Summary
В этой рукописи описывается новое устройство прямой инфузии растений для скрининга эффективности молекул против бактерий (Candidatus Liberibacter asiaticus) или их насекомых-переносчиков (Diaphorina citri, Kuwayama), которые в сочетании связаны с цитрусовой болезнью Хуанлунбин.
Abstract
Проверка функции терапевтических соединений в растениях является важным компонентом сельскохозяйственных исследований. Методы внекорневого и почвенного полива являются обычными, но имеют недостатки, в том числе переменное поглощение и разрушение тестируемых молекул окружающей средой. Приствольная инъекция деревьев хорошо зарекомендовала себя, но большинство методов для этого требуют дорогостоящего, запатентованного оборудования. Для скрининга различных методов лечения Хуанлунбин необходим простой и недорогой метод доставки этих соединений в сосудистую ткань небольших цитрусовых деревьев, выращенных в теплицах, инфицированных бактерией Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) или зараженных питающимся флоэмой насекомым-переносчиком CLas Diaphorina citri Kuwayama (D. citri).
Чтобы удовлетворить эти требования к скринингу, было разработано устройство прямой инфузии растений (DPI), которое подключается к стволу растения. Устройство изготовлено с использованием системы 3D-печати на основе нейлона и легкодоступных вспомогательных компонентов. Эффективность поглощения соединений этого устройства была протестирована на цитрусовых растениях с использованием флуоресцентного маркера 5,6-карбоксифлуоресцеин-диацетата. Обычно наблюдалось равномерное распределение маркера по всему растению.
Кроме того, это устройство использовалось для доставки противомикробных и инсектицидных молекул для определения их воздействия на CLas и D. citri соответственно. Аминогликозидный антибиотик стрептомицин был доставлен в цитрусовые растения, инфицированные CLas, с помощью устройства, что привело к снижению титра CLas с 2 до 4 недель после лечения. Доставка неоникотиноидного инсектицида имидаклоприда в цитрусовые растения, зараженные D. citri, привела к значительному увеличению смертности от псиллида через 7 дней. Эти результаты свидетельствуют о том, что это устройство DPI представляет собой полезную систему для доставки молекул в растения для тестирования и облегчения исследований и скрининга.
Introduction
Управление растениями в коммерческих и ландшафтных условиях часто требует использования химических соединений для оптимизации роста и здоровья растений. То, как эти молекулы доставляются, зависит от типа молекулы, функции молекулы, типа растения и существующей системы управления. Внекорневые и почвенные подкормки являются самыми простыми стратегиями доставки, но ограничения в поглощении некоторых молекул требуют прямой доставки. Примером этих молекул являются терапевтические молекулы, которые лучше всего функционируют, когда они системно перемещаются внутри растения, но не могут быть эффективно доставлены с помощью простых местных применений1. Так обстоит дело с болезнью Хуанлунбин (ГЛБ), также называемой болезнью позеленения цитрусовых. ГЛБ — это заболевание, связанное с ограниченной флоэмой бактерией Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), которую нельзя культивировать вне растения, или ее насекомым-переносчиком Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
Если предполагаемые терапевтические молекулы являются генными продуктами, их можно проверить, создав трансгенные растения, экспрессирующие эти соединения. Однако производство трансгенных растений может быть трудоемким и ресурсоемким, сильно зависит от генотипа и может быть ингибировано подавлением гена3. Кроме того, даже если эти трансгены показывают многообещающие результаты, ограничения со стороны регулирующих органов и общественного восприятия снижают вероятность их коммерческого принятия 4,5. Экзогенное применение соединений, однако, упрощает тестирование биологических и синтетических молекул, поскольку оно не требует производства стабильных или временно экспрессирующих трансгенных растений, что сокращает время и ресурсы для тестирования эффектов молекулы. Метод эффективной и действенной системной доставки экзогенных соединений растениям может быть использован для широкого круга исследовательских и скрининговых целей.
Одним из таких применений является анализ системного движения молекул в сосудистой системе растения, который может быть выполнен с использованием отслеживаемых маркеров, будь то флуоресцентные, видимые или уникальные химические изотопы 6,7,8,9. Одним из широко используемых флуоресцентных маркеров является 5,6-карбоксифлуоресцеин-диацетат (CFDA), который представляет собой мембранопроницаемый краситель, который разлагается внутриклеточными эстеразами на 5,6-карбоксифлуоресцеин (CF) и, впоследствии, становится флуоресцентным и мембранонепроницаемым10. CFDA широко используется для мониторинга транспорта флоэмы, отношений стока и источника, а также структуры сосудистой сети в растительной ткани11,12.
В дополнение к этим маркерам, некоторые соединения могут напрямую изменять физиологию растения, чтобы увеличить продуктивность или убить растение в случае гербицидов. Как инсектициды, так и противомикробные соединения являются средством повышения продуктивности растений, особенно в присутствии ГЛБ. Примером антимикробной молекулы, которая используется для контроля CLas, является стрептомицин. Стрептомицин представляет собой аминогликозидный антибиотик, который первоначально был выделен из Streptomyces griseus и, как было показано, ингибирует рост бактерий за счет ингибирования биосинтеза белка13. Что касается инсектицидов, то основной мишенью для исследований ГЛБ является D. citri, который передает CLas от дерева к дереву14. Для этой цели обычно используются неоникотиноиды, такие как имидаклоприд, поскольку они являются золотым стандартом борьбы с насекомыми-вредителями15. Все эти разнообразные виды использования являются важными аспектами текущих стратегий управления предприятием, и разработка новых продуктов зависит от эффективных скрининговых анализов.
Одним из методов, который используется для введения соединений в древесные растения, является прямое впрыскивание в ствол. Было разработано множество систем, которые различаются по своим потребностям для предварительно пробуренных участков закачки, и в этих системах используется либо впрыск на основе давления, либо пассивный поток16. Хотя системы, основанные на давлении, позволяют быстро вводить данное соединение, необходимо учитывать потенциальный физический ущерб, вызванный проталкиванием жидкости через заблокированную или эмболизированную сосудистую сеть17. Несмотря на то, что внекорневое или мокрое внесение компаундов требует меньше времени для реализации, непосредственная инъекция растений сокращает отходы интересующего соединения из-за потерь в воздух или почву, а также может продлить время, в течение которого соединения находятся в активном состоянии, за счет уменьшения воздействия внешней среды18. Оба эти аспекта важны для сохранения дорогостоящих реагентов и обеспечения согласованности репликаций в исследовательских условиях.
В этом исследовании описывается проектирование, конструкция и использование инновационного устройства прямой инфузии растений (DPI), которое может быть использовано для оценки того, как интересующие соединения влияют на растение-хозяина. Стандартный 3D-принтер использовался для изготовления как самого устройства, так и нескольких компонентов, связанных с его конструкцией. Этот собственный метод строительства позволяет исследователям модифицировать устройство и компоненты устройства в зависимости от их конкретных экспериментальных потребностей и снижает зависимость от коммерчески доступных устройств для впрыска растений. Настройка устройства проста и эффективна, а все вспомогательные компоненты легко доступны и недороги. Хотя система была разработана для использования с различными видами растений, представленные здесь примеры относятся к цитрусовым растениям в горшках. Кроме того, это исследование демонстрирует, что это устройство способно эффективно системно доставлять несколько типов соединений к молодым цитрусовым растениям, не вызывая летального исхода. Протестированные соединения включали CFDA, который использовался для оценки распределения соединений в растении, а также стрептомицин и имидаклоприд, которые использовались для проверки того, что антимикробные и инсектицидные эффекты этих соединений наблюдались при доставке через DPI.
Protocol
1. Производство цитрусовых растений для экспериментального впрыска соединений
- Размножайте небольшие цитрусовые деревья в горшках либо укоренившимися вегетативными черенками, либо семенами. Выращивайте цитрусовые в горшках при светлом/темном дне 16 ч/8 ч и при температуре 28 °C.
- Выберите для эксперимента цитрусовые растения подходящего размера. Описанные применения требовали, чтобы растения были от 12 см до 100 см в высоту и диаметром ствола 4-14 мм. Если требуется новый рост заподлицо, обрежьте растения до эксперимента.
2. Трехмерная печать устройства DPI и компонентов пресс-формы
- Нанесите тонкий слой клея на основе поливинилацетата на печатный стол.
- Загрузите нейлоновую нить в 3D-принтер и подготовьте принтер в соответствии с инструкциями производителя. Импортируйте нужный файл . STL-файл (Дополнительный файл 1, Дополнительный файл 2, Дополнительный файл 3, Дополнительный файл 4, Дополнительный файл 5, Дополнительный файл 6, Дополнительный файл 7, Дополнительный файл 8, Дополнительный файл 9, Дополнительный файл 10, Дополнительный файл 11, Дополнительный файл 12, Дополнительный файл 13 и Дополнительный файл 14), настройте и начните печать.
- Извлеките деталь из печатного стола. Промойте клей на основе поливинилацетата с основы печатного компонента водой и удалите все опорные конструкции.
- Распылите на компонент DPI два слоя прозрачной глянцевой аэрозольной краски.
3. Изготовление пресс-формы для пластизольного кольца
- Соберите форму формы, достаточно большую, чтобы вместить части выкройки, построив прямоугольный корпус из защелкивающихся пластиковых блоков на основании (дополнительный рисунок S1A).
- Смешайте силиконовый мономер RTV и катализатор в соотношении 10:1 и перемешайте, не добавляя пузырьков, в течение 1 минуты. Окрасите, добавив пищевой краситель (3 капли/25 мл силиконовой смеси) и мыло для рук (1 мл мыла/25 мл силиконовой смеси) (дополнительный рисунок S1B).
- Налейте в форму тонкий слой силикона, достаточный для полного покрытия дна. Утрамбуйте, чтобы поверхность выровнялась, и подождите 24 часа, пока силикон застынет (дополнительный рисунок S1C).
- Налейте второй слой силикона, как описано выше, достаточно глубокий, чтобы покрыть отпечаток сердцевины центрального отверстия на выкройке (виден в верхней части выкройки на дополнительном рисунке S1D). Вставьте выкройку в жидкий силикон отпечатком сердцевины центрального отверстия вниз. Убедитесь, что пузырьки не застряли, а узоры хорошо разделены и не соприкасаются (дополнительный рисунок S1E).
- Закрепите выкройки тяжелым предметом и/или скотчем, чтобы они не выплывали из силикона во время его схватывания. Подождите 24 часа, пока только что налитый слой схватится (дополнительный рисунок S1F).
- Налейте дополнительные слои силикона до тех пор, пока уровень не окажется вровень с верхней частью рисунка. Подождите 24 часа, чтобы затвердеть (дополнительный рисунок S1G).
- Разберите защелкивающиеся пластиковые блоки, чтобы освободить форму. Удалите узоры (дополнительный рисунок S1H). Осмотрите форму на наличие разрывов или деформаций (дополнительный рисунок S1I).
4. Литье пластизольных колец
- Покройте внутреннюю часть формы, все основные компоненты и уплотнительные кольца растительным маслом (дополнительный рисунок S2A, B). Поместите уплотнительное кольцо вокруг выемки в середине сердечника центральной стойки и поместите сердечник в центральное отверстие формы для пластизольного кольца (дополнительный рисунок S2C).
- Вставьте сердечник канала доставки в отверстие сбоку формы для пластизольного кольца. Сориентируйте V-образный наконечник на конце сердечника нагнетательного канала так, чтобы он совпал с уплотнительным кольцом на сердечнике центральной стойки (дополнительный рисунок S2D, E).
- Нагрейте пластизоль в микроволновой печи в течение коротких 10 с (дополнительный рисунок S2F, G). Аккуратно перемешайте пластизоль, чтобы избежать образования пузырьков (дополнительный рисунок S2H). Повторяйте нагревание и перемешивание до тех пор, пока раствор не достигнет температуры от 160 °C до 170 °C (дополнительный рисунок S2I).
ВНИМАНИЕ: Перегрев пластизоля может привести к выделению токсичных паров. Выполняйте процедуру в хорошо проветриваемом помещении или вытяжном шкафу. Не нагревайте пластизоль выше 170 °C. - Вылейте расплавленный пластизоль в форму с пластизольным кольцом у внешнего края формы, не образуя пузырьков (дополнительный рисунок S2J). Подождите 1 ч, пока кольца пластизоля остынут (дополнительный рисунок S2K). Выньте кольца из формы. Перед использованием в экспериментальных анализах обеспечьте надлежащее прилегание к устройству DPI (дополнительный рисунок S2L).
5. Крепление устройства DPI к растению
- Найдите ровное, здоровое место на багажнике для крепления устройства. Избегайте ударов или узлов, так как они могут способствовать утечке устройства.
- С помощью сверла диаметром 2 мм просверлите горизонтальное отверстие в центре стебля под углом 90° к поверхности ствола (дополнительный рисунок S3A). Пропустите сверло через отверстие несколько раз, чтобы очистить и разгладить его, чтобы создать беспрепятственное отверстие (дополнительный рисунок S3B).
- Создайте вертикальный срез в пластизольном кольце на противоположной стороне канала доставки соединения (дополнительный рисунок S3C). Установите кольцо вокруг установки и совместите нагнетательный канал с ранее просверленным отверстием (дополнительный рисунок S3D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Кольцо должно плотно прилегать к багажнику, чтобы избежать протечек; Стержневые узлы различного диаметра могут быть использованы для изготовления пластизольных колец для стеблей растений разного размера. - Добавьте устройство DPI к пластизольному кольцу, убедившись, что они плотно прилегают друг к другу. Совместите носик устройства DPI с каналом подачи пластизольного кольца и просверленным отверстием (дополнительный рисунок S3E).
ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть полезно использовать сверло для выравнивания отверстия и носика устройства DPI. - Плотно обмотайте силиконовой лентой, чтобы удерживать устройство на месте (дополнительный рисунок S3F). Осмотрите полностью собранное и прикрепленное устройство, чтобы обеспечить правильное выравнивание и ориентацию на установке.
6. Применение процентного соединения с помощью устройства DPI
- Используйте шприц или пипетку, чтобы наполнить устройство DPI интересующим раствором (дополнительный рисунок S3G). Используйте шприц, чтобы проникнуть в силиконовую ленту и пластизолевое кольцо на противоположной стороне устройства DPI, чтобы вытянуть воздух из внутреннего канала и избежать попадания пузырьков воздуха в сосудистую сеть растения (дополнительный рисунок S3H). Замените любое извлеченное соединение обратно в устройство DPI.
- Добавьте дополнительный небольшой пластырь силиконовой ленты поверх отверстия, созданного шприцем, чтобы укрепить область и предотвратить разрывы. Осмотрите устройство на наличие видимых утечек в месте крепления и осмотрите резервуар устройства на предмет стабильного уровня жидкости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Воду можно использовать изначально для проверки на наличие утечек, чтобы избежать потери тестового раствора. - Накройте открытый конец устройства DPI восковой герметизирующей пленкой и потяните вниз, чтобы сформировать уплотнение и уменьшить испарение экспериментального соединения. Проткните одно отверстие в восковой пленке наконечником шприца, чтобы предотвратить образование вакуума, а затем снова наполните устройство (дополнительный рисунок S3I).
- Ежедневно проверяйте устройство, чтобы убедиться в правильности выравнивания компонентов (дополнительный рисунок S3J), и доливайте жидкость с помощью шприца, чтобы резервуар не иссяк. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будет введено желаемое количество экспериментального раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соединения могут быть успешно введены из данного устройства на срок до 1 месяца. Продолжительность освоения раствора, превышающая этот период времени, должна быть проверена эмпирически перед экспериментальной установкой.
7. Использование CFDA для наблюдения за движением сосудов с цитрусовыми растениями
- Прикрепите устройство DPI к растениям цитрона высотой 25 см (Citrus medica L.), нанесите однократную обработку 2,0% ДМСО в контроле H2O или CFDA на устройство DPI и дайте ему впитаться в течение 24 часов. Чтобы следовать этому протоколу, приготовьте рабочий раствор CFDA, добавив 1,6 мл H2O к 400 мкл исходного раствора CFDA (исходный раствор содержит 10 мМ CFDA, растворенного в 100% диметилсульфоксиде [ДМСО]) для получения конечной концентрации CFDA 2 мМ и 20% ДМСО.
- Сделайте поперечные срезы различных тканей растения и используйте стереоскоп или составной микроскоп с флуоресцентным фильтром, который включает длину волны 498 нм, чтобы визуализировать CFDA в тканях растения. Сравните изображения с 20% ДМСО в контроле H2O, чтобы учесть автофлуоресценцию в ткани.
8. Измерение изменений титра CLas в образцах листьев после лечения стрептомицином
- Используя растения Валенсии (Citrus sinensis (L.) Osbeck «Valencia» высотой 0,75 м, выращенные в теплице, соберите черешок и среднюю жилку двух симптоматических листьев ГЛБ с каждого растения, нарежьте их на небольшие срезы, объедините каждый тип ткани и храните их отдельно в ударопрочных пробирках объемом 2 мл, содержащих стальной шарик диаметром 6,35 мм.
- Измельчите образец с помощью гомогенизатора, запрограммированного на два цикла по 15 с со скоростью 3,4 м/с. Извлеките общую нуклеиновую кислоту, как описано ранее19.
- Проведите кПЦР на образцах листьев, инфицированных CLas, используя смесь кПЦР, определенную в таблице 1 , и условия реакции, определенные в таблице 2. Для дальнейшего анализа используйте растения с устойчивыми инфекциями CLas (устойчивая инфекция обычно определяется как значения Ct на основе кПЦР < 30 для набора праймеров CLas 16S LasLong (LL)) для дальнейшего анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бактериальный титр оценивается с использованием праймеров CLas 16S Las Long (LL) и ДНК дегидрина цитрусовых для оценки относительных эквивалентов генома, как описано ранее20. - Снабдите цитрусовые растения, которые соответствуют минимальному титру инфекции, указанному выше, устройствами DPI и подвергните их одноразовой обработке 2,0 мл раствора H2O или раствора стрептомицина в желаемой концентрации. Чтобы следовать этому исследованию, используйте однократное лечение 2,0 мл 9,5 мг / мл (всего 19 мг) стрептомицина, растворенного вH2O.
- Собирайте образцы листьев через 7, 14 и 28 дней после обработки. Проанализируйте отобранные листья на титр CLas, используя тот же протокол, который описан выше.
- Через 60 дней после обработки получите фотографии растений, обработанных H2O или стрептомицином. Используйте визуальные наблюдения за инфекцией CLas, чтобы оценить тяжесть инфекции. Ищите <50% листьев с межжилковым хлорозом и закупоркой прожилок вместе с ростом смыва листьев как признаки легкой инфекции и более 50% листьев с межжилковым хлорозом и закупоркой вен, а также опадением листьев и задержкой роста растений как признаками более тяжелых инфекций.
9. Измерение смертности D. citri после лечения имидаклопридом
- Обрежьте растения цитрона (Citrus medica L.) высотой 0,5 м до высоты 12 см, чтобы стимулировать рост нового румянца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость роста смыва может зависеть от здоровья растений и времени года; Так что учитывайте это при проектировании эксперимента. - После того, как >6 смыва, длиной 1-2 см, разовьются, введите растения в клетки, содержащие взрослых D. citri. Оставьте растения в клетках на 24 часа, чтобы обеспечить отложение яиц.
- Проводят репрезентативные подсчеты яиц на трех всходах через 1-2 дня после кладки, а в последующем применяют приборы ДПИ. Наполните эти устройства 2,0 мл либо контроля воды, либо желаемой концентрации имидаклоприда (21,8% активного ингредиента). Чтобы следовать этому протоколу, используйте 528 мкл / л, 52,8 мкл / л и 5,28 мкл / л имидаклоприда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчет яиц является деструктивной мерой, поэтому подсчет на этом этапе используется для оценки количества яиц на неучтенном приливе того же растения и помогает обеспечить базовый уровень для последующих подсчетов появления нимф, которые проводятся в конце эксперимента. - Соберите скорость появления D. citri по крайней мере на трех из оставшихся побегов. Приобретите репрезентативные фотографии растений через 7 дней после внесения соединения.
Representative Results
Компоненты устройства прямой инфузии
Базовая версия устройства прямой инфузии имеет высоту 8 см и ширину 3,3 см спереди и сбоку (рис. 1А). Он содержит один центральный резервуар, который примыкает к носику, и общий объем, который может содержаться в этих компонентах, составляет 2,0 мл (рис. 1D). Пластизолевое кольцо имеет высоту 1,8 см и диаметр 2,7 см (рис. 1С). Это кольцо также содержит два канала: один для размещения носика устройства DPI, а другой переменного диаметра, который подходит для ствола обрабатываемого дерева. Кроме того, вокруг вертикального канала имеется канавка для направления избыточной обработки вокруг дерева, что обеспечивает дополнительное поглощение соединения через кору (рис. 1F). При правильной сборке пластизольное кольцо должно быть заподлицо с устройством DPI, а носик должен совпадать с отверстием, просверленным в дереве (рис. 1B и рис. 1E).
CFDA
Чтобы исследовать эффективность устройства DPI для введения экзогенных химических веществ в цитрусовые растения, с помощью устройства было инфильтрировано 2,0 мл 2 мМ CFDA. Сигнал флуоресценции был обнаружен в сосудистой сети обработанного растения (рис. 2A), но отсутствовал в контрольных растениях, обработанных 20% ДМСО в H2O (рис. 2B). Этот сигнал наблюдался во всех рассеченных типах тканей растений, включая мезофилл листьев, сосудистую сеть черешка, сосудистую сеть стебля и сосудистую сеть корня (рис. 2C). Этот сигнал наблюдался в растении в течение 24 ч после лечения и был относительно равномерно распределен по тканям.
Стрептомицин
Чтобы проверить, оказывают ли введенные соединения терапевтический эффект на заболевание ГЛБ, 2,0 мл бактерицидного соединения, стрептомицина, вводили в CLas-положительные растения сладкого апельсина Валенсии (Citrus sinensis) в концентрации 9,5 мг / мл (всего 19 мг). Эти растения содержали в тепличных горшках, а титр CLas (измеряемый эквивалентами генома CLas на эквиваленты генома цитрусовых) контролировался с течением времени с помощью кПЦР (рис. 3A). Первоначальные средние титры CLas в ДНК для растений, обработанных стрептомицином и H2 O, составляли 0,562 генома CLas / генома цитрусовых и 0,49 CLas генома / генома цитрусовых соответственно. Снижение среднего бактериального титра было обнаружено с помощью кПЦР через 7-28 дней после лечения стрептомицином по сравнению с контролем H2O в тот же момент времени. Кроме того, разница между временем 0 и днем 28 средних бактериальных титров составила 0,314 и 0,117 для растений, обработанных стрептомицином, и растений, обработанных H2O, соответственно.
Этот эксперимент был разработан для измерения реакции растения на различные обработки в разные периоды времени. Был использован двухфакторный квадратичный дизайн поверхности ответа, при котором время рассматривалось как количественный дискретный фактор с четырьмя уровнями (0 дней, 7 дней, 14 дней и 28 дней) и лечение как категориальный фактор с двумя уровнями (H2O и стрептомицин). Для каждой из восьми комбинаций лечения использовали пять повторений, а титр CLas измерялся в качестве переменной ответа. Данные были преобразованы с использованием log10 на основе анализа графика Бокса-Кокса. Редукция модели была выполнена путем прямого отбора с использованием информационного критерия Акаике (AICc)21, что привело к удалению как эффектов времени, так и эффектов взаимодействия. Оставшийся фактор, лечение, был значимым (p = 0,0252), при этом растения, обработанные стрептомицином, показали более низкий средний титр CLas (0,349), чем растения, обработанные H2O (0,496) во всех временных точках вместе взятых (рис. 3B). Это снижение титра CLas соответствовало случайному увеличению роста новых здоровых приливов через 60 дней у растений, получавших стрептомицин, о чем свидетельствуют фотографии репрезентативных деревьев, обработанных H2O (рис. 3C) по сравнению с 19 мг стрептомицина (рис. 3D).
Имидаклоприд
Имидаклоприд был введен в ювенильные растения цитрона, зараженные азиатским цитрусовым псиллидом (ACP), с использованием устройства DPI для проверки его потенциала в качестве инсектицидного скринингового анализа D. citri. Однократная обработка 2,0 мл коммерческого раствора инсектицида имидаклоприда была протестирована при трех различных концентрациях (5,28 мкл / л, 52,8 мкл / л и 528 мкл / л) вместе с контролем воды. Среднее общее количество яиц на три побега до обработки варьировалось от 280,5 до 321, и не было существенных различий между растениями, которые будут использоваться для каждой группы обработки (рис. 4А). Среднее общее количество выживших нимф на трех побегах через 7 дней после обработки составило 293,75, 268, 97,5 и 2 для контроля воды и 5,28 мкл / л, 52,8 мкл / л и 528 мкл / л растворов имидаклоприда соответственно (рис. 4B). Это представляло собой значительное снижение появления нимфы псиллиды при уровнях 52,8 мкл / л (p = 0,029) и 528 мкл / л (p = 0,002) раствора имидаклоприда по сравнению с контролем воды в соответствии с односторонним ANOVA с последующим последующим анализом Тьюки post-hoc. Кроме того, это увеличение смертности нимфы псиллиды при самом высоком уровне раствора имидаклоприда было визуально очевидно по снижению производства нимфы медвяной росы на линиях, обработанных имидаклопридом (рис. 4D) по сравнению с контролем воды (рис. 4C).
Рисунок 1: Устройство для прямой инфузии растений и кольцо для пластизоля. (A) Неповрежденное устройство прямой инфузии растений и (C) кольцо для пластизоля вместе с их размерами. (B) Устройство прямой инфузии растений и кольцо пластизоля, соединенные и прикрепленные к цитрусовому дереву. Вертикальные поперечные сечения (D) устройства прямой инфузии растений, (F) пластизолевого кольца и (E) этих двух компонентов, соединенных и прикрепленных к цитрусовому дереву. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Поперечное сечение средней жилки листа цитрусового растения высотой 25 см. Изображения, показывающие 24 часа после обработки (A) 2 мМ CFDA или (B) 20% ДМСО в H2O с использованием устройства прямой инфузии растений. (C) Поперечные срезы различных растительных тканей через 24 ч после обработки CFDA 2 мМ, включая ствол на 5 см выше устройства прямой инфузии растений (вверху слева), ствол на 5 см ниже устройства прямого инфузии растений (в середине слева), корень (внизу слева), среднюю жилку листа (вверху справа), черешок листа (в центре справа) и мезофилл листа (внизу справа). Масштабные линейки = 1 мм. Сокращения: CFDA = 5,6-карбоксифлуоресцеин-диацетат; ДМСО = диметилсульфоксид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Мониторинг титра CLas (измеряемого эквивалентами генома CLas для эквивалентов генома цитрусовых) с течением времени с помощью кПЦР. (A) Временной ход, показывающий изменения титра ДНК CLas, сравнивая пять растений, обработанных 19 мг стрептомицина, с пятью растениями, обработанными контролем H2O. Баллы представляют собой среднее значение для данного лечения в данный момент времени. Полосы погрешности представляют собой стандартную погрешность среднего значения. (B) Гистограмма, показывающая средний титр CLas растений, обработанных H2O- и стрептомицином, во все моменты времени. Полосы погрешности представляют собой 95% доверительный интервал, а звездочки обозначают значимые различия (* = p < 0,05) между средними титрами CLas для растений, обработанных стрептомицином и H2O, в соответствии с односторонним ANOVA. (C) Репрезентативные изображения цитрусовых растений через 0 месяцев и 2 месяца после прямой инфузионной обработки растений стрептомицином (C)H2Oили (D). Растения, обработанные стрептомицином, показывают новый светло-зеленый рост листьев через 2 месяца, что свидетельствует о снижении титра CLas. Аббревиатура: CLas = Candidatus Liberibacter asiaticus. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Мониторинг смертности нимфы псиллид в ювенильных растениях цитрона, зараженных ACP. Гистограммы, показывающие (А) предполагаемое начальное количество яиц и (Б) выжившие нимфы D. citri на трех цитрусовых через 7 дней после обработки с контролем воды и различными разведениями имидаклоприда. Полосы погрешности представляют собой стандартную ошибку среднего значения, а звездочки обозначают значительные различия (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) между данным уровнем очистки и контролем воды в соответствии с односторонним ANOVA, за которым следует последующий анализ Тьюки. Изображения цитрусовых, зараженных нимфами D. citri, смываются через 7 дней после обработки либо (C) контролем воды, либо (D) 528 мкл / л имидаклоприда с использованием устройства прямой инфузии растений. Сокращения: ACP = азиатский цитрусовый псиллид; D. citri = Diaphorina citri Kuwayama. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Объем на образец (мкл) | Компонент | |||||
| 12.5 | 2x GoTaq qPCR с мастер-миксом BRYT Green Dye | |||||
| 5 | Матрица ДНК (20 нг/мкл) | |||||
| 0.5 | Праймер 10 мкМ F и R для CLas | Класс: CTTACCAGCCCCTTGACATGTATAGG (Вперед); TCCCTATAAAGTACCCAACATCTAGGTAAA (Реверс) |
||||
| 0.5 | 10 мкМ Primer F и R для уборки цитрусовых | Дегидрин цитрусовых: TGAGTACGAGCCGAGTGTTG (вперед); AAAACTTCACCGATCCACCAG (Обратный) |
||||
| 6.5 | H2O | |||||
Таблица 1: Смесь для кПЦР, используемая для количественного определения титра CLas в цитрусовых линиях, обработанных стрептомицином. Показана последовательность праймеров 16S Las Long и праймеров дегидрина цитрусовых для количественного определения ДНК CLas и количественного определения цитрусовой ДНК.
| Шаг | Температура (°C) | Время | |
| 1 | Первоначальная денатурация | 95 | 2 мин |
| 2 | Денатурировать | 95 | 15 с |
| 3 | Отжиг | 60 | 20 с |
| 4 | Расширение | 72 | 20 с |
| 5 | Перейдите к шагу 2, повторите 39x | ||
| 6 | Кривая расплава | 60 до 95 при 0,2 °C/с | 3 мин |
Таблица 2: Условия реакции для кПЦР, используемой для количественного определения титра CLas в цитрусовых линиях, обработанных стрептомицином.
Дополнительный рисунок S1: Изображения, показывающие процесс сборки пресс-формы для создания пластизолевого кольца. (A) Для создания первого слоя формы из пластизольного кольца использовались защелкивающиеся пластиковые блоки. (B) Равномерно перемешанный раствор, содержащий силиконовую резину RTV, катализатор, пищевой краситель и мыло. (C) Равномерно заливается первый слой формы с пластизольным кольцом. (D) Изображение узоров из пластизольных колец с отпечатком сердцевины в центре удерживания вверху. (E) Узоры из пластизольных колец, вставленные в неотвержденный второй слой формы. (F) Малярная лента и резиновый молоток, используемые для закрепления узоров при отверждении второго слоя. (G) Третий слой формы добавляется до тех пор, пока он не окажется вровень с верхней частью выкройки. (H) Извлечение выкроек из формы. (I) Полностью изготовленная форма для пластизольного кольца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Изображения, показывающие процесс сборки пластизольного кольца, связанного с устройством прямой инфузии растений. (A) Компоненты сборки пластизольного кольца, включая пресс-форму, центральный сердечник с уплотнительным кольцом и сердечник нагнетательного канала. (B) Покрытие сердечников антипригарным распыляемым растительным маслом для облегчения удаления пластизольного кольца после затвердевания. (C) Вставка центрального сердечника и уплотнительного кольца в форму. (D) Вставка сердечника канала доставки перпендикулярно центральному сердечнику. (E) Правильная сборка компонентов сердечника пластизольного кольца в полости пресс-формы. (F) Пластизол, используемый для создания пластизолевого кольца. (G) Нагрев пластизоля в микроволновой печи. (H) Перемешивание пластизоля после нагревания. (I) Проверка температуры пластизоля. (J) Заливка нагретого пластизоля в собранную сердцевину. (K) Возможность охлаждения пластизоля вокруг собранного ядра. (L) Полностью собранные пластизольные кольца, прикрепленные к устройству прямой инфузии растений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S3: Изображения, показывающие процесс сборки устройства прямой инфузии растений. (A) Просверливание отверстия в центре цитрусового растения для создания канала для доставки соединения. b) Вид просверленного отверстия спереди. (C) Разрезание пластизольного кольца бритвенным лезвием напротив канала доставки состава. (D) Плотное прилегание пластизолевого кольца к стержню в месте ранее просверленного отверстия. (E) Установка устройства прямой инфузии растений на кольцо пластизоля с патрубком доставки соединения на устройстве, вставленным в канал кольца пластизоля. (F) Использование силиконовой ленты для крепления устройства прямой инфузии растений к пластизольному кольцу и удержания всего аппарата на месте. (G) Заполнение камеры устройства прямой инфузии растений интересующим соединением. (H) Использование шприца для вытягивания воздуха из просверленного отверстия в установке и запуска потока соединения. (I) Нанесение восковой герметизирующей пленки на отверстие в камере устройства прямой инфузии растений и протыкание отверстия для предотвращения вакуума. (J) Полностью собранное устройство для прямой инфузии растений на растении цитрусовых. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 1: Сердечник центрального столба с кольцом пластизоля. STL-файл для дерева 4 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 2: Сердечник центрального столба с кольцом пластизоля. STL-файл для дерева 6 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 3: Сердцевина центральной стойки пластизольного кольца. STL-файл для дерева 8 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 4: Сердечник центрального столба с пластизольным кольцом. STL-файл для дерева 10 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 5: Стержень стойки центрального кольца пластизоля. STL-файл для дерева 12 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 6: Сердцевина центрального столба с пластизольным кольцом. STL-файл для дерева 14 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 7: Ядро канала доставки пластизольного кольца. STL-файл для дерева 4 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 8: Ядро канала доставки пластизольного кольца. STL-файл для дерева 6 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 9: Ядро канала доставки пластизольного кольца. STL-файл для дерева 8 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 10: Ядро канала доставки пластизольного кольца. STL-файл для дерева 10 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 11: Ядро канала доставки пластизольного кольца. STL-файл для дерева 12 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 12: Ядро канала доставки пластизольного кольца. STL-файл для дерева 14 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 13: Устройство для прямой инфузии растений. STL файл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 14: Выкройка, используемая для создания формы для пластизольного кольца. STL файл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Для того, чтобы устройство DPI считалось жизнеспособным методом доставки экзогенных соединений в растения, оно должно способствовать надежному и последовательному поглощению соединений различными типами тканей. Эксперимент с использованием CFDA ясно показал движение как акропетальных, так и базипетальных соединений, а также как в сосудистой системе, так и в клетках мезофилла листа. Кроме того, и, по-видимому, из-за того, что просверленное отверстие, используемое в этом устройстве DPI, обеспечивает большую площадь поверхности для поглощения соединения, CFDA присутствовал в относительно равных количествах во всех секциях стебля, а не только в небольшом подмножестве сосудистой сети, прилегающей к устройству, как это было замечено в предыдущих исследованиях поглощения красителя у растений с использованием впрыскаствола 6. Кроме того, доставка зеленого флуоресцентного белка и цветочного красителя была протестирована с использованием устройства DPI, и наблюдалось распределение этих соединений, аналогичное CFDA (данные не показаны). Эти данные свидетельствуют о том, что устройство может быть использовано для системной доставки различных соединений, которые различаются по размеру и молекулярной структуре. Тем не менее, стоит отметить, что были различия в поглощении соединений в зависимости от стадии развития листьев, при этом молодые развивающиеся листья поглощали больше соединений, чем более старые укоренившиеся листья. Это может быть связано с изменениями свойств сосудистой сети, присутствующих в ткани стока по сравнению с исходной тканью, и должно быть оптимизировано для данного эксперимента.
Устройство DPI показало достаточное поглощение соединений для визуализации CFDA, GFP и цветочного красителя, а также достаточно, чтобы показать антибактериальное и инсектицидное действие стрептомицина и имидаклоприда соответственно. Оба эти соединения приводили к изменениям жизнеспособности целевого организма через 1 неделю после однократного лечения 2,0 мл. Эти данные свидетельствуют о том, что устройство DPI может быть использовано в анализах всего растения для проверки жизнеспособности широкого спектра соединений для борьбы с микробами и насекомыми-вредителями. Более того, благодаря прямому контакту с сосудистой системой, это устройство может даже дать возможность тестировать соединения, которые неэффективно поглощаются корнями или клетками эпидермиса. Особый интерес представляет РНК-интерференция (РНКи), поскольку она может быть использована для модуляции экспрессии генов в растении-хозяине, патогене или переносчике патогена. Предыдущее исследование, в ходе которого РНК шпильки вводилось через просверленное отверстие в стволе растений яблони и винограда, показало, что молекулы РНК ограничены тканью ксилемы, что позволяет предположить, что эти молекулы могут быть эффективны только против организмов, питающихся жевательным и сокомксилемы 22. Учитывая, что устройство DPI использует аналогичную систему доставки с просверленным отверстием, само собой разумеется, что шпилечная РНК, доставляемая с помощью этого устройства, также может быть ограничена тканью ксилемы. Однако наблюдаемое снижение титра КЛас, ограниченного флоэмой, после лечения стрептомицином с помощью устройства DPI убедительно свидетельствует о том, что этот антибиотик присутствовал во флоэме. Следовательно, вполне вероятно, что сосудистое распределение соединений, доставляемых с помощью устройства DPI, зависит от их размера и химического состава, и каждая молекула должна оцениваться на индивидуальной основе.
Несмотря на то, что на рынке существует ряд коммерчески доступных устройств DPI, описанное здесь устройство может быть изготовлено на собственном производстве и может быть модифицировано. Таким образом, улучшения и изменения в размерах могут быть сделаны в зависимости от видов растений и используемого экспериментального дизайна, и это не зависит от коммерческих продуктов. Кроме того, устройство полупостоянно прикреплено к растению, что означает, что несколько обработок данного соединения могут быть выполнены одновременно без необходимости повторного повреждения растения несколькими инъекциями соединения. Предостережение: устройство может протечь, если оно не установлено должным образом. В результате соединение теряется в окружающей среде, а не доставляется на завод. Поэтому следует позаботиться о том, чтобы осмотреть устройство на наличие признаков утечки во время настройки и в первые несколько дней после нее. Хотя сверление отверстия в дереве потенциально вредно, этот метод был выбран для обеспечения надежного и последовательного поглощения соединения. Кроме того, в этих экспериментах не было обнаружено никаких неблагоприятных воздействий на здоровье растений от прикрепления устройства DPI. Тем не менее, дополнительные растения должны быть включены в план эксперимента, чтобы заменить те, которые могут потерять энергию в ходе данного эксперимента. Наконец, поскольку это устройство использует пассивный поток для введения соединений, может быть трудно предсказать скорость поглощения у разных видов растений или стадий развития одного и того же вида. Это может усложнить эксперименты, если скорость поглощения соединения является ограничивающим фактором. Для достижения наилучших результатов эксперименты следует планировать таким образом, чтобы растению было предоставлено достаточно времени для полного поглощения 2,5 мл соединения, что может занять до 1 недели. В заключение, это устройство DPI является эффективным инструментом для быстрой оценки активности in planta антимикробных или инсектицидных соединений против CLas и его переносчика, D. citri, тем самым предоставляя больше информации о системной эффективности и влиянии на продуктивность растений, чем ранее представленный анализ отдельных листьев23. Несомненно, разнообразие применений этой системы выходит далеко за рамки конкретных применений, описанных в этом исследовании.
Disclosures
Конфликт интересов у авторов отсутствует. Использование названий торгов, фирм или корпораций в этой публикации предназначено для информации и удобства читателя. Такое использование не является официальным одобрением или одобрением Министерством сельского хозяйства США или Службой сельскохозяйственных исследований какого-либо продукта или услуги, за исключением других, которые могут быть подходящими. Министерство сельского хозяйства США (USDA) запрещает дискриминацию во всех своих программах и мероприятиях по признаку расы, цвета кожи, национального происхождения, возраста, инвалидности и, где это применимо, пола, семейного положения, семейного положения, родительского статуса, религии, сексуальной ориентации, генетической информации, политических убеждений, репрессий или потому, что весь или часть дохода человека получен от любой программы государственной помощи. Не все запрещенные базы применимы ко всем программам. Лица с ограниченными возможностями, которым требуются альтернативные средства передачи информации о программе (шрифт Брайля, крупный шрифт, аудиокассета и т. д.), должны связаться с Центром TARGET Министерства сельского хозяйства США по телефону (202) 720-2600 (голос и TDD). Чтобы подать жалобу на дискриминацию, напишите Министерству сельского хозяйства США, директору Управления по гражданским правам, 1400 Independence Avenue, S.W., Washington, D.C. 20250-9410, или позвоните по телефону (800) 795-3272 (голосовая связь) или (202) 720-6382 (TDD). Министерство сельского хозяйства США является поставщиком равных возможностей и работодателем.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Mant Acon за растения, использованные в этом исследовании. Финансирование было предоставлено проектом CRIS 8062-22410-007-000-D Министерства сельского хозяйства США (USDA) и грантом USDA NIFA 2020-70029-33176.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 cm Diameter Steel Balls | Ballistic Products Inc. | #SHT #T | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | Becton Dickinson | 382903029952 | |
| 20 G 1 Syringe Needle | Becton Dickinson | 305175 | |
| 2 mL Screw Cap Tubes | USA Scientific | 1420-9710 | |
| 3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964077 | |
| 3D Printer | Markforged | F-PR-2027 | |
| 3D Printing Software | Markforged | F-SW-FDVX | |
| 3D Printing Software | Markforged | S-FW-OEVX | |
| 5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C195 | |
| 5/64th Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964502 | |
| 96 Well qPCR Machine | Roche | 5815916001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22621408 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | SP-BX43-BI | |
| Fluorescent Microscope Filter | Chroma | 69401-ET | |
| Gloss Clear Spray Paint | Rustoleum | 249117 | |
| Grey Lego Baseplate | Lego | 11024 | |
| Handheld Cordless Drill | Makita | 6349D | |
| Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | |
| Imidacloprid 2F | Quali-Pro | 83080133 | |
| Liquid Plastisol Medium Hardness | Fusion X Fishing Lures | XSOL-505 | |
| Red Silicone 70 Shore A O-Ring | Grainger | Varies by Size | |
| Non-Stick Cooking Spray | PAM | 64144030217 | |
| NucleoSpin Plant II | Macherey-Nagel | 740770.5 | |
| Parafilm | Bemis | HS234526A | |
| Poly Viyl Acetate Based Glue | Elmers | E301 | |
| qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
| qPCR Primers | Integrated DNA Technologies | Varies by DNA sequence | |
| Reverse Transcriptase | Promega | A5003 | |
| Single Edge Razor Blade | Garvey | 40475 | |
| Translucent Silicone RTV Rubber | Aero Marine Products | AM 115T | |
| Transparent Silicone Tape | Maxwell | KE30S | |
| Truncated Oncocin 112 | Genscript | Varies by peptide sequence | |
| White 1 x 6 Lego Piece | Lego | 300901 | |
| White Nylon | Markforged | F-MF-0003 |
References
- Hu, J., Wang, N. Evaluation of the spatiotemporal dynamics of oxytetracycline and its control effect against citrus huanglongbing via trunk injection. Phytopathology. 106 (12), 1495-1503 (2016).
- Bendix, C., Lewis, J. D. The enemy within: Phloem-limited pathogens. Molecular Plant Pathology. 19 (1), 238-254 (2018).
- Keshavareddy, G., Kumar, A. R. V., Ramu, V. S. Methods of plant transformation- A review. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (7), 2656-2668 (2018).
- Qaim, M. Role of new plant breeding technologies for food security and sustainable agricultural development. Applied Economics Perspectives and Policy. 42 (2), 129-150 (2020).
- Siegrist, M., Hartmann, C. Consumer acceptance of novel food technologies. Nature Food. 1 (6), 343-350 (2020).
- Larson, D. W., Doubt, J., Matthes-Sears, U. Radially sectored hydraulic pathways in the xylem of Thuja occidentalis as revealed by the use of dyes. International Journal of Plant Sciences. 155 (5), 569-582 (1994).
- Mehdi, R., et al. Symplasmic phloem unloading and radial post-phloem transport via vascular rays in tuberous roots of Manihot esculenta. Journal of Experimental Botany. 70 (20), 5559-5573 (2019).
- Miller, G. S., Parente, R. M., Santra, S., Gesquiere, A. J. Tracking of fluorescent antibiotic conjugate in planta utilizing fluorescence lifetime imaging. Planta. 253 (2), (2021).
- Treydte, K., Lehmann, M. M., Wyczesany, T., Pfautsch, S. Radial and axial water movement in adult trees recorded by stable isotope tracing. Tree Physiology. 41 (12), 2248-2261 (2021).
- Nie, P. Liping Hu, Haiyan Zhang, Jixiang Zhang, Zhenxian Zhang, Lingyun Zhang, The predominance of the apoplasmic phloem-unloading pathway is interrupted by a symplasmic pathway during Chinese jujube fruit development. Plant and Cell Physiology. 51 (6), 1007-1018 (2010).
- Jiang, M., Deng, Z., White, R. G., Jin, T., Liang, D. Shootward movement of CFDA tracer loaded in the bottom sink tissues of Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59606 (2019).
- Liu, H., Si, C., Shi, C., Wang, S. Zhe Sun, Yanxi Shi, from apoplasmic to symplasmic phloem unloading during storage roots formation and bulking of sweet potato. Crop Science. 59 (2), 675-683 (2019).
- Erdos, T., Ullmann, A. Effect of streptomycin on the incorporation of amino-acids labeled with carbon-14 into ribonucleic acid and protein in a cell-free system of a Mycobacterium. Nature. 183 (4661), 618-619 (1959).
- Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Motaung, T. E. Chloronicotinyl insecticide imidacloprid: Agricultural relevance, pitfalls and emerging opportunities. Crop Protection. 131, 105097 (2020).
- Berger, C., Laurent, F. Trunk injection of plant protection products to protect trees from pests and diseases. Crop Protection. 124, 104831 (2019).
- Archer, L., Crane, J. H., Albrecht, U. Trunk injection as a tool to deliver plant protection materials-An overview of basic principles and practical considerations. Horticulturae. 6 (6), 552 (2022).
- Wise, J. C., et al. Trunk injection: A discriminating delivering system for horticulture crop IPM. Entomology, Ornithology & Herpetology: Current Research. 03 (2), (2014).
- Ammar, E. D., George, J., Sturgeon, K., Stelinski, L. L., Shatters, R. G. Asian citrus psyllid adults inoculate Huanglongbing bacterium more efficiently than nymphs when this bacterium is acquired by early instar nymphs. Scientific Reports. 10 (1), 18244 (2020).
- Stover, E., Mccollum, G., Ramos, J., Shatters, R. G. Growth, health and Liberibacter asiaticus titer in diverse citrus scions on mandarin versus trifoliate hybrid rootstocks in a field planting with severe Huanglongbing. Proceedings of the Florida State Horticultural Society. 127, 53-59 (2014).
- Akaike, H. A new look at the statistical model identification. IEEE Transactions on Automatic Control. 19 (6), 716-723 (1974).
- Dalakouras, A., Jarausch, W., Buchholz, G., Bassler, A., Braun, M., Manthey, T., Krczal, G., Wassenegger, M. Delivery of hairpin RNAs and small RNAs into woods and herbaceous plants by trunk injection and petiole absorption. Frontiers in Plant Science. 9, 1253 (2018).
- Ammar, E. D., Walter, A. J., Hall, D. G. New excised-leaf assay method to test inoculativity of Asian citrus psyllid (Hemiptera: Psyllidae) with Candidatus Liberibacter asiaticus associated with citrus Huanglongbing disease. Journal of Economic Entomology. 106 (1), 25-35 (2013).
