varies by peptide sequence | |
| White 1 x 6 Lego Piece | Lego | 300901 | |
| White Nylon | Markforged | F-MF-0003 |
References
- Hu, J., Wang, N. Evaluation of the spatiotemporal dynamics of oxytetracycline and its control effect against citrus huanglongbing via trunk injection. Phytopathology. 106 (12), 1495-1503 (2016).
- Bendix, C., Lewis, J. D. The enemy within: Phloem-limited pathogens. Molecular Plant Pathology. 19 (1), 238-254 (2018).
- Keshavareddy, G., Kumar, A. R. V., Ramu, V. S. Methods of plant transformation- A review. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (7), 2656-2668 (2018).
- Qaim, M. Role of new plant breeding technologies for food security and sustainable agricultural development. Applied Economics Perspectives and Policy. 42 (2), 129-150 (2020).
- Siegrist, M., Hartmann, C. Consumer acceptance of novel food technologies. Nature Food. 1 (6), 343-350 (2020).
- Larson, D. W., Doubt, J., Matthes-Sears, U. Radially sectored hydraulic pathways in the xylem of Thuja occidentalis as revealed by the use of dyes. International Journal of Plant Sciences. 155 (5), 569-582 (1994).
- Mehdi, R., et al. Symplasmic phloem unloading and radial post-phloem transport via vascular rays in tuberous roots of Manihot esculenta. Journal of Experimental Botany. 70 (20), 5559-5573 (2019).
- Miller, G. S., Parente, R. M., Santra, S., Gesquiere, A. J. Tracking of fluorescent antibiotic conjugate in planta utilizing fluorescence lifetime imaging. Planta. 253 (2), (2021).
- Treydte, K., Lehmann, M. M., Wyczesany, T., Pfautsch, S. Radial and axial water movement in adult trees recorded by stable isotope tracing. Tree Physiology. 41 (12), 2248-2261 (2021).
- Nie, P. Liping Hu, Haiyan Zhang, Jixiang Zhang, Zhenxian Zhang, Lingyun Zhang, The predominance of the apoplasmic phloem-unloading pathway is interrupted by a symplasmic pathway during Chinese jujube fruit development. Plant and Cell Physiology. 51 (6), 1007-1018 (2010).
- Jiang, M., Deng, Z., White, R. G., Jin, T., Liang, D. Shootward movement of CFDA tracer loaded in the bottom sink tissues of Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59606 (2019).
- Liu, H., Si, C., Shi, C., Wang, S. Zhe Sun, Yanxi Shi, from apoplasmic to symplasmic phloem unloading during storage roots formation and bulking of sweet potato. Crop Science. 59 (2), 675-683 (2019).
- Erdos, T., Ullmann, A. Effect of streptomycin on the incorporation of amino-acids labeled with carbon-14 into ribonucleic acid and protein in a cell-free system of a Mycobacterium. Nature. 183 (4661), 618-619 (1959).
- Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Motaung, T. E. Chloronicotinyl insecticide imidacloprid: Agricultural relevance, pitfalls and emerging opportunities. Crop Protection. 131, 105097 (2020).
- Berger, C., Laurent, F. Trunk injection of plant protection products to protect trees from pests and diseases. Crop Protection. 124, 104831 (2019).
- Archer, L., Crane, J. H., Albrecht, U. Trunk injection as a tool to deliver plant protection materials-An overview of basic principles and practical considerations. Horticulturae. 6 (6), 552 (2022).
- Wise, J. C., et al. Trunk injection: A discriminating delivering system for horticulture crop IPM. Entomology, Ornithology & Herpetology: Current Research. 03 (2), (2014).
- Ammar, E. D., George, J., Sturgeon, K., Stelinski, L. L., Shatters, R. G. Asian citrus psyllid adults inoculate Huanglongbing bacterium more efficiently than nymphs when this bacterium is acquired by early instar nymphs. Scientific Reports. 10 (1), 18244 (2020).
- Stover, E., Mccollum, G., Ramos, J., Shatters, R. G. Growth, health and Liberibacter asiaticus titer in diverse citrus scions on mandarin versus trifoliate hybrid rootstocks in a field planting with severe Huanglongbing. Proceedings of the Florida State Horticultural Society. 127, 53-59 (2014).
- Akaike, H. A new look at the statistical model identification. IEEE Transactions on Automatic Control. 19 (6), 716-723 (1974).
- Dalakouras, A., Jarausch, W., Buchholz, G., Bassler, A., Braun, M., Manthey, T., Krczal, G., Wassenegger, M. Delivery of hairpin RNAs and small RNAs into woods and herbaceous plants by trunk injection and petiole absorption. Frontiers in Plant Science. 9, 1253 (2018).
- Ammar, E. D., Walter, A. J., Hall, D. G. New excised-leaf assay method to test inoculativity of Asian citrus psyllid (Hemiptera: Psyllidae) with Candidatus Liberibacter asiaticus associated with citrus Huanglongbing disease. Journal of Economic Entomology. 106 (1), 25-35 (2013).
